COMPUESTOS AROMÁTICOS

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADATrease y Evans (1989) “Farmacognosia”, 13ª edición, Interamericana-McGraw Hill.Deanna Marcano, Marahisa Hosegawa (1991) “Fitoquímica Orgánica”, Universidad Central deVenezuela, Caracas.Mabry, T.J. ; Markham, K.R.y Thomas, M.B. (1970) “The Systematic Identification of Flavonoids”,Springer-Verlag, New York.Harborne, J.B. ; Mabry, T.J. ; Mabry, H. (1975) “The Flavonoids”, Chapman and Hall, London.Samuelson, Gunnar (1992) “Drugs of Natural Origin”, Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm.Bruneton, Jean (191993 “Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants”, Lavoisier, France.

Los compuestos aromáticos naturales incluyen derivados simples de benceno, anillos bencénicoscondensados, monómeros, dímeros o polímeros de alto peso molecular, como lo son la lignina y lostaninos. Generalmente presentan grupos oxigendos, mayormente fenoles. Biogeneticamente derivande la vía del ác. shikímico, y varios tienen origen mixto vías acetato-shikímico.Como ejemplo en el reino animal podemos citar el p-cresol, una secreción de defensa de algunosinsectos; la luciferina, responsable de la bioluminiscencia de las luciérnagas. Es un compuestofenólico azufrado, que debe oxidarse enzimáticamente para su luminiscencia.Un ejemplo de la vida real lo describe Mark J. Plotkin en su libro “Aprendiz de Chamán” (EmecéEditores SA, 1997, Buenos Aires, traducción del inglés “Tales of a Shaman’s Aprentice”, Mark J.Plotkin, 1993, Penguin Books USA Inc.). En él describe cómo los indios de la selva amazónicasalen de pesca. Primero salen en busca de la liana ay-ah-e-yah, un tipo de liana amarilla, la cualcortan en tramos de treinta centímetros. Al cortarla la madera despide un olor semejante al delpepino. Luego con dos hojas de la palmera wah-pu y tiras largas de corteza de los árboles me-de-bo-no trenzan y arman las mochilas para transportar a la aldea los trozos de liana. En la aldea los indiosse turnan para machacarla con garrotes de madera. Cargan la pila de pulpa amarilla en las canoas yse van a pescar lejos de la aldea. Las mujeres, paradas en las aguas frías del río, amasan la pulpaamarilla del ay-ah-e-yeh soltando una sustancia blancuzca y espumosa que es llevada corrienteabajo por el río.El compuesto que la madera libera se llama rotenona (un rotenoide). Es un vasoconstrictor quepenetra en las branquias de los peces y cierra los capilares responsables de la toma de oxígeno. Enotras palabras, el pez se asfixia. Los hombres esperan en las canoas con arcos y flechas río abajo.Cuando la rotenona comienza a hacer efecto, la superficie del río comienza a hervir y se agita conlos peces que salen en busca de aire. Todos los peces son alcanzados por una certera flecha huecaque vuelve a la superficie arrastrando con ella a la infeliz presa. Además los indios usan la pulpaamarilla de la liana ay-ah-e-yah para tratar por ejemplo heridas profundas.La rotenona es hoy día uno de los pesticidas biodegradables más importantes. Tiene poco efecto enanimales de sangre caliente, efectos limitados en peces, pero es devastadora para muchos insectos.La rotenona es ingrediente de insecticidas, pulverizadores hortícolas, polvos pulguicidas y parabaños de animales.

Glicósidos fenólicosLa mayoría de los compuestos fenólicos de bajo PM se presentan en las células vivas en formacombinada, generalmente como O-glicósidos. El azúcar unido puede ser un mono-, di-, o menosfrecuentemente un polisacárido y estar conformado por unidades de hexosas y pentosas. La

glicosidación aumenta la solubilidad de las agliconas en agua, aumentando así su movilidad yfacilidad de transporte dentro de la planta.Ejemplos :

O

O

Me

OC

HO

OH O

O

glucosil OH

glucovainillina Vitexina

En el aislamiento y caracterización de los glicósidos hay que considerar la posibilidad de que elenlace O-glicósido se hidrolice, sea por vía ácida o vía enzimática. Existen también en la naturalezala glicosidación sobre átomos de carbono, llamados C-glicósidos, los cuales son resistentes a lahidrólisis ácida. Las uniones C-glicosídicas siempre se encuentran adyacentes a un OH fenólico, porlo que se supone que en su bioformación interviene el precursor O-glicosidado.Entre las agliconas, el grupo de los flavonoides son los más glicosidados. La glicosidación es menosfrecuente en cumarinas, chalconas, y es escasa en isoflavonoides. Ciertos derivados forman un ésteren la porción del ácido. Estos ésteres glicosídicos son llamados ácidos clorogénicos, compuestosasociados con la resistencia de las plantas a ciertas enfermedades. Son ésteres del ác. químico y delác. 3,4-dihidroxicinámico.

