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©2012 Waters Corporation 1

Descubra la Cromatografía de Convergencia UltraPerformance : UPC²™

Waters UPC² Workshop

30 - 31 Mayo 2012 – Cerdanyola del Vallès


Agenda

09:15 Bienvenida

09:45 Introducción a la Cromatografía Supercrítica

10:00 Presentación del sistema ACQUITY UPC2 y de la tecnología de columnas asociadas

11:00 Pausa

11:30 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio

. Grupo 1: Estudio de una mezcla en UPC2

. Grupo 2: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC

13:00 Comida

14:00 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio

. Grupo 1: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC

. Grupo 2: Estudio de una mezcla en UPC2

15:30 Mesa redonda: Cómo aprovechar las posibilidades que ofrece el sistema UPC2

16:00 Conclusiones

16:30 Fin del seminario


Introducción a la Tecnología de Fluidos Supercríticos


Aplicaciones de los Fluidos Supercríticos

Supercritical CO2

Extracción (SFE) Compuestos Bioactivos Nutraceuticos Espécies y aromáticos Decafeinización Descontaminación o lavado Recuperación de compuestos valiosos en residuos

Reacción Hidrogenación Hidroformilación Carboxilación

SF Diseño de Partículas (RESS & SAS) Polymerización Cristalización Impregnación

Cromatografía (SFC) Analisis y Purificación Separaciones Quirales Fase Normal


Gas – Similar. Su baja viscosidad le confiere difusividad y limita la caída de presión

Liquido – Similar. Su elevada densidad le asegura buenas propiedades como solvente

Alto Coeficiente de Difusión, aumenta el rendimiento cinético de la SFC

¿Que es un Fluido Supercrítico?


CO2 @ 55°C

& 200 bar

C6H14 @ 25°C

MeOH @ 25°C

MeCl2 @25°C

Densidad (g/cm3)

0.75 0.66 0.79 1.33

Viscosidad (x104 PaS)

0.80 2.94 5.47 4.11

Difusividad (x109 m2/s)

6.0 4.0 1.8 2.9

CO2 vs Solventes


¿Qué Fluido Supercrítico?

Courtesy of A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Pr J-L. Veuthey, University of Geneva


CO2 Diagrama de Fases


CO2 Alcanza el Estado Supercrítico a 31.1ºC y 73.8 bar – Su estado físico es fácilmente manipulable

CO2 es no tóxico y no inflamable

CO2 es químicamente puro, estable y un solvente no-polar, también compatible con detectores de LC

CO2 es un solvente Verde – Se recupera de procesos industriales y plantas de fermentación – Evita la producción de CO2 que habría sido generada por el tratamiento

de los solventes que sustituye – Se necesita menos tiempo y energía para evaporar fracciones para

conseguir los analitos puros

¿Por qué CO2 ?


Reducción de costes


CO2 se usa como fase móvil en combinación con uno o mas solventes orgánicos – Gran variedad de fuerza de solventes

– La composición del modificador orgánico puede variar del 0 al 100% (típicamente metanol)

Técnica Cromatográfica similar al HPLC

¿Que es un Cromatógrafo de Fluidos Supercríticos (SFC) ?

Características Únicas Fase móvil comprimible Refrigerador para bomba de CO2 Celda UV resistente a la Presión Regulador de Presión


Alta difusividad (Dm), mayor velocidad lineal óptima Uopt. El mismo número de picos se pueden separar en menos tiempo.

Misma L, SFC es 3-10 veces mas rápida por la Uopt En el mismo tiempo de análisis, 3-10 columnas mas largas pueden utilizarse en SFC, N es por tanto 3-10 mayor.

Difusividad ~ Velocidad/Eficacia

Velocidad Lineal Óptima p

mopt d

DU 63.1≅

Tiempo de Retención )'1( KULtR +=

Eficacia:

pdLN

2≈


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50

SFC 5 µm HTLC/Monolith

UPLC 2 µm

HPLC 3 µm

Comparativa Curvas de Eficacia

Courtesy of C. West, E. Lesellier, ICOA – University of Orléans

HPLC 5 µm


Benzodiazepines I. Midazolam II. Flunitrazepam III. Lormetazepam IV. Clorazepam V. Nitrazepam VI. Oxazepam

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Minutes 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 4.00

Steroids 1. Androstenedione 2. Mestanolone 3. Testosterone 4. Stanozolol

Van Deemter curve H = f(u)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

H (µ

m)

u (mm/s)

uopt

1

2

4

3

0.60 min

1

2 4

3

1.90 min

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Minutes 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 4.00

2.75 min

I II

IV III

V VI 0.85 min

I II

IV

III

V VI

Generic conditions 2-EP, 150 x 4.6mm, 5µm. CO2-MeOH, 3.5mL/min

Oven temp @ 40 C BPR @ 200bar

UV detection @ 220nm

Condiciones Genéricas 2-EP, 150 x 4.6mm, 5µm. CO2-MeOH, 10mL/min

Oven temp @ 40 C BPR @ 200bar

UV detection @ 220nm

3 x uopt

Only 25% efficiency loss

Condiciones de Análisis Rápidas



El aumento de número de platos en HPLC está principalmente limitado por la presión (El aumento de L y la disminución del dp implica aumento de presión).

La baja viscosidad, disminuye el aumento de presión, permitiendo el aumento del caudal y la longitud de la columna, incluso el acoplamiento de varias columnas para mejorar la separación.

