COLOCADO NO SISTEMA

AO-6417_REVISÃO DO ORIGINAL EM INGLÊS – SUZANA GONTIJO

PREPRINT FRAN

Characterization of electrocorticographic, electromyographic and

electrocardiographic recordings after the use of caffeine in Wistar rats

Caracterização dos registros eletrocorticográficos, eletromiográficos e

eletrocardiográficos após o uso de cafeína em ratos Wistar

Short title: Characterization of electrocorticographic, electromyographic and

electrocardiographic recordings after the use of caffeine in Wistar rats

Diego Arthur Castro Cabral1, Fernanda Myllena Sousa Campos1, Maria Clara

Pinheiro da Silva1, João Paulo do Vale Medeiros1, Paula dos Santos Batista1,

Giovanna Coutinho Jardim1, Jéssica Lígia Picanço Machado1, Leonardo Giovanni

Castro Cabral1, Vanessa Joia de Mello1, Moises Hamoy1

1 Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil.

DOI: 10.31744/einstein_journal/2021AO6417

How to cite this article:

Cabral DA, Campos FM, Silva MC, Medeiros JP, Batista PS, Jardim GC, et al.

Characterization of electrocorticographic, electromyographic and electrocardiographic

recordings after the use of caffeine in Wistar rats. einstein (São Paulo).

2021;19:eAO6417.

Corresponding author:

Diego Arthur Castro Cabral

Rua Augusto Corrêa, 1 - Guamá

Zip code: 66075-110 - Belém, PA, Brazil

Phone: (55 91) 3201-7102

E-mail: diego.arthur.castro@gmail.com

Received on:

Dec 29, 2020

Accepted on:

Mar 26, 2021

Conflict of interest:

none

ABSTRACT

Objective: To describe electrocorticographic, electromyographic and

electrocardiographic profiles to report the electrophysiological effects of caffeine in

Wistar rats. Methods: Male adult Wistar rats weighing 230 to 250 g were used. Rats

were allocated to one of two groups, as follows: Group 1: control, intraperitoneal

injection of 0.9% saline solution (n=27); Group 2: treated with intraperitoneal injection

of caffeine (50 mg/kg) (n=27), in which rats were submitted to electrocorticographic,

electromyographic and electrocardiographic assessment. Results: Brain oscillations

(delta, theta, alpha, beta and gamma) in the frequency range up to 40 Hz varied after

caffeine administration to rats. Powers in delta and theta oscillations ranges were

preponderant. The contractile force of the skeletal striated and cardiac muscles

increased. Electrocardiogram analysis revealed shorter RR, QRS and QT intervals

under the effect of caffeine. Conclusion: In the central nervous system, there was an

increase in the delta, theta and alpha amplitude spectrum, which are related to

memory encoding and enhanced learning. With regard to skeletal muscle, increased

contraction of the gastrocnemius muscle was demonstrated, a clear indication of how

caffeine can be used to enhance performance of some physical activities.

Electrocardiographic changes observed after caffeine administration are primarily

related to increased heart rate and energy consumption.

Keywords: Caffeine; Electrocorticography; Electromyography; Electrocardiography;

Central nervous system; Rats, Wistar

RESUMO

Objetivo: Descrever os perfis eletrocorticográfico, eletromiográfico e

eletrocardiográfico para relatar os efeitos eletrofisiológicos da cafeína em ratos

Wistar. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos, pesando de 230 a

250 g. Os animais foram divididos nos seguintes grupos: Grupo 1: controle com

solução fisiológica 0,9% por via intraperitoneal (n=27); e Grupo 2: tratado com

cafeína (50 mg/kg intraperitoneal) (n=27), onde foram realizadas avaliações por

eletrocorticograma, eletromiograma e eletrocardiograma. Resultados: Houve

variações nas oscilações cerebrais (delta, teta, alfa, beta e gama) na faixa de

frequência de até 40 Hz após a aplicação de cafeína em ratos. Observou-se que as

potências nas faixas das oscilações delta e teta foram preponderantes. Há um

aumento da força de contração nos músculos estriado esquelético e cardíaco. A

avaliação do eletrocardiograma demonstrou que a duração dos intervalos RR, QRS

e QT são menores na presença da cafeína. Conclusão: No sistema nervoso central,

houve aumento do espectro de amplitude delta, teta e alfa, que auxiliam na

codificação das memórias e estão relacionados à melhora do aprendizado. Em

relação à musculatura esquelética, demonstrou-se aumento da contração do

músculo gastrocnêmio, uma clara indicação de como a cafeína pode ser usada para

aumentar o desempenho em algumas atividades físicas. As alterações

eletrocardiográficas observadas após a administração de cafeína estão relacionadas

principalmente ao aumento da frequência cardíaca e do consumo de energia.

Descritores: Cafeína; Eletrocorticografia; Eletromiografia; Eletrocardiografia;

Sistema nervoso central; Ratos Wistar

INTRODUCTION

Caffeine is a central nervous system (CNS) stimulant of the methylxanthine class,

and the most widely used psychoactive drug worldwide. Motivations behind caffeine

use are increased concentration, cognition and physical performance.(1) Caffeine can

be used to treat idiopathic apnea of prematurity(2) and acute respiratory depression,(3)

and for pain management.(4) Epidemiological data suggest that habitual coffee

consumption is protective against Parkinson's and Alzheimer's diseases and

promotes weight loss.(4,5)

Caffeine acts primarily as a non-selective adenosine receptor antagonist.

Caffeine increases motor activity and has arousal and reinforcing effects.(6)

Paraxanthine is the main metabolite of caffeine in humans and is associated with a

significant release of dopamine in areas of the striatum.(7)

The stimulating effect of caffeine has been widely described in literature,

primarily in behavioral and biochemical studies.(1,6,8) However, quantitative studies

describing the impact of electrophysiological changes on various systems following

caffeine administration are scarce. Given the wide use of caffeine at a global level

and its effects on living organisms, this study set out to examine

electrocorticographic, electromyographic and electrocardiographic profiles in Wistar

rats, to describe the electrophysiological effects of caffeine.

OBJECTIVE

To describe the electrophysiological changes induced by caffeine in male Wistar rats,

based on electrocorticographic, electromyographic and electrocardiographic

recordings.

METHODS

Animals

The animals were obtained from the Central Animal Facility of Universidade Federal

do Pará (UFPA), and individually housed in the Experimentation Vivarium of the

Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Natural Products, from April 2019 to

November 2020. Animals had access to water and food ad libitum, and were kept in

a temperature–controlled environment (25 – 28 ºC), under a 12/12h light-dark cycle.

Experimental procedures were conducted in compliance with the principles of

laboratory animal care and approved by the Ethics Committee on Experiments in

Animals (CEUA No. 2675110219).

A total of 54 adult male Wistar rats, weighing 230 to 250 g, were used. Rats

were allocated to one of two groups, as follows: Group 1: control (n=27), treated with

equivalent volume of 0.9% saline solution in an intraperitoneal (IP) injection; Group 2:

caffeine-treated (50 mg/kg IP) (n=27), as per Marriott, 1968. Rats were submitted to

electrocorticographic (ECoG), electromyographic (EMG) and electrocardiographic

(ECG) assessment. Surgically implanted electrodes were used to record ECoG, ECG

and EMG signals. Data were collected in separate groups, within five days of

surgery. Measurements were made on the same day, using a block design, as

follows: electrocorticographic data were collected first, then electrocardiographic, and

finally electromyographic data. Rats were not anesthetized prior to recordings. Rats

were placed in acrylic boxes measuring 60 x 50 x 20 cm (length, width and height,

respectively).

Chemicals

The following chemicals were used: ketamine hydrochloride (Laboratório Köing,

Santana de Parnaíba, SP, Brazil); xylazine hydrochloride (Laboratório Vallée, Montes

Claros, MG, Brazil); lidocaine (Laboratório Hipolabor, Sabará, MG, Brazil) and

caffeine powder (Sigma), in the form of crystals diluted and 0.9% saline solution.

Electrode implantation surgery

Surgical procedures were performed under general anesthesia obtained with 5 mg/kg

of xylazine and 50 mg/kg of ketamine. The site of electrode implantation was

anesthetized with lidocaine. Anesthetized rats were placed in a stereotactic device.

After proper positioning, the implantation site was clipped, and an incision made

through the skin, subcutaneous tissue and muscle planes to access the skull. Two

small craniotomies were then created, -0.96 and 1 mm lateral to the midline bony

landmark (bregma), to access each cerebral hemisphere containing the motor cortex,

where electrodes were implanted into the brain surface.(9) A screw was inserted at the

craniotomy site for electrode attachment using dental acrylic resin.

Electrocorticogram

Animal preparation and electrode implantation procedures for ECoG acquisition were

based on previous publications.(10) Electrodes were placed -0.96 and 1 mm lateral to

the stereotaxic coordinate taken from bregma, in each hemisphere comprising the

motor cortex.(9) Recording and reference electrodes were located on the right and left

hemisphere, respectively. On postoperative day five, electrodes were connected to a

data acquisition system consisting of a high impedance amplifier (Grass

Technologies, P511), monitored using an oscilloscope (Protek, 6510).(11) Caffeine

was injected IP, 15 minutes prior to ECoG recordings. Electrocorticographic data

were continuously digitized at a rate of 1 kHz, using a computer equipped with data

acquisition board (National Instruments, Austin, TX). Data were stored on a hard disk

and processed using dedicated software (LabVIEWexpress). The entire experiment

was carried out in a Faraday cage.

Electromyogram

Following ECoG data acquisition, conjugate electrodes were implanted 0.5 cm above

the insertion of the gastrocnemius muscle, as described in previous studies.

Intraperitoneal caffeine administration was performed 15 minutes prior to

electromyographic recordings. Animals were kept in an acrylic box throughout the 10-

minute recording procedure. Recordings were made with electrodes connected to a

Grass P511 amplifier, monitored using an oscilloscope.(12)

Electrocardiogram

Electrode insertion was guided by the vector plotted from lead D2. The reference

electrode was placed in the region of the fourth intercostal muscle near the right axilla

and the recording electrode in the 11th intercostal space, 1.5 cm to the left of the mid-

sagittal line.(13) Following IP administration of 50 mg/kg of caffeine and a 15-minute

latency period, ECG data were recorded for 10 minutes per animal. The following

variables were analyzed: amplitude (mV), heart rate (bpm), RR interval, PQ interval,

QT interval and QRS duration.

Electrophysiological data analysis

Amplitude graphs show potential differences between reference and recording

electrodes at a sampling rate of 1,000 samples per second. Spectrograms were

calculated using a Hamming window with 256 points (256/1000s); each frame was

generated with an overlap of 128 points per window. For each frame, the spectral power

distribution (SPD) was calculated using the Welch average periodogram method. A

frequency histogram was generated from the first signal SPD calculation using a

Hamming window with 256 points and no SPD overlap; this resulted in a histogram

constructed with 1 Hz boxes. Signals recorded up to 50 Hz were analyzed. Frequency

ranges were analyzed as follows: delta (1 – 4 Hz), theta (4 – 8 Hz), alpha (8 – 12 Hz),

beta (12 – 28 Hz) and gamma (28 – 40 Hz).(14)

Statistical analysis

Data normality and homogeneity of variance were verified using the Kolmogorov-

Smirnov and Levene’s test respectively. Data were expressed as means and

standard deviations; F and p values were provided when applicable. The level of

significance was set at p<0.05. Groups were compared using two-way ANOVA

followed by the Tukey’s test for multiple comparisons. The Student´s t-test was used

to compare ECoG, EMG and ECG data (power recorded in different frequency

bands) between the control and the caffeine-treated group. ANOVA was used

exclusively to analyze the preponderance of frequency spectra within groups.

Statistical analyses for outlier detection and removal were conducted using

GraphPad Prism, version 8 (Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA, USA).(11)

RESULTS

Caffeine alters the power spectrum of brain waves

Significant changes in ECoG tracings were observed following caffeine administration

relative to baseline (Table 1). Control Group recordings (Figure 1A) revealed greater

amplitude and power intensity in the spectrogram at frequencies lower than 10 Hz.

Caffeine-treated Group ECoG tracings (Figure 1B) shows greater power distribution

above 10 Hz.

Brain wave distribution is shown in tracings recorded at baseline and under

the effect of caffeine (Figure 1C). An increase in the power of low frequency waves

was seen, especially those up to 40 Hz (p<0.001). Overall, the greatest amplitude of

the signal power spectrum fell in the 1 to 8 Hz range (i.e., delta and theta wave

ranges (p <0.001).

Table 1. Numerical values obtained from electrocorticographic records performed during the experiments

Group Delta (1 – 4 Hz) Theta (4 – 8 Hz) Alpha (8 – 12 Hz) Beta (12 – 28 Hz) Gamma (28 – 30 Hz)

Control / mV2/Hz X 10-3 0.003883

±0.0009877

0.01440±0.00248

6

0.01176±

0.001643

0.007670±0.0014

97

0.003218±0.002155

Caffeine-treated /

mV2/Hz X 10-3

0.1227 ±0.001844** 0.03031

±0.006018**

0.02189±0.00348* 0.01979±0.00374* 0.01173±0.001083*

* means p<0.05 and ** <0.01 relative to the Control Group. All delta, theta, alpha, beta and gamma wave values obtained in the Control and the Caffeine-treated

Groups are shown.

ECoG: electrocorticogram.

Figure 1. Electrocorticographic recordings in the Control Group showing greater amplitude

and power intensity at frequencies lower than 10 Hz (A) and electrocorticographic tracings

following IP administration of 50 mg/kg of caffeine (B) at a frequency distribution larger

than 10 Hz; (C) spectral power distribution (SPD) after IP administration of caffeine (50

mg/kg) or 0.9% saline (control), and respective brain oscillations. Data were analyzed by

comparison of means using the t test followed by the Mann Whitney test; the level of

significance was set at p<0.001 (n=9)

The power spectrum of the Control Group revealed the following

relationship: theta > alpha > beta > delta = gamma (p<0.05) (Figure 2A). In the

Caffeine-treated Group, the prevailing oscillation profile was theta > alpha = beta >

delta = gamma (p<0.05) (Figure 2B).

Figure 2. Mean power amplitude of delta, theta, alpha, beta and gamma brain

oscillations in the Control and Caffeine-treated (50 mg/kg) Groups. (A) and (B)

indicate the prevailing power in brain oscillations in control and treated rats

respectively. (C) Comparison between oscillations detected in each group (n=9) (#

Student t test indicates statistically significant results whenever p<0.0001)

Mean delta oscillation differed significantly prior to and after caffeine

administration (0.003883±0.0009877 mV2 / Hz x 10-3 and 0.01227±0.001844 mV2 /

Hz x 10-3, respectively; p<0.0001), with higher values detected in Caffeine-treated

Group. Mean oscillations in the theta (0.01440±0.002569 mV2 / Hz x 10-3) and alpha

(0.01176±0.001643 mV2 / Hz x 10-3) ranges in the Control Group differed

significantly (p<0.001) from those recorded in the Caffeine-treated Group (theta,

0.03031±0.006081 mV2 / Hz x 10-3; alpha, 0.02189±0.003489 mV2 / Hz x 10-3).

Mean oscillations in the beta range differed significantly between the Control and

the Caffeine-treated group (0.007670±0.001497 mV2 / Hz x 10-3 and

0.01979±0.003748 mV2 / Hz x 10-3respectively; p<0.001). Mean oscillation in the

gamma range corresponded to 0.003218±0.002155 mV2 / Hz x 10-3 and

0.01173±0.001083 mV2 / Hz x 10-3 in the Control Group and the Caffeine-treated

Group, respectively (p<0.001).

Caffeine increases the amplitude of striated muscle contraction

Electromyographic (EMG) recordings in Figure 3A and Table 2 show muscle

contraction patterns at low amplitude (up to 1 mV), with an energy distribution

spectrogram up to 50 Hz. Within 15 minutes of IP administration of 50 mg/kg of

caffeine, contractions became more frequent, with amplitude larger than 2 mV and

higher energy concentration (Figure 3B).

Amplitude differences between recordings up to 50 Hz shown in Figure 3

indicate significant differences between the Control and the Caffeine-treated Group

(mean power 6.676±2.702mV2 / Hz x 10-3 and 28.22±6.736mV2 / Hz x 10-3

respectively; p<0.001) (Figure 3C). Analysis of the strongest contractions recorded

in the Control and the Caffeine-treated Group also revealed significant differences

(12.94±4.470mV2 / Hz x 10-3 and 78.56±26.46mV2 / Hz x 10-3; p<0.001) (Figure 3D).

Figure 3. Gastrocnemius muscle contraction recorded in control (A) and caffeine-

treated rats (B). Recording time, 300 s. The power observed in the full record at

frequencies up to 50 Hz demonstrate the power of muscle contractions in control

and caffeine-treated rats (C). Power of the strongest contractions recorded in the

Control and the caffeine-treated group during a fixed time of contraction of 5

seconds (D), (# Student´s t test indicates statistically significant results whenever p

<0.0001) (n=9). ATENÇÃO: CORRIGIR NA FIGURA: Time (seconds)

Table 2. Numerical representation of the values obtained during the

electromyographic study

Group Control / mV2/Hz X

10-3

Caffeine / mV2/Hz X

10-3

Full EMG record 6.675±2.702 28.22±6.736

Strongest contraction recorded

(EMG)

12.94±4.470* 78.56±26.46**

* means p<0.05 and ** <0.01 relative to the Control Group.

All values recorded in the Caffeine-treated and Control Groups are shown. Values recorded throughout EMG study and

values recorded during maximal gastrocnemius muscle contraction are also reported.

Caffeine affected electrocardiographic parameters

Electrocardiographic changes observed after caffeine administration were primarily

related heart rate (bpm) increase, as shown in Figures 4A, B, C and D. Caffeine

administration led to a significant increase in heart rate (249.2±21.26 and

303.7±7.194 BPM, Control and Caffeine-treated group, respectively; p=0.0004)

(Figure 4E and Table 3).

ECG: electrocardiogram.

Figure 4. Control Group electrocardiogram in derivation D-II (A); prolongation of the

40 to 50 second interval in the Control Group (B); Caffeine-treated group

electrocardiogram in derivation D-II (C); prolongation of the 40 to 50 second interval

in the electrocardiogram in rats treated with caffeine (D); characteristics of the

electrocardiogram of rats in sinus rhythm in lead D-II, showing intervals analyzed at

one-second magnification (E), representative electrocardiogram of the Caffeine-

treated Group showing cardiac deflagration characteristics, one-second

magnification (F).

Table 3. Numerical presentation of the values obtained during the execution of the electrocardiographic study

Parameter

Heart rate

(bpm)

Amplitude

(mV) RR Intervals (S) QRS duration (S) QT intervals (S) PQ intervals

Control 249.2±21.26 0.4746±0.04072 0.3453±0.01276 0.01011±0.001364 0.570±0.004062 0.07056±0.003779

Caffeine-

treated 303.7±7.194 ***

0.5250±0.01949

**

0.2400±0.03651

***

0.0082±0.0007953

**

0.03153±0.004996

***

0.08306±0.007435

***

** p<0.01 relative to the Control Group and *** p<0.001 relative to the Control Group.

Parameters extracted from electrocardiographic records in the Control and Caffeine-treated Group (Student´s t and Mann Whitney tests).

The mean amplitude also increased significantly after caffeine administration

(0.4746±0.04072 mV and 0.5250±0.01949 mV, Control and Caffeine-treated group

respectively; p=0.0061). The increase in heart rate (bpm) revealed shortening of the

RR interval in the ECG (Figures 4 E and F); means differed significantly between the

Control and the Caffeine-treated Groups (0.3453±0.01276 seconds and

0.2400±0.03651 seconds, respectively; p=0.0004). The mean duration of the QRS

complex was also characterized by a decrease in execution time and differed

significantly between the Control and the Caffeine-treated groups (0.01011±0.001364

seconds and 0.0082±0.0007953 seconds, respectively; p=0.0062). The cardiac cycle

represented by the QT interval, which involves the period of ventricular depolarization

and repolarization, also differed significantly (0.0570±0.004062 seconds and

0.03153±0.004996 seconds, Control and caffeine-treated group respectively;

p=0.0004). As to the PQ interval, mean was 0.07056±0.003779 seconds in the

Control Group and 0.08306±0.007435 seconds the Treated Group (Table 3).

DISCUSSION

In this study, ECoG, EMG and ECG recordings were used to describe

electrophysiological changes in rats following caffeine administration. The average

power was 50% higher in the amplitude of the delta brain oscillations in the group

treated with caffeine relative to the control group. Delta waves are thought to help

encode memories and enhance learning.(15) Positive acute effects on attention (span?)

have also been demonstrated in most studies investigating the effects of caffeine on

cognition.(16) This finding may also be related to the delta stage, since delta activity

“modulates” mental performance via inhibition of stimuli unrelated to the task at hand,

thereby increasing the individual level of attention during execution of tasks that

demand careful internal brain processing.(17)

The theta rhythm is implicated in several activities, such as establishment of

word pattern for speech recognition and microsaccadic eye movement

synchronization, which are often observed in the context of attentive and exploratory

behavior and in implicit learning, a largely unconscious non-hippocampus-dependent

learning category.(12-20)

Alpha waves are related to cognitive processing and self-regulation and are

increased in situations associated with attention gains.(21,22) Beta oscillations are a

strong predictor of perceptual and motor performance.(23) These oscillations are

associated with states of alertness, focus and active thinking. (24) In the upper cortex,

gamma waves are enhanced during working memory and learning. Such oscillation

plays a role in neural communication, reflecting the transfer of information from the

external world to the brain.(25)

Increased amplitude of all brain waves in this study (Figure 1C) suggests

caffeine or any of its metabolites may have direct or indirect impacts on pathways

involved in the generation of such rhythms, which may enhance cognitive functions

associated with brain oscillations. This finding supports the fact that caffeine acts as

a CNS stimulant.(6)

In this study, intraperitoneal administration of caffeine increased the frequency

of gastrocnemius muscle contraction, with higher amplitude (2 mV) and energy

concentration (Figure 3B) relative to the Control Group (1 mV amplitude) (Figure 3A).

Mismatches in muscle contraction force between the Control and the Caffeine-treated

Group are shown in Figure 3. Statistical differences (p<0.05) between the two

portions analyzed can be seen, particularly in the graph depicting the strongest

muscle contractions. Hence, caffeine affects skeletal muscle function, leading to an

increase in mechanical performance by enhancing the ability of muscles to produce

strength, work and energy.(26) Therefore, improvements in motor skills can be

attributed to caffeine, as advocated by other researchers.(27)

Caffeine increases myocardial activity, reducing the time of contraction and

increasing the heart rate. It also has positive inotropic effects, given it increases

contractile force.(28) In this study, an increase in heart rate (bpm) (Figure 4C) and

cardiac contraction force (Figure 4D) was observed in rats treated with caffeine.

Combined, these effects translate into greater caloric expenditure, which indicates

caffeine is in fact a thermogenic agent which enhances ergogenic effects.(29) It has

also been widely reported that moderate caffeine consumption (400 – 600 mg/d) is

not associated with increased risk cardiovascular disease development. On the

contrary, it seems to have a protective effect on the cardiovascular system. However,

individuals predisposed to or suffering from cardiovascular diseases appear to be

more sensitive to the effects of caffeine.(30)

CONCLUSION

This study demonstrated the major electrophysiological changes observed in the

central nervous system, myocardium and skeletal muscle after intraperitoneal

injection of caffeine. Electrophysiological changes described in this study support

acute positive effects on individual levels of attention, as observed following

consumption of caffeinated drinks in order to maintain alertness. At the level of the

central nervous system, there was an increase in delta, theta and alpha amplitude

spectra, which are associated with memory encoding and enhanced learning. With

regard to effects on skeletal muscles, increased contraction of the gastrocnemius

muscle was demonstrated, a clear indication of how caffeine can be used to enhance

performance in some physical activities. Electrocardiographic changes observed after

caffeine administration are primarily related to increased heart rate and higher energy

expenditure. Descriptions of quantitative changes in measurements in this

electrophysiological spectrum are of interest to further studies aimed at determining

the optimal daily caffeine dose and further describing positive, negative and toxic

effects associated with the use of this stimulant.

AUTHORS’ INFORMATION

Cabral DA: http://orcid.org/0000-0002-7582-7251

Campos FM: http://orcid.org/0000-0003-1903-0958

Silva MC: http://orcid.org/0000-0001-7697-7406

Medeiros JP: http://orcid.org/0000-0002-5110-2379

Batista PS: http://orcid.org/0000-0002-5918-2078

Jardim GC: http://orcid.org/0000-0002-0171-8300

Machado JL: http://orcid.org/0000-0003-0870-1090

Cabral LG: http://orcid.org/0000-0002-8814-9488

Mello VJ: http://orcid.org/0000-0003-0359-9760

Hamoy M: http://orcid.org/0000-0002-2931-4324

REFERENCES

1. Cappelletti S, Piacentino D, Sani G, Aromatario M. Caffeine: cognitive and physical

performance enhancer or psychoactive drug? Curr Neuropharmacol. 2015;13(1):71-88.

Review. Erratum in: Curr Neuropharmacol. 2015;13(4):554.

2. Abdel-Hady H, Nasef N, Shabaan AE, Nour I. Caffeine therapy in preterm infants.

World J Clin Pediatr. 2015;4(4):81-93. Review.

3. Daly JW. Caffeine analogs: biomedical impact. Cell Mol Life Sci. 2007;64(16):2153-

69. Review.

4. Munoz DG, Fujioka S. Caffeine and Parkinson disease: a possible diagnostic and

pathogenic breakthrough. Neurology. 2018;90(5):205-6.