HO

HO

O

OHO OH

OH

CO2H

Ej. ác. clorogénico (ác. 3,4-cafeoilquímico)

Aislamiento e IdentificaciónLos métodos de detección, aislamiento e identificación de compuestos fenólicos se fundamentan ensus propiedades ácidas y en su polaridad. La mayoría de los fenoles son sólidos y su color varíadesde incoloro hasta fuertemente coloreado, dependiendo de la conjugación del o de los cromóforospresentes. Su solubilidad en solventes polares (metanol, butanol) permite diferenciarlos de otrospigmentos liposolubles igualmente coloreados, los carotenoides. Su acidez los hace solubles enbases.Generalmente absorben en la región visible y ultravioleta, y sus espectros son afectados porreactivos de desplazamiento de manera característica. La prueba específica para fenoles es laproducción de un intenso color verde, marrón o azul con soluciones recién preparados de cloruroférrico 1-2 %. También se utilizan reacciones de acoplamiento con sales de diazonio reciénpreparadas, así como oxidación de los fenoles por reactivos oxidantes como el reactivo de Tollens.La extracción es precedida por el desgrasamiento del material con un solvente no polar. Se purificanmediante precipitaciones sucesivas o mediante la distribución contracorriente (DCCC). Esta últimatécnica se emplea para purificarlos y separarlos de acuerdo a su acidez, si una de las fases se ajustaa diferentes valores de pH. Además se utiliza también ampliamente la cromatografía en columnacon sílica, alúmina, celulosa, poliamida y carboximetilcelulosa. Para las TLC (cromatografía encapa fina) los reactivos de visualización (o reveladores) usados son una solución al 1-5 % de una salde aluminio (cloruro, acetato o sulfato), o una solución 0.2% de una amina diazotada estabilizadacon carbonato de sodio al 20 % (Ej: Fast Blue). Hoy día se utiliza mucho la cromatografía líquidade alta presión, HPLC y la técnica de cromatografía a contracorriente a la gota, DCCC.

CLASIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOSA) Compuestos Fenólicos Simples: C6C1, C6C2, C6C3.B) Flavonoides chalconas y auronas

flavonoles y flavonasantocianinasflavanonas y flavononolesflavonoles

C) Isoflavonoides isoflavonasisoflavanonasrotenoidesisoflavanos e isoflavenos

D) Quinonas benzoquinonanaftoquinonaantraquinonabis-antraquinona

E) α-Pironas cumarinasisocumarinasaflatoxinas

F) γ-Pironas cromanos y cromonascanabinoides

G) XantonasH) LignoidesI) DépsidosJ) Otros policétidos aromáticos

A) COMPUESTOS FENÓLICOS SENCILLOSLos compuestos fenólicos sencillos pueden considerarse derivados de fenoles simples (C6), del ác.benzoico (C6C1), de la acetofenona (C6C2) y del ác. cinámico (fenilpropano) (C6C3).Biosinteticamente derivan de la vía del ác. shikímico. Las acetofenonas (C6C2) provenientes de unproceso de β-oxidación del precursor C6C3, aparecen como glicósidos, por ejemplo pungenina,aislada de Picea pungens. Por repetición de las unidades C6C1 y C6C3 se forman las estructuraspoliméricas (taninos, melanina, ligninas). La formación de heterósidos es común, veamos algunosejemplos:

nombre ejemplos y fuentes1 Productos de hidrólisisSalicósido Salix y Populus spp

Viburnum prumifolumAlcohol salicílico, glucosa

Propulósido(benzoil-xalicosido)

Populus tremula Alcohol salicílico, ác. benzoico yglucosa

Arbutósido Ericaceae y Rosaceae fHidroquinona, glucosaFlorizósido Malus (Rosaceae) Floretina, glucosaConiferósido Coniferae Alcohol coniferílico, glucosaGlucovanillósido Vanilla spp y algunas

GraminaceaeVanillina, glucosa

Geósido Geum spp Eugenol, vicianosa (glucosa +arabinosa)

R1 R2 R3 R4 R5 compuesto

H H H OH OMe salicilato de metiloH OH H H OH ác. p-

hidroxibenzóicoH OH OMe H OH ác. vanílico =>

C6C1OH OH OH H OH ác. gálicoOMe OH OMe H OH ác. siríngicoH OH OH H OH ác. protocateúicoH OH OMe H H vanillinaH OH OGlu H Me pungenina =>

C6C2

R2

R1 R3

R4

COR5

siendo Glu = glucosa

R1

R2

OMe

R1 R2H OH Eugenol OCH2O Miristicina

R1 R2 R3 R4 R5 compuestos

H OH H H CO2H ác. p-cumáricoH H H OH CO2H ác. o-cumáricoH OH OH H CO2H ác. caféicoH OH OMe H CO2H ác. ferúlicoOMe OH OMe H CO2H ác. sinápicoH OGlu OMe H CH2O

Hconiferina

H OH OMe H CH2OH

alcoholconiferílico

OCH2O OMe H CH3 isomiristicina

siendo Glu = glucosa

R1

R2

R3

R4

R5

BiosíntesisLa biosíntesis de compuestos fenólicos sencillos comienza a través de un precursor común, el ác.shikímico. Éste se forma por una condensación aldólica entre fosfoenolpiruvato y el azúcar 4-fosfo-D-eritrosa, ambos metabolitos de la glucosa. Al pH presente en la planta los ácidos involucradosestán ionizados.

