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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Cuantificación de Campylobacter spp. en un matadero Semi-industrial de
Aves, y posterior identificación de especies (C. jejuni y C. coli) mediante
técnicas de Diagnóstico Molecular.
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de Médico
Veterinario Y Zootecnista.
AUTOR:
José Luis Medina Santana
TUTOR:
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
Quito, Diciembre 2015
iii
DEDICATORIA
A Dios, quien estuvo conmigo en todo momento permitiéndome seguir
adelante cuando parecía desfallecer, y encontrar la luz y guía en esos
momentos de desesperación.
A mi padre por todo el esfuerzo y valores centrados en mí, por sus consejos
y enseñanzas que me permitieron seguir, y no rendirme a pesar de las
adversidades del camino, a mi madre por cada minuto de su tiempo y
dedicación, por esas plegarias encaminadas al cielo a mi favor, a Juan y
Jean, hermanos gracias por su apoyo y cariño.
José
v
AGRADECIMIENTO
A mis mentores por esa semilla de curiosidad y conocimiento que plantaron
en mí, originando el interés y amor a esta bella profesión, en especial al Dr.
Christian Vinueza por permitirme ser parte del presente proyecto, por su
paciencia y constancia. Dr. Jorge Mosquera, maestro y amigo quien a más
de brindarme su conocimiento infundio valores y brindo herramientas para
superar el día a día. Dr. Marco Cisneros, quien me permitió abrir los ojos y
posibilidades a un mundo que consideraba negado, gracias por sus
enseñanzas y lecciones que me permitieron conocer un campo nuevo y
fascinante.
A Cristian, Marco, Jorge, Vero, Carlos y Sandra, por su compañía, ayuda y
pericias compartidas, gracias por cada mano y ánimo dado.
Y a todas aquellas personas que de una u otra manera aportaron a mi
formación, gracias por su apoyo y palabras de aliento, a todos y cada uno
de ustedes que Dios los bendiga.
vii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, JOSÉ LUIS MEDINA SANTANA, en calidad de autor del trabajo de
investigación o tesis realizada sobre “CUANTIFICACIÓN DE
Campylobacter spp. EN UN MATADERO SEMI-INDUSTRIAL DE AVES, Y
POSTERIOR IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES (C. jejuni. y C. coli.)
MEDIANTE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR”, autorizo hacer
uso de todos los contenidos correspondientes o de parte de los que
contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autores no corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley
Intelectual y su Reglamento.
Quito, a 10 de Diciembre del 2015.
FIRMA
C.C. 172129090-4
ix
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de tutor del trabajo de Grado presentado por el Sr. JOSÉ
LUIS MEDINA SANTANA, para optar por el Título o Grado de Médico
Veterinario y Zootecnista, cuyo título es “CUANTIFICACIÓN DE
Campylobacter spp. EN UN MATADERO SEMI-INDUSTRIAL DE AVES, Y
POSTERIOR IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES (C. jejuni y C. coli)
MEDIANTE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR”. Considero que
dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a
la presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que
se designe.
Quito a los 2 días del mes de diciembre del 2015.
_____________________________
FIRMA
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
C.C.: 1713266227
xi
APROBACIÓN DE TRIBUNAL
CUANTIFICACIÓN DE Campylobacter spp. EN UN MATADERO SEMI-
INDUSTRIAL DE AVES, Y POSTERIOR IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
(C. jejuni y C. coli) MEDIANTE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR.
El tribunal constituido por:
Presidente: Dra. María Inés Baquero.
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos.
Vocal Principal: Dr. Richard Rodríguez
Vocal Suplente: Dr. Alex Andrade.
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la
obtención del título o grado de Médico Veterinario Zootecnista, presentado
por el Sr. José Luis Medina Santana.
Con el título:
“Cuantificación de Campylobacter spp. en un matadero Semi-industrial de
Aves, y posterior identificación de especies (C. jejuni y C. coli) mediante
técnicas de Diagnóstico Molecular”.
Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO
En la Ciudad de Quito, a __________________ de 2015.
Para constancia de lo actuado firman:
Presidente: Dra. María Inés Baquero. ____________________________.
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos. ____________________________.
Vocal Principal: Dr. Richard Rodríguez ______________________________.
Vocal Suplente: Dr. Alex Andrade. __________________________________.
xiii
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ......................................................................................... iii
AGRADECIMIENTO .................................................................................. v
ÍNDICE GENERAL ................................................................................. xiii
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................ xv
ÍNDICE DE GRÁFICOS ......................................................................... xvii
RESUMEN.............................................................................................. xix
INTRODUCCIÓN ...................................................................................... 1
CAPÍTULO I ............................................................................................... 5
EL PROBLEMA ...................................................................................... 5
Planteamiento y Justificación del Problema. ....................................... 7
Objetivos .......................................................................................... 11
CAPÍTULO II ............................................................................................ 13
MARCO TEÓRICO .............................................................................. 15
Características .................................................................................. 15
Taxonomía ....................................................................................... 17
Diagnóstico de Campylobacter spp. ................................................. 19
Identificación de Especies. ............................................................... 21
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .................................. 24
Epidemiología. .................................................................................. 29
Camales. .......................................................................................... 35
CAPÍTULO III ........................................................................................... 43
METODOLOGÍA .................................................................................. 45
Tipo de investigación ........................................................................ 45
Diseño de la investigación ................................................................ 45
Descripción de la zona de estudio .................................................... 45
Población y muestra ......................................................................... 45
Muestra ............................................................................................ 45
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN. ...................................... 46
Muestreo de Campo. ........................................................................ 46
Procesamiento de muestras bacteriológicas. ................................... 47
Procesamiento de PCR múltiple. ..................................................... 50
Análisis y Recolección de Datos ...................................................... 53
CAPÍTULO IV .......................................................................................... 55
RESULTADOS .................................................................................... 57
Presentación de Resultados. ........................................................... 57
Discusión de Resultados. ................................................................. 62
CAPÍTULO V........................................................................................... 65
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ...................................... 67
Conclusiones. .................................................................................. 67
Recomendaciones. .......................................................................... 69
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................ 71
ANEXOS ................................................................................................. 85
xv
ÍNDICE DE CUADROS
TABLA 1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL GENERO CAMPYLOBACTER SPP. ...18
TABLA 2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE
CAMPYLOBACTER. ...............................................................................23
TABLA 3. RESUMEN DE VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS MÉTODOS DE
DETECCIÓN RÁPIDA..............................................................................28
TABLA 4. EFECTO DE OPERACIONES EN EL PROCESAMIENTO PRIMARIO SOBRE LA
CONCENTRACIÓN DE CAMPYLOBACTER SPP. ..........................................40
TABLA 5. MUESTRAS COLECTADAS Y PROCEDAS EN EL PROYECTO. .................46
TABLA 6. RESPALDOS REALIZADOS EN EL PROYECTO .....................................50
TABLA 7. PREPARACIÓN DE UN MASTERMIX PARA 5 REACCIONES. ...................51
TABLA 8. PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR PARA C. COLI. Y C JEJUNI. .....52
TABLA 9. PRUEBA DE NORMALIDAD DE CARGA BACTERIANA SEGÚN PUNTOS DE
MUESTREO. ........................................................................................58
TABLA 10. CARGAS BACTERIANAS EN LOS CINCO PUNTOS DE MUESTREO (LOG
10). ...................................................................................................58
TABLA 11. PRUEBA DE KRUSKAL WALLIS. .....................................................60
TABLA 12. PRUEBA U DE MANN-WHITNEY ....................................................60
TABLA 13. ESPECIES DE CAMPYLOBACTER IDENTIFICADAS DURANTE ES ESTUDIO.
.........................................................................................................61
TABLA 14. CARGA BACTERIANA EN LOG 10 DE CAMPYLOBACTER SPP. ..............93
TABLA 15. CEPAS DE CAMPYLOBACTER SPP RESPALDADAS E IDENTIFICADAS
DURANTE ES ESTUDIO. .........................................................................94
xvii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN DE CASOS REPORTADOS DE CAMPILOBACTERIOSIS
CONFIRMADA POR MESES EN 2012 COMPARADOS CON LOS DATOS 2008–
2011, EU/EEA. ..................................................................................30
FIGURA 2. TASAS DE CASOS REPORTADOS DE CAMPILOBACTERIOSIS
CONFIRMADOS, EN EDAD Y GÉNERO EN LA UE/EEA. ...............................31
FIGURA 3. DISTRIBUCIÓN DE CASOS REPORTES CONFIRMADOS DE
CAMPILOBACTERIOSIS EN MESES, EU/EEA, 2008–2012. .......................31
FIGURA 4. REPORTES DE TASAS NOTIFICADAS DE ZOONOSIS EN CASOS HUMANOS
CONFIRMADOS EN LA EU, 2013. ...........................................................32
FIGURA 5. DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL PROCESAMIENTO DE AVES. ...............37
FIGURA 6. AGAR RC CON COLONIAS ROJIZAS CARACTERÍSTICAS DE
CAMPYLOBACTER SPP. ........................................................................57
FIGURA 7. UFC EN LOG 10 POR PUNTO DE MUESTREO EN LOS DISTINTOS
MUESTREOS. ......................................................................................59
FIGURA 8. PROMEDIOS DE UFC EN LOG 10 POR PUNTO DE MUESTREO A LO
LARGO DEL ESTUDIO. ...........................................................................59
FIGURA 9. GEL DE AGAROSA CON BANDAS ESPECIFICAS PARA C. JEJUNI Y C.
COLI ...................................................................................................61
FIGURA 10. RELACIÓN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES IDENTIFICADAS. ...........61
xix
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FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Cuantificación de Campylobacter spp. en un matadero semi-industrial de aves, y posterior identificación de especies (C. jejuni y C. coli) mediante técnicas de Diagnóstico Molecular.
Autor: José Luis Medina Santana
Tutor: Dr. Cristian Vinueza M.Sc.
Fecha: Diciembre de 2015.
RESUMEN
La campilobacteriosis es una enfermedad entérica causada por
bacterias del genero Campylobacter spp. asociada principalmente a
Campylobacter coli y Campylobacter jejuni. Normalmente se la vincula
con la carne de ave y sus derivados al poseer estas características que
facilitan la supervivencia y replicación de las mismas. Se realizó un
estudio cuantitativo, no experimental, transversal, cuyo objetivo fue
cuantificar, aislar y tipificar C. jejuni y C. coli en puntos críticos de control
en un camal semi-industrial, mediantes métodos microbiológicos y
moleculares. Durante el faenamiento de las aves se estableció 4 puntos
críticos de control. Finalizado los 3 meses de muestreo se obtuvo 100
muestras, observándose un aumento significativo (P < 0,05) tras el
eviscerado y una reducción significativa (P < 0,05) al salir del
enfriamiento. Se aíslo 485 cepas al azar, las especies detectadas fueron:
363 (74,85%) C. coli, 75 (15,46%) C. jejuni, 7 (1,44%) muestras mixtas
de C. coli y C. jejuni y 40 (8,25%) no pudieron ser identificadas.
Concluyendo, en el presente estudio que C. jejuni fue la especie
predominante.
Descriptores:
Campylobacter coli/Campylobacter jejuni/Pollos Broiler/Pichincha-Quito/
Aislamiento Bacteriológico/Tipificación Molecular
xxi
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE
SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE
A quantification of Campylobacter spp. in a semi-industrial poultry
slaughterhouse with subsequent identification of the species (C.
jejuni and C. coli) utilizing molecular diagnostic techniques.
By: José Luis Medina Santana
Tutor: Dr. Cristian Vinueza M.Sc.
Date: December 2015
SUMMARY
Campylobacteriosis is an enteric disease caused by bacteria from the
Campylobacter spp. and most commonly caused by Campylobacter coli and
Campylobacter jejuni. Normally, it is associated with poultry and its
derivatives due to the fact that they possess many qualities that make it an
ideal environment in which these strains can survive and replicate. A
quantitative, non-experimental, longitudinal study was done with the
objective of quantifying, isolating, and identifying C. jejuni and C. coli at
control points within a semi-industrial poultry slaughterhouse utilizing
microbiological and molecular identification methods. Four different control
points were established throughout the slaughter line. One hundred
samples were taken over a three month span. A significant increase (P <
0.05) after evisceration and a significant decrease (P < 0.05) after cooling
were observed. From the same, 485 were isolated randomly and identified
using Multiplex PCR. The results showed that 363 (74.85%) were C. coli,
75 (15.46 %) were C. jejuni, 7 (1.44%) were mixed samples of both C. coli
and C. jejuni, and 40 (8.25%) were unable to be identified utilizing the
primers in this study. In conclusion, in this study to C. jejuni it was the
predominant species.
Key Words:
Campylobacter coli/Campylobacter jejuni/Poultry/Broilers/Pichincha-Quito/
Bacteriological Isolation/Molecular Typification
INTRODUCCIÓN
3
En los países en vías de desarrollo las diarreas infecciosas agudas son
patologías de gran frecuencia, Campylobacter spp. ha sido reconocido
desde los años 70 como un agente responsable, siendo objeto de un
creciente interés en los últimos años, ya que, ha pasado a ser el primer
agente productor de diarreas bacterianas en algunos grupos etarios, sobre
todo en población pediátrica y un importante microorganismo en grupos de
riesgo (Prieto, López, Pavan, & Littvik, 2013).