Viscosidad ~ Velocidad/Eficacia

22

250

cpddFLP η

≈∆Aumento de Presión:

Eficacia: pd

LN2

≈

′+

′

−⋅=

2

2

1125.0

kkNRs α

α


BZD 1. Diazepam 2. Midazolam 3. Flunitrazepam 4. Lormetazepam 5. Flurazepam 6. Alprazolam 7. Triazolam 8. Clorazepam 9. Bromazepam 10. Nitrazepam 11. Clonazepam 12. Oxazepam 13. Lorazepam 14. Clozapine 15. Olanzapine

N

N R2

R3 R4

R5

R1

150 x 4.6mm, 5µm 30bar

2 1 3

4

5 + 6 7

8 9

10 + 11

12 13 + 14

15

Pc = 63

450 x 4.6mm, 5µm

2 1 3

4

6

7 8 9 11 12

13 14

80bar

5 10

15

Pc = 108

Analytical conditions : CO2-MeOH gradient mode, 4mL/min ; PrincetonSFC 2EP 150 x 4.6mm, 5µm; Oven temp @ 40 C ; BPR @ 150bar ; UV @ 220nm

Analisis de Alta Resolución



Cualquier compuesto soluble en metanol o un solvente orgánico mas apolar.

Ácidos Orgánicos Fuertes y Bases requieren modificador con aditivo (DEA, TFA).

La mayor parte de sales y ácidos orgánicos y bases.

Pequeños péptidos lipofílicos

Se pueden separar solutos apolares como ceras y aceites

¿Qué compuestos pueden analizarse por SFC?


Mayor velocidad y Productividad

– Mejor forma de pico

– Mejor resolución

– Re-equilibrado mas rápido

– Reducción del ciclo de análisis

– Mas muestras por día

SFC complementa RP-LC

– Técnica de fase normal

– Compatible con MS

– Selectividad Diferente

– Mejor retención de compuestos polares.

SFC mejora la separación de isómeros y enantiómeros, y compuestos de estructura similar.

No substituye completamente el HPLC, pero permite analizar el ~80% de moléculas pequeñas

Ventajas del SFC

Zhao Y. et al. LC GC Europe, 2004, 174 (4), 224-238


Recordatorio: Partículas menores aumentan la Productividad


¿Tienen las columnas con química de menor tamaño de partícula (< 2 µm) los mismos benefícios en SFC, que el que tienen en HPLC?


Curvas de Eficacia en Columnas de SFC

2.5 µm XBridge™ HILIC, 3.0x50 mm



1.7 µm ACQUITY BEH , 3.0x50 mm

Condiciones Isocráticas CO2/Methanol 85:15 130 bar Presión de Salida


Comparación de Resolución

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Minutes0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

1.7 µm

5 µm 3.0x100 mm Column 2 mL/min CO2/Methanol Gradient


ACQUITY UPC2 – Nuevo Miembro…


… en la Familia ACQUITY


Gold Award en Pittcon !


Rango de caudal – 0.010 a 4.000 mL/min

Máxima presión de trabajo

– 6,000 psi (413 Bar) up to 4mL/min

Convergence Manager que contiene BPA integrado

Cuatro nuevas químicas de columnas de 1.7µm

Software Estandar de Waters (MassLynx™ o Empower™)

Completa compatibilidad con la consola de Empower

Connections INSIGHT®

ACQUITY UPC2 Características de Sistema


ACQUITY UPC2 System


3 Configuraciones de sistema

Configuración 1 2 SFC Columns




Calidad CO2

Presión : ~ 60 bar

Calidad alimentaria >99.97% Pureza

Sin necesidad de manoreductor

Una botella estandar de CO2 (B50 sifonado) puede durar ~3-4 semanas.


CO2 y seguridad

CO2 Monitorización – Un detector de CO2 debe situarse a unos 60cm de altura (a menor altura que la

mesa del instrumento). El detector debe iniciar una alarma a 4500 ppm de CO2. Waters no recomienda ningún distribuidor específico.

O2 Monitorización


UPC² Químicas de Columna


Clasificación Unificada

CO2/MeOH 90/10

Courtesy of C. West, E. Lesellier, ICOA – University of Orléans


Retención en Fases Estacionarias: Compuestos con propiedades similares


Diferentes Selectividades

1. Coumarin 2. Flavone 3. Caffeine 4. Thymine

5. Papaverine 6. Sulfamethoxazole 7. Cytosine 8. Sulfamethizole

CSH Fluoro-Phenyl

BEH

BEH 2-EP

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00

1 2

3 4

5 6 7

8

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

Columna: 4.6 x 150mm, 5 µm 5-40% MeOH sin aditivo 3.0mL/min at 40 C, 150 bar Volumen Inyección: 3µL


ACQUITY UPC² Químicas de Columna

Primer set de químicas de columna sub-2 µm – Diseñadas y testadas para el sistema ACQUITY UPC²

– Alta eficacia y resolución

– Amplio rango de selectividad

3.5 µm Químicas de columna – Máxima flexibilidad para resolver cualquier análisis


ACQUITY UPC² Químicas de Columna

Columnas disponibles en formato sub-2-µm Disponible en Q2 2012 en tamaño de partícula de 3.5 µm y todas las

columnas HSS Línea Viridis® – Las 4 químicas en 5 µm

BEH 2-EP (2-Ethylpyridine) • Buena retención, forma de pico y selectividad

BEH • Intensa interacción con grupos polares como fosfolípidos

CSH Fluoro-Phenyl • Buena retención de bases débiles • Ordenes de elución alternativos para compuestos ácidos y neutros

HSS C18 SB • Analisis de glicéridos en matrices diversas (Farmacéuticos, alimentación…)


Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen el resultado del test del batch de SFC en el Certificado de Análisis (CoA)

Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen un e-Cord™ conectado

Batch Testing


Sesiones Workshop


Mesa Redonda

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