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Anlisis InstrumentalTema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.
Espectroscopa de dispersin Raman.
Turbidimetra y Nefelometra.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.
Espectroscopa de dispersin RamanDispersin Raman (fenmeno y tcnica espectroscpica).El Espectrofotmetro Raman.Comparacin con la Espectroscopia IR
Turbidimetra y nefelometra Dispersin de Tyndall(fenmeno y tcnica no espectroscpica). Instrumentacin de la turbidimetra y nefelometra.Aplicaciones.
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Anlisis Instrumental
Choques elsticos con molculas o partculas de tamao atmico
Dispersin Rayleigh
Choques inelsticos con molculasDispersin Raman
Choques elsticos con macromolculas o partculas coloidales
Dispersin Tyndall
EspectroscopaRaman
Turbidimetra y nefelometra
Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin
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Anlisis InstrumentalTema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin
La dispersin de radiacin tiene lugar cuando un haz de radiacin incidente UV-visible choca con partculas atmicas, moleculares o coloidales.
Se observa que una pequea fraccin de la radiacin se difunde a partir del haz entodas las direcciones.
Radiacin dispersada
Radiacin transmitida
Radiacin incidente
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Anlisis Instrumental
Los fotones de un rayo de luz monocromatico de la regin vis- IR cercano pueden experimentarel fenmeno de una dispersin debido a:
1) Colisiones elsticas en algunas regiones de la molecula: es la dispersin Rayleigh (tamao de partcula pequeo) o dispersin Tyndall (tamao de partcula grande), que ocurre sin prcticamente prdida de energa.
2) Colisiones inelsticas (donde una parte de la energa del fotn se absorbe y el resto se dispersa: dispersin Raman), que inducen vibraciones moleculares cuantizadas segn los modos normales de vibracin posible en la molcula. Se pueden dar dos casos: Raman Stokes y Raman Anti-Stokes.
oF
oF
Stokes: 0 < F Anti-Stokes: 0 > F
Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
ESPECTROSCOPIA RAMAN
La tcnica analtica espectroscopia Raman se basa en un fenmeno especfico de dispersinde la luz que presenta alguna similitud y recuerda a la fluorescencia.
En Espectroscopa Raman, las vibraciones moleculares se miden en forma de emisin deenerga luminosa (radiacin Raman dispersada ) como consecuencia de la excitacin conuna fuente monocromtica de luz visible generalmente del rojo o IRC ( la intensidad de luzdispersada es slo de 10-5 a 10-6 de la incidente).
Para evitar la aparicin de emisiones de fluorescencia, el haz excitante es de la zona delrojo (600-1000 nm), donde la energa del fotn es insuficiente para activar la molcula alnivel electrnico excitado y desencadenar fluorescencia. Se evitar as un elevado fondo quepodra suponer una fluorescencia simultnea.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
El haz excitador debe ser:
a) de elevada intensidad
b) altamente monocromtico
c) De elevada (zona visible)
En los espectros Raman se representa la diferencia en cm-1 de la radiacindispersada con respecto a la radiacin original. Este desplazamiento en energade las emisiones Raman de una molcula con respecto a la energa asociada lalongitud de onda incidente es una importante arma analtica complementariaen cuanto a aplicaciones a la espectroscopia de absorcin infrarroja.
Las fuentes lser de luz roja o similar cumplen estos
requisitos, por lo que son las usadas habitualmente en esta
tcnica analtica espectrocpica.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
Choque elstico
S0ho S0
Dispersin Rayleigh
Choque inelstico
S0ho S0
Raman Stokes (o>f)
Choque inelstico
S0ho S0
Raman Anti-Stokes (o
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
Como regla, la dispersin Raman de la luz es soloobservada para un ngulo de 90 y se usanprincipalmente las lneas Raman Stokes que sonms intensas y contienen toda la informacin de lamolcula.
Inte
nsid
ad
Rayleigh
Stokes
Anti-Stokes
S0Las diferencias de energa entre la Incidente ylas Stokes se corresponden con las energasnecesarias para producir transicionesvibracionales. Por lo tanto, midiendo dichadiferencia de energa es posible obtenerinformacin sobre estas transiciones (esdecir, sobre la estructura).