Campylobacter coli, así como Campylobacter jejuni, son las especies más
comunes del género Campylobacter y ambos se posicionan entre los
principales agentes causantes de gastroenteritis y enterocolitis aguda en
humanos (Mena et al., 2013).
Un experimento llevado a cabo en voluntarios humanos determinó que se
necesitan solo 500 unidades formadoras de colonias (UFC) de C. jejuni en
200 ml de leche para producir diarrea (Stanchi et al., 2007).
Las infecciones sistémicas pueden presentarse en pacientes sanos, pero
la mayoría de casos documentados corresponden a pacientes
inmunosuprimidos o con desnutrición, neoplasias,
hipogammaglobulinemia, hepatopatías crónicas, nefropatías o en las
edades extremas de la vida. La mortalidad atribuida a bacteriemias por
Campylobacter spp. en pacientes inmunosuprimidos ronda entre el 4% y el
16% (Mena et al., 2013).
Si bien es posible obtener pollos parrilleros libres de Campylobacter spp. la
contaminación en granjas suele ser habitual. Es común encontrar más de
105 UFC/g en contenido cecal, propiciándose de esta manera una
contaminación muy frecuente de la canal en los mataderos (Stanchi et al.,
2007).
Los problemas de salud relacionados con los patógenos de transmisión
alimentaria (PTA) requieren de procedimientos adecuados de vigilancia y
control sanitario. Las metodologías basadas en la Reacción en Cadena de
4
la Polimerasa (PCR) aparecen como promisorias frente a la detección
fenotípica de PTA (Gómez et al., 2013).
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
7
EL PROBLEMA
Planteamiento y Justificación del Problema.
Las bacterias que pertenecen al género Campylobacter son Gram-
negativas, en forma de bastones y adquieren cuerpos esféricos o cocoides
en cultivos de más edad y no forman esporas (Iglesias Collar, 2013). Tienen
entre 0,2 a 0,9 micras de ancho y 0,5 a 5 micras de largo, son móviles y por
lo general se desplazan con un flagelo polar desenvainado en uno o ambos
extremos (Epps et al., 2013).
Son termófilos, no sacarolíticos y microaerófilos (requiriendo una
concentración de oxígeno de 5 a 7% y de 5 a 10% de dióxido de carbono
para su crecimiento (van Vliet & Ketley, 2001), aunque se han encontrado
algunas especies que pueden crecer en condiciones anaeróbicas o
aeróbicas (Nachamkin, Szymanski, Blaser, Kelly, & Miller, 2008).
Las enfermedades infecciosas causadas por miembros del género
Campylobacter spp. se denominan campilobacteriosis. Actualmente
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli se consideran los
enteropatógenos más importantes dentro del género (Epps et al., 2013).
La manifestación clínica de campilobacteriosis es difícilmente distinguible
de otras infecciones bacterianas intestinales. En casos severos por C.
jejuni, se pueden presentar complicaciones post-infección, principalmente
el síndrome de Guillain Barré o su forma variable más común síndrome de
Fisher Mille. Atribuyéndosele aproximadamente del 20 al 50% de los casos
clínicos reportados en Europa, Norte y Sudamérica, Japón y Australia
(Epps et al., 2013).
Estudios en Japón han determinado que el riesgo de desarrollar el
síndrome de Guillain Barré está más asociado a infecciones por C. jejuni
del tipo O:19 (Epps et al., 2013).
Las tasas de infecciones por Campylobacter spp. han aumentado en todo
el mundo, superando las reportadas como shigelosis, constituyéndose en
8
una de las infecciones alimentarias con mayor incidencia entre la población
en los países industrializados (Iglesias Collar, 2013). De igual forma se le
atribuye gran importancia socioeconómica, provocando incluso más casos
de diarrea transmitida por los alimentos que Salmonella spp. (Epps et al.,
2013; Iglesias Collar, 2013; Lapierre, 2013).
Los productos cárnicos carentes de manejo adecuado se constituyen en
vehículos propicios para la diseminación de entes contaminantes de
naturaleza física, química o biológica, que pueden ser causa de
enfermedades en los seres humanos (Iglesias Collar, 2013).
Las aves de corral y productos derivados siguen siendo la primera causa
de ETAS en todo el mundo (Epps et al., 2013).
Las aves son un importante reservorio de Campylobacter spp.,
presentándose habitualmente hasta en el 80% de las canales (EFSA &
ECDC, 2012).
La mayoría de las infecciones de origen alimenticio causadas por
Campylobacter spp. se asocian al consumo de pollos de engorde (Romero
Scharpen et al., 2013; Seliwiorstow, Baré, Van Damme, Uyttendaele, & De
Zutter, 2015).
Así la división sobre Riesgos Biológicos de la Autoridad Europea de
Seguridad Alimentaria (EFSA), estima que la manipulación, preparación y
consumo de carne de pollo son los responsables de un 20% a 30% de los
casos de campilobacteriosis humana en la UE, mientras que del 50% al
80% se puede atribuir a las aves (pollos broiler) como reservorio (EFSA &
ECDC, 2012).
La epidemiología de la infección por Campylobacter spp. es compleja, ya
que, el microorganismo se encuentra ampliamente distribuido en el
ambiente (EFSA & ECDC, 2012; Iglesias Collar, 2013).
El particular método de sacrificio de las aves, con etapas como el escaldado
y el desplumado contribuyen a la diseminación y alta prevalencia de esta
bacteria. Las condiciones de almacenamiento junto con la naturaleza de la
9
piel de las aves facilita la supervivencia de Campylobacter spp (Iglesias
Collar, 2013).
Se estima que la colonización en aves de engorde tiene lugar antes de los
siete días de edad, debido al incompleto sistema inmune de éstas y la gran
capacidad de transmisión horizontal del patógeno (Bahrndorff, Rangstrup-
Christensen, Nordentoft, & Hald, 2013; Epps et al., 2013), alcanzando
mayores porcentajes de colonización a la edad de sacrificio.
De forma experimental se demostró que una dosis infectante de 40 UFC de
Campylobacter spp. puede ser suficiente para contaminar a los pollos. Una
vez establecida la infección, alcanza rápidamente un elevado número en el
contenido cecal, observándose una media de 106 – 107 UFC/g de heces en
pollos con 30 a 45 días de edad (INS, UERIA, & MINSALUD, 2013; Torralbo
Montoro, 2013).
Se ha documentado que la contaminación de las canales con el patógeno
se produce al momento de su sacrificio, además de que los niveles de
Campylobacter spp. en ciegos al momento del sacrificio inciden
proporcionalmente con los niveles de contaminación de la canal y en
consecuencia su riesgo a la salud pública (El-Shibiny, Connerton, &
Connerton, 2009; Schroeder, Eifert, Ponder, & Schmale, 2014; Seliwiorstow
et al., 2015).
La campilobacteriosis humana ha presentado un marcado aumento de
reportes en la Unión Europea (UE) a partir del 2008, debido a una vigilancia
más estricta o mayor conciencia de la campilobacteriosis humana. Sin
embargo dadas las características de este patógeno multi-hospedador, es
difícil entender todos los aspectos de su epidemiología y las posibles
razones para el aumento de los casos humanos (EFSA & ECDC, 2012).
Las especies asociadas con enfermedades gastrointestinales más
importantes en seres humanos son: Campylobacter jejuni, Campylobacter
coli, Campylobacter lari, Campylobacter fetus y Campylobacter upsaliensis.
De estas especies, C. jejuni es responsable del 80-85% de todas las
10
infecciones humanas, en tanto que C. coli es la segunda especie más
aislada (10 a 15%). En Sudamérica C. coli representa cerca del 25% de los
casos clínicos registrados (Fernández, 2011; Lastovica, Le Roux, Byrne, &
Bourke, 2001).
Hay que tener a consideración que no todos los casos diagnosticados como
campilobacteriosis deben ser atribuidos a la ingesta de carne de pollo, pues
el género Campylobacter spp. está ampliamente distribuido en la
naturaleza (Lapierre, 2013).
En Sudamérica, se ha podido atribuir la mayor prevalencia de C. coli en
casos clínicos registrados a una vinculación directa entre medio ambiente
y el consumo de alimentos (contaminación cruzada), que al consumo de
carne de pollo en sí (Fernández, 2011).
Un alto número de niños en los países en vías de desarrollo se ven
afectados por las infecciones por Campylobacter spp., estimándose 60.000
casos por cada 100.000 niños menores a 5 años, sugiriendo que la
campilobacteriosis es una enfermedad pediátrica en éstos países (Epps et
al., 2013).
Sin embargo, existe un alto número de casos de campilobacteriosis que no
son notificados, por tanto se estima que infección real debe ser mayor que
la reportada en algunos estudios. Con estos antecedentes se han estimado
que la prevalencia sería entre un 7,6 y 100 veces más alta que los valores
oficiales declarados en varios países (Lapierre, 2013).
Un estudio llevado a cabo en 2011 recopiló información previa de países
sudamericanos, encontrándose un hallazgo frecuente de portadores sanos,
un comportamiento observado hace poco en Ecuador (Vasco et al., 2014),
aunque algo poco usual en países desarrollados (Fernández, 2011).
Un estudio realizado en contenido gastrointestinal de aves faenadas en
Quito y publicado en el 2014 arrojo una prevalencia de Campylobacter spp.
del 71,8%, de los cuales el 17,69% correspondía a C. jejuni y el 67,69% a
C. coli (Poma, 2014).
11
Por su parte otro estudio realizado en aves en sus respectivos puntos de
comercialización en la ciudad de Loja (Ecuador) y publicado en el 2015
arrojó una prevalencia de Campylobacter spp. del 62.7%, de los cuales el
68.8% correspondía a C. jejuni y el 31.2% a C. coli.(Simaluiza, Zorayda,
Ochoa, & Fernandez, 2015).
En base a éstos datos, podemos apreciar que, si bien se mantiene una
prevalencia más o menos estable de Campylobacter spp. entre el inicio del
proceso de faenado y el expendio en puntos de venta, la relación de las
especies citadas contrastan notoriamente.
La cuantificación y tipificación en puntos críticos del proceso de faenado
nos permitirá conocer la dinámica de la carga bacteriana a lo largo de la
misma, entendiendo la repercusión que tienen los distintos procesos como
el escaldado, desplume, enfriamiento mediante inmersión, y la
manipulación del operador.
La PCR de tipo múltiple para identificar las especies de Campylobacter spp.
ha sido utilizada en varios estudios. Así, en 1997 se usó esta técnica para
identificar y tipificar distintas subespecies de Campylobacter spp. de origen
intestinal (Stephen & Vandamme, 1997). Otro estudio en Dinamarca utilizó
PCR Multiplex para identificar C. coli y C. jejuni de cultivos puros y en
muestras de heces (Persson & Olsen, 2005).
El estudio y monitoreo de estos patógenos en las cadenas de producción
de alimentos permitirá mejorar los procesos de industrialización de carne
para obtener un producto alimenticio inocuo.
Objetivos
Objetivo General:
Cuantificar Campylobacter spp. en un matadero Semi-industrial de
Aves en la provincia de Pichincha, e identificar C. coli y C. jejuni
mediante técnicas de Diagnóstico Molecular.
12
Objetivos Específicos:
Aislar y cuantificar Campylobacter spp. en puntos críticos de control.
Identificar C. coli. y C. jejuni. presentes mediante técnicas
moleculares (PCR).
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
15
MARCO TEÓRICO
Características
Las especies de Campylobacter son bacterias espiraladas curvas
microaerófilas (necesitan menos O2,) y capnófilas (necesitan más CO2,),
móviles por medio de un único flagelo polar sin vaina (Koneman, Allen,
Janda, Schreckenberger, & Winn, 2013).
Estos microorganismos tienen un metabolismo no fermentador y no
oxidativo, y obtienen energía del uso de aminoácidos y los intermediarios
de cuatro y seis carbonos del ciclo de Krebs (Koneman et al., 2013).
Se necesita de condiciones especiales para su cultivo incluyendo una
atmósfera con dióxido de carbono enriquecido y reducida de oxígeno
(oxígeno al 5%, dióxido de carbono 10% y nitrógeno al 85%). Además, los
medios selectivos que se utilizan comúnmente incorporan antibióticos para
inhibir flora competitiva (Dey et al., 2012). Algunas células pueden adoptar
formas esféricas, cocoides o elongadas no cultivables en situaciones de
carencia o estrés, como por ejemplo en cultivos viejos o expuestos a
condiciones ambientales adversas, como oxígeno atmosférico (Haba &
Giménez, 2007).
Se los solía clasificar con las especies de Vibrio, hasta que algunos
estudios de homología del DNA mostraron que no estaban relacionados
con los vibriones (Koneman et al., 2013).
