06metodos de dispersion

Anlisis InstrumentalTema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.

Espectroscopa de dispersin Raman.

Turbidimetra y Nefelometra.

Anlisis InstrumentalTema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.

Espectroscopa de dispersin RamanDispersin Raman (fenmeno y tcnica espectroscpica).El Espectrofotmetro Raman.Comparacin con la Espectroscopia IR

Turbidimetra y nefelometra Dispersin de Tyndall(fenmeno y tcnica no espectroscpica). Instrumentacin de la turbidimetra y nefelometra.Aplicaciones.

Anlisis Instrumental

Choques elsticos con molculas o partculas de tamao atmico

Dispersin Rayleigh

Choques inelsticos con molculasDispersin Raman

Choques elsticos con macromolculas o partculas coloidales

Dispersin Tyndall

EspectroscopaRaman

Turbidimetra y nefelometra

Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin

Anlisis InstrumentalTema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin

La dispersin de radiacin tiene lugar cuando un haz de radiacin incidente UV-visible choca con partculas atmicas, moleculares o coloidales.

Se observa que una pequea fraccin de la radiacin se difunde a partir del haz entodas las direcciones.

Radiacin dispersada

Radiacin transmitida

Radiacin incidente


Los fotones de un rayo de luz monocromatico de la regin vis- IR cercano pueden experimentarel fenmeno de una dispersin debido a:

1) Colisiones elsticas en algunas regiones de la molecula: es la dispersin Rayleigh (tamao de partcula pequeo) o dispersin Tyndall (tamao de partcula grande), que ocurre sin prcticamente prdida de energa.

2) Colisiones inelsticas (donde una parte de la energa del fotn se absorbe y el resto se dispersa: dispersin Raman), que inducen vibraciones moleculares cuantizadas segn los modos normales de vibracin posible en la molcula. Se pueden dar dos casos: Raman Stokes y Raman Anti-Stokes.

oF

oF

Stokes: 0 < F Anti-Stokes: 0 > F

Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin

Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.

ESPECTROSCOPIA RAMAN

La tcnica analtica espectroscopia Raman se basa en un fenmeno especfico de dispersinde la luz que presenta alguna similitud y recuerda a la fluorescencia.

En Espectroscopa Raman, las vibraciones moleculares se miden en forma de emisin deenerga luminosa (radiacin Raman dispersada ) como consecuencia de la excitacin conuna fuente monocromtica de luz visible generalmente del rojo o IRC ( la intensidad de luzdispersada es slo de 10-5 a 10-6 de la incidente).

Para evitar la aparicin de emisiones de fluorescencia, el haz excitante es de la zona delrojo (600-1000 nm), donde la energa del fotn es insuficiente para activar la molcula alnivel electrnico excitado y desencadenar fluorescencia. Se evitar as un elevado fondo quepodra suponer una fluorescencia simultnea.


El haz excitador debe ser:

a) de elevada intensidad

b) altamente monocromtico

c) De elevada (zona visible)

En los espectros Raman se representa la diferencia en cm-1 de la radiacindispersada con respecto a la radiacin original. Este desplazamiento en energade las emisiones Raman de una molcula con respecto a la energa asociada lalongitud de onda incidente es una importante arma analtica complementariaen cuanto a aplicaciones a la espectroscopia de absorcin infrarroja.

Las fuentes lser de luz roja o similar cumplen estos

requisitos, por lo que son las usadas habitualmente en esta

tcnica analtica espectrocpica.


Choque elstico

S0ho S0

Dispersin Rayleigh

Choque inelstico

S0ho S0

Raman Stokes (o>f)

Choque inelstico

S0ho S0

Raman Anti-Stokes (o


Como regla, la dispersin Raman de la luz es soloobservada para un ngulo de 90 y se usanprincipalmente las lneas Raman Stokes que sonms intensas y contienen toda la informacin de lamolcula.

Inte

nsid

ad

Rayleigh

Stokes

Anti-Stokes

S0Las diferencias de energa entre la Incidente ylas Stokes se corresponden con las energasnecesarias para producir transicionesvibracionales. Por lo tanto, midiendo dichadiferencia de energa es posible obtenerinformacin sobre estas transiciones (esdecir, sobre la estructura).