Ejemplos de plantas

Vainilla y VainillinaLa vainilla (fruto de Vainilla) está constituida por los frutos inmaduros, cuidadosamente curados ytotalmente desarrollados, de Vainilla fragas (Salis.) Ames (sin. V. planifolia Andrews) (Fam.Orchidaceae) (Vainilla mexicana o Borbón) y de la V. tahitensis (vainilla de Tahiti).Es nativa del neotrópico donde se usaba extensivamente en América Central en la épocaprecolombina. Los aztecas hacían una bebida combinando vainilla, chocolate y pimientos chile. Elnombre “vainilla” viene de la palabra española “vaina” (debido a su forma), que deriva a su vez deltérmino en latín que designa a la vagina.Los frutos se recolectan cuando la parte superior del mismo cambia su color del verde al amarillo.El color y olor característico de la droga comercial se desarrollan por acción enzimática, que seefectúa a lo largo del curado, consistente en una desecación lenta a temperatura controlada.La vainilla verde contiene glicósidos, principalmente vanillósido (glucovanillina) y alcoholglucovaníllico. Durante el curado estos compuestos sufren oxidaciones e hidrólisis enzimáticas. La

OHO

OH

O

P

OO

O P

OO

O

OHHO

OH

O P

4-fosfo-D-eritrosa fosfoenolpiruvato(PEP)

7-fosfo-3-deoxi-D-arabino-heptulosato

O OH

HO

OO

OH

OH

O OH

O O

OH

OH

O O

HO

3-dehidroquinato

3-dehidroshikimato shikimato

O O

OOH O

O

OH

O

O

OO

O

chorismate prefenato

PEP

COOH

NH2

H

OH

O

O

OH

demas fenilpropanos...

BIOSINTESIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS SENCILLOS

glucovanillina se hidroliza dando glucosa y vanillina. El alcohol glucovaníllico se hidroliza dandoglucosa y alcohol vaníllico, el cual se transforma por oxidación en vanillina (aldehido vaníllico).

OOMe

O

glu gluO

OMe

OH

hidr.

OHOMe

OH

OHOMe

O

<O>

glucovanillina alcoholglucovaníllico

alcoholvaníllico

vanillina

hidrólisis

Los frutos de la vainilla son muy utilizados en confitería y perfumería, pero han sido parcialmentedesplazados por vainilla sintética. Sin embargo la esencia sintética no contiene el olor y el sabor delos frutos complejos. La vainilla es un componente clave de la receta secreta de la Coca-Cola.

SalicinaLas cortezas de sauce, especialmente de Salix fragilis y S. purpurea (Fam. Salicaceae) son unafuente de salicina (salicósido). Por maceración en agua caliente durante varias horas se extrae elglicósido junto a taninos. El extracto acuoso se filtra, se concentra al vacío y se trata, después, conacetato de plomo.Después de filtrar, se elimina el exceso de plomo por tratamiento con sulfuro de hidrógeno. Ellíquido filtrado, que carece ya de tanino, se neutraliza con amoníaco, se concentra y se deja enfriar,con lo que se separan cristales de salicina. Estos cristales pueden purificarse disolviéndolos denuevo, filtrando a través de carbón activado y recristalizando.

OH

O glu

OH

OH

OH

OH

O

hidrol. <O>

salicina alcohol salicíl ico ác. salicíl ico

Cápsico (Pimiento rojo, pimiento chile)La droga está constituida por los frutos desecados y maduros del Capsicum annum, var. minimum(Miller) Heiser y variedades de frutos pequeños de C. frutescens L. (Fam. Solanaceae). Loscápsicos parecen ser de origen americano, y fueron mencionados en el segundo viaje de Colón a lasIndias Occidentales.Los componentes picantes son la capsaicina y la 6,7-dihidrocapsaicina, así como en menorconcentración la nordihidrocapsaicina, la homocapsaicina (ácido C11) y la homodihidrocapsaicina.Los cápsicos se utilizan como condimento. La droga se administra internamente en la dispepsiaatónica y en la flatulencias. Externamente se usa como revulsivo en forma de pomada, emplasto,etc… para aliviar el reumatismo, lumbago, etc…

HOOMe

N (CH2)4CH=CHCH(CH3)2

O

Bálsamo de PerúSe obtiene del tronco de Myroxylon balsamum var. pereira, el cual crece en América Central (ElSalvador, Honduras, Guatemala). La droga exuda del tronco luego de golpearlo, de arrancar lacorteza y de chamuscarlos, y es de origen puramente patológico.El bálsamo de Perú, un líquido viscoso, pastoso y marrón, contiene 55%-66% de ésteres del ác.cinámico y benzoico, en especial cinamato de bencilo (cinameína), cinamato de cinamoilo(estiracina) y benzoato de bencilo, así como aprox. un 28% de resina y restos de ác. cinámico yvanillina libre, lo que le da su aroma característico.Usos: se emplea en cremas antisépticas, y también contra infecciones parasitarias de la piel.

Bálsamo de TolúEs un producto similar al del Bálsamo de Perú que se obtiene del tronco de Myroxylon balsamumvar balsamum, luego de realizarle incisiones en V en el tronco. La droga (bálsamo de Tolú,BP1980) es una pasta viscosa que lentamente solidifica, y que contiene un 80% de resina compuestapor ésteres de ác. cinámico y benzoico con alcoholes resínicas. El resto son ác. cinámico y ác.benzoico libre, y una pequeña cantidad de vanillina.Usos: es un componente de mezclas para combatir la tos, así como saborizante en dulces,especialidades farmacéuticas y perfumes.

CinamaldehidoEl cinamaldehido es el principal constituyente del aceite esencial de cinnamon, es decir de lacorteza de Cinnamonum zeylanicum, un pequeño árbol cultivado en Sri Lanka, India, IslasSeycheles y Brasil.La corteza se separa y se deja secar. Durante el secado ocurre un pequeño proceso de fermentación,el cual le da un color marrón a la droga. Por destilación con arrastre de vapor se obtiene un 0.5%-1.5% de aceite esencial, cuyo principal constituyente es el cinamaldehido (65%-75%).