Aun entre las especies de Campylobacter actualmente reconocidas, existe
gran diversidad genotípica y fenotípica. Los microorganismos habitan una
amplia variedad de nichos ecológicos y ambientes (Koneman et al., 2013).
Si bien hace más de 90 años se diagnosticó estas bacterias en animales,
no fue hasta 1970 cuando finalmente se reconoció como patógeno humano
(Iglesias Collar, 2013).
16
La campilobacteriosis es la causa bacteriana más común de las
enfermedades diarreicas y las especies más comunes asociados con la
infección humana son C. jejuni, C. coli y C. lari (ECDC, 2014). El período
de incubación varía de dos a cinco días. Los síntomas clínicos más
comunes son diarrea acuosa, a veces con sangre, dolor abdominal, fiebre,
dolor de cabeza y náuseas. En algunos casos, la infección por
Campylobacter spp. puede provocar complicaciones pos clínicas graves,
incluyendo la artritis reactiva, el síndrome de Guillain-Barré (parálisis
progresiva aguda) y el síndrome de Intestino Irritable (ECDC, 2014; WHO,
2013).
Un estudio de infección experimental humano reveló que la tasa de
colonización se incrementó con el aumento de dosis de C. jejuni, mientras
que el desarrollo de la enfermedad no. La infección con una dosis tan baja
como 800 UFC dio lugar a la diarrea en algunos voluntarios, sin embargo,
se ha especulado que dosis tan bajas como 360 UFC de C. jejuni pueden
ser suficientes para desarrollar campilobacteriosis. (Kaakoush, Castaño-
Rodríguez, Mitchell, & Man, 2015).
El Síndrome de Guillain Barré es una enfermedad grave, que requiere de
cuidados intensivos en un 20% de los casos; las tasas de letalidad en los
países de altos ingresos son entre 3 y 10%. A nivel mundial,
aproximadamente un tercio de los casos se han atribuido a la infección por
Campylobacter spp. Si bien es difícil determinar su verdadero alcance
debido a la falta de criterios diagnósticos y de clasificación, los estudios
sugieren que ocurre en el 1-5% de los infectados por esta bacteria (Epps
et al., 2013; WHO, 2013).
Se ha estimado que el 25% de los casos artritis reactiva puede pasar a
espondiloartropatía crónica. El Síndrome de Intestino irritable se desarrolla
en hasta el 36% de los pacientes con campilobacteriosis dentro de 1-2 años
después de la infección; el riesgo parece ser mayor entre las personas con
enfermedad aguda más grave (WHO, 2013).
17
Campylobacter spp. son frecuentes en animales productores de alimentos,
mascotas, aves silvestres, y en las fuentes de agua del medio ambiente. Si
bien se producen brotes, la mayoría de las enfermedades registradas
aparece como casos esporádicos y la vía de transmisión es raramente
identificada. Los brotes están asociados con la ingestión de alimentos
contaminados (principalmente pollo o leche no pasteurizada) o agua. La
transmisión entre personas aunque posible, es rara (ECDC, 2014).
Taxonomía
La primera descripción del genero Campylobacter fue realizada por
Theodor Escherich en 1886 en heces procedente de bebes con diarrea,
reportando un microorganismo espiriláceo, no cultivable, denominándolo
Vibrio felinus, por su parecido morfológico con otros aislamientos de Vibrio
(Iglesias Collar, 2013; Nachamkin et al., 2008).
En 1963 Mc Fadyean y Stockman realizaron el primer aislamiento de estos
organismos provenientes de fetos ovinos abortados, llamados para
entonces V. fetus y reconocidos actualmente como C. fetus (Haba &
Giménez, 2007; Nachamkin et al., 2008).
En 1963, Sebald y Véron transfieren las especies Vibrio feto y Vibrio
bubulus, a un nuevo género llamándolo Campylobacter, denominándolos
Campylobacter fetus y Campylobacter bubulus, respectivamente. Las
razones para la transferencia y creación del nuevo género incluyeron su
bajo peso molecular, sus requerimientos de crecimiento microaerófilo, y su
metabolismo no fermentador (Koneman et al., 2013; Nachamkin et al.,
2008).
La clasificación de estas bacterias está en continua revisión y modificación,
según la organización mundial de la salud a la fecha el género está
compuesto por más de 17 especies y 6 subespecies (WHO, 2011).
En 1991, una revisión de la taxonomía y nomenclatura del género
Campylobacter fue propuesto de acuerdo con Manual de Bergey (Lapierre,
18
2013). Con los cambios ocurridos recientemente (WHO, 2011), la
clasificación taxonómica del género se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Clasificación Taxonómica del Genero Campylobacter spp.
Categoría Taxonómica Bacteria
Filo Proteobacteria.
Clase Épsilon.
Orden Campilobacterales.
Familia Campylobacteraceae.
Género Campylobacter
Especies
C. avium
C. canadensis
C. coli
C. concisus
C. cunicolurum
C. curvus
C. fetus
C. gracilis
C. helveticus
C. hyointestinalis
C. lawsonii
C. hominis
C. hyoilei
C. insulaenigrae
C. jejuni
C. lanienae
C. lari
C. mucosalis
C. peloridis
C. rectus
C. showae
C. sputorum
C. subantarticus
C. upsaliensis
C. volucris
C. ureoliticus
19
Subespecies
C. fetus subespecie fetus
C. fetus subespecie venerealis
C. hyointestinalis subespecie hyointestinalis
C. hyointestinalis subespecie lawsonii
C. jejuni subespecie jejuni
C. jejuni subespecie doylei
C. sputorum biovariedad bubulus
C. sputorum biovariedad fecalis
C. sputorum biovariedad sputorum
Fuente: (Koneman et al., 2013; Lapierre, 2013)
Elaboración: El autor.
Diagnóstico de Campylobacter spp.
Campylobacter spp. es difícil de aislar, cultivar e identificar. El esquema de
identificación convencional para Campylobacter spp. y microorganismos
relacionados se basa en características fenotípicas clásicas, como el
aspecto morfológico, reacciones bioquímicas, la temperatura de
crecimiento y pruebas de tolerancia (WHO, 2013).
La mayoría de Campylobacter spp. requieren una atmósfera microaerófila
con aproximadamente 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono, y 85%
de nitrógeno. Algunas especies como C. sputorum, C. concisus, C.
mucosalis, C. curvus, C. rectus y C. hyointestinalis, pueden requerir de
hidrógeno para el aislamiento primario (Koneman et al., 2013; WHO, 2013).
El método convencional para aislar las especies de Campylobacter
entéricos comunes (C. jejuni y C. coli) de las heces, es cultivo primario en
medios selectivos e incubación a 42°C en una atmósfera microaeróbica
durante 48h (Koneman et al., 2013; Nachamkin et al., 2008; OIE, 2008;
WHO, 2013).
Los medios selectivos que inhiben la flora competitiva y mejoran la
recuperación de Campylobacter spp. se pueden clasificar en medios con
base sangre y aquellos con base en carbón libre de sangre, ambos
contienen uno o más antibióticos, principalmente Cefoperazona. Entre los
medios con sangre están: Agar Preston, Agar Skirrow, Campy-Cefex. Y
20
entre los con carbón: mCCDA, Agar Karmali, medio de carbón selectivo
(CSM), entre otros. Vale considerar que no todos los medios de cultivo de
uso común han sido plenamente validados en entornos clínicos de
laboratorio de diagnóstico (Poma, 2014; WHO, 2013).
Además se ha reportado que un aumento de la flora competitiva resistente
a los antimicrobianos puede afectar la selectividad. El medio cromogénico
selectivo para Campylobacter spp. de reciente introducción, ha venido a
apaciguar en algo este problema reduciendo la carga de trabajo en el
laboratorio (Oyarzabal, Macklin, Barbaree, & Miller, 2005; WHO, 2013).
El aislamiento de Campylobacter spp. de muestras alimentarias y
ambientales requiere de métodos más complejos, generalmente se
requiere de enriquecimiento precedido de incubación a 37°C a fin de
revitalizar las bacterias que han sido dañadas por la exposición al calor o
al frío. Se ha observado que variaciones en el método de enriquecimiento
utilizado y en el momento de la adición de antibióticos puede afectar los
resultados (WHO, 2013).
En vista de esto la Organización Internacional de Normalización (ISO por
sus siglas en Ingles) ha desarrollado y publicado cuatro normas que
contemplan la detección, el aislamiento y el recuento de Campylobacter
spp. en alimentos, agua y muestras ambientales (WHO, 2013).
Las normas ISO 10272:2006 en su primera parte describen un método que
puede ser utilizado en un gran variedad de muestras para la detección de
Campylobacter spp., la parte 2 describe el método de enumeración, la parte
3 describe un método horizontal para la determinación semi-cuantitativa de
Campylobacter spp. y la cuarta un método para cuantificación en muestras
de agua (ISO, 2006a, 2006b; WHO, 2013).
Generalmente se necesita un cultivo puro para pruebas confirmativas, pero
según la OIE se puede obtener una confirmación preliminar mediante el
examen macro y microscópico directo del material con colonias
sospechosas. Entre las pruebas tenemos:
21
a) Identificación en medio sólido: En agares con sangre, las colonias
típicas son de color rosa pálido, redondas, convexas, lisas y
brillantes, con un borde regular. En medios basados en carbón
vegetal, las colonias son grisáceas, planas y húmedas, con
tendencia a extenderse, y muchas tienen un brillo metálico (Falcón,
2015; OIE, 2008; Poma, 2014).
b) En el examen microscópico de la morfología y la movilidad: se
observar bacilos finos en espiral o curvados que se mueven en forma
de sacacorchos. Los cultivos más antiguos muestran formas de coco
menos móviles (OIE, 2008; Public Health England, 2014).
c) Detección mediante oxidasa: se toma el material de una colonia
sospechosa y se coloca en papel de filtro humedecido con reactivo
de oxidasa. La aparición de un color violeta o azul oscuro antes de
10 segundos significa una reacción positiva (OIE, 2008; Public
Health England, 2014).
d) Crecimiento aeróbico a 41,5°C: Se inocula el cultivo puro en placa
de agar sangre no selectivo y se incuba a 41,5°C en una atmósfera
aerobia durante 48 horas, no deberá crecer nada (OIE, 2008; Public
Health England, 2014).
e) La prueba de aglutinación en látex para la confirmación de cultivos
puros de C. jejuni/C. coli y frecuentemente de C. lari (OIE, 2008;
Public Health England, 2014).
Identificación de Especies.
Las diversas especies de Campylobacter aisladas de los seres humanos
no son fáciles de identificar. Sólo C. jejuni puede ser identificado de forma
rutinaria con marcadores fenotípicos; otros requieren un enfoque polifásico,
usando una combinación de marcadores fenotípicos y moleculares en vista
de los cada vez más comunes fenotipos atípicos (WHO, 2013). En muchos
laboratorios clínicos, la identificación de Campylobacter spp. solamente se
lleva a cabo a nivel de género (Linton, Lawson, Owen, & Stanley, 1997;
WHO, 2013).
22
La Administración de Alimentos y Drogas y el Departamento de Agricultura
de EE.UU. en los EE.UU., y la ISO en Europa recomiendan algunos
métodos o técnicas para la tipificación de las distintas especies (Gharst,
Oyarzabal, & Hussain, 2013). Entre ellas:
a) Pruebas Bioquímicas. Campylobacter spp. se caracteriza por ser
oxidasa positiva e hidrólisis de la urea negativo (Koneman et al.,
2013). Una vez se tengan bacterias con las anteriores características
puede realizarse la identificación por medio de pruebas bioquímicas
específicas (INS et al., 2013). La diferenciación de especies,
especialmente C. coli y C. jejuni mediante pruebas fenotípicas se
lleva a cabo mediante las pruebas del ácido nalidíxico e hidrólisis del
hipurato principalmente, aunque a menudo es problemático
(Leblanc-Maridor, Beaudeau, Seegers, Denis, & Belloc, 2011;
Mateo, Cárcamo, Urquijo, Perales, & Fernández-Astorga, 2005). C
jejuni puede ser diferenciado de otras especies de Campylobacter
mediante la prueba de la hidrólisis del hipurato, aun así se ha
descrito falsos negativos a la prueba (Steinhauserova, Ceskova,
Fojtikova, & Obrovska, 2001). La sensibilidad al ácido nalidíxico solía
ser otra prueba de uso común, pero hoy en día se han presentado
problemas de interpretación, debidos a un aumento de cepas de C.
jejuni y C. coli resistentes y debido también al aislamiento de
genogrupos de C. lari sensibles al ácido nalixídico. Las
características fenotípicas a la principales pruebas pueden ser
apreciadas en la tabla 2 (INS et al., 2013; Koneman et al., 2013; OIE,
2008).
23
Tabla 2. Pruebas bioquímicas para diferenciación de especies de Campylobacter.
