REVISÃO DO ORIGINAL EM INGLÊS – SUZANA GONTIJO

AO-5665_VERSÃO EM INGLÊS_PREPRINT FRAN

Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response of

male rat offspring

Diferenças na ingestão de ferro durante a gravidez influenciam na resposta à

treinabilidade da prole de ratos machos

Short title: Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response

of male rat offspring

Beatriz da Silva Franco1 , Lucca Antonio Rodrigues Cavallaro2, Diego Silva Mota2,

Natália de Almeida Rodrigues2, Fúlvia de Barros Manchado-Gobatto1,2,Rosângela Maria

Neves Bezerra2, Andrea Maculano Esteves1,2

1 Faculdade de Educação Física, Universidade Estadual de Campinas,Campinas, SP,

Brazil.

2 Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas, Limeira, SP,

Brazil.

DOI: 10.31744/einstein_journal/****AO5665

How to cite this article:

Franco BS, Cavallaro LA, Mota DS, Rodrigues NA, Manchado-Gobatto FB, Bezerra RM,

et al. Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response of male

rat offspring. einstein (São Paulo). XXX;XX:eAO5665.

http://dx.doi.org/10.31744/einstein_journal/ XXXX AO5665

Corresponding author:

Andrea Maculano Esteves

Rua Pedro Zaccaria, 1,300 – Jardim Paulista

Zip code: 13484-350 – Limeira, SP, Brazil

Phone: (19) 3701-6730

E-mail: andrea.esteves@fca.unicamp.br

Received on:

Mar 11, 2020

Accepted on:

**** ***, ****

Conflict of interest:

none.

ABSTRACT

Objective: To evaluate if different concentrations of iron in diets during pregnancy would

interfere in the aerobic and anaerobic performance of the offspring, observed during 8-

week swimming training and measured by lactate minimum test. Methods: Pregnant rats

were divided into 4 groups with different dietary iron concentrations: standard (40 mg/kg),

supplementation (100 mg/kg), restriction since weaning, and restriction only during

pregnancy (4 mg/kg). After birth, the offspring were assigned to their respective Groups

(Standard Offspring, Supplementation Offspring, Restriction Offspring or Restriction

Offspring 2). The lactate minimum test was performed at 3 time points: before starting

exercise training, after 4 weeks and after 8 weeks of exercise training. Results: The

results showed the Restriction Offspring Group had a significant reduction in the

concentration of lactate minimum and in swimming time to exhaustion, after 4 and 8

weeks of training as compared to before training. Therefore, the results showed the

Restriction Offspring Group was not able to maintain regularity during training in lactate

minimum tests. Conclusion: In this context, the results suggested the Restriction

Offspring Group showed a marked decrease in its performance parameters, which may

have occurred due to iron restriction.

Keywords: Lactate minimum; Animal model; Iron supplementation; Iron restriction

RESUMO

Objetivo: Este estudo avaliou parâmetros aeróbicos e anaeróbicos da prole de ratas

alimentadas com diferentes dietas de ferro durante a prenhez, por meio do teste de

lactato mínimo. Métodos: As ratas prenhes foram divididas em 4 grupos com diferentes

concentrações de ferro na dieta: padrão (40 mg/kg), suplementação (100 mg/kg),

restrição desde o desmame e restrição apenas durante a gravidez (4 mg/kg). Após o

nascimento, os filhotes foram designados para seus respectivos Grupos (Prole Padrão,

Prole Suplementação, Prole Restrição ou Prole Restrição 2). O teste de lactato mínimo

foi realizado em três momentos: antes de iniciar o treinamento físico, após 4 semanas e

após 8 semanas de treinamento físico. Resultados: Os resultados mostraram que o

Grupo Prole Restrição apresentou uma redução significativa na concentração do lactato

mínimo e no tempo de natação até a exaustão, após 4 e 8 semanas de treinamento em

relação à antes do início do treinamento. Portanto, os resultados mostraram que o Grupo

Prole Restrição não foi capaz de manter regularidade durante o treinamento nos testes

de lactato mínimo. Conclusão: Nesse contexto, os resultados sugerem que o Grupo

Prole Restrição apresentou uma diminuição acentuada nos parâmetros de desempenho,

o que pode ter ocorrido devido à restrição de ferro.

Descritores: Lactato mínimo; Modelo animal; Suplementação de ferro; Restrição de

ferro

INTRODUCTION

Iron is the functional component of hemoglobin and myoglobin, and an essential nutrient

for the efficient transport of oxygen to body tissues. Iron also plays a key role in the

electron transport chain, in oxidative phosphorylation within the mitochondria, and red

blood cell production.(1)

Iron deficiency (ID) is a common micronutrient deficiency all over the world, and

may cause some symptoms, such as fatigue, exhaustion, heart palpitations, and pallor,

besides influencing body functions, such as physical performance, thermoregulation,

immune response, and neurological functions.(2,3)

The risk groups for ID include women during pregnancy and postpartum. Many

studies have shown that the consequences of ID during a development period, such as

gestation, can extend throughout adult life, even with iron replacement. These

consequences are behavioral, neuroanatomic, neurochemical, and neurophysiological. (4-

6) Iron supplementation seems to be adequate to prevent ID in 90% of women during

pregnancy and postpartum.(7)

Maternal intake during pregnancy can impact health and cause physical and

mental changes throughout the life of the offspring.(8,9) In addition, some habits developed

during life (such as diet and exercise) contribute to these changes.(10)

However, to date, little is known about the effect of this exposure of mothers to ID

or iron supplementation on the physical performance of offspring in adult life.