FLAVONOIDES

Los flavonoides, que se encuentran tanto en estado libre como glicosidado, constituyen el grupomás amplio de los fenoles naturales. Son sustancias de origen vegetal y le dan los colores (rojos,azules, amarillo) a las flores y las hojas de otoño (del latín flavus, amarillo). Son abundantes en lasPolugonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbelliferae y Compositae.Los flavonoides se encuentran sobre todo en los órganos aéreos amarillos (hojas y botones florales)localizados en tejidos superficiales. Están disueltos como glicósidos en el jugo vacuolar,cloroplastos y membranas. La luz no es esencial para su formación, pero incluye cuantitativamente.La intensidad de color amarillo aumenta con el aumento de pH, es decir de ser incoloros o blancos apH ácido, pasan a ser fuertemente amarillos a pH básicos.El grupo de los flavonoides es conocido por sus efectos antiinflamatorios y antialérgicos, por suspropiedades antitrombóticas y vasoprotectoras, por la inhibición de la promoción de tumores ycomo protectores de la mucosa gástrica. Estos efectos se han atribuido a su influencia sobre elmetabolismo del ác. araquidónico. Los flavonoides también poseen actividad antioxidante,aplicaciones como colorantes naturales y poseen propiedades antibactarianas y antifúngicas. En losvegetales intervienen en los fenómenos de oxidación-reducción, protegen a otros pigmentos de laluz y de la radiación UV, presentan actividad fungicida y contra parásitos agresores, ayudan en lapolinización, ya que por sus colores atraen a los insectos junto con los aceites esenciales.EstructuraLa estructura general de los flavonoides comprende un anillo A, derivado de la cadena policetídica,un anillo B, derivado del ác. shikimico, tres átomos de carbono que unen los anillos A y B,correspondientes a la parte alquílica del fenilpropano. Por eso se los conoce como C6-C3-C6.La estructura puede conformar un heterociclo (γ−pironas) que son los más abundantes, o una cadenaabierta, las chalconas. Las polimerizaciones son frecuentes, y ocurren principalmente por uniones

C-C. El estado de oxidación del anillo central determina varios grupos estructurales, como se ve acontinuación en ambas tablas.

O

O

A

B

C C

B

AO

OOH

Flavonas Flavonoles

CA

O

O BC

B

AO

OIsoflavonas Flavanonas

O

OOH

A

B

C

OCH

O

Dihidroflavonoles Auronas

O

α

β

23

4

56

2'3'

4'

5'6'

Chalconas

La estructura base puede presentar hidroxilos, metoxilos, estar O-glicosidada o estar C-glicosidada.En general el anillo A presenta hidroxilos, y no metoxilos, los cuales se ubican mayormente en 7 yen 5. El anillo B en cambio presenta 1,2 o 3 hidroxilos o metoxilos, los cuales se ubican de lasiguiente manera: si hay un solo hidroxilo/metoxilo su ubica en la posición 4’, si hay doshidroxilos/metoxilos se ubican en las posiciones 3’ y 5’, y si hay tres hidroxilos/metoxilos se ubicanen las posiciones 3’, 4’ y 5’.

OA

B

C

3'4'

5'6'

2'1'1

2

345

6

78

Numeración general de flavonoides.Sitios de hidroxilación y metoxilación.

Todos los flavonoides se numeran en sentido horario, simplemente números en el anillo Ay C, ynúmeros con “prima” en el anillo B. La excepción son las auronas, donde la numeración se invierte.Los azúcares forman O-glicósidos en las posiciones 3, 7, 3’ y 4’, siendo los mas comunesdiglicósidos en 3 y 7 o en 7 y 4’. Ej: Negretina.

87

65 4

3

2

11'2'

6'5'

4 '3'

C

B

AO

sitios de O-glicosidación.Los O-glicósidos dan hidrólisis por tratamiento con ácidos. En cambio los C-glicósidos, menosabundantes, no son hidrolizados por tratamiento con ácidos. La C-glicosidación se presenta sobreC6 y C8. Ej. Vitexina (C-glucósido) y Negretina (O-glucósido).

C

HO

OH O

O

glucosil OH

OHO

OO

OMeOH

OMe

glu

gluO

rha O

O

OH

Los azúcares que podemos encontrar pueden ser mono-, di- y polisacáridos. Dentro de losmonosacáridos tenemos D-glucosa, D-galactosa, D-xylosa, L-rhamnosa, L-arabinosa y ác. D-glucurónico. Como ejemplos de disacáridos tenemos la Gentiobiosa (gluβ1->6glu) y la rutinosa (rhaα1 -> 6glu), y como ejemplos de trisacáridos tenemos la Gentiotriosa (glu β1 -> 6glu β1 -> 6glu) yla sorborosa (glu β1 -> 6glu α1 -> 4glu). Hay que resaltar que la unión de los azúcares es en general1,2 o 1,6, y son mayormente isómeros β . Además, la unión entre el azúcar y la genina es una uniónβ .

Biosíntesis de FlavonoidesLos flavonoides son biosintetizados por una combinación de ambas vias biosintéticas, la del ác.shikímico y la del malonil-CoA. El compuesto obtenido por la vía biosintética del ác. shikímico,p.ej. ác. cinámico, es luego utilizado como compuesto de partida para la vía del malonil-CoA, en lacual se le adicionan tres acetatos. Con la posterior ciclación se obtiene la estructura clásica de losflavonoides, en la cual el anillo A se formó por la vía del malonil-CoA, mientras que el anillo B seformó por la vía del ác. shikímico, y el puente de tres carbonos proviene de la adición defosfoenolpiruvato. Con sucesivas hidroxilaciones y reducciones se forman los diferentesflavonoides, con la opción de una glicosidación final.