Es
pe
cie
s
Cata
las
a
Cto
. a
25
°C
Cto
. a
42
°C
Red
uc
ció
n d
e
Nit
rato
s
Hid
róli
sis
de
l
Pir
uv
ato
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So
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cid
o
Nali
díx
ico
(30
μg
)
Se
n.a
Ce
falo
tin
a
(30
μg
)
C. Coli + - + + - + -
C. consisus - - + + - - -
C. fetus subs. fetus + + - - - - +
C. hyointestinalis subs. hyointestinalis - + - V - - +
C. jejuni subs. jejuni + - + + + + -
C. jejuni subs. doylei V - V - + + +
+: Positivo. -: Negativo -d: reacción débil. V: reacción variable. Cto.: crecimiento. Sen.: sensibilidad.
Fuente: (INS et al., 2013; Koneman et al., 2013; OIE, 2008)
Elaboración: El autor.
b) Pruebas de aglutinación de látex para la rápida identificación de
Campylobacter spp. han estado en uso durante aproximadamente
20 años. El principio de la prueba es el uso de anticuerpos
policlonales para detectar las proteínas flagelares o la membrana
externa. Las partículas de látex se recubren con inmunoglobulinas
que se presenta contra el antígeno de varias especies de
Campylobacter, principalmente C. jejuni, C. coli y C. lari (Gharst et
al., 2013).
c) Ensayos de Inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Una
evaluación reciente de estos ensayos mostró que los ensayos ELISA
son muy variables y que solo estos ensayos no se deben utilizar para
la identificación directa de Campylobacter spp. en muestras varias
como heces. Además, los ensayos ELISA no son suficientes para su
confirmación y, por tanto, los laboratorios deberán confirmar los
resultados positivos ELISA por métodos de cultivo (Dey et al., 2012;
Gharst et al., 2013; Giltner, Saeki, Bobenchik, & Humphries, 2013).
24
d) Métodos de identificación moleculares. Son herramientas rápidas y
específicas para la identificación de Campylobacter spp. Los
protocolos de secuenciación actuales, sobre todo el PCR en tiempo
real están proporcionando una forma rápida de detectar segmentos
específicos de ADN que son únicos para la identificación de las
especies y en ocasiones de subespecies (Gharst et al., 2013).
Actualmente, estos métodos suministran herramientas fiables para
la detección rápida de muestras positivas presuntivas (Gharst et al.,
2013; Ivanova et al., 2014)., facilitando una alternativa eficaz, ágil y
sensible a los métodos basados en cultivos para la detección de C.
coli y C. jejuni, teniendo como principales ventajas su rapidez,
especificidad y sensibilidad. (Leblanc-Maridor et al., 2011; Mateo et
al., 2005).
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Es uno de los métodos moleculares más comúnmente utilizado para la
detección de patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos. Fue
inventado hace aproximadamente 30 años y según su variante, permite la
detección de uno o más patógenos mediante la detección de una secuencia
de ADN diana específica (Velusamy, Arshak, Korostynska, Oliwa, & Adley,
2010).
La PCR opera mediante la amplificación de una secuencia de ADN diana
específica en un proceso cíclico de tres pasos. Primero, la doble cadena de
ADN se desnaturaliza a alta temperatura. A continuación, dos
oligonucleótidos sintéticos monocatenarios o cebadores específicos se
hibridan en las hebras de ADN en sitios específicos. Por último sigue por
un proceso de polimerización mediante el cual los cebadores
complementarios al ADN monocatenario se extienden con la presencia de
desoxirribonucleótidos y una ADN polimerasa termoestable (Law, Ab
Mutalib, Chan, & Lee, 2015; Velusamy et al., 2010).
La identificación de especies de Campylobacter usando métodos
fenotípicos es lenta y problemática debido a sus necesidades de
25
crecimiento, llegando a necesitarse hasta 8 días para obtener resultados
concluyentes, en consecuencia se requieren rápidos y confiables métodos
de detección e identificación (Saiyudthong, Phusri, & Buates, 2015).
Por otra parte, la detección de C. coli y C. jejuni en sustratos complejos,
como las heces o muestras ambientales es difícil, ya que los medios de
cultivo tienen que ser lo suficientemente selectivos para evitar el
crecimiento excesivo de organismos competitivos. Además, estas bacterias
pueden entrar en un estado viable pero no cultivable, aunando más la poca
fiabilidad de estas pruebas (Dey et al., 2012; Ivanova et al., 2014; Leblanc-
Maridor et al., 2011; Mateo et al., 2005).
Métodos basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utilizan
cada vez más en el diagnóstico de campilobacteriosis en seres humanos,
así como para detectar Campylobacter spp. como algunas de sus especies
en alimentos y muestras de animales. Al menos un ensayo de PCR en
tiempo real ha sido validado en la norma ISO 10272-1: 2006 para la
detección de C. jejuni, C. coli y C. lari en las heces de las aves de corral de
hisopos cloacales (ISO, 2006a; WHO, 2013).
PCR Simple
Fue inventado hace aproximadamente 30 años, permite la detección de un
solo patógeno bacteriano presente en los alimentos mediante la detección
de una secuencia de ADN diana específica. Si bien la primera PCR para
identificación de Campylobacter spp. fue hace más de 20 años (Oyofo et
al., 1992), la PCR se ha convertido en una de las plataformas más utilizadas
para la identificación de estos patógenos transmitidos por los alimentos
(Gharst et al., 2013).
La sensibilidad de los ensayos de PCR está en un rango de 10-3 UFC por
ml en cultivos puros, pero se reduce considerablemente cuando se prueba
muestras alimentarias (Gharst et al., 2013).
26
PCR Múltiple (mPCR)
La reacción en cadena múltiple de la polimerasa (mPCR) es el método más
simple y más rápido para identificar varias cepas a nivel de especie,
probablemente la principal opción de confirmación del futuro (Gharst et al.,
2013).
Hasta hace 8 a 10 años, los PCR eran individuales, lo que significa que
detectaban sólo una especie bacteriana por reacción. Pero en los últimos
años los mPCR han sido diseñados para detectar la presencia de dos o
más especies en la misma muestra. Por ejemplo, los ensayos de PCR han
ayudado a entender que tanto C. jejuni y C. coli se multiplican de igual
manera durante el enriquecimiento de muestras pollo contaminadas
(Gharst et al., 2013; O. Oyarzabal et al., 2007), así como la dinámica de los
mismos en plantas de proceso (Rasschaert, Houf, Van Hende, & De Zutter,
2006).
Al día de hoy varios ensayos de mPCR se han utilizado con éxito para
identificar una gran cantidad de especies de Campylobacter, muchas de
ellas en carcasas de aves (Klena et al., 2004; Linton et al., 1997; Mateo et
al., 2005; Oyarzabal, Wesley, Barbaree, Lauerman, & Conner, 1997;
Persson & Olsen, 2005; Poma, 2014; Stephen & Vandamme, 1997), y por
tanto corroborando la eficacia de los mismos al proporcionar una rápida
identificación de Campylobacter spp (Gharst et al., 2013).
Un estudio llevado a cabo durante el 2005 evaluó la eficacia del PCR frente
al cultivo bacteriológico para la identificación de C. coli y C. jejuni en
muestras de aves de corral tanto de forma directa como con pre
enriquecimiento, se encontró 100% de concordancia positiva. El límite de
detección por PCR fue de 5 UFC que correspondían a 0,2 UFC por 5µl en
la mezcla de PCR. Los porcentajes de muestras que requirieron de
enriquecimiento para demostrar la presencia de Campylobacter spp. fueron
moderados, el 18% para cultivo y el 13% para PCR. El tiempo total de
análisis se redujo a unas pocas horas (dentro de la jornada de trabajo) o 24
27
horas cuando se requería enriquecimiento. Por tanto, el PCR demostró ser
útil como prueba rutinaria de diagnóstico para Campylobacter spp. y la
confirmación de C. jejuni y C. coli (Mateo et al., 2005).
PCR en Tiempo Real (qPCR)
El PCR en tiempo real (qPCR) es el método molecular más avanzada
disponible para la detección rápida de patógenos transmitidos por los
alimentos y el procesamiento de alimentos. El qPCR es un método
sensible, exacto y rápido, puede proporcionar datos cuantitativos y no
requiere pasos post amplificación que eliminan el riesgo de contaminación
cruzada (Barletta et al., 2013), sin embargo, dos desventajas evitan que
sus resultados puedan ser correlacionados a la carga bacteriana y omitir el
cultivo y cuantificación bacteriológica. Es así que esta tecnología es
sensible a la inhibición por los alimentos y además no distingue entre el
ADN procedente de cultivos viables, viables no cultivable, y células muertas
(Wolffs, Norling, Hoorfar, Griffiths, & Radstrom, 2005).
A la fecha numerosos estudios se han publicado para estimar la prevalencia
y la concentración de Campylobacter spp. así como sus principales
especies, sea en muestras de aves o durante su procesamiento (Barletta
et al., 2013; Elvers, Morris, Newell, & Allen, 2011; Ivanova et al., 2014;
Wolffs et al., 2005).
Más ensayos basados qPCR, y sus variaciones, seguirán apareciendo en
el mercado en un futuro próximo (Gharst et al., 2013). Pero a día de hoy se
cuenta con las herramientas necesarias para una rápida identificación de
los principales patógenos transmitidos por alimentos, basta evaluar las
características de cada uno y ajustarlas a las necesidades de cada
situación (Tabla 3)(Law et al., 2015).
28
Tabla 3. Resumen de ventajas y limitaciones de los métodos de detección rápida.
Método de
Detección. Ventajas. Limitaciones. Referencias.
PCR
Simple
Alta Sensibilidad.
Alta Especificidad.
Automatizado.
Resultados Fiables.
Se puede afectar por
inhibidores de PCR,
por lo que suele
requerirse
purificación de ADN.
Dificultad para
distinguir entre
células viables y no
viables.
(Mandal, Biswas,
Choi, & Pal,
2011; Park et al.,
2014; Zhang,
2013)
PCR
Múltiple
Alta Sensibilidad.
Alta Especificidad.
Detección de
múltiples
patógenos.
Automatizado.
Resultados Fiables.
Se puede afectar por
inhibidores de PCR.
Dificultad para
distinguir entre
células viables y no
viables.
El diseño de Primers
es crucial.
(Mandal et al.,
2011; Park et al.,
2014; Zhang,
2013)
PCR en
tiempo
Real
Alta Sensibilidad.
Alta Especificidad.
Ciclos Rápidos.
No requiere el
procesamiento de
productos post-
amplificación.
Monitorización en
tiempo real de los
productos
amplificados.
Alto Costo.
Dificultad en el
proceso para PCR
múltiple en tiempo
real.
Se puede afectar por
inhibidores de PCR.
Dificultad para
distinguir entre
células viables y no
viables.
Requiere personal
capacitado.
Se puede producir
contaminación
cruzada.
(Mandal et al.,
2011; Park et al.,
2014; Zhang,
2013)
29
ELISA
Especifico.
Puede ser
automatizado para
que sea más
eficiente en tiempo
y ahorro de mano
de obra.
Permite la
detección de
toxinas bacterianas.
Se puede manejar
un gran número de
muestras.
Baja sensibilidad.
Resultados falso
negativos.
Puede presentarse
actividad cruzada con
antígenos
estrechamente
relacionados.
Se requiere pre-
enriquecimiento con
el fin de producir los
antígenos de
superficie celular.
Requiere personal
capacitado.
Requiere etiquetado
de anticuerpos o
antígenos.
(Park et al.,
2014; Zhang,
2013; Zhao, Lin,
Wang, & Oh,
2014)
AFLP
Muy reproducibles.
No requiere
secuencias previas
de ADN
Adecuado para
análisis
filogenéticos.
Requiere gran
cantidad de ADN
Lento
Costoso
Requiere personal
capacitado.
Requiere programas
computacionales
(Romero,
Serrano,
Rendón, &
Rocha, 2014)
Fuente: (Law et al., 2015; Romero et al., 2014). Elaboración: El Autor.
Epidemiología.
Hay pruebas que sugieren que ha habido un aumento en la incidencia
global de la campilobacteriosis en la última década. El número de casos de
campilobacteriosis han aumentado en América del Norte, Europa y
Australia. Aunque los datos epidemiológicos procedentes de África, Asia y
el Medio Oriente son todavía incompletos, indican que la infección por
Campylobacter spp. es endémica en estas regiones (CDC, 2014).
30
Según el Centro Europeo para la prevención y Control de Enfermedades
(ECDC por sus siglas en inglés) los casos de Campilobacteriosis
aumentaron entre el 2008 y 2011 pero se redujeron ligeramente en el 2012
(Ilustración 1) (ECDC, 2014), a pesar de esto se consideró bastante estable
durante el periodo 2009- 2013 al ser analizado mes a mes (EFSA & ECDC,
2015).
Figura 1. Distribución de casos reportados de campilobacteriosis confirmada por meses en 2012 comparados con los datos 2008–2011, EU/EEA. Fuente: ECDC, 2014.