Incidente


EspectroscopaRaman

Radiacin

Induce vibraciones, reemite a menor E

Toma E de molculas vibrando

Se reemite sin intercambio de E

Complementa a IR

Tema 6: Dispersin Raman.


Inte

nsid

ad

fuente = 532 nm

= 576 nm

Inte

nsid

ad

fuente = 785 nm = 885 nm

Si se representa la intensidad de radiacin dispersada en funcin de su , el espectroobtenido depende de la incidente

A) Espectro Raman con una fuente de excitacin

de 532 nm

B) Espectro Raman con una fuente de excitacin

de 785 nm


pero si se trabaja en nmero de ondas en unidades relativas (asignando a la radiacinincidente un valor de 0), el espectro es independiente de la fuente empleada.

Inte

nsid

ad

relativas

1142 cm-1

532 nm 576 nm

N ondas

absolutas 18797 cm-1 17355 cm-1

N ondas

relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

785 nm 885 nm

N ondas

absolutas 12739 cm-1 11297 cm-1

N ondas

relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

A B

0

Anlisis InstrumentalTema 6: Espectrofotmetro de Raman.

FuenteDebe proporcionar una radiacin de monocromtica intensa con visible/IR cercano. Hoy da, los lser se usan para esto (haz de luz muy estrecho e intenso que puede ser focalizado perfectamente hacia la muestra). Una lnea de un plasma gaseoso productor de radiacin lser (lser inico de Ar o Kr) es enfocada en la muestra.

El ESPECTROFOTMETRO RAMAN

FuenteLaser

Mono-cromador

Detector

Radiacin incidente


Radiacin dispersada

Filtro bloqueante

Espejo

concentrador

Muestra


Raman-FT

Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.


Compartimento de muestraLas muestras pueden ser dispuestas en tubos de punto de fusin cuando se trata deslidos en polvo, lquidos puros o disoluciones, y para gases en cubetas demltiples reflexiones. Se requiere un sistema de enfriamiento efectivo parasustancias termosensibles o que pueden experimentar degradacin fotoltica, poreso las medidas se hacen mientras la muestra est rotando.

Filtro bloqueantePara eliminar la dispersin Rayleigh proveniente de la fuente laser.

Monocromador (tambin existen espectrmetros Raman-FT)

Debido a la dbil intensidad de la radiacin de dispersin Raman y la necesidad deseparar sta de la radiacin Raleigh, el monocromador equipado debe ser de altacalidad ptica. Con el monocromador de rejilla de difraccin hologrfica se alcanzauna muy buena resolucin.


Detector

En el fotomultiplicador los fotones, que corresponden a la regin visible/IR cercanopero cuyos desplazamientos de con respecto a la incidente se dan en unaextensin de la zona IR medio, producen una corriente fotoelctrica. A pesar de quela intensidad de la luz Raman producida es muy pequea, el detectorfotomultiplicador es muchsimo ms sensible que los detectores para absorcin de IRconstituidos por termoelementos.

La posibilidad de usar tubos fotomultiplicadores, junto con que los picos son muyestrechos y con poco fondo, hace que la espectroscopia Raman d mejores resultadosque la IR en anlisis cuantitativos.

Ir = k P0 b C = K C

Anlisis InstrumentalTema 6: Comparacin de la Espectroscopa Raman con la Espectroscopa IR.

La base de espectrocopa IR es la absorcin de la energa de fotones (hv) para la excitacin de vibracionesmoleculares. Los espectros Raman e IR no coinciden en cuanto a las bandas que aparecen, si bien puedentener algunas bandas en comn. En Raman se obtienen espectros algo ms simples, pues los sobretonos opicos de combinacin suelen ser muy poco intensos.

- La espectroscopa Raman puede ser usada para identificar molculas inactivas al IR por tener una totalsimetra, o en las que abundan grupos simtricos o grupos poco polares. El IR va mejor para investigarmolculas poco simtricas y con grupos muy polares.

- En Raman se puede usar el agua como disolvente y cubetas de vidrio.

-La ventaja fundamental de la espectroscopia Raman respecto al IR es su mejor aptitud para realizaranlisis cuantitativos (mayor linealidad y sensibilidad), no obstante el anlisis de estructura de compuestosorgnicos sigue siendo una aplicacin destacada.