BIOSINTESIS DE FLAVONOIDES

cinamatofenilalanina

O

O

COOH

NH2

H

PEP

chorismate

O

O

OH

O O

O

shikimato

OH

O O

HO

OH

R-CO-SCoA 3CH2CO-SCoA

COOHR

OOCOOH

acil-CoA malonil-CoA policétidos

O

HO 3 acetatosO O

OHOOC

OHHO

OH O

O

O

HO

OH

A

B

Aislamiento e Identificación de FlavonoidesEn las plantas los flavonoides están en general glicosidados, por lo tanto son altamente polares. Seubican preferentemente en las vacuolas y son hidrofilicos. Debido a eso hay que extraer ysolubilizarlos en solventes polares como ser agua, etanol. Las geninas en cambio son solubles enéter de petróleo, diclorometano, y no en agua.

Conviene usar la muestra previamente secada, así las enzimas no tienen actividad, evitando ladegradación de los compuestos. Asimismo conviene usar etanol y no agua, porque el etanol inactivalas enzimas (rompe la estructura 3aria) y además se puede eliminar más fácil.Para aislar los flavonoides del extracto etanólico tenemos 3 posibilidades, que pueden usarse porcombinación. Tradicionalmente se utilizaba la cristalización en medio ácido, redisolviéndolos luegoen medio básico. La precipitación con acetato de plomo fue muy utilizada, ya que precipitan los di-y polihidroxifenoles de los monohidroxilados, que quedan en solución. Para recuperar losflavonoides precipitados se trata el precipitado con ác. sulfhídrico o con ác. Sulfúrico, liberando losflavonoides y precipitando entonces sulfuro de plomo o sulfato de plomo. Conviene usar sulfatos yno sulfuros, ya que el sulfuro de plomo tiene un gran poder de adsorción, y eso no es conveniente.El PVP es muy útil porque causa una buena precipitación de compuestos fenólicos hidroxilados apH ácido en metanol. Se hace reversible por cambio de pH. En el caso del carbón activado, ésteactúa adsorbiendo los compuestos. Se filtra y para poder liberarlos se pone en contacto con unasolución fenólica en agua. El fenol libera los flavonoides por competencia.Actualmente en la separación y purificación se emplean columnas de resina de intercambio iónicoácidas (fase H+) que separa a los flavonoides del material soluble. El fraccionamiento se puedelograr por cromatografía de adsorción usando como fase estacionaria sílica gel, celulosa, poliamida,alúmina y Sephadex (polímeros de dextranos, forman poros y separan por tamaño). Jugando con lapolaridad de los solventes podemos hacer separaciones buenas. Primero con un solvente apolareluímos las geninas que están bastante metoxilados, luego aumentamos la polaridad de la fase móvil

Muestra frescao seca

EtOH, calor

Solución alcohólicadel glicósido

Lavado con éter

Fase etérea- clorofilas- carotenoides- flavonoides apolares

F. alcohólica- glicósidos

Separación ypurificación

Cromatografía* Columna con:Sílica, alúmina, celulosa,poliamida, resinas de II* HPLC* TLC, GC (no prep.)- DCCC

Precipitación con* Pb(Ac)2, redisolución con H2So H2SO4.* C activ., redisolución con solnfenólicas acuosas* PVP, pptan en medio H+/H2Oy son solubles en medio básico

Cristalización* Pptan en medio ácido, sonsolubles en medio básico

pudiendo eluir compuestos polihidroxilados y finalmente con solventes muy polares eluímos losglicósidos. El problema es que quedan retenidas muchas cosas.En los últimos años se han desarrollado varias técnicas cromatográficas nuevas, entre ellas PHLC(High Performance Liquid Chromatography, Cromatografía líquida de alta presión) y DCCC(Droplet Counter Current Chromatography, cromatografía contracorriente a la gota). Para HPLCpreparativa (es decir separar grandes cantidades) se utiliza en general una columna de fase reversaODS C-18 (OctaDodecilSilano). La separación se basa en interacciones hidrofóbicas y no necesitaderivados, tiene alto poder de resolución y necesita un detector UV. Se usan solventes polares comoser mezclas de agua metanol y/o acetonitrilo.Para usar GC (gas chromatography) se requiere de compuestos termoestables, y en general esnecesario derivatizarlos con agentes sililantes a fin de aumentar su volatilidad. No se hace GCpreparativa, GC es con fines analíticos. Se puede acoplar la GC a la espectrometria de masas, dandoGC.MS. La fragmentación principal implica la escisión del anillo.

Determinación de la estructuraSi tenemos un glicósido debemos identificar la genina y también los azúcares. Para eso se hidrolizael glicósido, pudiendo previamente metilar los hidroxilos libres. Los azúcares los identificamos porTLC y por RMN, y la genina la podemos identificar por RMN y por espectrofotometría UV-VIS.Antiguamente la genina se identificaba usando una “batería” de reacciones (hidrólisis, etc...).Espectrofotometría UVEs ampliamente usado por requerir solo pequeñas cantidades del compuesto puro, el cual no sedestruye, al igual que para el NMR. El espectro UV de un flavonoide se relaciona con su estructurade la siguiente manera:

B

A

8

5

7

64

3

2

O

O

200 500

II benzoico I cinamoilo Banda II Banda I

En general : Banda I 300 - 400 nmBanda II 240 - 285 nm

Flavona y Flavonol Banda I 320-350 nm, intensaIsoflavona Banda I, hombro, banda II 245-270 nm, intensaFlavanona y Dihidroflavonol Banda I, hombro, banda II 270-295 nm, intensaChalcona Banda I 340-380 nm, intensaAurona Banda I 370-430 nm, intensaAntocianinas Banda I 480-550 nm, intensaEl espectro en metanol de los flavonoides da información sobre el tipo de flavonoide y el estado deoxidacion. El máximo de absorción de los flavonoides varía de acuerdo al estado de oxidación delanillo central y según el número y posición de los grupos OR, como resultado de los diferentessistemas conjugados. El empleo de reactivos de desplazamientos como etóxido de sodio, cloruroférrico, acetato de sodio y ác. bórico produce corrimientos de los máximos de absorción de acuerdoa la localización y naturaleza de las funciones oxigenadas.