En el 2012 la tasa de notificaciones de campilobacteriosis en la UE fue de
68 casos por cada 100.000 habitantes, para el 2013 fue 64.8 ubicándolo a
un nivel similar al 2012. De los casos reportados se pudo concluir que se
presenta con mayor frecuencia en niños menores de cinco años. A más de
esto la tasa en hombres fue mayor que en mujeres, independiente del grupo
de edad (Figura 2) (ECDC, 2014; EFSA & ECDC, 2015).
31
Figura 2. Tasas de casos reportados de campilobacteriosis confirmados, en edad y género en la UE/EEA. Fuente: ECDC, 2014.
Se ha podido verificar que la campilobacteriosis presenta una
estacionalidad regular con las tasas más altas reportadas entre junio y
agosto (ECDC, 2014) Ilustración 3.
Figura 3. Distribución de casos reportes confirmados de campilobacteriosis en meses, EU/EEA, 2008–2012. Fuente: ECDC, 2014.
32
La Campilobacteriosis humana sigue siendo la enfermedad gastrointestinal
más frecuente en Europa desde el 2005 (Ilustración 4). Aunque teniendo
en cuenta el elevado número de casos, la gravedad en términos de letalidad
fue baja (0.05%) (ECDC, 2014; EFSA & ECDC, 2014, 2015).
Figura 4. Reportes de tasas notificadas de zoonosis en casos humanos confirmados en la EU, 2013. Fuente: (ECDC, 2015).
Se estima que la manipulación, preparación y consumo de carne de pollo
representan del 20 a 41% de los casos de campilobacteriosis humana. Así
por ejemplo El pollo asado y la ensalada fueron fuentes sospechosas de un
brote en una escuela española durante el 2012 con 75 casos de C. jejuni
(Calciati et al., 2012; ECDC, 2014).
33
Las fuentes de infección que causan enfermedad esporádica parecen
derivar de pollo, pero las vías de transmisión siguen sin estar claros, al igual
que los conductores de los aumentos en los ancianos, la estacionalidad y
las diferencias urbano-rurales. (ECDC, 2014).
En los Estados Unidos, el número anual de casos de campilobacteriosis se
estimó en 845,024 casos, resultando de 8.463 hospitalizaciones y 76
muertes entre 1996 y 2012. La Red de Vigilancia Activa de Enfermedades
Transmitidas por Alimentos de Estados Unidos reportó una incidencia anual
de 14,3 casos por cada 100.000 habitantes. Es importante destacar que
hubo un aumento del 14% en la incidencia de la campilobacteriosis en 2012
en comparación con el período 2006-2008 (CDC, 2014; Kaakoush et al.,
2015).
En México, C. jejuni es la causa más común de gastroenteritis aguda en
lactantes y preescolares entre 2006 y 2007 se llevó a cabo un estudio
donde presento una prevalencia del 15,7% de los casos (Larrosa-Haro,
Macias-Rosales, Sánchez-Ramírez, Cortés-López, & Aguilar-Benavides,
2010).
Según El Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) en el periodo 2005 –
2013 se confirmaron 462 cepas de Campylobacter spp. además de 267
muestras sospechosas. De los casos positivos 79.2% se corroboro para C.
jejuni, 15.2% para C. coli y 4.3% para C. fetus, el resto fueron inespecíficas
(ISP, 2014).
En el periodo 2007 y 2011, el Grupo de Microbiología del Instituto Nacional
de Salud de Colombia, sobre la base de las muestras de pacientes con
enfermedad diarreica aguda (EDA) calculó prevalencias de Campylobacter
spp. entre 3,3% y 6,8% (INS et al., 2013).
Una encuesta oficial del Ministerio de Salud de Brasil en 2009 demostró
que Campylobacter spp. es de los agentes menos frecuentes en cuanto a
ETAS en Brasil, y representa el 0,13% de los brotes notificados en
comparación con el 42% de Salmonella (Gonsalves, 2014).
34
Un estudio llevado a cabo por el Ministerio de Salud de Paraguay entre el
2010 y 2012 en muestras procedentes de niños menores de 11 años arrojo
una prevalencia de Campylobacter spp. del 16% (Orrego et al., 2014),
aunque no se realizaron estudios de tipificación.
Por otro lado un seguimiento realizado a pacientes ambulatorios menores
de 5 años en dos hospitales de la localidad de Lima (Perú), obtuvo una
prevalencia del 9.3% de Campylobacter spp., siendo el grupo etéreo más
vulnerable los niños menores de un año (Hurtado & Rojas, 2008).
Para el 2012 se investigó la prevalencia de Campylobacter spp. en
pacientes con diarrea aguda que concurrieron al Servicio de Bacteriología
del Hospital "Dr. Lucio Molas" (La Pampa – Argentina). Se manejó una
prevalencia del 15.29% de Campylobacter spp. con 96% para C. jejuni y
4% para C. coli (Tamborini et al., 2012).
Si bien las enteritis por Campylobacter spp. son comunes y ha cobrado gran
importancia a lo largo de las últimas décadas en Norteamérica y Europa,
este interés no se ha visto reflejado en Sudamérica, muestra de ello es la
escasa cantidad de investigaciones, planes nacionales de monitoreo y
control implementados.
Venezuela, Bolivia, y Uruguay, no tienen numerosos estudios sobre la
prevalencia de Campylobacter spp. en pollos para consumo, así como
reportes humanos de prevalencia recientes, lo cual deja en evidencia la
fragilidad de los sistemas de seguridad alimentaria realidad de varios
países Sudamericanos, problemática que ha sido planteada por
organismos internacionales desde hace ya un tiempo (Marilina et al., 2015;
WHO, 2013).
Ecuador no es la excepción, situación que se ve reflejada en la falta de
legislación específica, así como la inexistencia de planes o proyectos de
monitoreo, aún peor de control. Es así que los pocos estudios de los que
se dispone han sido financiados y dirigidos por la empresa privada, o entes
educativos y de Investigación.
35
La primera investigación registrada se llevó a cabo sobre muestras de niños
con diarrea del hospital Baca Ortiz de en la ciudad de Quito. Se trabajó
sobre muestras de heces arrojando una prevalencia de Campylobacter spp.
del 23%, que junto al Rotavirus (21%) que se constituyeron en los
enteropatógenos más comunes asociados a la diarrea aguda dentro del
estudio (Guderian, Ordóñez, & Bossano, 1987).
Un estudio reciente realizado en pacientes pediátricos de “Hospital del Día”
de la Universidad Técnica Particular de Loja, arrojo una prevalencia del 9%
de Campylobacter spp. de las Cuales 71% constituyeron C. jejuni y 29% C.
coli (Cueca, 2015).
En Quito se realizó un estudio de casos y controles donde se determinó la
presencia de quince agentes etiológicos de la diarrea aguda en muestras
fecales, si bien Campylobacter spp. no se encontró en casos clínicos fue
frecuentemente halladas en personas asintomáticas, (Vasco et al., 2014).
Camales.
El beneficio o proceso de faenado convierte los pollos vivos en canales de
pollo a lo largo de las siguientes etapas: recepción de los pollos, colgado,
aturdimiento (insensibilización), sangrado, escaldado, desplumado,
escaldado de patas, corte de patas, corte de cloaca, evisceración, corte de
pescuezo (chiller de vísceras), chiller de lavado, chiller de enfriamiento y
empaque (INS et al., 2013).
Este procedimiento se lleva a cabo en los centros de sacrificio o camales,
realizando un control de calidad de todos los productos; no obstante, se
presentan deficiencias, que disminuyen la calidad, inocuidad o aceptación
por parte del consumidor (Mosquera, Aleman, & Villada, 2007), en vista de
esto el Departamento de agricultura de los Estados Unidos (USDA por sus
siglas en inglés) emitió en 1999 un modelo HACCP general para el sacrificio
de aves (USDA, 1999).
Un Punto Crítico de Control, es aquel que se ha identificado, gracias a que
en él se pueden evitar, analizar o controlar peligros dentro de un proceso
36
determinado (FAO & OMS, 2011; Mosquera et al., 2007), por ello sobre
estos que se basan muchos estudios epidemiológicos y de Inocuidad
alimentaria (Duffy, Blackall, Cobbold, & Fegan, 2014; Falcón, 2015).
En la figura 5 se aprecia un modelo general para el sacrificio sanitario de
pollos, donde cada eslabón de la cadena constituye un proceso que debe
ser evaluado según las características del matadero, y puede constituir un
punto de control para entes biológicos, entre ellos el Campylobacter spp.
37
Figura 5. Diagrama de flujo para el procesamiento de Aves. Elaboración: El Autor.
38
Escaldado. Se utiliza para abrir los folículos de las plumas y facilitar su
eliminación. Se especula que los folículos pueden permanecer abiertos
durante todo el proceso hasta el enfriamiento de la carcasa, al cerrarse
estos los microorganismos pueden ser retenidos. Se ha recuperado
periódicamente Campylobacter spp. a partir de agua de escaldar (Keener,
Bashor, Curtis, Sheldon, & Kathariou, 2004; Stern et al., 2001).
Desplume. Se cree que en esta área se puede producir contaminación
cruzada, los dedos de goma que superaron las plumas del ave se
contaminan y pueden transmitir el organismo de ave a ave. Se ha
encontrado que tras el desplume, los recuentos aumentaron
significativamente, incluso en carcasas que anteriormente tenían niveles
bajos o indetectables de Campylobacter spp. (Berrang & Dickens, 2000;
Keener et al., 2004). Por otro lado se corroboro que niveles altos de
contaminación en las plumas incidían en un mayor nivel de contaminación
tras el desplume (Seliwiorstow et al., 2015).
La evisceración. Varios estudios han corroborado a la evisceración como
una etapa crucial en el aumento de la carga bacteriana (Duffy et al., 2014;
Falcón, 2015; Rosenquist, Sommer, Nielsen, & Christensen, 2006), en
parte debido a la ruptura de paquetes intestinales que suelen presentarse,
manipulación de los operarios, pero sobre todo a la naturaleza de la piel
como tal. Misma que ha demostrado ser apta para albergar y apoyar la
supervivencia de Campylobacter spp. (Iglesias Collar, 2013).
En ciertas investigaciones se observó que muestras tomadas de músculo
fueron poco contaminadas, mientras aquellas tomadas de alas y área del
cuello, zonas con gran cantidad de folículos de plumas fueron altamente
colonizadas (Berrang & Dickens, 2000; Keener et al., 2004).
Duchas de Carcasas. Las canales se lavan comúnmente con los sistemas
de duchas a lo largo de casi todo el proceso, utilizando agua clorada para
eliminar la contaminación, tal como sangre, fragmentos de tejido, y la
contaminación fecal. El lavado de carcasas se ha permitido desde 1978
39
como una alternativa a recortes con cuchilla, dado que los estudios han
demostrado que es igualmente eficaz. Estos sistemas de lavado usan de
20 a 50 ppm de cloro libre como agente antimicrobiano y generalmente
consumen 25 a 50 gal/min de agua (Keener et al., 2004).
Lamentablemente los sistemas de lavado que se utilizan actualmente para
el interior y exterior de las canales han demostrado una eficacia limitada
para la eliminación de Campylobacter spp. La razón principal el agua fría,
pues independientemente de la presión y el volumen de flujo, no se logra
un descenso en la tensión superficial del agua, un factor importante en la
eliminación bacteriana fecal (Bashor et al., 2004).
Enfriadores de Carcasas (Chiller). Se requiere que las carcasas se
enfríen rápidamente para evitar el crecimiento bacteriano, para ello muchos
procesadores avícolas utilizan enfriadores de agua. En el tanque de
enfriamiento, se requiere niveles de cloro de hasta 50 ppm de cloro libre a
pH 6,0 para controlar la contaminación cruzada, esto debido a la mayor
carga orgánica (Keener et al., 2004; USDA, 2015).
La USDA permite además de hipoclorito da calcio, el uso de ozono, dióxido
de cloro, hipoclorito de sodio, además de mezclas específicas de ácidos, a
fin de evitar una contaminación cruzada en enfriadores (USDA, 2015).
Actualmente se están llevando a cabo investigaciones y la industria está
explorando aire y nitrógeno criogénico como alternativas. Estudios
recientes encontraron que los niveles de Campylobacter spp. en las
canales refrigeradas fueron significativamente mayores en enfriamiento por
inmersión que el aire frío (Keener et al., 2004; Rosenquist et al., 2006).
Las fuentes de contaminación dentro de una planta de sacrificio de aves
pueden provenir del entorno, o del intestino del pollo (Marilina et al., 2015).
En la tabla 4 se detalla el efecto de las diferentes operaciones del faenado
en la carga de Campylobacter spp. sobre la carcasa del pollo (INS et al.,
2013).
40
Tabla 4. Efecto de operaciones en el procesamiento primario sobre la concentración de Campylobacter spp.
Fuente: (FSANZ, 2005).