Some studies have shown that physical exercise can reduce iron-blood

concentration, including serum ferritin (sFer), hemoglobin and erythrocytes, and

increases the soluble transferrin receptor (sTfR), indicating impaired iron metabolism. (11-

13)

ID can attenuate aerobic performance, sincethere is a decrease in hemoglobin

levels, oxygen transport in skeletal muscle, maximal oxygen uptake, and ability to

withstand submaximal exertion. Moreover, ID negatively interferes in the activity of

oxidative enzymes and respiratory proteins. Iron status can affect endurance and energy

efficiency.(14-16) Thus, an individual who does not have adequate iron levels may show a

noticeable drop in his physical performance.(17)

Studies have shown an association between iron status and anaerobic

performance.(18,19) However, since anaerobic exercise does not require the availability of

oxygen, it is difficult to explain these relations. One hypothesis debated is that the

process of resynthesis of creatine phosphate (used as energy by the ATP-CP system) is

oxygen-dependent.(20)

One way to analyze aerobic and anaerobic parameters in just one assessment

session is by means of the lactate minimum test (LMT),(21) adopted for this purpose in

human(22) and animal models.(23)

OBJECTIVE

To evaluate if different concentrations of iron in diets during pregnancy would interfere in

the aerobic and anaerobic performances of the offspring, observed during 8-week

swimming training and measured by LMT.

METHODS

Animals

All procedures were approved by the Ethics Committee on the Use of Animals of the

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (number 3876-1). The experiment was

carried out in 2 moments (Figure 1): with the mothers; with the offspring.

PFeSt: pregnant with standard iron diet; PFeSu: pregnant with iron supplementation diet;PFeR1: pregnant with iron-

restricted diet since weaning - 21 days; PFeR2: pregnant with iron-restricted diet only in pregnancy; OFeSt: offspring of

mothers who received standard diet; OFeSu; offspring of mothers who received iron supplementation diet during

pregnancy;OFeR1 offspring of mothers who received iron-restricted diet since weaning; OFeR2: offspring of mothers

who received iron-restricted diet only in pregnancy.

Figure 1. Flowchart showing the groups and exercise

First moment: this experiment used 12 female and 3 male Wistar rats, aged 21

days and over, acquired from the Bioethics Center of Centro Multidisciplinar para

Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB), of

UNICAMP. Rats were kept transparent cages, four animals per cage, until induction of

pregnancy, under controlled conditions of 12-hour light-dark cycle (lights on at 6:00 a.m.),

at a temperature of 23±2°C, with unrestricted access to water and food.

For the induction of pregnancy, two females were placed with one male in each

cage. After pregnancy was identified, the mothers were housed in individual cages and

randomly distributed into the following groups:

- Pregnant with standard iron diet (PFeSt, n=3);

- Pregnant with iron supplementation diet (PFeSu, n=3);

- Pregnant with iron-restricted diet since weaning - 21 days (PFeR1, n=3);

- Pregnant with iron-restricted diet only in pregnancy (PFeR2, n=3).

The PFeSt Group remained on the standard Fe diet (40 mg/kg)(24) throughout the

experiment. The PFeR1 Group received the reduced Fe (4 mg/kg) diet until the offspring

was born. The PFeSu (100 mg/kg) and PFeR2 (4 mg/kg) groups received the standard

diet until the pregnancy was detected, and during the whole pregnancy period, they

received the supplementation and restriction diets, respectively. All diets were freely

available, and body weight was recorded weekly throughout the experiment. After birth

and until weaning the mothers received a standard iron diet (40 mg/kg). After 21 days of

lactation, the female offspring was separated from the male offspring.

Second moment: the male offspring were distributed into the groups according to

the diet ingested by the mother:

- Offspring of mothers who received a standard diet (OFeSt, n=6);

- Offspring of mothers who received iron supplementation diet during pregnancy

(OFeSu, n=8);

- Offspring of mothers who received iron-restricted diet since weaning (OFeR1,

n=8);

- Offspring of mothers who received iron-restricted diet only in pregnancy

(OFeR2, n=8).

The offspring was weighed at birth and, after weaning, all groups received

standard Fe diet. At 70 days of age, the offspring was submitted to procedures of

adaptation to a liquid medium progressively for 14 consecutive days. After adaptation,

they were evaluated by the LMT for individual determination of anaerobic threshold (AT)

and determination of the aerobic condition. The training was performed for 8 weeks, with

reevaluations after 4 and 8 weeks of exercise. After the last LMT, the animals were

submitted to euthanasia (Figure 1).

Experimental procedures

Iron diet

The diet used to feed the females was produced from purified ingredients, following the

composition of the AIN93-G formulations. The values presented in AIN93-G correspond

to the needs of the rodent diet in the growth, pregnancy and lactation stages. (25) The diets

for restriction (4 mg/kg) and supplementation (100 mg/kg) of iron were performed by

manipulating the mineral mix, according to the specific percentage for that condition,

adjusting the general composition of the mix by the vehicle (sucrose), not altering the

caloric density of the diet. The 40 mg/kg-diet was used for the Standard Mothers’ Group

[N.T. este grupo não tinha sido mencionado antes – seria o standard?] and Offspring

Groups.

Diet samples were sent to the Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP, to verify the

iron concentration of each specific diet (standard, restriction, and supplementation).

Exercise: the swimming training and the LMT were applied with controlled loads

always at the same time (6 p.m.). All procedures were performed in water maintained at

31 ± 1°C and individually, with swimming tanks divided by cylindrical 30-cm diameter

PVC tubes.

Adaptation to water: the animals were submitted to 14 sessions of adaptation to

water, being three sessions in water at 15 cm of depth. On subsequent days, 5 sessions

of adaptation to free swimming with 120 cm of depth, starting with 2 minutes of exercise

and increments of 2 minutes daily, until 10 minutes of effort were reached. Next, 6

specific sessions of adaptation were applied with the mouse swimming and carrying

different loads, in percentages of body weight, and time interval varying as a function of

the intensity applied. These were only aimed for adaptation to the liquid environment,

thermal stress, manipulation, and loads, which remained attached to the animal (back),

and were not designed to improve physical condition (training).

Lactate minimum test: for determination of aerobic and anaerobic parameters, the

LMT protocol described by de Araujo et al.,(26) was adopted, applied at three-time points

during the experimental period:

- Before the training program (animals approximately 84 days old), aiming to

identify the individual intensity of AT for training prescription (Test 1);

- After 4 weeks of training (animals approximately 112 days old), to follow the

aerobic and anaerobic evolutions and to adjust the training loads (Test 2);

- After 8 weeks of training (animals approximately 140 days old), to identify the

training effects on the aerobic and anaerobic parameters analyzed (Test 3).

For the LMT and during training, the loads were attached to the animal's back and

the percentage of load was calculated for the weight of each animal.

