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Ledezma-Gairaud, Marisol.Validación del método: determinación de vitamina C total por cromatografía líquida de alta resolución “HPLC” Tecnología en Marcha. Vol. 17-4.

110%. y para el ácido ascórbico, y 110-120% para el ácido deshidroascórbico.Utilizando este método es posibledeterminar ambas formas activas de lavitamina C.

Introducción

La vitamina C ha sido reconocida como unnutriente importante en varios productosalimentarios. La importancia de estavitamina es bien entendida, particularmentecomo antioxidante y en la síntesis delcolágeno. La dosis diaria recomendada(DDR) de vitamina C se ha determinado en60 mg, suficiente para prevenir el escorbutoy mantener una reserva de 1.500 mg, muchade la cual proviene de frutas y vegetales.1-5

Debido a su fácil degradación, la vitaminaC es un compuesto muy utilizado en latecnología de alimentos como índice decalidad nutricional de las comidasprocesadas. Se dice que si esta vitaminaresiste los tratamientos térmicos de losalimentos, todos los demás nutrientes seencuentran en buen estado.6-8

La acción de la vitamina C es suministradapor el ácido L-ascórbico (AA) y su forma

Palabras clave

HPLC, ácido deshidroascórbico, ácidoascórbico, vitamina C, validación.

Resumen

El método de determinación de vitaminaC total utilizando cromatografía líquidade alta resolución “HPLC”, fue validadoutilizando varias matrices. Incluye laextracción con una disolución al 3% enácido metafosfórico y al 8% en ácidoacético. El ácido ascórbico es separado enuna columna C18 utilizando un buffer defosfatos como fase móvil y un detectorUV a 254 nm. El ácido deshidroascórbicoes obtenido mediante la oxidación delácido ascórbico con carbón activado, elcual reacciona con o-fenilendiaminaformando un derivado que se determinaempleando un detector de fluorescencia.Los parámetros de validación confirmanque el método es adecuado paradeterminar vitamina C total en frutasfrescas, jugos y colados de frutas. Ladesviación estándar relativa (DER %)para todas las muestras fue < 10%. Losdatos de los porcentajes de recuperaciónestuvieron en un ámbito de entre 95-

Validación del método:Determinación de vitamina C total por cromatografía líquida de alta resolución “HPLC”

Marisol Ledezma-Gairaud1

1 CITA, UCR, San Pedro Montes de Oca, Costa Rica. Fax: (506) 253-3762. Correo electrónico:(mledezma@cita.ucr.ac.cr)

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método validado en donde se puedananalizar simultáneamente las dos formasactivas de esta sustancia.

Parte experimental

Principio

El método consiste en la extracción delácido ascórbico (AA) y el dehidroascórbico(DHAA) con reactivos y condicionesque eviten al máximo su deterioro. Estose logra utilizando una disoluciónextractora de ácido metafosfórico y EDTAque protege al ácido ascórbico de laoxidación por el aire y la luz. El extracto esanalizado por cromatografía líquida de altaresolución donde los dos compuestos seseparan y cuantifican simultáneamente. Elácido ascórbico se detecta y cuantifica porespectrofotometría ultravioleta mientrasque el dehidroascórbico se cuantifica porla formación de un derivado poscolumnaque se detecta por fluorescencia. Lacuantificación e identificación de losácidos se realiza inyectando patrones deconcentración conocida, los cuales seutilizan para calibrar el equipo en cuanto aconcentraciones y para la identificación delos tiempos de retención.

Los parámetros analizados para lavalidación de este método fueron lossiguientes:

• Linealidad

• Ámbito (10-200 mg/L)

• Veracidad (% recuperación)

• Precisión (RSDr %)

• Límite de detección

• Límite de cuantificación

Equipos

• Balanza analítica con una precisiónde 0,1 mg.

• Cromatógrafo líquido de altaresolución que incluye:

oxidada, el ácido deshidroascórbico(DHAA). En humanos ambas formas sonbiológicamente activas, definiéndose asíla vitamina C total como la suma de lasdos.1,2 Al haber solo dos formas activasde esta vitamina C, el desafío analíticopareciera simple comparado con otrassustancias; sin embargo, se debenconsiderar factores tales comoespecificidad, inestabilidad del analitofrente a condiciones de pH, luz ytemperatura y autocatálisis durante laextracción, entre otras.2 Existendiferentes métodos analíticos utilizadospara la determinación de la vitamina C,dentro de los cuales tenemos lossiguientes: el de valoración con el 2, 6-dicloroindofenol; el colorimétricoutilizando 2, 4- dinitrofenilhidrazina; elmicrofluorométrico y varios métodos porcromatografía líquida de alta resolución(HPLC). Los primeros dos métodoscarecen de especificidad y están sujetos ainterferencias de la matriz, produciendo asíalteración de la exactitud, y el tercero esespecífico para vitamina C total y se utilizaen productos considerados como buenasfuentes de esa sustancia. Los métodoscromatográficos que hasta hoy se conocenestán limitados porque la vitamina C sepresesenta naturalmente, en muchosalimentos, como AA y DHAA y a menosque el DHAA sea convertido a AA, losresultados obtenidos pueden ser bajoscuando se analiza solo la forma reducida.