Incidente
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Anlisis Instrumental
EspectroscopaRaman
Radiacin
Induce vibraciones, reemite a menor E
Toma E de molculas vibrando
Se reemite sin intercambio de E
Complementa a IR
Tema 6: Dispersin Raman.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
Inte
nsid
ad
fuente = 532 nm
= 576 nm
Inte
nsid
ad
fuente = 785 nm = 885 nm
Si se representa la intensidad de radiacin dispersada en funcin de su , el espectroobtenido depende de la incidente
A) Espectro Raman con una fuente de excitacin
de 532 nm
B) Espectro Raman con una fuente de excitacin
de 785 nm
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Anlisis InstrumentalTema 6: Dispersin Raman.
pero si se trabaja en nmero de ondas en unidades relativas (asignando a la radiacinincidente un valor de 0), el espectro es independiente de la fuente empleada.
Inte
nsid
ad
relativas
1142 cm-1
532 nm 576 nm
N ondas
absolutas 18797 cm-1 17355 cm-1
N ondas
relativas 0 cm-1 -1142 cm-1
785 nm 885 nm
N ondas
absolutas 12739 cm-1 11297 cm-1
N ondas
relativas 0 cm-1 -1142 cm-1
A B
0
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Anlisis InstrumentalTema 6: Espectrofotmetro de Raman.
FuenteDebe proporcionar una radiacin de monocromtica intensa con visible/IR cercano. Hoy da, los lser se usan para esto (haz de luz muy estrecho e intenso que puede ser focalizado perfectamente hacia la muestra). Una lnea de un plasma gaseoso productor de radiacin lser (lser inico de Ar o Kr) es enfocada en la muestra.
El ESPECTROFOTMETRO RAMAN
FuenteLaser
Mono-cromador
Detector
Radiacin incidente
Radiacin transmitida
Radiacin dispersada
Filtro bloqueante
Espejo
concentrador
Muestra
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Anlisis Instrumental
Raman-FT
Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Espectrofotmetro de Raman.
Compartimento de muestraLas muestras pueden ser dispuestas en tubos de punto de fusin cuando se trata deslidos en polvo, lquidos puros o disoluciones, y para gases en cubetas demltiples reflexiones. Se requiere un sistema de enfriamiento efectivo parasustancias termosensibles o que pueden experimentar degradacin fotoltica, poreso las medidas se hacen mientras la muestra est rotando.
Filtro bloqueantePara eliminar la dispersin Rayleigh proveniente de la fuente laser.
Monocromador (tambin existen espectrmetros Raman-FT)
Debido a la dbil intensidad de la radiacin de dispersin Raman y la necesidad deseparar sta de la radiacin Raleigh, el monocromador equipado debe ser de altacalidad ptica. Con el monocromador de rejilla de difraccin hologrfica se alcanzauna muy buena resolucin.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Espectrofotmetro de Raman.
Detector
En el fotomultiplicador los fotones, que corresponden a la regin visible/IR cercanopero cuyos desplazamientos de con respecto a la incidente se dan en unaextensin de la zona IR medio, producen una corriente fotoelctrica. A pesar de quela intensidad de la luz Raman producida es muy pequea, el detectorfotomultiplicador es muchsimo ms sensible que los detectores para absorcin de IRconstituidos por termoelementos.
La posibilidad de usar tubos fotomultiplicadores, junto con que los picos son muyestrechos y con poco fondo, hace que la espectroscopia Raman d mejores resultadosque la IR en anlisis cuantitativos.
Ir = k P0 b C = K C
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Anlisis InstrumentalTema 6: Comparacin de la Espectroscopa Raman con la Espectroscopa IR.
La base de espectrocopa IR es la absorcin de la energa de fotones (hv) para la excitacin de vibracionesmoleculares. Los espectros Raman e IR no coinciden en cuanto a las bandas que aparecen, si bien puedentener algunas bandas en comn. En Raman se obtienen espectros algo ms simples, pues los sobretonos opicos de combinacin suelen ser muy poco intensos.
- La espectroscopa Raman puede ser usada para identificar molculas inactivas al IR por tener una totalsimetra, o en las que abundan grupos simtricos o grupos poco polares. El IR va mejor para investigarmolculas poco simtricas y con grupos muy polares.
- En Raman se puede usar el agua como disolvente y cubetas de vidrio.
-La ventaja fundamental de la espectroscopia Raman respecto al IR es su mejor aptitud para realizaranlisis cuantitativos (mayor linealidad y sensibilidad), no obstante el anlisis de estructura de compuestosorgnicos sigue siendo una aplicacin destacada.