1er corrimientoMeOHMeOH + NaMeOH

Obtengo el espectro del flavonoide en metanol entre 200 a 500 nm. Luego agrego en la mismacubeta metóxido de sodio y obtengo un nuevo espectro. El metóxido de sodio es una base fuerte yarranca todos los protones de los hidroxilos libres causando un desplazamiento batocrómico (alongitudes de onda mayores) en ambas bandas. Este es mayor en la medida que aumenta laconjugación a través del sistema enona.2do corriemientoMeOH + AlCl3MeOH + AlCl3 + HClSe obtiene primero el espectro en metanol, luego en metanol con tricloruro de aluminio, yfinalmente en metanol con tricloruro de aluminio con ác. clorhídrico. El corrimiento se basa en laformación de quelatos entre el AlCl3 y dos grupos hidroxilos en posición orto, así como con elcarbonilo en C4 y un hidroxilo libre en C5 o en C3. El quelato con los hidroxilos en orto en el anilloB no es estable en medio ácido.Si los espectros realizados en MeOH + AlCl3 y en MeOH + AlCl3 + HCl coinciden, no tenemoshidroxilos en el anillo B.Si el espectro de MeOH no cambia con el agregado de MeOH + AlCl3 + HCl, no hay hidroxilos en3 ni en 5. Si el espectro cambia mostrando un efecto batocrómico, efectivamente tenemos unhidroxilo libre en 3 y/o en 5.3er corrimientoMeOH + AcONaMeOH + AcONa + H3BO3El acetato de sodio es una base débil. Se usa para detectar específicamente el hidroxilo en 7,observándose un efecto batocrómico importante en la banda II. Además también puededesprotonarse el protón en 3 y en 4’, dando los corrimientos batocrómicos correspondientes en labanda I.Al agregar H3BO3 a la cubeta, se puede observar un efecto batocrómico de la banda I si el anillo Bcontiene β dihidróxidos. Esto se debe a que el ácido bórico en presencia de acetato de sodio formaun complejo con β dihidróxidos, es decir forma diesteres con hidroxilos en orto, en gral condihiróxidos del anillo B. Además el ác. bórico puede protonar al OH en 7 y restablecer la banda IIPodemos resumir el uso de reactivos de desplazamiento en la siguiente tabla:

Variación en la absorción UV-VIS de los flavonoides (nm)Esqueleto MeOH NaOH NaOAc AlCl3Flavonas 315-350 40-60 --- 25-40Flavonoles 350-385 40-60 --- 40-60Flavanonas 275-295 30-40 30-40 20-30Isoflavonas 250-270 10-15 5-15 10-20Chalconas 370-395 40-60 --- 50-65Auronas 385-415 40-60 --- 50-65Antocianinas 475-545 Inest. Inest. 15-50

Analicemos cada grupo ahora por separado.1) Chalconas y AuronasLas chalconas se encuentran solamente en algunas familias botánicas. Estructuralmente sonisómeros de las flavanonas por apertura del núcleo central o piranósico. Cabe mencionar elglucósido de la floretina :

florizina, ampliamente distribuído en la corteza de losfrutos de varias Rosáceas. Produce la “diabetes de lafloretina” que se caracteriza por un aumento de laglucosuria, es decir la excresión urinaria de glucosa,causada por interferencia en la reabsorción de la glucosapor los túbulos renales.

HO

OR

OH

O

OH

2) Flavonas y FlavonolesAmbos son los flavonoides naturales más abundantes. Se han aislado tanto libres como glicósidos.Los compuestos más frecuentes son la apigenina, la quercitina (de mayor abundancia) y el kanferol.

R1 R2 R1 R2H H apigenina H OH quercitinaH OH luteolina OH rutinaapiosil-glu H apiína H H kanferol

3) AntocianinasConstituyen los pigmentos principales de las flores y de las hojas de otoño, sus colores van desde elrojo hasta el azul. Son glicósidos de polihidroxiflavilio, en los cuales la unión glicosídica estáprincipalmente en C3. Veamos algunos ejemplos :

aglicona R R1 R2 R3 R4 R5apigenidina H OH OH OH H Hpeonidina OH OH OH OH OMe Hrosinidina OH OH OMe OH OMe Hcianidina OH OH OH OH OH Hmalvidina OH OH OH OH OMe OMehirsutidina OH OH OMe OH OMe Ome

Las antocianinas de las flores se han señalado como mercadores genéticos y por ello son utilizadosen la manipulación genética para obtener nuevas variedades de petunias, rododendros, camelias,etc... Se ha encontrado que la deficiencia de fósforo en el suelo, la baja temperatura (de 0º a 5º) y laexposición a ozono, aumentan el contenido de antocianinas.

OH

OR1O

OH

O

R2

OH

OHO

OH

O

OR1

R2

R4R2

R1

R

O

R5

R3

Debido a las resticciones sanitarias hacia el uso de colorantes sintéticos, las antocianinas presentaninterés comercial pra la industris alimentaria. Las antocianinas presentan isomerización por cambiosde pH, variando su color y estructura del anillo central.

Los pigmentos vegetales se pueden clasificar en cuatro grandes grupos, dos liposolubles : clorofilasy carotenoides, y dos hidrosolubles : las betalaínas y los flavonoides, los cuales se encuentranprincipalmente en flores y frutos. La coloración de las antocianinas varía con el cambio de pH, derojo en medio ácido, pasando por amarillo, a violeta y azul en medio alcalino.Se ha propuesto que el mecanismo de agrupación procede :1. Mediante puentes de hidrógeno.Esto no es tan importante, ya que las antocianinas completamente metiladas producen las mismascoloraciones que las no metiladas.2. Mediante interacción entre anillos bencénicos.La interacción puede deberse al fenómeno de copigmentación intermolecular, es decir involucra unmezcla de flavonoides. Estos complejos se estabilizan por la presencia de metales bivalentes, asícomo por la sustitución con el ác. cumárico y por la glicosidación, lo que estabiliza el pigmentofrente a la acción enzimática y a la luz. Puede haber copigmentación intramolecular, en cuyo caso launión tiene lugar entre dos unidades de éster del tipo cinamoílo, que se presentan comosustituyentes de la porción del azúcar. En este caso la adición de metales bivalentes no incrementala estabilidad del color. La copigmentación intramolecular produce un desplazamiento batocrómico.

4) Flavanonas y FlavanonolesLa saturación del anillo heterocíclico crea en la molécula al menos dos centros quirales C2 y C3 yun tercero : C4 en el caso de los flavanodioles. Las flavanonas de origen natural presentan casisiempre la configuración 2S, que dispone el anillo B ecuatorial. Pueden presentarse como O- y C-glicósidos (hesperidina y aervanona), también pueden tener O- y C-metilaciones o alquilacionessuperiores (prenilaciones). Las agliconas más representativas son hesperetina y naringenina.

HO

OR

OR

O

OH

HO

OR

OR

OR

HO

OR

OR

OR

HO

OR

OR

OH

OOH

HO

OR

OR

OH

O

OH

sal de flavilio (rojo) cromenol (pseudobase) (incoloro)

chalcona (amarillo)

OO

OH

OR

OR

OHO

OR

OR

O

anhidrobases (azules)

R=H: naringenina R=H: hesperetina RutinósiloR=rutinósilo: Narirutina R=rutinósilo:hesperidina (6-[β-L-rham]-D-glu)

Los flavanonoles, llamados también 3-hidroxiflavanonas o dihidroflavonoles, presentan doscarbonos asimétricos : 2 y 3. La mayoría tiene configuración 2R :3R. Los compuestos incluyenpolioxigenaciones en los anillos A y B, glicosidación, prenilación, y también algunas estructurascíclicas como en el caso del flavolignano silycristina (de Silybum marianum, Compuesta).

silvlycristina sophoronol

R1 R2 SustanciaH H Taxifolina

Me H HulteninaGlu H GlucodistylinaH Me Cederodarina

Algunas flavanonas y flavanonoles inhiben el crecimiento larval de Heliothis zea, una plaga delmaíz, entre ellos el eriodictiol, la taxifolina (dihidroquercetina) y su 3-0-ramnósido.5) FlavanolesEl esqueleto del flavano puede estar mono- o dihidroxilado formando los flavan-3,4-dioles, flavan-4-oles y flavan-3-oles, o catequinas.

R C-2 C-3 C-4H R S R MollisacacidinaH S R S Leucofisetidina

OH R R R MelacacidinaOH R R S isomelacacidina

Los flavan-3,4-dioles pueden ser facilmente convertidos en antocianinas por tratamiento con ácidomineral, lo que provoca la deshidratación seguida de oxidación, por el oxígeno del aire, originandola sal de flavilio. Por esta razón se conocen estos flavonoides como leucoantonianidinas.Las catequinas o flavan-3-oles son las unidades monoméricas de los flavonoides condensados :taninos.ISOFLAVONOIDES

Están distribuidos en pocas familias, principalmente en las Leguminosas. Estructuralmente se lospuede dividir en varias clases, correspondientes éstas a los flavonoides respectivos : isoflavonas,isoflavonoles, etc... Para su análisis también son de capital importancia la espectrofotometría UV yla RMN.1) IsoflavonasDentro de los isoflavonoides son las más abundantes. La O-glicosidación es más frecuente que la C-glicosidación. Las cuatro agliconas más comunes son:

O

OOH

RO

OH

2sORO

OH

OMe

OH

O

HO

HO OMe

OH

OO

HOOH

OOH

OHO

OH OOH

OOH OH

OMe

CH2OHH O

O

HO

OH O

OMeOH

O

OOR1

OHR2

HO

OH

OH

OR

HO

OHOH

OH

OH

R

R1 R2 X

H OH OH H DaizdeínaH OH OMe H FormononetinaOH OH OH H GenisteínaOH OH OMe H Biochanina-AOH OH OH Me2C=CH-CH2 wighteona

Las alquilaciones pueden presentarse sobre C2, tal es el caso de la 7-hidroxi-2-metilisoflavona quese encuentra en la raíz de regaliz (Glycyrrhiza glabra).

2) IsoflavanonasSon mucho más escasas que las anteriores y contienen generalmente una o más unidades de prenilo.Como ejemplo podemos mencionar al lespedeol presente en Neurautanenia amboensis, que estápresente en el vegetal junto al 4-isoflavanol correspondiente ambanol.

3) RotenoidesSon una clase de isoflavonoides que contienen un anillo heterocíclico adicional en su estructura. Seencuentran preferencialmente en las Leguminosas.