5. Tabrizi R, Saneei P, Lankarani KB, Akbari M, Kolahdooz F, Esmaillzadeh A, et al.

The effects of caffeine intake on weight loss: a systematic review and dose-response meta-

analysis of randomized controlled trials. Crit Rev Food Sci Nutr. 2019;59(16):2688-96.

Review.

6. Ferré S. Mechanisms of the psychostimulant effects of caffeine: implications for

substance use disorders. Psychopharmacology (Berl). 2016;233(10):1963-79. Review.

7. Ferré S, Orrú M, Guitart X. Paraxanthine: connecting caffeine to nitric oxide

neurotransmission. J Caffeine Res. 2013;3(2):72-8.

8. Alasmari F. Caffeine induces neurobehavioral effects through modulating

neurotransmitters. Saudi Pharm J. 2020;28(4):445-51. Review.

9. Paxinos G, Franklin KB. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic

coordinates. 5th ed. Academic Press; 2019.

10. Hamoy M, Dos Santos Batista L, de Mello VJ, Gomes-Leal W, Farias RA, Dos

Santos Batista P, et al. Cunaniol-elicited seizures: behavior characterization and

electroencephalographic analyses. Toxicol Appl Pharmacol. 2018;360:193-200.

11. Estumano DP, Ferreira LO, Bezerra PA, da Silva MC, Jardim GC, Santos GF,et al.

Alteration of testosterone levels changes brain wave activity patterns and induces

aggressive behavior in rats. Front Endocrinol (Lausanne). 2019;10:654.

12. Santos GF, Ferreira LO, Gerrits Mattos B, Fidelis EJ, de Souza AS, Batista PS, et al.

Electrocorticographic description of the effects of anticonvulsant drugs used to treat

lidocaine‐induced seizures. Brain Behav. 2021;11(2):e01940.

13. Farraj AK, Hazari MS, Cascio WE. The utility of the small rodent electrocardiogram in

toxicology. Toxicol Sci. 2011;121(1):11-30. Review. Erratum in: Toxicol Sci.

2012;126(1):289.

14. Souza-Monteiro JR, Arrifano GP, Queiroz AI, Mello BS, Custódio CS, Macêdo DS, et

al. Antidepressant and antiaging effects of Açaí (Euterpe oleracea Mart.) in Mice. Oxid Med

Cell Longev. 2019;2019:3614960.

15. Jansen JM, Lopes AJ, Jansen U, Capone D, Maeda TY, Noronha A, organizadores,

et al. Medicina da noite: da cronobiologia à prática clínica. Rio de Janeiro: Editora

FIOCRUZ; 2007. p.103-20. Capítulo 7.

16. Szczepanik JC, de Oliveira PA, de Oliveira J, Mack JM, Engel DF, Rial D, et al.

Caffeine mitigates the locomotor hyperactivity in middle‐aged low‐density lipoprotein

receptor (LDLr)‐knockout mice. CNS Neurosci Ther. 2016;22(5):420-2.

17. Harmony T, Fernández T, Silva J, Bernal J, Díaz-Comas L, Reyes A, et al. EEG delta

activity: an indicator of attention to internal processing during performance of mental tasks.

Int J Psychophysiol. 1996;24(1-2):161-71.

18. Hyafil A, Fontolan L, Kabdebon C, Gutkin B, Giraud AL. Speech encoding by coupled

cortical theta and gamma oscillations. Elife. 2015;4:e06213.

19. Kienitz R, Schmiedt JT, Shapcott KA, Kouroupaki K, Saunders RC, Schmid MC.

Theta rhythmic neuronal activity and reaction times arising from cortical receptive field

interactions during distributed attention. Curr Biol. 2018;28(15):2377-87.e5.

20. Loonis RF, Brincat SL, Antzoulatos EG, Miller EK. A meta-analysis suggests different

neural correlates for implicit and explicit learning. Neuron. 2017;96(2):521-34.e7. Review.

21. Bazanova O. Comments for current interpretation EEG alpha activity: a review and

analysis. J Behav Brain Sci. 2012;2(2):239-48.

22. Kim SC, Lee MH, Jang C, Kwon JW, Park JW. The effect of alpha rhythm sleep on

EEG activity and individuals’ attention. J Phys Ther Sci. 2013;25(12):1515-8.

23. Sherman MA, Lee S, Law R, Haegens S, Thorn CA, Hämäläinen MS, et al. Neural

mechanisms of transient neocortical beta rhythms: converging evidence from humans,

computational modeling, monkeys, and mice. Proc Natl Acad Sci U S A.

2016;113(33):E4885-94.

24. Kim JH, Chung EJ, Lee BH. A study of analysis of the brain wave with respected to

action observation and motor imagery: a pilot randomized controlled trial. J Phys Ther Sci.

2013;25(7):779-82.

25. Jia X, Kohn A. Gamma rhythms in the brain. PLoS Biol. 2011;9(4):e1001045.

26. Tallis J, Duncan MJ, James RS. What can isolated skeletal muscle experiments tell

us about the effects of caffeine on exercise performance? Br J Pharmacol.

2015;172(15):3703-13. Review.

27. Sousa AM, Suzuki FA. Effect of caffeine on cervical vestibular-evoked myogenic

potential in healthy individuals. Braz J Otorhinolaryngol. 2014;80(3):226-30.

28. Chaban R, Kornberger A, Branski N, Buschmann K, Stumpf N, Beiras-Fernandez A,

et al. In-vitro examination of the positive inotropic effect of caffeine and taurine, the two

most frequent active ingredients of energy drinks. BMC Cardiovasc Disord. 2017;17(1):220.

Erratum in: BMC Cardiovasc Disord. 2019;19(1):33.

29. Murayama T, Ogawa H, Kurebayashi N, Ohno S, Horie M, Sakurai T. A tryptophan

residue in the caffeine-binding site of the ryanodine receptor regulates Ca2+ sensitivity.

Commun Biol. 2018;1:98.

30. Turnbull D, Rodricks JV, Mariano GF, Chowdhury F. Caffeine and cardiovascular

health. Regul Toxicol Pharmacol. 2017;89:165-85. Review.

AO-6417_TRADUÇÃO PARA PORTUGUÊS – SUZANA GONTIJO

PREPRINT FRAN

Caracterização dos registros eletrocorticográficos, eletromiográficos e

eletrocardiográficos após o uso de cafeína em ratos Wistar

Characterization of electrocorticographic, electromyographic and

electrocardiographic recordings after the use of caffeine in Wistar rats

Título curto: Caracterização dos registros eletrocorticográficos, eletromiográficos e

eletrocardiográficos após o uso de cafeína em ratos Wistar

Diego Arthur Castro Cabral1, Fernanda Myllena Sousa Campos1, Maria Clara

Pinheiro da Silva1, João Paulo do Vale Medeiros1, Paula dos Santos Batista1,

Giovanna Coutinho Jardim1, Jéssica Lígia Picanço Machado1, Leonardo Giovanni

Castro Cabral1, Vanessa Joia de Mello1, Moises Hamoy1

1 Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brasil.

DOI: 10.31744/einstein_journal/2021AO6417

Como citar este artigo:

Cabral DA, Campos FM, Silva MC, Medeiros JP, Batista PS, Jardim GC, et al.

Characterization of electrocorticographic, electromyographic and electrocardiographic

recordings after the use of caffeine in Wistar rats. einstein (São Paulo).

2021;19:eAO6417.

Autor correspondente:

Diego Arthur Castro Cabral

Rua Augusto Corrêa, 1 - Guamá

CEP: 66075-110 - Belém, PA, Brasil

Tel.: (55 91) 3201-7102

E-mail: diego.arthur.castro@gmail.com

Data de submissão:

29/12/2020

Data de aceite:

26/03/2021

Conflito de interesse:

Não há

ABSTRACT

Objective: To describe electrocorticographic, electromyographic and

electrocardiographic profiles to report the electrophysiological effects of caffeine in

Wistar rats. Methods: Male adult Wistar rats weighing 230 to 250 g were used. Rats

were allocated to one of two groups, as follows: Group 1: control, intraperitoneal

injection of 0.9% saline solution (n=27); Group 2: treated with intraperitoneal injection

of caffeine (50 mg/kg) (n=27), in which rats were submitted to electrocorticographic,

electromyographic and electrocardiographic assessment. Results: Brain oscillations

(delta, theta, alpha, beta and gamma) in the frequency range up to 40 Hz varied after

caffeine administration to rats. Powers in delta and theta oscillations ranges were

preponderant. The contractile force of the skeletal striated and cardiac muscles

increased. Electrocardiogram analysis revealed shorter RR, QRS and QT intervals

under the effect of caffeine. Conclusion: In the central nervous system, there was an

increase in the delta, theta and alpha amplitude spectrum, which are related to

memory encoding and enhanced learning. With regard to skeletal muscle, increased

contraction of the gastrocnemius muscle was demonstrated, a clear indication of how

caffeine can be used to enhance performance of some physical activities.