The LMT consisted of a phase of induction of hyperlactatemia, followed by the

protocol of incremental loads. The phase of hyperlactatemia was divided into three

consecutive parts: 30 seconds effort swimming (load of 13%); 30 seconds of rest

interval; and swimming time to exhaustion (TLim) (load of 13%). After the TLim, a

passive rest lasting 9 minute (to reach blood lactate peak). After 9 minutes, a protocol of

incremental loads was applied to determine the intensity at which the lowest lactatemia

was observed, representing the highest intensity of balance between the production and

removal of blood lactate. The incremental protocol was performed by swimming with

loads of 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, and 7% of the animal weight (lasting 5 minutes for

each load) or until exhaustion.

In this way, the lactate minimum concentration was used as an individualized

parameter of aerobic capacity and the time to exhaustion during the induction phase as

the anaerobic capacity parameter.

Blood samples were drawn from the tip of the animal tail (25 μL per collection)

through disposable capillary tubes calibrated with heparin.

Subsequently, the extracted blood was stored in Eppendorf tubes with an addition

of 50 μL of 1% sodium fluoride. Lactate concentrations were determined using the YSI-

2300 Yellow Spring lactometer, calibrated and operated according to the manufacturer's

specifications.

The value of the balance between production and lactate removal was used to

calculate the training load (80% of this value versus body weight). The loads were

adjusted weekly.

Training program: the individual intensity of exercise corresponded to the product

of body weight for 80% of the intensity obtained in the LM, with a volume of 60 minutes

per day of swimming, six times a week.(27) The loads added to the back were readjusted

according to the body mass weekly. Physical exercise was performed in the dark period

(corresponding to the daytime period of the rats).

Statistical analysis

The results were analyzed through the Statistica [N.T.] 7.0 software. The mean number

of animals per mother was analyzed by ANOVA one-way, followed by Tukey test post

hoc analysis. For analysis of the lactate minimum, TLim (of the LMT) and the weight of

offspring, the repeated measure ANOVA was applied, followed by Tukey test post hoc

analysis. The level of significance was set at p<0.05 and data were expressed as

mean±standard error.

RESULTS

The results did not present statistically significant differences for the mean number of

animals per mother (PFeSt: 7 animals, PFeSu: 10 animals, PFeR1: 7 animals, and

PFeR2: 9 animals). All groups of offspring had a similar pattern of body weight gain

throughout the experiment. All groups had a significant increase, relative to themselves,

as from 84 days of life.

The results presented here from the LMT are the TLim during the hyperlactatemia

phase and contraction of lactate at the moment of balance between production and

removal of lactate in the blood (lactate minimum).

The OFeR1 Group had a statistically significant reduction of TLim from tests 2 and

3 to test 1, as well as the OFeSu and OFeR2 Groups in test 3 to test 1 of the OFeR1

Group. In addition, a tendency (p=0.06) of limit time reduction was demonstrated for the

OFeSu Group in test 3 compared to the OFeSt Group in test 1. (Figure 2A).

Results showed that the OFeR1 Group had a statistically significant reduction of

lactate minimum value in tests 2 and 3 in relation to test 1 (Figure 2B).

mmol/L: lactate minimum concentration; OFeSt: offspring of mothers who received standard diet; OFeSu: offspring of

mothers who received iron supplementation diet during pregnancy; OFeR1: offspring of mothers who received iron-

restricted diet since weaning; OFeR2: offspring of mothers who received iron-restricted diet only in pregnancy.

Figure 2. Results of lactate minimum test. (A) swimming time to exhaustion seconds

obtained through the lactate minimum test at 3 time points: baseline (Test 1), after 4

weeks of training (Test 2) and after 8 weeks of training (Test 3). ANOVA repeated

measures, post Tukey test. Time [F(6.52) = 20,1922, p<0.00001] Group [F(6.52) =

1,7200, p<0.187469] interaction [F(6.52) = 2,2092, p=0.056] [N.T. favor verificar se é

ponto decimal mesmo, nestes números iluminados em amarelo] *differs from the OFeR1

Group at Test 1. Data were expressed as mean±standard error;(B) lactate minimum

concentration obtained through the lactate minimum test at 3 time points: baseline (Test

1), after 4 weeks of training (Test 2) and after 8 weeks of training (Test 3). ANOVA

repeated measures, post Tukey test. Time [F(6.52) = 8,627, p<0.001] group [F(6.52) =

0,889, p=0.459668] interaction [F(6.52) = 4,068, p<0.01]. *differs from the OFeR1 Group

at Test 1. Data were expressed as mean±standard error

No statistical differences were found between groups at the time of test 1. And the

other groups did not show significant alterations in the lactate minimum concentration

and TLim after tests 2 and 3 to test 1.

DISCUSSION

The use of animals in laboratory research helps to investigate stress conditions observed

in humans, and enables the monitoring of further changes arising, like iron restriction and

exercise.

The study evaluated if different concentrations of iron in diet during pregnancy

would interfere in the aerobic and anaerobic performance, measured through the LMT, of

rat offspring.

In LMT, our results showed a reduction in aerobic and anaerobic capacity in

OFeR1 Group over 8 weeks of training.

A possible hypothesis for these changes would be through epigenetics, when

there are modifications in the genome through chemical changes that occur in the DNA

molecule, which are caused by external factors, such as exercise, diet and stress, and

that can be inherited during cellular division.(28)

The literature has shown remarkable results of inheritable epigenetics in an animal

models. Some studies have shown that altering the mother's diet affects the metabolism,

gene expression of offspring and, consequently, generates metabolic disorders in adult

life.(29,30)

In the study, serum iron and/or gene expression was not performed, however, the

diet produced was analyzed; it was found that it presented the specific concentrations for

each group.

Even though there were no statistically significant differences in the mean number

of animals per mother, the mothers receiving a diet with supplementation had a higher

number of pups as compared to other groups. However, it was verified that the weight of

the animals throughout the experiment remained similar, not showing changes due to the

mother's diet.

The analyses performed for LMT demonstrated the OFeR1 Group showed a

significant decrease in lactate values in the first test. The mothers of the OFeR1 Group

offspring suffered iron restriction before and during pregnancy, demonstrating a possible

relation between diet, epigenetics, and aerobic capacity. However, the OFeR2 Group, in

which the mothers received the iron-restricted diet only during pregnancy, did not obtain

the same results, suggesting the duration of iron restriction intake influenced the

changes.