En los últimos años dado el creciente índice de campilobacteriosis
provenientes de alimentos contaminados y en vista de que gran parte estas
son atribuidas al consumo de productos aviares (Koneman et al., 2013;
Nachamkin et al., 2008), se han ido realizando estudios sobre la dinámica
esta bacteria en las distintas etapas del proceso de faenamiento, así por
ejemplo tenemos:
En el Norte de Georgia (USA) se llevó a cabo un estudio de cuantificación
de Campylobacter spp. en lavados de carcasas a lo largo de distintos
puntos críticos de control, obteniéndose prevalencias de 45.9% en aves al
41
ingreso a la planta, 43% después del desplume, 18.2% antes de ingresar
al prechiller y 2.4 a la salida del chiller (Berghaus et al., 2013).
Otro estudio realizado en 20 plantas de sacrifico también en Estados
Unidos se encamino a cuantificar y medir la prevalencia de Campylobacter
spp. antes del prechiler y después del chiller, a fin de evaluar la eficacia del
cloro en el agua de enfriamiento sobre esta bacteria. Se obtuvo una
prevalencia del 75% y un promedio de 2.66 log10 UFC/ml de enjuague antes
del prechiler. Después del chiller se manejó una prevalencia del 35% y un
promedio de 0.43 log10 UFC/ml, confirmando el éxito en la reducción
significativa de la prevalencia y el número de Campylobacter spp. en las
canales de pollos de engorde durante el procesamiento (Berrang et al.,
2007).
Por su parte en Minas Gerais también Brasil se llevó a cabo un estudio de
características similares obteniéndose 56% de Campylobacter spp. al
ingresar al prechiller, y 44% al salir del chiller. De las muestras positivas se
diagnosticó como C. jejuni 42.9% de las muestras al del prechiller y 36.4%
de las muestras al salir del chiller(Oliveira & Oliveira, 2013).
En Reino Unido se llevó a cabo un interesante estudio en el que se utilizó
un marcador molecular basado en la proteína flagelar A (flaA) para rastrear
distintas cepas de Campylobacter spp. a lo largo del proceso de
faenamiento. Se muestrearon cinco parvadas positivas y dos parvadas
negativas faenadas inmediatamente después de las positivas. El estudio
revelo que las cepas encontradas en el ambiente del matadero no son una
causa importante de contaminación de carcasas previamente colonizadas
por Campylobacter spp. Sin embargo, las bandadas negativas que fueron
precedidas por rebaños positivos fueron contaminadas por cepas que
generalmente no se recuperaron de ciegos de las parvadas positivas
anteriores. Esto sugiere que el entorno del matadero tiene un papel
importante en la contaminación de las canales de parvadas negativas pero
no completamente en aquellas colonizadas (Elvers et al., 2011). Otro
estudio de base similar sugirió que algunos subtipos pueden no ser
42
capaces de sobrevivir a la línea de proceso, mientras que otros pueden
persistir en la canal o dentro de los equipos a pesar de los factores de estrés
encontradas en el entorno de procesamiento (Hunter, Berrang,
Meinersmann, & Harrison, 2009).
En Andalucía (España), desde el año 2010 hasta el 2012 se llevó a cabo
una investigación a fin de determinar a prevalencia y las distintas especies
del género Campylobacter en un matadero. Encontrándose una
prevalencia para Campylobacter spp. de 59.4% en aves al ingreso, 69.2%
tras el escaldado, 79.1% tras la evisceración y 67.4% tras salir del Chiller.
En cuanto a las especies de forma global a través de la línea de proceso,
C. coli fue la que se aisló con mayor frecuencia encontrándose el 44,15%,
seguida de C. jejuni con el 28.95%. Asimismo, se hallaron infecciones
mixtas de C. jejuni y C. coli en el 14,7% de las muestras, y otras especies
pertenecientes al género Campylobacter que no pudieron ser identificadas
en el 12,18% (Torralbo Montoro, 2013).
Por su parte el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA
por sus siglas en Ingles), maneja desde 1988 un programa denominado
“Salmonella y Campylobacter Pruebas de Materias Primas, productos
cárnicos y avícolas”, para supervisar la Reducción de Patógenos en base
al Sistema Análisis de Peligros y de Puntos Críticos de Control (PR /
HACCP), mismo que emite informes anuales al respecto (USDA, 2014).
Según el Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos
creador de esta iniciativa, el porcentaje en muestras de Campylobacter spp.
en pollos y pavos al 2014 fue de 6 y 2% respectivamente, obteniendo una
prevalencia del 10.4% para pollos y 0.8% en pavos durante los últimos 5
años (USDA, 2014).
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
45
METODOLOGÍA
Tipo de investigación
El estudio comprendió una investigación observacional, descriptiva e
identificación de casos.
Diseño de la investigación
El diseño utilizado fue no experimental, descriptivo y transversal. Ya que no
se manipulo las variables de manera voluntaria.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de campo se realizó en una planta de faenamiento ubicada en la
provincia de Pichincha; Cantón Quito. El trabajo de laboratorio en la
“Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del
Ecuador” (FMVZ – UCE) en el área de investigación del laboratorio de
Bacteriología, y el laboratorio de Biología Molecular del “Centro
Internacional de Zoonosis” (CIZ), ambos ubicados en la Ciudadela
Universitaria en la provincia de Pichincha, cantón Quito, Parroquia Belisario
Quevedo.
Población y muestra
La población objeto de estudio se conformó por las diferentes parvadas de
aves provenientes de un mismo galpón y lote, que fueron faenadas durante
dos meses en el camal industrializado en el cantón Quito, propiedad de la
misma empresa productora de aves.
El nombre de la empresa se mantuvo en absoluta reserva, ya que, se
estableció un acuerdo de confidencialidad, por lo cual para identificar las
muestras se estableció un código alfanumérico tanto en las muestras como
en los resultados.
Muestra
El tipo de muestreo que se empleó en la investigación fue aleatorio simple
ya que se intentó incluir a todos los sujetos accesibles como parte de la
muestra.
46
Para la identificación de Campylobacter spp. se tomó cinco muestras de
piel por punto de muestreo todos de carcasas individuales, proceso que se
repitió en cinco ocasiones. En total se tomaron 100 muestras de piel
procedentes de 100 aves procesadas durante la investigación.
En la tabla 5, se muestra el número de muestras de piel que se tomó
durante la investigación, así como el código y su punto de muestreo
respectivo.
Tabla 5. Muestras colectadas y procedas en el Proyecto.
Muestras colectadas y procedas en el Proyecto
Código P E A D
Punto Tras el
Desplume
Tras el
Eviscerado
Antes del
Enfriamiento
Tras el
Enfriamiento
Muestras colectadas
x muestreo 5 5 5 5
Muestreos
realizados 5 5 5 5
Total de muestras
procesadas 25 25 25 25
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN.
El presente proyecto se llevó a cabo en tres fases, dos de las cuales se
realizaron de manera secuencial y el último al finalizar la totalidad de los
muestreos por razones de logística.
Muestreo de Campo.
La toma de muestras se realizó de una parvada por muestreo, esto durante
el faenamiento en 4 puntos críticos establecidos: P, E, A y D (Elvers et al.,
2011; Falcón, 2015).
Las 5 muestras de piel se extrajeron del área de la pechuga, considerada
la mejor área para siembras en protocolos que omiten el paso de pre-
enriquecimiento(Ugarte-Ruiz et al., 2012), al ser la zona con más
47
posibilidades de ser contaminada durante la manipulación (Keener et al.,
2004).
a) Toma de muestra de piel.
Las muestras de piel de pechuga se obtuvieron de la siguiente
forma:
Con una funda nueva y limpia se envolvió la carcasa sin tocarla
directamente.
Se colocó la carcasa en una mesa limpia en donde estuvo ya
preparado el material de disección
Se cortó la funda de tal forma que ésta nos sirva a manera de
campo.
Se incidió la piel de la pechuga, realizando un corte medial desde
el cuello hacia la quilla y bordeando el ala para extraer
aproximadamente 25gr de piel.
Se colocó la piel en una funda para stomacher con filtro
previamente etiquetada.
Se la guardó las muestras en un cooler con hielo químico, en el
que fueron transportadas al laboratorio.
Procesamiento de muestras bacteriológicas.
Lo siguiente a realizar fueron las diluciones y sus respectivas siembras, las
cuales se realizaron de manera directa. De forma curiosa estudios basados
en modelos bayesianos determinaron que la sensibilidad del aislamiento
bacteriano utilizando pre enriquecimiento fue de 41% mientras que la
siembra directa fue de 69% (Habib, Sampers, Uyttendaele, De Zutter, &
Berkvens, 2008).
Se deberá considerar que las siembras de muestras se basan en la
cantidad estimada de bacterias dispersadas sobre un medio, independiente
de la disolución en la que están contenidas, es decir, la masa bacteriana
en sí, por poner un ejemplo:
48
Al tomar 1ml de una disolución a la 10-1, y dispersarla sobre un medio se
obtendrá un conteo sobre una disolución a 10-1, pero de tomar 0.1ml (100ul)
de la misma solución y dispersarlo sobre otro medio se obtendrá un conteo
sobre una disolución 10-2, es decir, al tomar únicamente la décima parte del
volumen anterior, se estará sembrando también la décima parte de la masa
bacteriana contenida en la misma obteniendo directamente la siguiente
disolución.
Para realizar la dispersión sobre el medio se utilizó asas de Digraslky.
a) Diluciones
Se pesó la muestra de piel agregando posteriormente peptona
bacteriológica hasta alcanzar una dilución 10-1, se colocó esta dilución en
el Stomacher por 60 segundos. Paso seguido se realizó una segunda
dilución colocando 1ml de dicha solución en un tubo que contiene 9ml de
peptona bacteriológica estéril (Anexo 1) logrando una dilución 10-2(Public
Health England, 2014).
b) Siembra
Las muestras de los puntos críticos P, E, A, D se sembraron en diluciones
secuenciales de la 10-1, al 10-3, utilizando como medio específico Rapid
Campylobacter (RC) (Anexo1), medio certificado como alternativa al
método de referencia ISO/TS 10272-2:2006 para el recuento de
Campylobacter spp. en la carne y los productos cárnicos, de aves de corral,
productos avícolas, y muestras ambientales (ISO, 2006b; Omar A.
Oyarzabal et al., 2005).
Para ello se dispersó 1ml de la dilución 10-1 dividida en dos cajas (500ul x
caja) obteniendo el conteo de la solución 10-1, 100ul de esta misma solución
en otra caja para obtener el conteo 10-2 y por último 100ul de la solución
10-2 para obtener el conteo 10-3.
49
c) Incubación y Cuantificación
Se colocaron todas las cajas en una jarra para microaerofilia, en la que con
la ayuda de una bomba de vacío y un tanque de gas preparado (92% DE
N2, 8% DE CO2), se obtuvo un ambiente óptimo para el desarrollo de la
bacteria en cuestión, luego se procedió a incubar a 42°C por 48 horas (ISO,
2006a, 2006b).
Finalizado el proceso de incubación se extrajeron las cajas de la jarra con
microaerofilia, se clasificaron por muestra y dilución, y contaron las cajas
que contengan de 15 a 200 colonias aproximadamente. Se tomaron
fotografías de cada caja seleccionada y se procedió a contar las colonias.
Los resultados se expresaron en UFC/g. a log10 (Public Health England,
2014).
d) Respaldos
Como último paso en la etapa de laboratorio bacteriológico se procedió a
realizar los respaldos de las cepas encontradas, así como, sus respectivos
lisados.
Para ello se utilizó un protocolo estandarizado en la FMVZ-UCE (Falcón,
2015; Poma, 2014) que se detalla a continuación:
De cada caja contabilizada se tomó de 2 a 20 colonias
independientes, que pasaron a constituir cepas aisladas y fueron
sembradas individualmente y de forma masiva en agar sangre
(Anexo 1), con la finalidad de obtener una mayor cantidad de cultivo
bacteriano.
Estas colonias fueron llevadas a microaerofilia con el método
descrito anteriormente e incubadas a 42ºC por 48 horas.
Transcurrido este tiempo, se tomó mediante asas desechables de
10 µl la mayor cantidad posible de cultivo de cada caja y se colocó
en un tubo Ependorf previamente etiquetado con 700 µl de sangre
de ovino desfibrinada.
50
De haber cepas con poco o nulo crecimiento se repetía el
procedimiento cambiando el medio de cultivo a RC o MCCDA
(Anexo 1).
Las cepas se guardaron a -80ºC según lo expuesto en la tabla 6.
Tabla 6. Respaldos realizados en el proyecto
Muestreos y Puntos P E A D Respaldos por muestreo
Muestreo 1 10 10 10 9 39
Muestreo 2 46 46 46 46 184
Muestreo 3 10 10 10 10 40
Muestreo 4 10 10 10 10 40
Muestreo 5 45 46 46 45 182
Total de respaldos x punto 121 122 122 120 485
Procesamiento de PCR múltiple.
Al momento de respaldar las cepas también se realizaron los respectivos
lisados sometiendo 1 µl de cultivo a 90°C por 20 minutos en un baño maría
(Poma, 2014), mismos que fueron almacenados a -20ºC.
a) Pre - PCR
En el área de Pre-PCR se realizó el master mix en un tubo Ependorf® de
1.5 ml según el protocolo establecido por Vandamme detallado en la tabla
7 (Vandamme et al., 1997), dispersándose de 15 a 25 µl de esta solución
en tubos de reacción para PCR de 200 µl. Adicional a las muestras a
procesar se integraron controles positivos para C. jejuni, C. coli. y un control
negativo.