Electrocardiographic changes observed after caffeine administration are primarily

related to increased heart rate and energy consumption.

Keywords: Caffeine; Electrocorticography; Electromyography; Electrocardiography;

Central nervous system; Rats, Wistar

RESUMO

Objetivo: Descrever os perfis eletrocorticográfico, eletromiográfico e

eletrocardiográfico para relatar os efeitos eletrofisiológicos da cafeína em ratos

Wistar. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos, pesando de 230 a

250 g. Os animais foram divididos nos seguintes grupos: Grupo 1: controle com

solução fisiológica 0,9% por via intraperitoneal (n=27); e Grupo 2: tratado com

cafeína (50 mg/kg intraperitoneal) (n=27), onde foram realizadas avaliações por

eletrocorticograma, eletromiograma e eletrocardiograma. Resultados: Houve

variações nas oscilações cerebrais (delta, teta, alfa, beta e gama) na faixa de

frequência de até 40 Hz após a aplicação de cafeína em ratos. Observou-se que as

potências nas faixas das oscilações delta e teta foram preponderantes. Há um

aumento da força de contração nos músculos estriado esquelético e cardíaco. A

avaliação do eletrocardiograma demonstrou que a duração dos intervalos RR, QRS

e QT são menores na presença da cafeína. Conclusão: No sistema nervoso central,

houve aumento do espectro de amplitude delta, teta e alfa, que auxiliam na

codificação das memórias e estão relacionados à melhora do aprendizado. Em

relação à musculatura esquelética, demonstrou-se aumento da contração do

músculo gastrocnêmio, uma clara indicação de como a cafeína pode ser usada para

aumentar o desempenho em algumas atividades físicas. As alterações

eletrocardiográficas observadas após a administração de cafeína estão relacionadas

principalmente ao aumento da frequência cardíaca e do consumo de energia.

Descritores: Cafeína; Eletrocorticografia; Eletromiografia; Eletrocardiografia;

Sistema nervoso central; Ratos Wistar

INTRODUÇÃO

A cafeína é um estimulante do sistema nervoso central (SNC) da classe das

metilxantinas, e a droga psicoativa mais usada no mundo. O uso da cafeína é

motivado pelo aumento da concentração, da cognição e do desempenho físico.(1) A

droga também pode ser usada para tratamento da apneia idiopática da

prematuridade(2) e da depressão respiratória aguda,(3) e para controle da dor.(4)

Dados epidemiológicos sugerem que o consumo habitual de café tem efeito protetor

contra as doenças de Parkinson e Alzheimer, além de favorecer a perda de peso.(4,5)

A cafeína é um antagonista não seletivo dos receptores de adenosina, que

estimula a atividade motora e tem efeitos excitatórios e de reforço.(6) A paraxantina é

o principal metabólito da cafeína em seres humanos e promove liberação

significativa de dopamina em áreas do estriado.(7)

O efeito estimulante da cafeína encontra-se amplamente descrito na literatura,

sobretudo em estudos comportamentais e bioquímicos.(1,6,8) Entretanto, estudos

quantitativos descrevendo o impacto de alterações eletrofisiológicas nos diferentes

sistemas após a administração do estimulante são escassos. Em vista do amplo uso

da cafeína em escala global, e seus efeitos nos organismos vivos, este estudo teve

por objetivo analisar os perfis eletrocorticográfico, eletromiográfico e

eletrocardiográfico de ratos Wistar, para descrever os efeitos eletrofisiológicos da

cafeína.

OBJETIVO

Descrever as alterações eletrofisiológicas induzidas pela cafeína em ratos Wistar

machos, com base em registros eletrocorticográficos, eletromiográficos e

eletrocardiográficos.

MÉTODOS

Animais

Os animais foram obtidos no Biotério Central da Universidade Federal do Pará

(UFPA) e alojados individualmente no Biotério Experimental do Laboratório de

Farmacologia e Toxicologia de Produtos Naturais, de abril de 2019 a novembro de

2020. Os animais tinham acesso livre à água e alimento, e foram mantidos em

ambiente com temperatura controlada (25 – 28 ºC) e submetidos a um ciclo claro-

escuro de 12/12h. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em

conformidade com os princípios de cuidados de animais de laboratório e aprovados

pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA nº. 2675110219).

Foram usados 54 ratos Wistar adultos machos, pesando entre 230 e 250 g.

Os animais foram alocados para um dos seguintes grupos: Grupo 1: controle (n=27),

tratado com volume equivalente de solução fisiológica (salina a 0.9%, injeção

intraperitoneal - IP); Grupo 2: tratado (n=27), tratado com cafeína (50 mg/kg IP),

conforme descrito por Marriott, 1968. Os ratos foram submetidos à eletrocorticografia

(ECoG), à eletromiografia (EMG) e à eletrocardiografia (ECG). Eletrodos

implantados cirurgicamente foram utilizados para registro de sinal nos

procedimentos de ECoG, MG e ECG. A coleta dos dados foi realizada em grupos

separados, no 5o dia após a cirurgia. As mensurações foram realizadas no mesmo

dia, empregando-se o seguinte delineamento em blocos: os dados

eletrocorticográficos foram coletados primeiro, seguindo-se dos dados

eletrocardiográficos e, por último, dados eletromiográficos. Os dados foram

coletados sem uso de anestesia. Os animais foram acomodados em caixas acrílicas

medindo 60 x 50 x 20 cm (comprimento, largura e altura, respectivamente).

Substâncias químicas

As seguintes substâncias químicas foram utilizadas: cloridrato de cetamina

(Laboratório Köing, Santana de Parnaíba, SP, Brasil); cloridrato de xilazina

(Laboratório Vallée, Montes Claros, MG, Brasil); lidocaína (Laboratório Hipolabor,

Sabará, MG, Brasil); e cafeína em pó (Sigma), na forma de cristais diluídos em

solução fisiológica 0,9%.

Procedimento cirúrgico para implante de eletrodos

O procedimento cirúrgico foi realizado sob anestesia geral com 5 mg/kg de xilazina e

50 mg/kg de cetamina. O sítio operatório foi anestesiado com lidocaína. Uma vez

anestesiados, os animais foram colocados em um dispositivo esterotáxico e

devidamente posicionados. O local de implantação foi tricotomizado e uma incisão

realizada através da pele, tecidos subcutâneos e musculares, até chegar ao crânio.

Duas craniotomias pequenas foram então criadas, -0.96 e 1 mm lateralmente à

fontanela anterior (bregma), a fim de se obter acesso a cada um dos hemisférios

cerebrais contendo o córtex motor, onde os eletrodos foram implantados na

superfície do cérebro.(9) Um parafuso foi introduzido no local da craniotomia para

fixação dos eletrodos com resina acrílica odontológica.

Eletrocorticograma

O preparo dos animais e a implantação dos eletrodos para aquisição do ECoG foram

realizados de acordo com relatos prévios.(10) Os eletrodos foram posicionados 0,96 e

1 mm lateralmente à coordenada estereotáxica relativa ao bregma, em cada um dos

hemisférios contendo o córtex motor.(9) Os eletrodos de registro e referência foram

posicionados no hemisfério direito e esquerdo, respectivamente. No quinto dia após

a cirurgia, os eletrodos foram conectados a um sistema de aquisição de dados

composto por um amplificador de alta impedância (Grass Technologies, P511),

monitorado com osciloscópio (Protek, 6510).(11) A administração intraperitoneal de

cafeína foi realizada 15 minutos antes do registro. Os dados foram digitalizados de

forma contínua a uma frequência de 1 kHz, por meio de um computador equipado

com placa de aquisição de dados (National Instruments, Austin, TX). Os dados foram

armazenados em um disco rígido e processados empregando-se software específico

(LabVIEWexpress). Todo o experimento foi realizado em gaiola de Faraday.

Eletromiograma

Após a aquisição dos dados de ECoG, eletrodos conjugados foram implantados 0,5

cm acima da inserção do músculo gastrocnêmio, conforme descrito na literatura. A

administração intraperitoneal de cafeína foi realizada 15 minutos antes do registro

eletromiográfico. Os animais foram mantidos em uma caixa acrílica durante o

procedimento de registro (duração de 10 minutos), sendo os eletrodos conectados a

um amplificador Grass P511 monitorado com osciloscópio.(12)

Eletrocardiograma

Os eletrodos foram inseridos ao longo do vetor relativo à derivação D2. O eletrodo

de referência foi colocado na região do quarto músculo intercostal, próximo à axila

direita, e o eletrodo de registro no 11o espaço intercostal, 1,5 cm à esquerda da linha

sagital mediana.(13) Após a administração intraperitoneal de 50 mg/kg de cafeína e

um período de latência de 15 minutos, os dados eletrocardiográficos foram

registrados por 10 minutos em cada animal, analisando-se as seguintes variáveis:

amplitude (mV), frequência cardíaca (bpm), intervalo RR, intervalo PQ, intervalo QT

e duração do complexo QRS.