Como ya mencionamos, Derris ellíptica (Leguminosa) rica en rotenona, es utilizada como venenotemporal en las aguas de ríos del amazonas para facilitar la pesca.

Rotenona (rotenoide) Rotenonona (deshidrorotenoide)Derris negrensis, D. elliptica Neorautanenia amboensis

O O

OH

OH

OOH

OR1

XR O

R2

OO

O

A C B

A1

23

4

567

89

1011 12

oo

oH

O

OM e

OM e

H

H

E

D C B

A

5'

O OO

O

O

OMeO

EJEMPLOS DE PLANTAS

Ginkgo bilobaCon excepción de Ginkgo biloba L, las plantas del orden Ginkgoaceae solo se encuentran al estadode fósiles, originarios del terciario. El árbol, de más de 30 metros de altura, produce maderautilizable y semillas comestibles que contienen aceite. Se cultiva en Corea, sureste de Francia yUSA para abastecer el mercado farmacéutico de hojas.Se ha demostrado que los principios activos amargos (ginkgólidos) son potentes antagonistasespecíficos del PAF (Factor Activador de Plaquetas), así como vasodilatadores arteriales yvasoconstrictores venosos, es decir con posible acción terapéutica en la inflamación alérgica ohiperactividad bronquial. El extracto también mejora la irrigación de los tejidos, activa elmetabolismo celular, en particular en la corteza cerebral, incrementando la absorción de glucosa yde oxigeno.Las hojas de Ginkgo biloba contienen aprox un 0.5%-1% de flavonoides totales, comprendiendouna mezcla de aprox 20 compuestos. Entre ellos quercetina, kaempferol, isorhamnetina, susglicósidos, biflavonoides (bilobetin, ginkgetina, isoginkgetina, etc...), y 0.01%-0.04% gingkgólidosA, B, C (diterpenos), ác. ginkgólico, ác. shikímico, ác. vaníllico, ác. chlorogénico, catequinas,sesquiterpenos (bilobalida), etc...

HO

(CH2)7 CH=CH (CH2)5 CH3

ginkgol

OHO

OH O

OCH3

OHO

OH O

OCH3

bilobetin

Usos: El extracto de las hojas de Ginkgo biloba que contiene por valoración un 24% de flavonoidesy un 6% de ginkgolidos, es indicado para el tratamiento de oclusiones arteriales, para la enfermedadde Raynaud, así como en la insuficiencia señil cerebral y pérdida auditiva por origen isquémico.Otras formulaciones y combinacines, p.ej. con heptaminol y trihidroxyethylrutina, son indicadaspara tratar síntomas relacionados con insuficiencia venosa y linfática.

Passiflora incarnataLa planta de Passiflora incarnata L. (flor de la pasión o passiflora), Passifloraceae, crece en formade arbustos en el sur de USA y en México. La droga incluye partes aereas secas conteniendopedazos de troncos, zarcillos, hojas y flores. La hoja tiene un pecíolo largo y es trilobulada, siendoel lóbulo medio el más desarrollado. La droga puede verse adulterada con troncos y hojas de P.edulis Sim., cuya fruta es comestible (la fruta de la pasión), y cuya hoja es dentada. Otro adulterantelo presenta P. caerules L., cuyas hojas son pentalobuladas y que se cultiva por sus flores azulesornamentales.La droga contiene ác. Fenólicos, coumarinas, fitosteroles, 0.1% de aceite esencial, glicósidoscianogenéticos, 0.05% maltol, menos de 0.03% de alcaloides indólicos y varios flavonoides. Loscompuestos mayoritarios son flavon-di-C-glicósidos, shaftósido e inoshaftósido, y 2’’glicósidos deisovitexina e iso-orientina.

R1 R2 R3 R4

Vitexin H H glc HIsovitexin glc H H HOrientin H H glc OHIso-orientin glc H H OHShaftoside glc H ara HIsoshaftoside ara H glc H

El estudio del contenido de glicósidos flavónicos totales del extracto metanólico por TLC permiteidentificar las especies oficiales y rechazar las no oficiales. La farmacopea francesa (10ª edición)exige un contenido mayor o igual al 1.5% de flavonoides totales, expresados como vitexina,midiendo la absorción luego de formar el complejo con AlCl3.Usos: en preparaciones galénicas y en fitofarmacéuticos para controlar anormalidades del ritmocardíaco, así como sedante.

CitroflavonoidsCitrus (Rosaceae) son árboles de origen oriental, de los que se cultivan muchas especies paraconsumir los frutos, y tambien para obtener los aceites esenciales, así como fuentes de pectinas yflanonoides. Estos abundan en el pericarpio principalmente como glicósidos (hesperidina ohesperetin-7-O-rutinósido, neohesperidina, naringenina, eriodyctina, eriocitrina) y flavoneglycosidos (diosmina, rutina).

Usos: se utilizan puros (diosmina), en extractos o en combinaciones (con p.ej. ác. Ascórbico, rutina,papaverina, etc...) en preparaciones farmacéuticas para tratar insuficiencia venosa crónica y

O

OOHR1

R2OR3

R4OH

ORO

OH

OMe

OH

O

Hesperetina7-Rutinosil: Hesperidina

funcional, y para tratar dolores de piernas y calambres. La administracions de una dosis de (1 g/día)por un período de tiempo mediano (8 semanas) hace disminuir e incluso desaparecer los síntomas.La eficacia del tratamiento es significativamente mayor a la del placebo, pero en éste tipo depatologías el 50% de los pacientes siente alivio solamente con el placebo...y por adoptar normashigiénicas generales.