Studies have shown the reversibility of iron changes in the body depends on the

severity and duration of ID.(2,8,31) Also, a study conducted in 2000 with rats fed an iron-

deficient diet during pregnancy showed the brain iron levels returned to normal values in

2 weeks of standard iron diet.(21) Another study with ID during pregnancy showed that iron

and monoamine levels in offspring fed standard dietary after weaning were restored. (32)

However, further studies are warranted to understand the different consequences caused

by iron restriction for longer or shorter periods.

The literature demonstrates that one of the properties of iron is to be ergogenic,

that is, iron can help in the formation of hemoglobin and improve the transport of oxygen

in the blood and muscles, and also in the production of energy via oxidative

phosphorylation.(33) The OFeSt and OFeSu Groups did not show significant differences in

the values of the tests; therefore, they were able to maintain regularity in the results in all

tests of LMT, but without improvement. These results open a space for the hypothesis

that a regular iron diet or supplementation during pregnancy can enable the offspring to

maintain constancy in their aerobic capacity results, being able to present regularity in

their training.

The TLim was established to verify the anaerobic performance of the offspring, in

which the OFeR1 Group showed a significant decrease to itself when compared to the

first test. The iron restriction of this group did not allow them to progress or maintain their

performance throughout the tests. According to some studies, when hemoglobin and iron

are not at normal levels it can lead to a significant worsening of anaerobic performance.

(19,34) Our results showed a reduction in TLim of the OFeSu, OFeR2, and OFeR1 in test 3

compared to OFeR1 in test 1. However, the OFeSt, OFeSu and OFeR2 groups

maintained similar results throughout the experiment (test 1, test 2 and, test 3) to

themselves.

Research groups around the world are dedicated to understanding the effects of

epigenetic changes during pregnancy, and how the offspring's lifestyle habits can interact

with these changes. Studies have shown that iron restriction causes epigenetic changes

in the hippocampus of mice and mitochondrial proteins.(31,35) In this sense, we believe that

restriction and supplementation during pregnancy was sufficient to cause changes in iron

metabolism, due to the results demonstrated in the offspring.

CONCLUSION

In this context, these results obtained from swimming training of the animals showed that

the offspring of mothers who received an iron-restricted diet, before and during

pregnancy, showed a marked decrease in their aerobic capacity and anaerobic

metabolism indicator through lactate minimum test, while the other Groups (offspring of

mothers who received standard diet , offspring of mothers who received iron

supplementation diet during pregnancy and offspring of mothers who received iron-

restricted diet only in pregnancy) had no change in performance over the experiment.

However, further studies are required on the subject, since little is known about the

consequences of iron restriction on inheritable epigenetics about physical performance.

ACKNOWLEDGMENTS

The research was supported by the State of São Paulo Research Foundation (FAPESP)

(#2014-19212-0, #2017/11167-4) and the Coordination for the Improvement of Higher

Education Personnel - Brazil (CAPES) - Finance Code 001. The authors would like to

thank Leonardo Henrique Dalcheco Messias for collaborating in data collection.

AUTHORS’ INFORMATION

Franco B: http://orcid.org/0000-0003-2197-304X

Cavallaro LA: http://orcid.org/0000-0001-5378-4812

Mota DS: http://orcid.org/0000-0001-5487-4027

Rodrigues NA:http://orcid.org/0000-0003-4265-9586

Manchado-Gobatto FB:http://orcid.org/0000-0002-1178-570X

Bezerra RM: http://orcid.org/0000-0001-5089-651X

Esteves AM: http://orcid.org/0000-0003-2435-5335

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TRADUÇÃO PARA PORTUGUÊS – SUZANA GONTIJO

AO-5665_ _PREPRINT FRAN

Diferenças na ingestão de ferro durante a gravidez influenciam na resposta à

treinabilidade da prole de ratos machos

Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response of male rat

offspring

Título curto: Diferenças na ingestão de ferro durante a gravidez influenciam na resposta

à treinabilidade da prole de ratos

Beatriz da Silva Franco1 , Lucca Antonio Rodrigues Cavallaro2, Diego Silva Mota2,

Natália de Almeida Rodrigues2, Fúlvia Manchado-Gobatto1,2,Rosângela Maria Neves

Bezerra2, Andrea Maculano Esteves1,2

1 Faculdade de Educação Física, Universidade Estadual de Campinas,Campinas, SP,

Brasil.

2 Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas, Limeira, SP,

Brasil.

DOI: 10.31744/einstein_journal/****AO5665

Como citar o artigo:

Franco BS, Cavallaro LA, Mota DS, Rodrigues NA, Manchado-Gobatto F, Bezerra RM, et

al. Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response of male

rat offspring. einstein (São Paulo). XXX;XX:eAO5665.

http://dx.doi.org/10.31744/einstein_journal/ XXXX AO5665

Autor correspondente:

Andrea Maculano Esteves

Rua Pedro Zaccaria, 1,300 – Jardim Paulista

CEP: 13484-350 – Limeira, SP, Brasil

Tel.: (19) 3701-6730

E-mail: andrea.esteves@fca.unicamp.br

Data de submissão:

11/03/2020

Data de aceite:

**** ***, ****

Conflitos de interesse:

Não há.

ABSTRACT

Objective: To evaluate if different concentrations of iron in diets during pregnancy would

interfere in the aerobic and anaerobic performance of the offspring, observed during 8-

week swimming training and measured by lactate minimum test. Methods: Pregnant rats

were divided into 4 groups with different dietary iron concentrations: standard (40 mg/kg),

supplementation (100 mg/kg), restriction since weaning, and restriction only during

pregnancy (4 mg/kg). After birth, the offspring were assigned to their respective Groups

(Standard Offspring, Supplementation Offspring, Restriction Offspring or Restriction

Offspring 2). The lactate minimum test was performed at 3 time points: before starting

exercise training, after 4 weeks and after 8 weeks of exercise training. Results: The

results showed the Restriction Offspring Group had a significant reduction in the

concentration of lactate minimum and in swimming time to exhaustion, after 4 and 8

weeks of training as compared to before training. Therefore, the results showed the

Restriction Offspring Group was not able to maintain regularity during training in lactate

minimum tests. Conclusion: In this context, the results suggested the Restriction

Offspring Group showed a marked decrease in its performance parameters, which may

have occurred due to iron restriction.