Análise dos dados eletrofisiológicos

Os gráficos de amplitude mostram a diferença de potencial entre o eletrodo de

referência e o eletrodo de registro a uma frequência de amostragem de 1.000 amostras

por segundo. Os espectrogramas foram calculados empregando-se uma janela de

Hamming com 256 pontos (256/1000s) e cada quadro foi gerado com uma

sobreposição de 128 pontos por janela. Para cada quadro, a distribuição de energia

espectral (SPD) foi calculada empregando-se o método do periodograma médio de

Welch. O histograma de frequência foi gerado a partir do primeiro cálculo de SPD do

sinal empregando-se a janela de Hamming com 256 pontos sem sobreposição com a

SPD, resultando em um histograma construído com caixas de 1 Hz. Os sinais

registrados até a faixa de 50 Hz foram analisados. As bandas de frequência foram

analisadas da seguinte maneira: delta (1 – 4 Hz), teta (4 – 8 Hz), alfa (8 - 12Hz), beta

(12 – 28 Hz) e gama (28 – 40 Hz).(14)

Análise Estatística

A normalidade dos dados e a homogeneidade de variâncias foram verificadas por

meio dos testes de Kolmogorov-Smirnov e Levene, respectivamente. Os dados

foram expressos como médias e desvios padrão. Valores de F e p foram

apresentados quando pertinentes. O nível de significância adotado foi de p<0,05. As

comparações entre os grupos foram realizadas por meio da ANOVA bidirecional

seguida pelo teste de Tukey para comparações múltiplas. O teste t de Student foi

utilizado para comparação dos dados de ECoG, EMG e ECG (potência nas

diferentes faixas de frequência) entre os grupos controle e tratado. A ANOVA foi

realizada apenas para análise da preponderância do espectro de frequência entre

animais do mesmo grupo. As análises estatísticas para detecção e remoção de

outliers foram realizadas empregando-se o software GraphPad Prism, versão 8

(Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA, EUA).(11)

RESULTADOS

A cafeína altera o espectro de potência das ondas cerebrais

Alterações importantes foram observadas no traçado do ECoG após a administração

de cafeína em relação ao traçado inicial (Tabela 1). O registro obtido no Grupo

Controle pode ser visualizado na Figura 1A, que mostra aumento da amplitude e da

intensidade de potência no espectrograma em frequências inferiores a 10 Hz. O

traçado do ECoG após a administração de cafeína, visualizado na Figura 1B, mostra

maior distribuição de potência acima de 10 Hz.

A distribuição das ondas cerebrais pode ser visualizada nos traçados

registrados antes e depois da administração de cafeína (Figura 1C). Observou-se

aumento da potência em ondas de baixa frequência, principalmente até 40 Hz

(p<0,001). De forma geral, a maior amplitude do espectro de potência do sinal ficou

entre 1 e 8 Hz, que corresponde a ondas delta e teta (p<0,001).

Tabela 1. Valores numéricos obtidos nos registros eletrocorticográficos realizados durante os experimentos

Grupo Delta (1 – 4 Hz) Teta (4 – 8 Hz) Alfa (8 – 12 Hz) Beta (12 – 28 Hz) Gama (28 – 30 Hz)

Controle / mV2/Hz X 10-3 0,003883±0,00098

77

0,01440±0,00248

6

0,01176±0,001643 0,007670±0,0014

97

0,003218±0,002155

Tratado (cafeína) / mV2/Hz

X 10-3

0,1227±0,001844** 0,03031±0,00601

8**

0,02189±0,003489

*

0,01979±0,00374

8*

0,01173±0,001083*

* médias p<0,05 e ** <0,01 em relação ao Grupo Controle. Todos os valores de ondas delta, teta, alfa, beta e gama obtidos nos grupos Controle e Tratado

(cafeína) foram apresentados.

TRADUÇÃO DA FIGURA:

Controle ECoG

Cafeína ECoG

Frequência

Tempo (segundos)

Delta – Teta - Alfa - Gama

ECoG: eletrocorticograma.

Figura 1. Registro eletrocorticográfico do Grupo Controle, mostrando aumento da

amplitude e da potência em frequências inferiores a 10 Hz (A) e o traçado

eletrocorticográfico obtido após a administração IP de 50 mg/kg de cafeína (B) a uma

distribuição de frequência acima de 10 Hz; (C) distribuição de energia espectral (PSD)

após a administração IP de cafeína (50 mg/kg) ou solução fisiológica (controle) e

respectivas oscilações cerebrais. Os dados foram analisados por comparação de médias,

empregando-se o teste t seguido do teste de Mann Whitney, com um nível de significância

de p<0,001) (n=9)

O espectro de potência do Grupo Controle revelou a seguinte relação: teta

> alfa > beta > delta = gama (p<0,05), ilustrada na Figura 2A. No grupo tratado com

cafeína o perfil dominante de oscilação foi: teta > alpha = beta > delta = gama

(p<0,05) (Figura 2B).

TRADUÇÃO DA FIGURA:

Controle

Cafeína

Potência

Teta - Alfa – Beta – Delta – Gama

Figura 2. Amplitude média de potência das oscilações cerebrais delta, teta, alfa,

beta e gama nos grupos controle e tratado com cafeína (50 mg/kg). (A) e (B)

indicam as potências predominantes nas oscilações cerebrais em ratos controle e

tratados, respectivamente. (C) Comparação das oscilações detectadas em cada

grupo (n=9) (# teste t indica significância estatística quando p<0,0001)

A oscilação média da onda delta antes e após a administração de cafeína

(0,003883±0,000987 7mV2 / Hz x 10-3 e 0,01227±0,001844 mV2 / Hz x 10-3,

respectivamente) diferiu de forma significante (p<0,0001), sendo maior no Grupo

Tratado. No Grupo Controle, as oscilações médias nas faixas teta

(0,01440±0,002569 mV2 / Hz x 10-3) e alfa (0,01176±0,001643 mV2 / Hz x 10-3)

diferiram de forma significante em relação ao grupo tratado com cafeína (teta,

0,03031±0,006081 mV2 / Hz x 10-3 e alfa 0,02189±0,003489 mV2 / Hz x 10-3;

p<0,001). A oscilação média na faixa beta no Grupo Controle (0,007670±0,001497

mV2 / Hz x 10-3) diferiu forma significante em relação ao grupo tratado com cafeína

(0,01979±0,003748 mV2 / Hz x 10-3; p<0,001). Na faixa de oscilação gama, a média

foi de 0,003218±0,002155mV2 / Hz x 10-3 no Grupo Controle e de

0,01173±0,001083mV2 / Hz x 10-3 no Grupo Tratado com cafeína (p<0,001).

A cafeína aumenta a amplitude de contração da musculatura esquelética

estriada

O registro eletromiográfico (EMG) apresentado na Figura 3A e na Tabela 2 mostra

o padrão de contração muscular em baixa amplitude (até 1 mV), com

espectrograma de distribuição de energia até 50 Hz. Passados 15 minutos da

administração IP de cafeína, a frequência de contrações aumentou, com registro de

amplitude acima de 2 mV e concentração mais alta de energia, como mostra a

Figura 3B.

As diferenças de amplitude entre o total de registros até 50 Hz mostradas

na Figura 3 indicam que a potência média diferiu de forma significante entre o

Grupo Controle e o Grupo Tratado com cafeína (6,676±2,702 mV2 / Hz x 10-3 e

28,22±6,736mV2 / Hz x 10-3, respectivamente; p<0,001) (Figura 3C). A análise das

contrações mais fortes registradas no Grupo Controle e no Grupo Tratado com

cafeína revelou diferença significante (12,94±4,470 mV2 / Hz x 10-3 e 78,56±26,46

mV2 / Hz x 10-3, respectivamente; p<0,001) (Figura 3D).

TRADUÇÃO DA FIGURA:

EMG Controle

EMG Cafeína

Amplitude

Frequência

Potência

Tempo

Figura 3. Contração do músculo gastrocnêmio registrada em animais controle (A) e

após a administração de cafeína (B). O tempo de registro foi de 300 s. A potência

observada no registro completo em frequências de até 50 Hz demonstra a potência

das contrações musculares mensurada nos animais controle e tratados com

cafeína (C). Potência das contrações mais fortes registradas nos grupos Controle e

tratado com cafeína em um tempo fixo de 5 segundos de contração (D), (# teste t

de Student indica significância estatística quando p<0,0001) (n=9).