Para el respectivo proceso se utilizó el Kit “GoTaq® G2 Flexi DNA
Polymerase” y el dNTPMix, 10nM de Promega, (Anexo 2), a más de los
siguientes primers:
51
C. coli 1 Fa 5’-AG GCA AGG GAG CCT TTA ATC-3’ (Col 1)
C. coli 2 Ra 5’-TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3’ (Col 2)
C. jejuni 3 Fa 5’-CA TCT TCC CTA GTC AAG CCT-3’ (Jun 3)
C. jejuni 4 Ra 5’-AAG ATA TGG CTC TAG CAA GAC-3’ (Jun 4)
(a: F, Hacia delante; R, de reversa).
Tabla 7. Preparación de un mastermix para 5 reacciones.
Reactivo Volumen
total
C. inicial C. final Volumen para una
reacción
Cantidad Unidad Cantidad Unidad Cantidad Unidad
Agua 71,0 14,2 µl
Template 5 1 µl
Buffer 25 5 X 1 X 5 µl
dNTP Mix 3,75 10 mM 0,3 mM 0,75 µl
MgCl2 15 25 mM 3 mM 3 µl
Col 1 1 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Col 2 1 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Jun 3 1 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Jun 4 1 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Taq 1,25 5 U/µl 0,05 U/µl 0,25 µl
Total 25 µl
Fuente: Vandamme (Vandamme et al., 1997)
Elaboración: El Autor.
b) PCR
En el área de PCR se procedió a integrar la muestra a amplificar, rotulando
y registrando el respectivo tubo.
Los tubos de reacción para PCR se colocaron en el termociclador, usando
un protocolo Touchdown recomendado por Vandamme detallado en la tabla
8 (Vandamme et al., 1997), mismo que iniciaba en 64°C y descendía de
dos en dos grados hasta alcanzar los 54°C. Este protocolo fue evaluado
52
con cepas de referencia bien caracterizadas, determinando que la
sensibilidad y especificidad para la identificación de C. jejuni es de 93% y
100% respectivamente, mientras que para C. coli estos valores alcanzaron
el 100% (On & Jordan, 2003).
Tabla 8. Programación del termociclador para C. coli. y C jejuni.
Programa T° Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 5min 1
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 64°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 62°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 60°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 58°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 56°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
30 Alineación de Primers 54°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Elongación final 72°C 10 min 1
Reposo (opcional) 4º Infinito
Fuente: Vandamme (Vandamme et al., 1997)
Elaboración: El Autor.
53
c) Electroforesis
Se preparó un gel de agarosa al 1%, añadiendo agarosa a una solución
tampón (TBE al 0,5x), y calentando la mezcla hasta su disolución, se añadió
intercálate de ADN “SYBR® Safe” (1 µl por cada 10ml) y vertió la mezcla
en un molde agregando un peine que separará a cada reacción de PCR
(Anexo 2).
Ya solidificado el gel, se colocó en la cámara de electroforesis. En cada
pocillo moldeado por el peine se añadió de 2 a 5 µl de cada amplicon
dependiendo el tamaño del gel, adicional a esto los controles y el ladder de
100 pb (Anexo 2).
El resultado se visualizó en un transiluminador o en un sistema digital de
foto documentación, observándose el ADN amplificado como bandas
fluorescentes, ubicándose en 364pb para C. coli y 773pb para C. jejuni.
Análisis y Recolección de Datos
Se registraron en hojas de Excel todos los resultados obtenidos en cada
punto crítico, así como datos de la granja, niveles de cloro, temperaturas
entre otras. Para el análisis estadístico se utilizó el programa IMB SPSS 23
(Norusis, 2015), en el que se realizó la prueba SHAPIRO WILK a fin de
conocer si los datos de los distintos puntos críticos poseían una distribución
normal. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis a fin de determinar si existían
diferencias significativas y la prueba U de Mann-Whitney para identificar los
puntos entre los que se detectó diferencia.
54
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
57
RESULTADOS
Presentación de Resultados.
En el presente estudio el Agar Rapid Campylobacter (RC) utilizado en la
cuantificación de Campylobacter spp. presentó colonias redondas de
coloración rojiza (Figura 6).
Figura 6. Agar RC con colonias rojizas características de Campylobacter spp.
Los cinco muestreos realizados se llevaron a cabo en una empresa semi
industrial que reunía las características detalladas a continuación:
Velocidad de la Línea: 1000 carcasas/hora
Aturdimiento: Eléctrico
Temperatura de Escaldado: 70 °C
Tipo de escaldado: Mediante paletas tipo Olla.
Maquina desplumadora: Rotativa tipo Olla
Duchas Intermedias: Presentes
Tanques de enfriamiento: 2
Cloro en Tanques: No, solo el proveniente del agua potable utilizada.
Al finalizar el muestreo se obtuvo 100 muestras de piel de carcasas
individuales.
Se utilizó la prueba Shapiro Wilk para el análisis de normalidad entre datos
(Tabla 9).
58
Tabla 9. Prueba de normalidad de carga Bacteriana según puntos de muestreo.
Punto Crítico de muestreo Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig.
Log 10 de Carga
Bacteriana
P 0,972 25 0,699
E 0,865 25 0,003
A 0,942 25 0,162
D 0,968 25 0,591
En la tabla 10 podemos apreciar en logaritmos base 10 los promedios de
la carga de Campylobacter spp. y sus desviaciones estándar (SD) en los
puntos muestreados.
Tabla 10. Cargas bacterianas en los cinco puntos de muestreo (Log 10).
Punto Crítico de muestreo
Desplume Log10 CFU/g
Eviscerado Log10 CFU/g
Pre Enfriamiento Log10 CFU/g
Post Enfriamiento Log10 CFU/g
Total Log10 CFU/g
Media (y
desviación (SD)
SD SD SD SD SD
Muestreo 1 3,08 0,28 3,74 0,12 3,19 0,39 2,94 0,28 3,24 0,41
Muestreo 2 3,51 0,13 3,67 0,43 3,79 0,11 2,57 0,35 3,39 0,56
Muestreo 3 3,02 0,34 4,09 0,95 3,47 0,65 3,28 0,67 3,47 0,75
Muestreo 4 3,35 0,26 3,63 0,37 3,72 0,61 3,59 0,25 3,57 0,39
Muestreo 5 3,83 0,40 3,95 1,12 4,02 0,41 3,87 0,37 3,92 0,61
Promedio 3,36 0,41 3,82 0,67 3,64 0,52 3,25 0,60 3,52 0,59
SD: Desviación Estándar; Promedio
En el grafico 8 podemos observar la dinámica de contaminación de los
distintos muestreos a lo largo de la cadena de proceso.
59
Figura 7. UFC en Log 10 por punto de muestreo en los distintos muestreos.
En la figura 9 se muestra los promedios de UFC en Log 10 en cada punto
muestreado.
Figura 8. Promedios de UFC en Log 10 por punto de muestreo a lo largo del estudio.
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
D E S P L U M E E V I S C E R A C I Ó N P R E -E N F R I A M I E N T O
P O S T -E N F R I A M I E N T O
LOG
10
DE
CA
RG
A B
AC
TER
IAN
A
PUNTO DE MUESTREO
Muestreo 1
Muestreo 2
Muestreo 3
Muestreo 4
Muestreo 5
3,36
3,823,64
3,25
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Desplume Evisceración Pre-Enfriamiento Post-Enfriamiento
Log
10
de
Car
ga B
acte
rian
a
Punto de Muestreo
Total
60
Se realizó un análisis de Varianza (ANOVA) de una vía de Kruskal Wallis,
prueba no paramétrica al no registrarse una distribución normal de datos.
Significancias Asintóticas menores a 0.05 muestran que existen diferencias
significativas entre los puntos de muestreo.
Tabla 11. Prueba de Kruskal Wallis.
Estadísticos de Prueba Log 10 de Carga Bacterianaa
Chi-cuadrado 16,008
gl 3
Sig. asintótica 0,001
a. Variable de agrupación: Punto Crítico de muestreo.
Una vez confirmada la existencia de diferencias estadísticamente
significativas entre los puntos de muestreo recurrimos a la prueba U de
Mann-Whitney para evaluarlos por parejas e identificar entre qué puntos
se presentó las diferencias.
Tabla 12. Prueba U de Mann-Whitney
Puntos Críticos Sig. Asintótica Diferencias significativas
P - E 0,001 Si
P - A 0,008 Si
P - D 0,467 No
E - A 0,634 No
E - D 0,004 Si
A - D 0,023 Si
(P: Desplume, E: Evisceración, A: Pre-enfriamiento, D: Post-enfriamiento).
Los resultados de la especiación de las cepas de Campylobacter spp.
aisladas en este estudio se pueden apreciar en la Tabla 13 y la Figura 10.
61
Tabla 13. Especies de Campylobacter identificadas durante es estudio.
Punto de muestreo
C. coli C. jejuni C. coli/C.
jejuni Negativas Total de
Muestras n % n % n % n %
P 90 74,38 26 21,49 0 0,00 5 4,13 121
E 96 78,69 16 13,11 1 0,82 9 7,38 122
A 91 74,59 14 11,48 1 0,82 16 13,11 122
D 86 71,67 19 15,83 5 4,17 10 8,33 120
Total 363 74,85 75 15,46 7 1,44 40 8,25 485
(n: Normalidad, P: Desplume, E: Evisceración, A: Pre-enfriamiento, D: Post-enfriamiento).
Figura 9. Gel de Agarosa con bandas Especificas para C. jejuni y C. coli
En la Figura 10 podemos observar la proporción de especies aisladas en
los distintos puntos de muestreo.
Figura 10. Relación Porcentual de las especies identificadas.
74,38 78,69 74,59 71,67
21,49 13,1111,48 15,83
4,13 7,3813,11 8,33
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Desplume Evisceración Pre-Enfriamiento Post-Enfriamiento
PO
RC
ENTA
JES
PUNTO DE MUESTREO
C. coli C. jejuni Negativas C. coli/C. Jeju
62
Discusión de Resultados.
El objetivo de la presente investigación fue cuantificar Campylobacter spp.
e identificar C. jejuni y C. coli en carcasas de pollo destinadas a consumo
humano, a lo largo de la línea de sacrificio sanitario en un camal semi
industrializado de la provincia de pichincha.
El aislamiento y cuantificación de Campylobacter spp. en un medio
cromógeno demostró ser un método efectivo (Omar A. Oyarzabal et al.,
2005), corroborando lo demostrado en estudios afines (Falcón, 2015;
Poma, 2014; Seliwiorstow et al., 2015).
La cuantificación de Campylobacter spp. ha demostrado ser la mejor
herramienta para determinar el riesgo a la salud pública, en comparación a
las pruebas de presencia-ausencia (Seliwiorstow et al., 2015).
Estudios estimaron que cargas menores a 1.000 UFC/g (3.0 Log10 UFC/g)
en piel de cuello, incidirían en reducciones superiores al 50% de riesgo
hacia la salud pública, y cargas no mayores a 500 UFC/g en hasta el 90%
(EFSA & BIOHAZ, 2011).
Tras el desplume la carga bacteriana de Campylobacter spp. fue de 3,36
Log10 UFC/g, datos superiores a los expuestos en Bélgica (Seliwiorstow et
al., 2015) en donde se reporta un promedio de 2.97 Log10 UFC/g; USA
(Berrang et al., 2007) con 2.66 Log10 UFC/ml y en Ecuador con 3.00 Log10
UFC/g (Falcón, 2015). La carga reportada en este estudio puede atribuirse
a los procesos semiautomáticos utilizados en esta planta.
Tras la evisceración, paso que supone el mayor riesgo de contaminación
según varios autores (Guerin et al., 2010; Rosenquist et al., 2006), la carga
bacteriana fue de 3.82 Log10 UFC/g siendo el punto más contaminado en
este estudio, demostrando un aumento significativo (P < 0,05) en relación
a la carga tras el desplume. Otros estudios han reportado cargas
bacterianas en este punto que van de 3.14 a 3,8 Log10 UFC/g en Ecuador
y Bélgica respectivamente (Falcón, 2015; Seliwiorstow et al., 2015). Las
diferencias en las cargas bacterianas en este punto se pueden deber al
63
tamaño del camal y al método de evisceración. Varios estudios han
demostrado que el aumento de la contaminación bacteriana en las carcasa
tras el eviscerado está ligado a la ruptura de paquetes intestinales (Allen et
al., 2007; Franchin, Ogliari, & Batista, 2007; Rahimi, Momtaz, Ameri,
Ghasemian-Safaei, & Ali-Kasemi, 2010),
Las muestras analizadas antes de ingresar al tanque de enfriamiento por
inmersión, revelaron cargas de 3.64 Log10 UFC/g. este resultado es mayor
a lo reportado por Falcón, (2015) con 3.06 Log10 UFC/g. Estudios en otros
países han reportado datos con sistemas diferentes de cuantificación, así
en Australia se reportó 6.50 Log10 UFC/carcasa (Duffy et al., 2014), y en
Estados Unidos 4.74 Log10 de número más probable (MPN) (Berghaus et
al., 2013).