Muchos alimentos han sido analizadosy se ha encontrado que ≥ 90% de losproductos contienen DHAA. Enalgunos de ellos, tales como zanahoriasfrescas y papa sin cáscara, los nivelesdel DHAA representan ~ 40% o más delcontenido total de la vitamina C.1

Debido a la importancia que tienenambas formas activas de esta vitaminapara el ser humano, la cuantificacióntanto del ácido ascórbico como eldehidroascórbico en frutas y derivadosde frutas, que son fuentes ricas devitamina C, es preciso contar con un

Muchos alimentos hansido analizados y se haencontrado que ≥ 90%de los productoscontienen DHAA. Enalgunos de ellos, talescomo zanahoriasfrescas y papa sincáscara, los nivelesdel DHAA representan~ 40% o más delcontenido total de lavitamina C.

• Disolución extractora A: 3% ácidometafosfórico, 8% ácido acético: Sedisolvieron 30 g de perlas de HPO3en 80 mL de ácido acético glacial y400 mL de agua; se diluyó a 1 L conagua grado HPLC y se filtrórápidamente a través de papel de filtroen una botella con tapa de vidrio. Estadisolución, si se mantiene enrefrigeración, dura 7-10 días.

• Disolución extractora B: Sedisolvieron 3,6 g de EDTA en 400 mLde agua con agitación y se diluyó a 1L. Esta disolución se conserva enbuen estado hasta por 6 meses.

• Disolución extractora de trabajo: Semezclaron volúmenes iguales de lasdisoluciones A y B inmediatamenteantes de usar. Esta disolución debeestar fresca.

• Disolución de OPDA, paraderivatización poscolumna: Se pesó0,70 g de o-fenilendiamina (OPDA) yse disolvieron en 200 mL de fasemóvil. Se filtró por microporo y sedesgasificó en el ultrasónico por 25minutos.

Extracción

Durante todas estas etapas, se protegió lamuestra de la luz para evitar el deterioro dela vitamina recubriendo los recipientes conpapel aluminio.

• Jugos de frutas: Se pesó porheptaplicado, 25 mL en un balón de100 mL y se llevó a volumen con ladisolución extractora de trabajo. Sefiltraron por microporo (0,45mm) yse inyectaron.

• Frutas frescas y colados de frutas:Se pesaron por heptaplicado 20 g enun balón de 100 mL (para colados) y25 g (para frutas frescas) y se llevó avolumen con la disolución extractorade trabajo. Una vez aforadas, lasdisoluciones se trasvasaron a botellaspara centrífuga, en el agitador

• Detector espectrofotométrico UV-visible Shimadzu SPD-6A

• Detector de fluorescencia ShimadzuRF-530

• Bomba Shimadzu LC-10AD • Integrador EZCHROM • Módulo de reacción poscolumna

Pickering Laboratories PCX3100.• Columna de cromatografía:

econosphera C18, marca Alltech oequivalente, 5 mm, de 250 x 4,6 mm.

• Precolumna correspondiente.

• Equipo para microfiltración de lafase móvil marca Sartorius, para usarcon filtros para solventes acuosos de47 mm.

• Microfiltros 45 mm, de marcaMillipore, MSI o equivalentes, dediámetros 47 mm, 25 mm y/o 13 mm,aptos para filtración de fases acuosas.

• Portafiltros para filtros de 25 mm o 13mm y jeringas para la microfiltraciónde las muestras.

• Baño de ultrasonido para ladesgasificación de la fase móvil.

• Agitadores magnéticos o vortex paraagitación durante la extracción.

• Centrífuga, con capacidad de llegar a4.000 rpm y los tubos correspondientes.

• Beakers.

• Balones aforados de 100 mL.

• Embudo, ángulo 60º, DI 65 a 75 mm.

• Papel de filtro Whatman N.º 4 oequivalente.

Reactivos

• Agua bidestilada o desionizada enMilli Q, filtrada por microporo ydesgasificada.

• Ácido acético glacial grado ACS.

• Ácido ascórbico marca Alldrich-Sigma o equivalente, para usarcomo patrón, 99-100% de pureza.