Keywords: Lactate minimum; Animal model; Iron supplementation; Iron restriction

RESUMO

Objetivo: Este estudo avaliou parâmetros aeróbicos e anaeróbicos da prole de ratas

alimentadas com diferentes dietas de ferro durante a prenhez, por meio do teste de

lactato mínimo. Métodos: As ratas prenhes foram divididas em 4 grupos com diferentes

concentrações de ferro na dieta: padrão (40 mg/kg), suplementação (100 mg/kg),

restrição desde o desmame e restrição apenas durante a gravidez (4 mg/kg). Após o

nascimento, os filhotes foram designados para seus respectivos Grupos (Prole Padrão,

Prole Suplementação, Prole Restrição ou Prole Restrição 2). O teste de lactato mínimo

foi realizado em três momentos: antes de iniciar o treinamento físico, após 4 semanas e

após 8 semanas de treinamento físico. Resultados: Os resultados mostraram que o

Grupo Prole Restrição apresentou uma redução significativa na concentração do lactato

mínimo e no tempo de natação até a exaustão, após 4 e 8 semanas de treinamento em

relação à antes do início do treinamento. Portanto, os resultados mostraram que o Grupo

Prole Restrição não foi capaz de manter regularidade durante o treinamento nos testes

de lactato mínimo. Conclusão: Nesse contexto, os resultados sugerem que o Grupo

Prole Restrição apresentou uma diminuição acentuada nos parâmetros de desempenho,

o que pode ter ocorrido devido à restrição de ferro.

Descritores: Lactato mínimo; Modelo animal; Suplementação de ferro; Restrição de

ferro.

INTRODUÇÃO

O ferro é o componente funcional da hemoglobina e da mioglobina, sendo um nutriente

essencial para o transporte eficiente de oxigênio aos tecidos do organismo. Além disso,

o ferro desempenha um papel fundamental na cadeia de transporte de elétrons, na

fosforilação oxidativa dentro da mitocôndria, e na produção de glóbulos vermelhos.(1)

A deficiência de ferro (DFe) é uma deficiência de micronutrientes comum no

mundo todo, e pode causar alguns sintomas como fadiga, exaustão, palpitações e

palidez, além de afetar funções orgânicas, como desempenho físico, termorregulação,

resposta imune e funções neurológicas.(2,3)

Os grupos de risco para DFe incluem mulheres durante a gravidez e no pós-parto.

Muitos estudos mostraram que as consequências da DFe ocorrida durante um período

de desenvolvimento, como a gestação, podem se prolongar ao longo da vida adulta,

mesmo com reposição de ferro. Tais consequências são comportamentais,

neuroanatômicas, neuroquímicas e neurofisiológicas.(4-6) A suplementação de ferro

parece ser adequada para prevenir DFe em 90% das mulheres durante a gravidez e no

pós-parto.(7)

A ingestão materna durante a gravidez pode impactar na saúde e causar

alterações físicas e mentais ao longo da vida da prole.(8,9) Além disso, há hábitos

mantidos ao longo da vida (como alimentação e exercícios) que contribuem para essas

alterações.(10)

Porém, até o momento, pouco se sabe sobre o efeito da exposição da mãe a DFe

ou suplementação de ferro sobre o desempenho físico da prole na vida adulta.

Alguns estudos mostraram que o exercício físico pode reduzir a concentração de

ferro no sangue, incluindo ferritina sérica (sFer), hemoglobina e eritrócitos, e aumentar a

concentração do receptor de transferrina solúvel (sTfR), indicando a presença de um

metabolismo de ferro prejudicado. (11-13)

A DFe pode atenuar o desempenho aeróbio, pois há uma diminuição em níveis de

hemoglobina, transporte de oxigênio no músculo esquelético, o consumo máximo de

oxigênio e a capacidade de suportar esforços submáximos. Ainda, a DFe interfere de

forma negativa na atividade de enzimas oxidativas e proteínas respiratórias. Os níveis

de ferro podem afetar a resistência e a eficiência energética.(14-16) Portanto, um indivíduo

que não apresenta níveis adequados de ferro pode apresentar queda perceptível em seu

desempenho físico.(17)

Há estudos que mostram uma associação entre os níveis de ferro e o

desempenho anaeróbio.(18,19) No entanto, como o exercício anaeróbio não requer a

disponibilidade de oxigênio, é difícil explicar essas relações. Uma hipótese debatida é a

de que o processo de ressíntese do fosfato de creatina (usado como energia pelo

sistema ATP-CP) é dependente de oxigênio.(20)

Uma forma de analisar os parâmetros aeróbios e anaeróbios em apenas uma

sessão de avaliação é por meio do teste de lactato mínimo (TLM), (21) adotado para esse

fim em humanos(22) e em modelos animais.(23)

OBJETIVO

Avaliar se diferentes concentrações de ferro na dieta durante a gestação afetariam o

desempenho aeróbio e anaeróbio da prole, observado durante 8 semanas de

treinamento de natação e medido por meio do TLM.

MÉTODOS

Animais

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (nº 3876-1). O experimento foi

realizado em 2 momentos (Figura 1): com as mães; com a prole.

PFeSt: Prenhes com dieta padrão de ferro; PFeSu: prenhes com dieta de suplementação de ferro; PFeR1: prenhes

com dieta com restrição de ferro desde o desmame - 21 dias; PFeR2: prenhes com dieta restrita em ferro apenas na

prenhez; OFeSt: prole de mães que receberam dieta padrão; OFeSu; prole de mães que receberam dieta de

suplementação de ferro durante a prenhez; OFeR1 prole de de mães que receberam dieta com restrição de ferro

desde o desmame; OFeR2: prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro apenas na prenhez.