Tabela 2. Representação numérica dos valores obtidos durante o estudo

eletromiográfico

Grupo Controle / mV2/Hz

X 10-3

Cafeína / mV2/Hz X

10-3

Registro EMG completo 6,675± 2,702 28,22±6,736

Registro da contração mais forte

(EMG)

12,94±4,470* 78,56±26,46**

* médias p<0,05 e ** <0,01 em relação Grupo Controle.

Todos os valores obtidos nos Grupos Controle e Tratado com cafeína foram apresentados. Valores encontrados no

estudo completo e valores referentes exclusivamente à contração mais forte do músculo gastrocnêmio também foram

apresentados.

A cafeína alterou os parâmetros eletrocardiográficos

As principais alterações eletrocardiográficas observadas após a administração de

cafeína foram relacionadas ao aumento da frequência cardíaca (bpm), como

mostrado nas Figuras 4A, B, C e D. Houve aumento significante da frequência

cardíaca após o uso da cafeína (249,2±21,26 e 303,7±7,194 BPM, Grupo Controle

e Tratado com cafeína, respectivamente; p=0,0004) (Figura 4E e Tabela 3).

ECG: eletrocardiograma.

TRADUÇÃO DA FIGURA:

ECG Controle D-II

ECG Cafeína D-II

Amplitude

Tempo (s)

Ritmo sinusal

Intervalos R-R (s)

Duração QRS (s)

Tempo 1 s

Intervalos Q-T (s)

Intervalos P-Q (s)

Taquicardia sinusal

Figura 4. Eletrocardiograma do Grupo Controle na derivação D-II (A);

prolongamento do intervalo 40 a 50 segundos no Grupo Controle (B);

eletrocardiograma do Grupo Tratado com cafeína na derivação D-II (C);

prolongamento 40 a 50 segundos no eletrocardiograma dos ratos tratados com

cafeína (D); características do eletrocardiograma dos ratos em ritmo sinusal na

derivação D-II, mostrado os intervalos analisados, um segundo de aumento (E);

eletrocardiograma representativo do Grupo Tratado com cafeína, mostrando as

características da deflagração cardíaca, um segundo de aumento (F).

Tabela 3. Apresentação numérica dos valores obtidos durante a execução do estudo eletrocardiográfico

Parâmetro

Frequência

cardíaca (bpm)

Amplitude

(mV) Intervalos RR (S) Duração QRS (S) Intervalos QT (S) Intervalos PQ

Controle 249,2±21,26 0,4746±0,04072 0,3453 ± 0,01276 0,01011±0,001364 0,570±0,004062 0,07056±0,003779

Tratado com

cafeína 303,7±7,194 ***

0,5250±0,01949

**

0,2400 ± 0,03651

***

0,0082±0,0007953

**

0,03153±0,004996

***

0,08306±0,007435

***

** p<0,01 em relação ao Grupo Controle e *** p<0,001 em relação ao Grupo Controle.

Lista de parâmetros obtidos através dos registros eletrocardiográficos dos grupos Controle e Tratado com cafeína (testes t de Student e de Mann Whitney).

A amplitude média também aumentou de forma significante após a

administração de cafeína (0,4746±0,04072 mV e 0,5250±0,01949 mV, Grupo

Controle e Grupo Tratado com cafeína, respectivamente; p=0,0061). O aumento da

frequência cardíaca (bpm) no registro revelou um encurtamento do intervalo RR no

ECG (Figuras 4 E e F); as médias diferiram de forma significante entre o Grupo

Controle e o Grupo Cafeína (0,3453±0,01276 segundos e 0,2400±0,03651

segundos, respectivamente; p=0,0004). A duração média do complexo QRS

também foi caracterizada pela diminuição do tempo de execução e diferiu de forma

significante entre o Grupo Controle e o Grupo Tratado com cafeína

(0,01011±0,001364 segundos e 0,0082±0,0007953 segundos, respectivamente;

p=0,0062). O ciclo cardíaco representado pelo intervalo QT, que envolve o período

de despolarização e repolarização ventricular, também diferiu estatisticamente

(média de 0,0570±0,004062 segundos e 0,03153±0,004996 segundos no Grupo

Controle e no grupo tratado com cafeína, respectivamente; p=0,0004). No caso do

intervalo PQ, a média foi de 0,07056±0,003779 segundos no Grupo Controle e de

0,08306±0,007435 segundos no Grupo Tratado com cafeína (Tabela 3).

DISCUSSÃO

Neste estudo, os registros de ECoG, EMG e ECG foram empregados para

descrever alterações eletrofisiológicas observadas em ratos após a administração

de cafeína. No grupo tratado com cafeína, a potência média foi 50% mais alta na

amplitude das oscilações cerebrais delta em relação ao controle. Acredita-se que

as ondas delta contribuam para a codificação de memórias e para o aprendizado.

(15) Efeitos agudos positivos sobre a atenção também foram demonstrados na

maioria dos estudos que investigaram os efeitos da cafeína sobre a cognição.(16)

Esse achado também pode estar relacionado ao estágio delta, uma vez que a

atividade delta “modula” o desempenho mental através da inibição de estímulos

não relacionados à tarefa a ser executada, aumentando o nível de individual de

atenção durante a execução de tarefas que requerem processamento cerebral

interno cuidadoso.(17)

O ritmo teta é implicado em diversas atividades, tais como estabelecimento

de padrões de palavras para reconhecimento da fala e sincronização de

movimentos microssacádicos, frequentemente observados no contexto do

comportamento relacionado à atenção e exploratório e a na aprendizagem

implícita, uma categoria de aprendizagem em grande parte inconsciente e

independente do hipocampo.(12-20)

As ondas alfa guardam relação com o processamento cognitivo e a

autorregulação e aumentam em situações associadas a ganhos de atenção.(21,22) As

oscilações beta são um forte preditor do desempenho perceptivo e motor.(23) Essas

oscilações têm relação com estados de alerta, foco e pensamento ativo.(24) No

córtex superior, as ondas gama aumentam durante o uso da memória de trabalho e

a aprendizagem. Essas oscilações participam da comunicação neural, refletindo a

transferência de informações do mundo exterior para o cérebro.(25)

O aumento da amplitude de todas as ondas cerebrais neste estudo (Figura

1C) sugere que a cafeína ou qualquer de seus metabólitos pode afetar direta ou

indiretamente as vias envolvidas na geração desses ritmos, podendo estimular as

funções cognitivas associadas às oscilações cerebrais e corroborando o fato de

que a cafeína age como um estimulante do SNC.(6)

Neste estudo, a administração intraperitoneal de cafeína aumentou a

frequência de contração do músculo gastrocnêmio, registrando-se maior amplitude

(2 mV) e concentração de energia (Figura 3B) em relação ao Grupo Controle

(amplitude de 1 mV) (Figura 3A). As disparidades de força de contração muscular

entre os grupos Controle e tratado com cafeína encontram-se ilustradas na Figura

3. Diferenças significativas (p<0,05) entre as duas porções analisadas podem ser

observadas, sobretudo no gráfico que mostra as contrações musculares mais

potentes. Assim, a cafeína pode afetar a função da musculatura esquelética,

promovendo maior desempenho mecânico através do aumento da capacidade do

músculo de produzir força, trabalho e energia.(26) Portanto, a melhora das

habilidades motoras pode ser atribuída à cafeína, conforme advocado por outros

pesquisadores.(27)

A cafeína estimula a atividade miocárdica, o que diminui o tempo de

contração e resulta no aumento da frequência cardíaca. Além disso, a cafeína

possui efeito inotrópico positivo, uma vez que aumenta a força de contração.(28)

Neste estudo, a frequência cardíaca (bpm) e a força de contração cardíaca (Figure

4C) aumentaram nos ratos tratados com cafeína. Combinados, esses efeitos se

traduzem em maior gasto calórico, o que confere à cafeína o status de agente

termogênico, capaz de intensificar os efeitos ergogênicos.(29) Além disso, o conceito

de que o consumo moderado de cafeína (400 – 600 mg/d) não aumenta o risco de

desenvolvimento de doença cardiovascular é amplamente difundido; ao contrário,

parece haver um efeito protetor sobre o sistema cardiovascular. Entretanto,

indivíduos predispostos ou que sofrem de doenças cardiovasculares parecem ser

mais sensíveis aos efeitos da cafeína.(30)

CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou as principais alterações eletrofisiológicas observadas no

sistema nervosa central, no miocárdio e na musculatura esquelética após a injeção

intraperitoneal de cafeína. As alterações eletrofisiológicas aqui descritas

corroboram os efeitos agudos positivos sobre o nível individual de atenção,

conforme observado após o consumo de bebidas cafeinadas com intuito de manter

o estado de alerta. No sistema nervoso central, observou-se aumento dos

espectros de amplitude delta, teta e alfa, associados à codificação de memórias e

melhora da aprendizagem. No que se refere à musculatura esquelética, foi

demonstrado um aumento da contração do músculo gastrocnêmio, uma indicação

clara de como a cafeína pode ser utilizada para melhorar o desempenho em

algumas atividades físicas. As alterações eletrocardiográficas observadas após a

administração de cafeína se referem principalmente ao aumento da frequência

cardíaca e do consumo de energia. A descrição de alterações quantitativas de

mensurações realizadas nesse espectro eletrofisiológico é de interesse para

estudos futuros destinados a determinar a dose diária ideal de cafeína e a

descrever em maiores detalhes os efeitos positivos, negativos e tóxicos associados

ao uso desse estimulante.

INFORMAÇÕES DOS AUTORES

Cabral DA: http://orcid.org/0000-0002-7582-7251

Campos FM: http://orcid.org/0000-0003-1903-0958

Silva MC: http://orcid.org/0000-0001-7697-7406

Medeiros JP: http://orcid.org/0000-0002-5110-2379

Batista PS: http://orcid.org/0000-0002-5918-2078

Jardim GC: http://orcid.org/0000-0002-0171-8300

Machado JL: http://orcid.org/0000-0003-0870-1090

Cabral LG: http://orcid.org/0000-0002-8814-9488

Mello VJ: http://orcid.org/0000-0003-0359-9760

Hamoy M: http://orcid.org/0000-0002-2931-4324

REFERÊNCIAS

31. Cappelletti S, Piacentino D, Sani G, Aromatario M. Caffeine: cognitive and physical

performance enhancer or psychoactive drug? Curr Neuropharmacol. 2015;13(1):71-88.

Review. Erratum in: Curr Neuropharmacol. 2015;13(4):554.

32. Abdel-Hady H, Nasef N, Shabaan AE, Nour I. Caffeine therapy in preterm infants.

World J Clin Pediatr. 2015;4(4):81-93. Review.

33. Daly JW. Caffeine analogs: biomedical impact. Cell Mol Life Sci. 2007;64(16):2153-

69. Review.

34. Munoz DG, Fujioka S. Caffeine and Parkinson disease: a possible diagnostic and

pathogenic breakthrough. Neurology. 2018;90(5):205-6.

35. Tabrizi R, Saneei P, Lankarani KB, Akbari M, Kolahdooz F, Esmaillzadeh A, et al.

The effects of caffeine intake on weight loss: a systematic review and dos-response meta-

analysis of randomized controlled trials. Crit Rev Food Sci Nutr. 2019;59(16):2688-96.

Review.

36. Ferré S. Mechanisms of the psychostimulant effects of caffeine: implications for

substance use disorders. Psychopharmacology (Berl). 2016;233(10):1963-79. Review.

37. Ferré S, Orrú M, Guitart X. Paraxanthine: connecting caffeine to nitric oxide

neurotransmission. J Caffeine Res. 2013;3(2):72-8.

38. Alasmari F. Caffeine induces neurobehavioral effects through modulating

neurotransmitters. Saudi Pharm J. 2020;28(4):445-51. Review.

39. Paxinos G, Franklin KB. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic

coordinates. 5th ed. Academic Press; 2019.

40. Hamoy M, Dos Santos Batista L, de Mello VJ, Gomes-Leal W, Farias RA, Dos

Santos Batista P, et al. Cunaniol-elicited seizures: behavior characterization and

electroencephalographic analyses. Toxicol Appl Pharmacol. 2018;360:193-200.

41. Estumano DP, Ferreira LO, Bezerra PA, da Silva MC, Jardim GC, Santos GF,et al.

Alteration of testosterone levels changes brain wave activity patterns and induces

aggressive behavior in rats. Front Endocrinol (Lausanne). 2019;10:654.

42. Santos GF, Ferreira LO, Gerrits Mattos B, Fidelis EJ, de Souza AS, Batista PS, et

al. Electrocorticographic description of the effects of anticonvulsant drugs used to treat

lidocaine‐induced seizures. Brain Behav. 2021;11(2):e01940.

43. Farraj AK, Hazari MS, Cascio WE. The utility of the small rodent electrocardiogram

in toxicology. Toxicol Sci. 2011;121(1):11-30. Review. Erratum in: Toxicol Sci.

2012;126(1):289.

44. Souza-Monteiro JR, Arrifano GP, Queiroz AI, Mello BS, Custódio CS, Macêdo DS,

et al. Antidepressant and antiaging effects of Açaí (Euterpe oleracea Mart.) in Mice. Oxid

Med Cell Longev. 2019;2019:3614960.

45. Jansen JM, Lopes AJ, Jansen U, Capone D, Maeda TY, Noronha A, organizadores,

et al. Medicina da noite: da cronobiologia à prática clínica. Rio de Janeiro: Editora

FIOCRUZ; 2007. p.103-20. Capítulo 7.

46. Szczepanik JC, de Oliveira PA, de Oliveira J, Mack JM, Engel DF, Rial D, et al.

Caffeine mitigates the locomotor hyperactivity in middle‐aged low‐density lipoprotein

receptor (LDLr)‐knockout mice. CNS Neurosci Ther. 2016;22(5):420-2.

47. Harmony T, Fernández T, Silva J, Bernal J, Díaz-Comas L, Reyes A, et al. EEG

delta activity: an indicator of attention to internal processing during performance of mental

tasks. Int J Psychophysiol. 1996;24(1-2):161-71.

48. Hyafil A, Fontolan L, Kabdebon C, Gutkin B, Giraud AL. Speech encoding by

coupled cortical theta and gamma oscillations. Elife. 2015;4:e06213.

49. Kienitz R, Schmiedt JT, Shapcott KA, Kouroupaki K, Saunders RC, Schmid MC.

Theta rhythmic neuronal activity and reaction times arising from cortical receptive field

interactions during distributed attention. Curr Biol. 2018;28(15):2377-87.e5.

50. Loonis RF, Brincat SL, Antzoulatos EG, Miller EK. A meta-analysis suggests

different neural correlates for implicit and explicit learning. Neuron. 2017;96(2):521-34.e7.

Review.

51. Bazanova O. Comments for current interpretation EEG alpha activity: a review and

analysis. J Behav Brain Sci. 2012;2(2):239-48.

52. Kim SC, Lee MH, Jang C, Kwon JW, Park JW. The effect of alpha rhythm sleep on

EEG activity and individuals’ attention. J Phys Ther Sci. 2013;25(12):1515-8.

53. Sherman MA, Lee S, Law R, Haegens S, Thorn CA, Hämäläinen MS, et al. Neural

mechanisms of transient neocortical beta rhythms: converging evidence from humans,

computational modeling, monkeys, and mice. Proc Natl Acad Sci U S A.

2016;113(33):E4885-94.

54. Kim JH, Chung EJ, Lee BH. A study of analysis of the brain wave with respected to

action observation and motor imagery: a pilot randomized controlled trial. J Phys Ther Sci.

2013;25(7):779-82.

55. Jia X, Kohn A. Gamma rhythms in the brain. PLoS Biol. 2011;9(4):e1001045.

56. Tallis J, Duncan MJ, James RS. What can isolated skeletal muscle experiments tell

us about the effects of caffeine on exercise performance? Br J Pharmacol.

2015;172(15):3703-13. Review.

57. Sousa AM, Suzuki FA. Effect of caffeine on cervical vestibular-evoked myogenic

potential in healthy individuals. Braz J Otorhinolaryngol. 2014;80(3):226-30.

58. Chaban R, Kornberger A, Branski N, Buschmann K, Stumpf N, Beiras-Fernandez A,

et al. In-vitro examination of the positive inotropic effect of caffeine and taurine, the two

most frequent active ingredients of energy drinks. BMC Cardiovasc Disord.

2017;17(1):220. Erratum in: BMC Cardiovasc Disord. 2019;19(1):33.

59. Murayama T, Ogawa H, Kurebayashi N, Ohno S, Horie M, Sakurai T. A tryptophan

residue in the caffeine-binding site of the ryanodine receptor regulates Ca2+ sensitivity.

Commun Biol. 2018;1:98.

60. Turnbull D, Rodricks JV, Mariano GF, Chowdhury F. Caffeine and cardiovascular

health. Regul Toxicol Pharmacol. 2017;89:165-85. Review.