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Se preparó otro set de patrones diluidosde ácido ascórbico A’, B’, C’, D’, E’ y F’y se trataron como se detalla acontinuación:

Se transfirió cada patrón a frascosyodimétricos con tapón esmerilado a los quese les agregaron 2 g de carbón activadolavado con ácido, para convertir el ácido

Para la validación de la curva se prepararon5 disoluciones madre, independientes de1.000 ppm de ácido ascórbico y seconstruyó la curva de calibración con 6patrones que se encontraban en elámbito 10-200 ppm. Se hizo la curva decalibración de los puntos inyectandoaleatoriamente los patrones A, B, C, DE y F de cada disolución madre.

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• Temperatura del reactor: 100ºC

• Presión de reactivo: 400 psi

• Presión poscolumna: 150 psi

• Longitud de onda emisión: 430 nm

• Longitud onda excitación: 350 nm

Una vez que el equipo alcanzó lascondiciones indicadas, se procedió ainyectar los patrones y luego las muestras.Entre inyección e inyección se lavó lajeringa con disolución extractora de trabajopor lo menos 6 veces para asegurarse de queno se contaminaran entre sí las muestras.

Cuantificación

Validación de las curvas decalibración

En la Cuadro 1 se presenta la preparaciónde la curva de calibración.

mecánico se agitaron vigorosamentedurante 30 minutos. Se dejaronreposar por una hora y luego secentrifugaron por 15 minutos a 4.000rpm. Las disoluciones se filtraron pormicroporo (0,45µm) y se inyectaron.

Análisis cromatográfico Condiciones de trabajo

La fase móvil utilizada fue una disoluciónde fosfato diácido de potasio en aguabidestilada, KH2PO4 0,1 mol/L (13,60 g/L)llevada a pH 2,50 con ácido fosfóricoconcentrado, filtrada por filtro de 0,45mm ydesgasificada en ultrasonido por 20minutos. El flujo fue de 0,7 mL/min y latemperatura de la columna es latemperatura ambiente. El detector UV-Visse utilizó a una longitud de onda de 254 nmpara el ácido ascórbico. El módulo depickering o derivatización poscolumna setrabajó bajo las siguientes condiciones:

Una vez que el equipo alcanzó lascondiciones indicadas,se procedió a inyectarlos patrones y luegolas muestras.

Cuadro 1Preparación de la curva de calibración

Preparación* Concentración (mg/L o ppm)

M Pesar 0,100 g de AA y aforar a 100 mLcon disolución extractora de trabajo. 1.000

A Diluir M: 0,5 mL en 50,00 mL 10B Diluir M: 2,0 mL en 50,00 mL 40C Diluir M: 2,0 mL en 25,00 mL 80D Diluir M: 5,00 mL en 50,00 mL 100E Diluir M: 4,00 mL en 25,00 mL 160F Diluir M: 5,0 mL en 25,00 mL 200

*Nota: todos los patrones se aforan con disolución extractora de trabajo y se protegen de la luz con papel aluminio.

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una por una. Se determinó la desviaciónestándar de los resultados.

Factor de recuperación

Para comprobar la veracidad del métodose realizaron pruebas de recuperación,pesando una cantidad de muestra cuyopeso fue la mitad del de las muestrasanalizadas. Se agregó una cantidad delpatrón de ácido ascórbico de 1.000 ppm.de modo que la concentración final fueradel mismo orden de la concentración delanalito sin marcar.

Para la recuperación del ácidodehidroascórbico, se tomó una alícuotade 25 mL del patrón de 1.000 ppm de ácidoascórbico y se siguió el tratamientoanteriormente descrito. Una vez finalizadoeste, se agregó una cantidad del patrón deácido dehidroascórbico de 1.000 ppm. demodo que la concentración final fuera delmismo orden que la concentración delanalito sin marcar.

Discusión

La validación del método:“Determinación de vitamina C totalutilizando HPLC” se realizó tomando encuenta aspectos que pueden degradarla.Como se ha mencionado anteriormente,las dos formas biológicamente activas quecontribuyen con el valor nutricional de losalimentos incluyen el AA y el DHAA,cuyas estructuras pueden observarse en laFigura 19.

Se ha comprobado que una disoluciónde vitamina C en agua destilada a un pHigual a 7,00 es inestable, por lo que esrápidamente oxidada.10 Casi siempre lavelocidad de oxidación es reducidacuando se utiliza un pH bajo, por estarazón se usó un buffer de fosfatos comofase móvil (pH = 2,5), además se empleócomo disolución extractora una mezcla50:50 de ácido metafosfórico: EDTA. Elácido metafosfórico se utiliza paraprecipitar proteína y junto al EDTAestabilizan el ácido ascórbico, al ser elEDTA un agente quelatante, este reacciona

ascórbico (AA) en ácido dehidroascórbico(DHAA). Se agitó por 10 minutos en unagitador magnético y se dejaron en reposopor 5 minutos para permitir que sedimentasela mayor cantidad posible de carbónactivado. Se pasó a través de papel de filtroWhatman # 5 y el filtrado se recogió en unerlenmeyer protegido con papel dealuminio. Se filtraron 500 mL a través demicroporo de 0,45 mm. La concentraciónde DHAA será la misma que la disoluciónde AA de donde proviene. Se hizo la curvade calibración de los puntos inyectandoaleatoriamente los patrones A’, B’, C’, D’,E’ y F’ de cada disolución madre.