Figura 1. Fluxograma mostrando os grupos e exercícios

TRADUÇÃO DA FIGURA

1º momento

Prenhez

PFeS / PFeSu / PFeR1 / PFeR2

2º momento

Nascimento da prole

OFeS / OFeSu / OFeR1 / OFeR2

Adatação à água 14 dias

Teste mínimo de lactato (Teste 1)

Treinamento físico 4 semanas

Teste mínimo de lactato (Teste 2)

Treinamento físico 4 semanas

Teste mínimo de lactato (Teste 3)

Eutanásia

[vertical] PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Primeiro momento: este experimento utilizou ratos Wistar - 12 fêmeas e 3

machos, com pelo menos 21 dias de idade, adquiridos no centro de bioética do Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de

Laboratório (CEMIB) da UNICAMP. Os ratos foram mantidos em gaiolas transparentes,

quatro animais por gaiola, até a indução da prenhez, sob condições controladas de ciclo

claro-escuro de 12 horas (luzes acesas às 6:00 hs), a uma temperatura de 23±2°C, com

acesso irrestrito a água e comida.

Para a indução da prenhez, duas fêmeas foram colocadas com um macho em

cada gaiola. Após a identificação da prenhez, as mães foram alojadas em gaiolas

individuais e distribuídas aleatoriamente nos seguintes grupos:

- Prenhes com dieta padrão de ferro (PFeSt, n=3);

- Prenhes com dieta de suplementação de ferro (PFeSu, n=3);

- Prenhes com dieta com restrição de ferro desde o desmame – 21 dias (PFeR1,

n=3);

- Prenhes com dieta restrita em ferro apenas na prenhez (PFeR2, n=3).

O grupo PFeSt manteve a dieta padrão com Fe (40 mg/kg)(24) durante todo o

experimento. O Grupo PFeR1 recebeu dieta com redução de Fe (4 mg/kg) até o

nascimento da prole. Os grupos PFeSu (100 mg/kg) e PFeR2 (4 mg/kg) receberam a

dieta padrão até a detecção da prenhez, e durante todo o período gestacional

receberam as dietas de suplementação e restrição, respectivamente. Todas as dietas

estavam disponíveis livremente e o peso corporal foi registrado a cada semana durante

o experimento. Após o nascimento e até o desmame, as mães receberam uma dieta

padrão de ferro (40 mg/kg). Após 21 dias de lactação, a prole feminina foi separada da

prole masculina.

Segundo momento: os filhotes machos foram distribuídos nos grupos de acordo

com a dieta ingerida pela mãe:

- Prole de mães que receberam dieta padrão (OFeSt, n=6);

- Prole de mães que receberam dieta de suplementação de ferro durante a

prenhez (OFeSu, n=8);

- Prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro desde o desmame

(OFeR1, n=8);

- Prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro apenas na prenhez

(OFeR2, n=8).

A prole foi pesada ao nascer e, após o desmame, todos os grupos receberam

dieta padrão com Fe. Aos 70 dias de idade, os filhotes foram submetidos

progressivamente a procedimentos de adaptação a meio líquido por 14 dias

consecutivos. Após a adaptação, foram avaliados pelo TLM para determinação individual

do limiar anaeróbio (LA) e determinação da condição aeróbica. O treinamento foi

realizado por 8 semanas, com reavaliações após 4 e 8 semanas de exercícios. Após o

último TLM, os animais foram submetidos a eutanásia (Figura 1).

Procedimentos experimentais

Dieta de ferro

A dieta utilizada na alimentação das fêmeas foi produzida a partir de ingredientes

purificados, seguindo a composição das formulações AIN93-G. Os valores apresentados

no AIN93-G correspondem às necessidades da dieta de roedores nas fases de

crescimento, prenhez e lactação.(25) As dietas de restrição (4 mg/kg) e suplementação

(100 mg/kg) de ferro foram realizadas por meio da manipulação da mistura de minerais,

de acordo com o percentual específico para aquela condição, ajustando a composição

geral da mistura pelo veículo (sacarose), não alterando a densidade calórica da dieta. A

dieta de 40 mg/kg foi usada no grupo de mães padrão [N.T. este grupo não tinha sido

mencionado antes – seria o padrão?] e nos grupos de filhotes.

Amostras das dietas foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz, de São Paulo, SP,

para verificar a concentração de ferro de cada dieta específica (padrão, restrição e

suplementação).

Exercício: o treinamento de natação e o TLM foram aplicados com cargas

controladas, sempre no mesmo horário (18:00 hs). Todos os procedimentos foram

realizados em água mantida a 31 ± 1° C e individualmente, com tanques de natação

divididos por tubos cilíndricos de PVC de 30 cm de diâmetro.

Adaptação à água: os animais foram submetidos a 14 sessões de adaptação à

água, sendo três sessões em água com 15 cm de profundidade. Nos dias subsequentes,

5 sessões de adaptação para natação livre com 120 cm de profundidade, iniciando com

2 minutos de exercício e incrementos de 2 minutos diários, até atingir 10 minutos de

esforço. Em seguida, foram aplicadas 6 sessões específicas de adaptação com

diferentes cargas amarradas ao corpo do animal, em porcentagens do peso corpóreo,

com os tempos variando em função da intensidade aplicada. Estas se destinavam

apenas à adaptação ao meio líquido, estresse térmico, manipulação e cargas, as quais

ficavam presas ao animal (dorso), não objetivando melhorar a condição física

(treinamento).

Teste mínimo de lactato: para a determinação dos parâmetros aeróbicos e

anaeróbicos, foi adotado o protocolo TLM descrito por de Araujo et al.,(26) aplicado em

três momentos durante o período experimental:

- Antes do programa de treinamento (animais com aproximadamente 84 dias de

idade), visando identificar a intensidade individual do LA para a prescrição do

treinamento (Teste 1);

- Após 4 semanas de treinamento (animais com aproximadamente 112 dias de

idade), para acompanhar a evolução aeróbica e anaeróbica e ajustar as cargas de

treinamento (Teste 2);

- Após 8 semanas de treinamento (animais com aproximadamente 140 dias de

idade), para identificar os efeitos do treinamento sobre os parâmetros aeróbicos e

anaeróbicos analisados (Teste 3).

Para o TLM e durante o treinamento, as cargas foram fixadas no dorso do animal

e a porcentagem da carga foi calculada para o peso de cada animal.

O TLM consistiu em uma fase de indução de hiperlactatemia, seguida do

protocolo de cargas incrementais. A fase de hiperlactatemia foi dividida em três partes

consecutivas: 30 segundos de esforço de natação (carga de 13%); 30 segundos de

intervalo de descanso; e tempo de nado até a exaustão (TLim) (carga de 13%). Após o

TLim, repouso passivo com duração de 9 minutos (para atingir o pico de lactato

sanguíneo). Após 9 minutos, foi aplicado um protocolo de cargas incrementais para

determinar a intensidade em que foi observada a menor lactatemia, representando a

maior intensidade de equilíbrio entre a produção e a retirada do lactato sanguíneo. O

protocolo incremental foi realizado com o animal nadando com cargas de 4%, 4,5%, 5%,

5,5%, 6% e 7% de seu peso (com duração de 5 minutos para cada carga) ou até a

exaustão.

Dessa forma, a concentração mínima de lactato foi utilizada como parâmetro

individualizado da capacidade aeróbica, e o tempo até a exaustão durante a fase de

indução como parâmetro da capacidade anaeróbica.

Foram retiradas amostras de sangue da ponta da cauda do animal (25 μL por

coleta) por meio de tubos capilares descartáveis e calibrados com heparina.

Posteriormente, o sangue extraído foi armazenado em tubos Eppendorf com

adição de 50 μL de fluoreto de sódio a 1%. As concentrações de lactato foram

determinadas usando o lactômetro YSI-2300 Yellow Spring, calibrado e operado de

acordo com as especificações do fabricante.

O valor do equilíbrio entre a produção e a retirada de lactato foi utilizado para

calcular a carga de treinamento (80% desse valor em relação ao peso corpóreo). As

cargas foram ajustadas semanalmente.

Programa de treinamento: a intensidade individual de exercício correspondeu ao

produto do peso corpóreo por 80% da intensidade obtida no LM, com um volume de 60

minutos de natação por dia, seis vezes por semana.(27) As cargas somadas ao dorso

foram reajustadas de acordo com a massa corpórea semanalmente. O exercício físico

foi realizado no período escuro (correspondendo ao período diurno dos ratos).

Análise estatística

Os resultados foram analisados por meio do programa Statistica [N.T.] 7.0. O número

médio de animais por mãe foi avaliado por análise de variância simples, seguida de

análise post hoc do teste de Tukey. Para análise do lactato mínimo, TLim (do TLM) e do

peso da prole, foi aplicada a ANOVA com medidas repetidas, seguida do teste de Tukey

post hoc. O nível de significância foi estabelecido como p<0,05 e os dados foram

expressos como média±erro padrão.

RESULTADOS

Os resultados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas para o

número médio de animais por mãe (PFeSt: 7 animais, PFeSu: 10 animais, PFeR1: 7

animais e PFeR2: 9 animais). Todos os grupos de filhotes tiveram um padrão

semelhante de ganho de peso corpóreo ao longo do experimento. Todos os grupos

tiveram um aumento significativo, em relação a eles próprios, a partir dos 84 dias de

vida.

Os resultados do TLM aqui apresentados são o TLim durante a fase de

hiperlactatemia e a contração do lactato no momento do equilíbrio entre a produção e a

retirada do lactato no sangue (lactato mínimo).

O Grupo OFeR1 teve redução estatisticamente significativa do TLim dos testes 2

e 3 para o teste 1, assim como os Grupos OFeSu e OFeR2 do teste 3 para o teste 1 do

Grupo OFeR1. Além disso, foi demonstrada uma tendência (p=0,06) de redução do

tempo limite para o Grupo OFeSu no teste 3 em relação ao Grupo OFeSt no teste 1.

(Figura 2A).

Os resultados mostraram que o Grupo OFeR1 apresentou redução

estatisticamente significativa do valor mínimo de lactato nos testes 2 e 3 em relação ao

teste 1 (Figura 2B).

mmol/L: concentração mínima de lactato; OFeSt: prole de mães que receberam dieta padrão; OFeSu: prole de mães

que receberam dieta com suplementação de ferro durante a gravidez; OFeR1: prole de mães que receberam dieta

com restrição de ferro desde o desmame; OFeR2: prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro apenas

na gravidez.

Figura 2. Resultados do teste de lactato mínimo. (A) medida em segundos do tempo de

nado até a exaustão obtidos por meio do teste de lactato mínimo em 3 momentos:

início/basal (Teste 1), após 4 semanas de treinamento (Teste 2) e após 8 semanas de

treinamento (Teste 3). ANOVA com medidas repetidas, pós-teste de Tukey. Tempo [F

(6,52) = 20,1922, p<0,00001] Grupo [F (6,52) = 1,7200, p<0,187469] interação [F (6,52)

= 2,2092, p=0,056] *difere do grupo OFeR1 no Teste 1. Os dados foram expressos em

média±erro padrão; (B) concentração mínima de lactato obtida através do teste de

lactato mínimo em 3 momentos: basal (Teste 1), após 4 semanas de treinamento (Teste

2) e após 8 semanas de treinamento (Teste 3) ANOVA com medidas repetidas, pós-

teste de Tukey. Tempo [F (6,52) = 8,627, p<0,001] grupo [F (6,52) = 0,889, p=0,459668]

interação [F (6,52) = 4,068, p < 0,01]. *difere do Grupo OFeR1 no Teste 1. Os dados

foram expressos como média±erro padrão

TRADUÇÃO DA FIGURA:

Mínimo de lactato

Segundos

Tempo limite

Teste 1 Teste 2 Teste 3

Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos no momento do

teste 1. E os demais grupos não apresentaram alterações significativas na concentração

mínima de lactato e no TLim após os testes 2 e 3 para o teste 1.

DISCUSSÃO

O uso de animais em pesquisas laboratoriais auxilia na investigação das condições de

estresse observadas em humanos, e possibilita o monitoramento de novas alterações

decorrentes disso, como restrição de ferro e exercícios.

O estudo avaliou se diferentes concentrações de ferro na dieta durante a prenhez

poderiam interferir no desempenho aeróbico e anaeróbico, medido por meio do TLM, da

prole de ratas.