-Se hacen anlisis de muestras artsticas tales como pinturas para identificar los pigmentos (tcnica nodestructiva)

COMPARACIN CON LA ESPECTROSCOPIA IR Y APLICACIONES

Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra

TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) de radiacin de la zona visible, atraviesa ygolpea una suspensin de partculas coloidales (muestra turbia en una cubeta) ocurre losiguiente:

una parte de la luz es reflejada (a) hacia atrs

una parte es diseminada en todas direcciones (dispersin Tyndall) (b)

parte es absorbida (c)

parte es transmitida (d)

Generalmente la suma de c y d es la mayor fraccin. Como consecuencia (a) y (b) es unamedida indirecta de la turbidez y dicha fraccin de luz dispersada se puede usar para elanlisis cuantitativo de disoluciones o suspensiones coloidales, emulsiones, humos onieblas (soluciones no homogneas)


Ambas tcnicas sirven para medir la dispersin Tyndall de suspensiones slidasen un lquido (Propiedad no espectroscopica)

La turbidez y la luz que ella dispersa se puede medir:

1) directamente por la intensidad de luz desviada a, normalmente, un ngulo de 90 conrespecto a la radiacin incidente (nefelometra).

2) indirectamente como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin(turbidimetra).

Radiacin dispersada


Radiacin incidente


La turbidimetra y la nefelometra son dos tcnicas complementarias para medirturbidez pero que emplean distintos instrumentos (similares respectivamente aun fotmetro y a un flurmetro).

En principio cualquier materia en suspensin, analito que d una reaccin deprecipitacin (precipitacin inducida), o muestra con microorganismos se puedecuantificar por su turbidez natural u originada.

En las reacciones de precipitacin inducida se deben formar partculas muyfinas, de tamao reproducible y que permanezcan en suspensin sincoagular. Si no se da este ltimo caso, se aade un coloide protector (comogelatina o glicerina) o un agente tensioactivo.


-La intensidad de luz dispersada depende de: la concentracin o densidad del nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, la longitud de onda de la radiacin incidente y de los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante.

-El procedimiento de medida de la dispersin es generalmente emprico haciendo que permanezcan invariables las condiciones experimentales de tamao/forma de las partculas y de intensidad/longitud de onda usada. Las medidas generalmente usan una lmpara cualquiera de luz blanca (policromtica) pero asegurndonos de que su intensidad sea constante durante el proceso.

-Slo se obtienen datos fiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan al tamao de partculas, y si se mantiene una distribucin uniforme del tamao de partculas en la muestra, y entre muestras y patrones.


Esquema de un turbidmetro-nefelmetro que permite medir la luz transmitida y dispersada en dos ngulos para tener en cuanta los distintos patrones de dispersin de

acuerdo a las caractersticos y tamao de las partculas.

P0

Id 90

Fuente

Com

parti

men

to

de m

uest

ra

Detector 1

(Turbidimetra)

P

Detector 2

(Nefelometra 90)


Turbidimetra-log T = k b C k = f (forma , y )

Se aplica a muestras de elevada turbidez dentro de ciertos lmites, realizando la medida de unaabsorbancia aparente (ya que, realmente, no se produce un proceso de absorcin, sino de dispersin).

Existe una relacin directa entre la absorbancia aparente y la concentracin de analito o laconcentracin celular bacteriana siempre y cuando se trate de suspensiones diluidas ( A< 0.3) ya quevalores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. En las medidas de turbidez como parmetrono especfico se emplea la reaccin de la formazina (hidrazina + hexametilen tetramina) comoestndar.

Nefelometra

ID = kD I0 C kD = f (forma , y )

Es ms sensible que la turbidimetra , por lo que se usa para muestras con bajo nivel de turbidez (lo cual,por otro lado, presenta el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas que suelen involucrar un mayorerror de pipeteo) y que el ajuste en general de las condiciones experimentales es ms crtico.

Anlisis InstrumentalTemaTema 4. Otros mtodos pticosTcnicas de dispersin

Bioqumica clnica

Turbidez Especies inorgnicas

Proteinas

Alcaloides

Desnaturalizar con c. sulfosaliclico o tricloroactico y medir a 420 nm

Precipitar con reactivo de Sheibler(Na2WO4, Na3PO4, H+)

Nmero de diapositiva 1Nmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18Nmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Nmero de diapositiva 22Nmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24

06metodos de dispersion

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