La linealidad de la curva se evaluómediante pruebas de significanciaestadística (falta de ajuste). Una vezevaluados tanto el ácido ascórbico comoel dehidroascórbico, se procedió a lavalidación de muestras. Cada muestra sepreparó por heptaplicado.

Cálculos

Cálculo de concentraciones

El valor de la concentración en lamuestra se estimó interpolando el área apartir de la regresión de la curva decalibración. La concentración del ácidoascórbico y del dehidroascórbico secalculó utilizando la siguiente fórmula:

mg/100g = Cn interp * 10/masa muestra

Se calculó el promedio, la desviaciónestándar y el coeficiente de variaciónpara las muestras y se reportó elcontenido de vitamina C total como lasuma de los dos ácidos analizados.

Repetibilidad

Se prepararon por separado y porheptaplicado muestras sólidas y semisólidasque incluyeron la extracción y lacentrifugación, y líquidas, representativas delos grupos de alimentos que más se analizan,por ejemplo, frutas frescas, refrescos defrutas y un puré de frutas, y se inyectaron

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frutas. La veracidad del método fuecomprobada por medio del porcentaje derecuperación. En la Cuadro 2 se presentanlos resultados junto con la desviaciónestándar relativa, expresada comoporcentaje (DER).

Los resultados se encuentran dentro de loslímites establecidos en la literatura paramétodos cromatográficos (80-120%).12

La repetibilidad del método se determinócomo la desviación estándar relativa desiete réplicas, analizadas bajo condicionesidénticas y en el mismo día. Los resultadosse observan en la Cuadro 3. En todos loscasos el resultado fue menor del 10%,límite establecido para aceptar losresultados del análisis.

De acuerdo con el ámbito de trabajoestablecido, se realizó el análisis estadísticoutilizando el método de ajuste de mínimoscuadrados clásicos para efectuar lasmediciones de los patrones y de lasmuestras. En los Gráficos 1 y 2 se muestranla recta de mejor ajuste, el ámbito delinealidad y el coeficiente de correlaciónpara la curva del AA y la del DHAA.

Con estos resultados, se determinaron loslímites de detección y de cuantificacióncalculados según Miller y Miller (1993)11,los cuales fueron de 1,82 y 6,06 ppm. parael AA y de 3,18 y 10,61 ppm. para elDHAA, respectivamente.

En el estudio de validación del método seevaluaron tres tipos de muestras: jugos defrutas, frutas frescas y colados o purés de

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patrones como las muestras se protegieronde la luz con papel aluminio y el análisisse realizó el mismo día.

con los iones metálicos tales como el Cu2+

y el Fe3+ presentes en la matriz a analizar.Además de estos cuidados, tanto los

Figura 1Estructura de la vitamina C.

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Cuadro 2% de recuperación de las muestras validadas

Muestra % Rec DER % % Rec DER %AA AA DHAA DHAA

Frutas 107 0,7 120 1,Jugos 101 1,1 110 0,8Colados de frutas 98 0,9 119 1,0

Cuadro 3Desviación estándar relativa de siete réplicas

de las muestras validadas

Muestra DER % (AA) DER % (DHAA)

Frutas 0,8 2,0Jugos 0,1 3,6Colados de frutas 1,7 2,9

9.000.000

8.000.000

7.000.000

6.000.000

5.000.000

4.000.000

3.000.000

2.000.000

1.000.000

00,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00

Concentración (ppm)

Áre

a

Gráfico 1Promedio curvas de calibración para la validación del AA por HPLC.

y = 1.932,2x + 8.728,1R2 = 0,9951

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Conclusiones

El estudio de validación de este método, deacuerdo con los parámetros establecidos, seconsidera adecuado para la determinaciónde vitamina C en frutas y derivados defrutas, pudiéndose identificar y cuantificartanto el ácido ascórbico como eldeshidroascórbico, ambos biológicamenteactivos en humanos.

Abreviaturas

HPLC: High Performance LiquidChromatography

AA: Ácido AscórbicoDHAA: Ácido DeshidroascórbicoDDR: Dosis Diaria RecomendadaDER: Desviación Estándar RelativaUV: Ultravioletanm: Nanómetrosmg: MiligramosEDTA: Ácido etiendiaminotetracético

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Gráfico 2Promedio curvas de calibración para la valoración del DHAA por HPLC.

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