Los datos obtenidos no demostraron diferencias significativas entre la
evisceración y el prechiller, por lo que se demuestra que en este camal las
duchas finales no tienen el efecto esperado en la reducción de carga
bacteriana en las carcasas. Esto se puede atribuir a factores como presión
de las duchas, cantidad de agua o ausencia de cloro.
Tras el enfriamiento, el porcentaje de carcasas altamente contaminadas
(>3.0 Log10 UFC/g), fue de 64% (16/25). La carga bacteriana promedio en
este punto disminuyo a 3.25 Log10 UFC/g, mayor a lo reportado por en
Ecuador con 1.85 Log10 UFC/g (Falcón, 2015) y Bélgica con 3.12 Log10
UFC/g (Seliwiorstow et al., 2015). Estas diferencias podrían atribuirse al
uso de cloro o a diferencias en los procesos industriales.
En este estudio se observó una reducción significativa (P < 0,05) de 0.39
Log10 UFC/g. en la concentración de Campylobacter spp. tras el
enfriamiento por inmersión. Este dato concuerda con lo observado por otros
autores (Berghaus et al., 2013; Berrang et al., 2007; Duffy et al., 2014;
Falcón, 2015; Rosenquist et al., 2006). Investigaciones a nivel de camal
han concluido en que esta disminución de carga bacteriana puede
atribuirse a la calidad del agua utilizada en el enfriamiento (Demirok et al.,
64
2013). Vale mencionar que la USDA permite niveles de cloro libre de hasta
50 ppm (USDA, 2015).
La identificación de especies de Campylobacter por PCR demostró ser
fiable y rápida corroborando los estudios de On & Jordan, (2003) y los
realizados en Ecuador por Poma (2014).
C. coli demostró ser la especie predominante en las cepas aisladas con un
promedio de 74.85%, mientras que C. jejuni se presentó con un promedio
de 15.46%. El 1.44% de muestras fue positivo para ambas especies y el
8.25% de cepas no pudo ser identificado con los primers utilizados,
pudiendo concluirse que se trata de especies ajenas a las investigadas.
Esta relación de datos se ajusta a lo expuesto Poma (2014) quien encontró
que la prevalencia de C. coli y C. jejuni fue de 67.69 y 17.69%
respectivamente. Datos similares se reportaron en España en un estudio
de características similares con 44.15% para C. coli, 28.95% de C. jejuni,
14.7% de infecciones mixtas y 12.18% que no pudieron ser identificadas
(Torralbo Montoro, 2013). Por otra parte estos resultados contrastan con
gran variedad de investigaciones incluido Ecuador (Gonsalves, 2014;
Lucas, Vilca, & Ramos, 2013; Marilina et al., 2015; Perdoncini et al., 2015;
Rasschaert et al., 2006; Simaluiza et al., 2015). Las diferencias pueden ser
atribuidas a los métodos de muestreo, número de cepas aisladas, factores
medioambientales y geográficos o métodos de aislamiento bacteriano.
Los diferentes métodos para el muestreo y cálculo de la carga de
Campylobacter spp. en carcasas de pollo hacen difícil la comparación de
datos. Esto ha sido reportado en estudios que ponen en evidencia la
necesidad de ensayos normalizados (Guerin et al., 2010).
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
67
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.
Conclusiones.
Se determinó que en el camal semi industrial estudiado el principal
punto de riesgo de contaminación es la evisceración.
Las duchas finales con agua potable demostraron ser inefectivas en
la reducción de Campylobacter spp. Además se demostró que el
enfriamiento de las carcasas es el paso que incide en la disminución
de la carga bacteriana.
Se identificó a C. coli. como la especie predominante en los todos
los puntos muestreados en este estudio.
68
69
Recomendaciones.
Realizar estudios de cuantificación de Campylobacter spp. en
carcasas en percha para determinar la contaminación posterior a los
procesos semi industriales de faenamiento de pollos de engorde.
Confirmar e identificar las especies de Campylobacter presentes en
las muestras que no pudieron ser diagnosticadas con los primers
utilizados.
Realizar estudios que demuestren las relaciones genotípicas entre
las cepas de Campylobacter spp. presentes en la cadena de
producción de carne de pollo.
70
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84
ANEXOS
87
Anexo 1. Medios de Cultivo.
Agar Rapid Campylobacter (RC)
Presentación:
Agar Base: 500g Código: 356-4295
Suplemento Liofilizado: 10 viales 400mlc/u Código 356-4296
Formula Teórica
Mezcla Nutritiva: 28.5g.
Mezcla Reducida: 1g.
Cloruro de Sodio: 5g.
Buffer: 1.25 g
Mezcla Selectiva: 0.082 g
Substrato Cromógeno: 0.05 g
Agar: 14 g
pH (25°C) final = 7.2 - 7.5
Protocolo para preparación de Agar Rapid Campylobacter (RC)
Añadir 370ml de agua destilada en un matraz de 500ml
Pesar 20g de agar RC (Base) y agregar al matraz
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas)
Una vez disuelto autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50ºC
Reconstituir un vial de complemento (RC) en 40ml de agua estéril.
Agregar el complemento reconstituido al medio autoclavado.
Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estériles.
Dejar enfriar y almacenar en completa obscuridad entre 18 y 24
horas.
Almacenar entre 2 y 4ºC hasta su utilización. (No más de 12 días).
88
Agar Base selectivo para Campylobacter sin Sangre. (MCCDA-
Preston).
Presentación:
Agar Base: 500g Código: CM0739
Suplemento Liofilizado: 10 viales 2L.c/u Código SR0155H
Formula Típica (1L.)
Caldo Nutritivo No.2: 25.0g
Carbón Bacteriológico: 4.0g
Caseína Hidrolizada 3.0g
Desoxicolato de Sodio 1.0g
Sulfato Ferroso 0.25g
Piruvato de Sodio 0.25g
Agar 12.0g
pH 7.4 ± 0.2 (25°C)
Contenido del Vial (1L.)
Cefoperazona 32mg.
Anfotericina B 10mg
Protocolo para preparación de Agar Base selectivo para
Campylobacter sin Sangre. (MCCDA-Preston).
Añadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml
Pesar 22.75g de agar MCCDA (Base) y agregar al matraz
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas)
Una vez disuelto autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50ºC
Reconstituir el complemento (CCDA) en 2ml de agua estéril.
Agregar el complemento reconstituido al medio autoclavado en
base a la cantidad preparada (vial para 2L.)
89
Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estériles.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4ºC hasta su utilización. (No
más de 12 días).
90
Agar Sangre (AS)
Presentación:
Agar Base: 500g Código: 211037
Formula Típica (1L.)
Infusión de musculo cardiaco a partir de Solidos: 2g.
Caseína digerida por enzimas pancreáticas: 13g.
Extracto de Levadura: 5g.
Agar: 15g.
pH 7.4 ± 0.2 (25°C)
Protocolo para preparación de Agar Sangre (AS)
Añadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml
Pesar 20g de agar Sangre y agregar al matraz
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas)
Una vez disuelto autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50ºC
Agregar el 5% de sangre desfibrinada estéril de ovino.
Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estériles.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4ºC hasta su utilización. (No
más de 12 días).
91
Peptona Bacteriológica
Presentación:
Polvo Cremoso: 500g Código: MC024
Análisis Típico
Amino Nitrógeno: 5% ± 0.5.
Nitrógeno Total: 12% ± 0.5.
pH con solución al 2%: 7.2 ± 0.2 (25°C)
Protocolo para preparación de Agar Sangre (AS)
Añadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml
Pesar 0.5g de Peptona Bacteriológica y agregar al matraz
Una vez disuelto autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4ºC hasta su utilización. (No más
de 12 días).
92
Anexo 2. Reactivos de Biología Molecular
Kit “GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase” para PCR.
GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase Cód. M780A
5X Green GoTaq® Flexi Buffer Cód. M891A
5X Colorless GoTaq® Flexi Buffer Cód. M890A
Magnesium Chloride Solution, 25mM Cód. A351H
Primers
Primers de Campylobacter col1 SY140127478-001, SYGMA
Primers de Campylobacter col2 SY140127481-005, SYGMA
Primers de Campylobacter jun3 SY130807052-019, SYGMA
Primers de Campylobacter jun4 SY130807052-020, SYGMA
Nucleótidos
dNTPMix, 10nM, 1000 µl Promega. Cód. U1515
Electroforesis.
Agarose, LE, Analytical Grade Cód. V3125
TAE Buffer, Molecular Biology Grade (Tris-acetate-EDTA) Cód.
V4281
SYBR® Safe DNA Gel Stain Cód.
S33102
100 bp DNA Ladder Cód.
15628-050
93
Anexo 3: Detalle de carga de Campylobacter spp. en las distintas
muestras.
Tabla 14. Carga bacteriana en Log 10 de Campylobacter spp.
Carga bacteriana por muestreos a Log 10
Muestreos 1 2 3 4 5
Nu
me
ro d
e M
ue
str
a
P
1 2,71 3,34 2,97 3,07 3,45
2 3,40 3,58 3,52 3,13 4,08
3 3,06 3,57 3,15 3,34 3,54
4 3,28 3,41 2,88 3,49 4,40
5 2,94 3,66 2,60 3,72 3,70
E
1 3,81 4,07 3,52 3,67 2,30
2 3,68 3,81 3,80 4,14 3,58
3 3,83 4,05 5,76 3,20 4,26
4 3,56 3,29 3,58 3,79 5,36
5 3,84 3,15 3,77 3,38 4,23
A
1 3,71 3,85 3,59 3,81 3,66
2 2,90 3,71 3,54 2,78 4,04
3 3,15 3,91 2,36 4,02 3,58
4 2,75 3,83 3,96 4,40 4,58
5 3,43 3,64 3,91 3,59 4,21
D
1 3,28 2,23 2,60 3,22 3,26
2 2,56 2,99 3,32 3,49 3,78
3 2,76 2,76 2,70 3,88 4,18
4 3,09 2,18 3,51 3,66 4,03
5 3,02 2,69 4,26 3,70 4,10
Elaboración: El Autor.
94
Anexo 4: Detalle de especies identificadas mediante PCR
Tabla 15. Cepas de Campylobacter spp respaldadas e identificadas durante es estudio.
Muestreo
Punto de
muestreo
Cepas aisladas
Campylobacter spp.
C. coli C. jejuni Negativas C. coli/C.
Jejuni
n % n % n % n %
1 P 10 7 70,00 3 30,00 0 0,00 0 0,00
2 P 46 43 93,48 3 6,52 0 0,00 0 0,00
3 P 10 3 30,00 7 70,00 0 0,00 0 0,00
4 P 10 0 0,00 10 100,0
0 0 0,00 0 0,00
5 P 45 37 82,22 3 6,67 5 11,11 0 0,00
Total 121 90 74,38 26 21,49 5 4,13 0 0,00
Promedio 24,2 18 74,38 5,2 21,49 1 4,13 0 0,00
1 E 10 7 70,00 1 10,00 2 20,00 0 0,00
2 E 46 37 80,43 3 6,52 5 10,87 1 2,17
3 E 10 9 90,00 1 10,00 0 0,00 0 0,00
4 E 10 0 0,00 10 100,0
0 0 0,00 0 0,00
5 E 46 43 93,48 1 2,17 2 4,35 0 0,00
Total 122 96 78,69 16 13,11 9 7,38 1 0,82
Promedio 24,4 19,2 78,69 3,2 13,11 1,8
7,38 0,2
0,82
1 A 10 6 60,00 1 10,00 3 30,00 0 0,00
2 A 46 44 95,65 0 0,00 2 4,35 0 0,00
3 A 10 4 40,00 5 50,00 0 0,00 1 10,00
4 A 10 0 0,00 8 80,00 2 20,00 0 0,00
5 A 46 37 80,43 0 0,00 9 19,57 0 0,00
Total 122 91 74,59 14 11,48 16 13,11 1 0,82
Promedio 24,4 18,2 74,59 2,8 11,48 3,2
13,11 0,2
0,82
1 D 9 8 88,89 0 0,00 1 11,11 0 0,00
2 D 46 28 60,87 8 17,39 7 15,22 3 6,52
3 D 10 5 50,00 4 40,00 0 0,00 1 10,00
4 D 10 2 20,00 6 60,00 2 20,00 0 0,00
5 D 45 43 95,56 1 2,22 0 0,00 1 2,22
Total 120 86 71,67 19 15,83 10 8,33 5 4,17
Promedio 24 17,2 71,67 3,8 15,83 2 8,33 1 4,17
Suma Total 485 363 74,85 75 15,46 40 8,25 7 1,44
Elaboración: El Autor.