No TLM, nossos resultados mostraram uma redução na capacidade aeróbica e

anaeróbica no Grupo OFeR1 ao longo de 8 semanas de treinamento.

Uma possível hipótese para essas alterações seria por meio da epigenética,

quando há modificações na expressão do genoma por meio de alterações químicas que

ocorrem na molécula de DNA, que são causadas por fatores externos, como exercícios,

dieta alimentar e estresse, e que podem ser herdadas durante a divisão celular.(28)

A literatura mostrou resultados notáveis de epigenética hereditária em modelos

animais. Alguns estudos mostraram que uma alteração na dieta da mãe afeta o

metabolismo, a expressão gênica da prole e, consequentemente, gera distúrbios

metabólicos na vida adulta.(29,30)

Neste estudo não foi realizada a expressão gênica e/ou do ferro sérico, mas a

dieta produzida foi analisada e se constatou que apresentava concentrações específicas

para cada grupo.

Embora não tenha havido diferenças estatisticamente significativas no número

médio de animais por mãe, as mães que receberam dieta com suplementação

apresentaram maior número de filhotes em relação aos outros grupos. Porém, verificou-

se que o peso dos animais ao longo do experimento permaneceu semelhante, não

apresentando alterações decorrentes da dieta da mãe.

As análises realizadas para o TLM demonstraram que o Grupo OFeR1

apresentou diminuição significativa dos valores de lactato no primeiro teste. As mães da

prole do Grupo OFeR1 sofreram restrição de ferro antes e durante a prenhez,

demonstrando uma possível relação entre dieta, epigenética e capacidade aeróbica.

Porém, o Grupo OFeR2, no qual as mães receberam dieta restrita em ferro apenas

durante a gestação, não obteve os mesmos resultados, sugerindo que o tempo de

restrição da ingestão de ferro influenciou nas mudanças.

Estudos têm demonstrado que a reversibilidade das alterações do ferro no

organismo depende da gravidade e duração da DFe.(2,8,31) Além disso, um estudo

realizado em 2000 com ratas alimentadas com dieta deficiente em ferro durante a

prenhez mostrou que os níveis de ferro no cérebro voltaram aos valores normais em 2

semanas de dieta padrão de ferro.(21) Outro estudo com DFe durante a prenhez mostrou

que os níveis de ferro e monoamina na prole alimentada com dieta padrão após o

desmame foram restaurados.(32) No entanto, mais estudos são necessários para

compreender as diferentes consequências da restrição de ferro por períodos mais

longos ou mais curtos.

A literatura mostra que uma das propriedades do ferro é a de ser ergogênico, ou

seja, o ferro pode auxiliar na formação de hemoglobina e melhorar o transporte de

oxigênio no sangue e nos músculos, e também ajudar na produção de energia por meio

de fosforilação oxidativa.(33) Os grupos OFeSt e OFeSu não apresentaram diferenças

significativas nos valores dos testes, de forma que conseguiram manter a regularidade

nos resultados em todos os testes do TLM, porém sem melhora. Esses resultados

abrem espaço para a hipótese de que uma dieta regular com ferro ou uma

suplementação durante a gestação podem permitir que a prole mantenha constância nos

seus resultados de capacidade aeróbica, podendo apresentar regularidade no seu

treinamento.

O TLim foi estabelecido para verificar o desempenho anaeróbico da prole, no qual

o Grupo OFeR1 apresentou redução significativa em relação a eles mesmos quando

comparado ao primeiro teste. A restrição de ferro desse grupo não permitiu que

progredissem ou mantivessem seu desempenho ao longo dos testes. De acordo com

alguns estudos, quando a hemoglobina e o ferro não estão em níveis normais, pode

levar a uma piora significativa do desempenho anaeróbico.(19,34) Nossos resultados

mostraram uma redução no TLim dos grupos OFeSu, OFeR2 e OFeR1 no teste 3 em

comparação com o grupo OFeR1 no teste 1. No entanto, os grupos OFeSt, OFeSu e

OFeR2 mantiveram resultados semelhantes ao longo do experimento (teste 1, teste 2 e

teste 3) em relação a eles mesmos.

Há grupos de pesquisa em todo o mundo que se dedicam a compreender os

efeitos das mudanças epigenéticas durante a gravidez e como os hábitos de vida da

prole podem interagir com essas mudanças. Estudos demonstraram que a restrição de

ferro causa alterações epigenéticas no hipocampo de camundongos e nas proteínas

mitocondriais.(31,35) Nesse sentido, acreditamos que a restrição e a suplementação

durante a gestação foram suficientes para causar alterações no metabolismo do ferro,

devido aos resultados demonstrados na prole.

CONCLUSÃO

Nesse contexto, esses resultados obtidos no treinamento de natação dos animais

mostraram que a prole de mães que receberam dieta restrita em ferro, antes e durante a

gestação, apresentaram diminuição acentuada em sua capacidade aeróbica e no

indicador de metabolismo anaeróbico por meio do teste de lactato mínimo, ao passo que

os demais grupos (prole de mães que receberam dieta padrão, prole de mães que

receberam dieta de suplementação de ferro durante a prenhez e prole de mães que

receberam dieta com restrição de ferro apenas na gravidez) não tiveram alteração no

desempenho durante o experimento. No entanto, mais estudos são necessários sobre o

assunto, pois pouco se sabe sobre as consequências da restrição de ferro na

epigenética hereditária sobre o desempenho físico.

AGRADECIMENTOS

A pesquisa teve apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP) (no 2014-19212-0, no 2017/11167-4) e da Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código financeiro 001. Os autores

gostariam de agardecer a Leonardo Henrique Dalcheco Messias pelo auxílio na coelta

de dados.

INFORMAÇÕES DOS AUTORES

Franco B: http://orcid.org/0000-0003-2197-304X

Cavallaro LA: http://orcid.org/0000-0001-5378-4812

Mota DS: http://orcid.org/0000-0001-5487-4027

Rodrigues NA:http://orcid.org/0000-0003-4265-9586

Manchado-Gobatto FB:http://orcid.org/0000-0002-1178-570X

Bezerra RM: http://orcid.org/0000-0001-5089-651X

Esteves AM: http://orcid.org/0000-0003-2435-5335

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