-Se hacen anlisis de muestras artsticas tales como pinturas para identificar los pigmentos (tcnica nodestructiva)
COMPARACIN CON LA ESPECTROSCOPIA IR Y APLICACIONES
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) de radiacin de la zona visible, atraviesa ygolpea una suspensin de partculas coloidales (muestra turbia en una cubeta) ocurre losiguiente:
una parte de la luz es reflejada (a) hacia atrs
una parte es diseminada en todas direcciones (dispersin Tyndall) (b)
parte es absorbida (c)
parte es transmitida (d)
Generalmente la suma de c y d es la mayor fraccin. Como consecuencia (a) y (b) es unamedida indirecta de la turbidez y dicha fraccin de luz dispersada se puede usar para elanlisis cuantitativo de disoluciones o suspensiones coloidales, emulsiones, humos onieblas (soluciones no homogneas)
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
Ambas tcnicas sirven para medir la dispersin Tyndall de suspensiones slidasen un lquido (Propiedad no espectroscopica)
La turbidez y la luz que ella dispersa se puede medir:
1) directamente por la intensidad de luz desviada a, normalmente, un ngulo de 90 conrespecto a la radiacin incidente (nefelometra).
2) indirectamente como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin(turbidimetra).
Radiacin dispersada
Radiacin transmitida
Radiacin incidente
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
La turbidimetra y la nefelometra son dos tcnicas complementarias para medirturbidez pero que emplean distintos instrumentos (similares respectivamente aun fotmetro y a un flurmetro).
En principio cualquier materia en suspensin, analito que d una reaccin deprecipitacin (precipitacin inducida), o muestra con microorganismos se puedecuantificar por su turbidez natural u originada.
En las reacciones de precipitacin inducida se deben formar partculas muyfinas, de tamao reproducible y que permanezcan en suspensin sincoagular. Si no se da este ltimo caso, se aade un coloide protector (comogelatina o glicerina) o un agente tensioactivo.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
-La intensidad de luz dispersada depende de: la concentracin o densidad del nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, la longitud de onda de la radiacin incidente y de los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante.
-El procedimiento de medida de la dispersin es generalmente emprico haciendo que permanezcan invariables las condiciones experimentales de tamao/forma de las partculas y de intensidad/longitud de onda usada. Las medidas generalmente usan una lmpara cualquiera de luz blanca (policromtica) pero asegurndonos de que su intensidad sea constante durante el proceso.
-Slo se obtienen datos fiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan al tamao de partculas, y si se mantiene una distribucin uniforme del tamao de partculas en la muestra, y entre muestras y patrones.
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
Esquema de un turbidmetro-nefelmetro que permite medir la luz transmitida y dispersada en dos ngulos para tener en cuanta los distintos patrones de dispersin de
acuerdo a las caractersticos y tamao de las partculas.
P0
Id 90
Fuente
Com
parti
men
to
de m
uest
ra
Detector 1
(Turbidimetra)
P
Detector 2
(Nefelometra 90)
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Anlisis InstrumentalTema 6: Turbidimetra y Nefelometra
Turbidimetra-log T = k b C k = f (forma , y )
Se aplica a muestras de elevada turbidez dentro de ciertos lmites, realizando la medida de unaabsorbancia aparente (ya que, realmente, no se produce un proceso de absorcin, sino de dispersin).
Existe una relacin directa entre la absorbancia aparente y la concentracin de analito o laconcentracin celular bacteriana siempre y cuando se trate de suspensiones diluidas ( A< 0.3) ya quevalores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. En las medidas de turbidez como parmetrono especfico se emplea la reaccin de la formazina (hidrazina + hexametilen tetramina) comoestndar.
Nefelometra
ID = kD I0 C kD = f (forma , y )
Es ms sensible que la turbidimetra , por lo que se usa para muestras con bajo nivel de turbidez (lo cual,por otro lado, presenta el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas que suelen involucrar un mayorerror de pipeteo) y que el ajuste en general de las condiciones experimentales es ms crtico.
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Anlisis InstrumentalTemaTema 4. Otros mtodos pticosTcnicas de dispersin
Bioqumica clnica
Turbidez Especies inorgnicas
Proteinas
Alcaloides
Desnaturalizar con c. sulfosaliclico o tricloroactico y medir a 420 nm
Precipitar con reactivo de Sheibler(Na2WO4, Na3PO4, H+)
Nmero de diapositiva 1Nmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18Nmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Nmero de diapositiva 22Nmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24