cromatografía de líquidos de alta resolución
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Cromatografiacutea de liacutequidos de
alta resolucioacuten
HPLC
INSTITUTO TECNOLOGICO DE MERIDA
INSTRUMENTACION ANALITICA
Jorge Carlos Vaacutezquez Saacutenchez
bull Objetivo
bull Que es la cromatografiacutea
bull Utilidad de la cromatografiacutea
bull Empleo
bull Tipos de cromatografiacutea
bull Diagrama de bloques
bull Fase moacutevil y estacionaria
bull Sistema de pretratamiento de fases
bull Equipo de filtracioacuten para HPLC
bull Lenguaje del Analista
bull Vaacutelvula de inyeccioacuten
bull Eluyentes usados en HPLC
bull Teoriacutea cineacutetica o dinaacutemica
bull Detectores empelados en HPLC
bull Anaacutelisis cuantitativos
bull Cuantificacioacuten cromatografica
bull Meacutetodos de cuantificacioacuten
Iacutendice
Objetivo
bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten
Que es la cromatografiacutea
bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se
distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de
la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase
moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria
Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos
Recipiente para
abastecimiento
del solventeUnioacuten de vidrio
esmerilado
Relleno previo para proteger
el empaque de la caiacuteda del
liquidoColumna empacada
Llave
Tapoacuten de hule
A la bomba
Matraz de succioacuten
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull Objetivo
bull Que es la cromatografiacutea
bull Utilidad de la cromatografiacutea
bull Empleo
bull Tipos de cromatografiacutea
bull Diagrama de bloques
bull Fase moacutevil y estacionaria
bull Sistema de pretratamiento de fases
bull Equipo de filtracioacuten para HPLC
bull Lenguaje del Analista
bull Vaacutelvula de inyeccioacuten
bull Eluyentes usados en HPLC
bull Teoriacutea cineacutetica o dinaacutemica
bull Detectores empelados en HPLC
bull Anaacutelisis cuantitativos
bull Cuantificacioacuten cromatografica
bull Meacutetodos de cuantificacioacuten
Iacutendice
Objetivo
bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten
Que es la cromatografiacutea
bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se
distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de
la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase
moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria
Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos
Recipiente para
abastecimiento
del solventeUnioacuten de vidrio
esmerilado
Relleno previo para proteger
el empaque de la caiacuteda del
liquidoColumna empacada
Llave
Tapoacuten de hule
A la bomba
Matraz de succioacuten
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Objetivo
bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten
Que es la cromatografiacutea
bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se
distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de
la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase
moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria
Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos
Recipiente para
abastecimiento
del solventeUnioacuten de vidrio
esmerilado
Relleno previo para proteger
el empaque de la caiacuteda del
liquidoColumna empacada
Llave
Tapoacuten de hule
A la bomba
Matraz de succioacuten
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Que es la cromatografiacutea
bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se
distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de
la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase
moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria
Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos
Recipiente para
abastecimiento
del solventeUnioacuten de vidrio
esmerilado
Relleno previo para proteger
el empaque de la caiacuteda del
liquidoColumna empacada
Llave
Tapoacuten de hule
A la bomba
Matraz de succioacuten
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos
Recipiente para
abastecimiento
del solventeUnioacuten de vidrio
esmerilado
Relleno previo para proteger
el empaque de la caiacuteda del
liquidoColumna empacada
Llave
Tapoacuten de hule
A la bomba
Matraz de succioacuten
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten
bull Determinaciones cuantitativas exactas
bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular
bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles
bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten
identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Empleo
bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud
bull medioambiente)
bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos
faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc
bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos
inorgaacutenicos y bioloacutegicos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
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08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
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08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Fase moacutevil y Fase estacionaria
bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos
bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes
provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partiacuteculas
1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)
Aluacutemina(Al2O3)
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Sistemas de pretratamiento de fases
moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten
2 desgasificacioacuten por vaciacuteo
3 calentamiento
4 agitacioacuten
5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)
6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Equipo de filtracioacuten HPLC
Es imprescindible filtrar y desgasificar
todos los estaacutendares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
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0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Lenguaje del Analista
bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL
bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida
de esta
bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten
bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece
constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)
bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la
composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la
composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las
caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA
bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute
dada por dos factores
bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que
origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos
bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que
traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten
de las especies en disolucioacuten
bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia
de una determinada sustancia en la muestra
bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la
respuesta del detector con la concentracioacuten
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Detectores empleados en HPLC
bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes
bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
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04
05
06
07
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09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones
es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase moacutevil y el componente de la muestra
bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la
sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten
bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3
el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se
conoce como deteccioacuten indirecta
bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas
o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
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05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
Are
a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de
informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad
bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un
componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La
determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para
realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea
del pico
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
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02
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0 02 04 06 08 1 12 14 16
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a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Cuantificacioacuten cromatografica
bull Disponer de patrones adecuados
bull Cromatograma reproducibles
bull mi = Ki Ai
bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna
bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i
bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
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Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Meacutetodos de cuantificacioacuten
bull Estaacutendar o patroacuten externo
1 Estaacutendar o patroacuten
externo
2 Curva analiacutetica o
calibracioacuten
3 Adicioacuten de estaacutendares
4 Estaacutendar interno
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
02
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Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
bull Curva analiacutetica o calibracioacuten
bull
00383
02196
03523
04894
08199
y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765
0
01
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05
06
07
08
09
0 02 04 06 08 1 12 14 16
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a
Concentracion
CURVA 1
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Adicioacuten de estaacutendares
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos
Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos