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AA

ElectroforeseElectroforese

Capilar numCapilar num

LaboratLaboratrio de Genrio de Genticatica

Instituto de GenInstituto de Gentica Mtica MdicadicaFaculdade de Medicina daFaculdade de Medicina daUniversidade de CoimbraUniversidade de Coimbra

Lus Mesquita

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AA ElectroforeseElectroforese Capilar numCapilar numLaboratLaboratrio de Genrio de Genticatica

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Objectivos:Objectivos:

Conhecer os princConhecer os princpios laboratoriais dapios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilar.capilar.

Descrever a tDescrever a tcnica decnica de SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger

-- TTcnicacnica

--AnAnliselise

--AplicaAplicaeses

-- Outras metodologias de sequenciaOutras metodologias de sequenciaoo

Descrever a tDescrever a tcnica de Ancnica de Anlise de fragmentoslise de fragmentos-- TTcnicacnica

--AplicaAplicaeses

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A separaA separao depende:o depende:

-- Tempo de migraTempo de migraoo

-- TemperaturaTemperatura

-- ForFora ia inica do tamponica do tampo

-- Intensidade do campo elIntensidade do campo elctricoctrico

-- Viscosidade do meioViscosidade do meio

ELECTROFORESE CAPILARElectroforeseElectroforese separaseparao de parto de partculas carregadas por aplicaculas carregadas por aplicaoo

de um campo elde um campo elctrico.ctrico.

O capilarO capilar o suporte so suporte slido, com 25 a 100lido, com 25 a 100m de dimetro interno,m de dimetro interno,

que contque contm a fase estacionm a fase estacionria (polria (polmero)mero)

PrincPrincpios laboratoriais dapios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilarcapilar

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OsOs cidoscidos nucleicosnucleicos migram para o nodo porque a pH neutromigram para o nodo porque a pH neutrotm carga negativa.tm carga negativa.

A velocidade de migrao inversamente proporcional aotamanho dos fragmentos gerados.

PrincPrincpios laboratoriais dapios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilarcapilar

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SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger: T: Tcnicacnica

TerminadoresTerminadores:: ddNTPddNTP marcadosmarcados fluorimetricamentefluorimetricamente onde na posionde na posio 3o 3dadadesoxirribosedesoxirribose um grupo OHum grupo OH substitusubstitudo por um H, impossibilitando odo por um H, impossibilitando o

formaformao de uma ligao de uma ligaoo fosfodiesterfosfodiester e a continuae a continuao da reaco da reaco deo de

polimerizapolimerizao.o.

ddCTP

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A C G T

1 -Fazendo uma reacopara cada terminador

1 2

2Uma s reaco com os 4

terminadores marcados comdiferentes fluorocromos

Direco damigrao na

electroforese -

+


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AmplificaAmplificao da sequncia alvo por PCRo da sequncia alvo por PCR PurificaPurificao do produto PCRo do produto PCR

EliminaEliminao de primerso de primers

EliminaEliminao de saiso de sais

Protocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaoo

PurificaPurificao da PCR de sequenciao da PCR de sequenciaoo

EliminaEliminao de primerso de primers

EliminaEliminao deo de terminadoresterminadores ((ddNTPsddNTPs) no incorporados) no incorporados ElectroforeseElectroforese capilarcapilar

InterpretaInterpretao dos dadoso dos dados

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ApAps a amplificas a amplificao da sequncia alvo por PCRo da sequncia alvo por PCR

Controlo da amplificaControlo da amplificao com electroforese emo com electroforese emgel de agarose a 2gel de agarose a 2 3%3%

PurificaPurificaoo

Isolar a banda

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Protocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaoo

Adequar a quantidade de produto PCR ao nAdequar a quantidade de produto PCR ao n dede pbpb

Isolar bandas se necessIsolar bandas se necessriorio

PurificaPurificaoo

SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger::

TTcnicacnica

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SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger: T: TcnicacnicaProtocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaoo

4min60

5seg50 25x

10seg96

1min96

Normal

- PCR enhancer: DMSO a 5%- Terminadores: Aumento

4min60

10seg50 35x

25seg98

1min98

Sequncias

difceis

Protocolo normal:Protocolo normal:

Produtos PCRProdutos PCR

PlasmPlasmdeosdeos

Sequncias difSequncias difceis:ceis:

Estruturas secundEstruturas secundriasrias shRNAshRNA

ConteContedo em G e Cdo em G e C

RegiesRegies homopolimhomopolimricasricas

Regies repetitivasRegies repetitivas

Protocolos de sequenciaProtocolos de sequenciaoo

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SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger: An: Anliselise

computacional dos resultadoscomputacional dos resultados

Raw data

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SequenciaSequenciaoo: An: Anlise computacional doslise computacional dos

resultadosresultados

Sequenciao de um plasmdeo

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CorrecCorreco dos dados obtidoso dos dados obtidos

-- SequencingSequencing analysisanalysis ((AppBioAppBio))

Gerar uma sequencia consenso, entreGerar uma sequencia consenso, entrea sequencia F e R.a sequencia F e R.

-- SeqScapeSeqScape ((AppBioAppBio))

-- NCBI (alinhamento de 2NCBI (alinhamento de 2 seqseq))

-- Outros softwaresOutros softwares

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Comparar a sequnciaComparar a sequncia

obtida, com outrasobtida, com outraspublicadaspublicadas

NCBINCBI BlastBlast

ManualManual

SeqScapeSeqScape ((AppBioAppBio))

Links to subsequent sectionson the current results page.Links to other GenBank pages

showing matching accessions.

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SequenciaSequenciaoo: An: Anlise manual dos resultadoslise manual dos resultados

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SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger: An: Anliselisecomputacional dos resultadoscomputacional dos resultados

Formatos (Formatos (SequencingSequencing filefile formatsformats))

Formato GenBank

- Uma sequncia no formato GenBank pode conter vrias sequncias.

- Uma sequncia no formato GenBank comea com uma linha contendo apalavra LOCUS.

- O incio da sequncia, est marcado com a palavra "ORIGIN"- O fim da sequncia est marcado est marcado com duas barras "//.- Tem 60 nucleotidos por linha em grupos de 10.

Exemplo:

LOCUS AB000263 368 bp mRNA linear PRI 05-FEB-1999DEFINITION Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin like peptide, complete cds.

ACCESSION AB000263ORIGIN1 acaagatgcc attgtccccc ggcctcctgc tgctgctgct ctccggggcc acggccaccg61 ctgccctgcc cctggagggt ggccccaccg gccgagacag cgagcatatg caggaagcgg

121 caggaataag gaaaagcagc ctcctgactt tcctcgcttg gtggtttgag tggacctccc181 aggccagtgc cgggcccctc ataggagagg aagctcggga ggtggccagg cggcaggaag241 gcgcaccccc ccagcaatcc gcgcgccggg acagaatgcc ctgcaggaac ttcttctgga

301 agaccttctc ctcctgcaaa taaaacctca cccatgaatg ctcacgcaag tttaattaca361 gacctgaa//

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SequenciaSequenciaoo pelo mpelo mtodo detodo de SangerSanger: An: Anliselisecomputacional dos resultadoscomputacional dos resultados

Formatos (Formatos (SequencingSequencing filefile formatsformats))

Formato FASTA

- Uma sequncia no formato FASTA pode conter vrias sequncias.

- Cada sequncia comea , com uma linha descritiva e dados

informativos.

- O formato FASTA comea sempre com o sinal ">" na primeira

coluna.

Exemplo:

>AB000263 |acc=AB000263|descr=Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin likepeptide, complete cds.|len=368

ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCCCCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGCCTCCTGACTTTCCTCGCTTGGTGGTTTGAGTGGACCTCCCAGGCCAGTGCCGGGCCCCTCATAGGAGAGG

AAGCTCGGGAGGTGGCCAGGCGGCAGGAAGGCGCACCCCCCCAGCAATCCGCGCGCCGGGACAGAATGCCCTGCAGGAACTTCTTCTGGAAGACCTTCTCCTCCTGCAAATAAAACCTCACCCATGAATGCTCACGCAAG

TTTAATTACAGACCTGAA

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SequenciaSequenciaoo: Aplica: Aplicaeses

-- SequenciaSequenciaoo do genoma humano;do genoma humano;

-- SequenciaSequenciao de outroso de outros genomasgenomas com aplicacom aplicao nao nabiologia, filogenia, alimentabiologia, filogenia, alimentao,o, zootzootcniacnia e outros.e outros.

-- Controlo de PCR,Controlo de PCR, RFLPsRFLPs,, etcetc (confirma(confirmao de outraso de outrasmetodologias)metodologias)

-- IdentificaIdentificao de microorganismos (vo de microorganismos (vrus, bactrus, bactrias erias e

fungos)fungos)

o nico mtodo que descreve a sequncia

nucleotdica completa

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-- FarmacogenFarmacogenticatica ((NAT2NAT2 e ae a acetilaacetilaoo dada IsoniazidaIsoniazida, resistncia a, resistncia a

antiretroviraisantiretrovirais na SIDA)na SIDA)

-- TipagemTipagem HLA de alta resoluHLA de alta resoluo para transplanteso para transplantes

-- Pesquisa de mutaPesquisa de mutaes em DNA de doentes/posses em DNA de doentes/possveis portadoresveis portadores --

particularmenteparticularmente til nas situatil nas situaeses monogmonognicasnicas comcom

heterogeneidadeheterogeneidade alallicalica ((BRCA1BRCA1//22; HNPCC,; HNPCC, ))

-- IdentificaIdentificao de mutao de mutaes em tumores: para avaliaes em tumores: para avaliaoo

prognprognstica e selecstica e seleco teraputica (o teraputica (exex: muta: mutaes does do EGFREGFR ee kRASkRAS

e cancro do pulmo)e cancro do pulmo)

-- IdentificaIdentificao de alterao de alteraeses epigenepigenticasticas: metila: metilao das regieso das regies

promotoraspromotoras

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MetilaMetilaoo

- Metilao de C em resduos CpG nas regies promotoras

- Silenciamento transcricional

- Converso da citosina metiladas a uracil com bissulfito

Antes do bisulfito

Aps bisulfito

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SequenciaSequenciaoo: Outros m: Outros mtodos detodos desequenciasequenciaoo

Outros mtodos de sequenciao:- Maxam Gilbert- 454 Life Sciences/Roche- Illumina

- Solid/Applied Biosystems

MassivelyMassively parallelparallel sequencingsequencing

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AnAnlise de fragmentos: Tlise de fragmentos: Tcnicacnica

Gerar produtos marcadosGerar produtos marcados fluorimetricamentefluorimetricamente

PCR de amplificaPCR de amplificao, com um doso, com um dos primersprimers marcados.marcados.

Sondas especSondas especficas para a regio em estudo.ficas para a regio em estudo.

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AnAnlise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: Aplicaeses

Rastreio de mutaRastreio de mutaeses AnAnlise delise de STRsSTRs ((ShortShort TandemTandem RepeatsRepeats))

Pesquisa dePesquisa de IndelsIndels ((InsertionsInsertions//DelectionsDelections))

MultiplexMultiplex LigantionLigantion--dependentdependent ProbeProbeAmplificationAmplification (MLPA)(MLPA)

Estudo de RNA de proteEstudo de RNA de protenas inflamatnas inflamatriasrias

Cancro hereditCancro hereditriorio

FarmacogenFarmacogenmicamica CromossomopatiasCromossomopatias;;

OLA (OLA (OligonucleotideOligonucleotide LigationLigationAssayAssay))

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MMtodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaeses

IndicaIndicaes: heterogeneidadees: heterogeneidade alallicalica eegengenticatica

AnAnliselise conformacionalconformacional HAHA--CAE (CAE (HeteroduplexHeteroduplex analysisanalysis--capillarycapillary arrayarray

electrophoresiselectrophoresis)) SSCP (SSCP (SingleSingle strandstrand conformationconformation polymorphismpolymorphism

etcetc

Desvantagens:Desvantagens:-- nn de amostras muito grandede amostras muito grande-- PolPolmeromeroConformationConformationAnalysisAnalysisPolymerPolymer(CAP)(CAP)

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MMtodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaeses

Mtodos de rastreio:DGGE, SSCP, HAHA--CAECAE

Para identificar osegmento suspeito

Fragmentosgnicos

correspondentes

aos exes

PCR

Sequenciao dosegmento suspeito

Normal

Cancro hereditrio da mama

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MMtodos de rastreiotodos de rastreio

de mutade mutaes: HAes: HA--CAECAE

Seq. normais

Identificao de um perfil

de migrao anmalo

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MMtodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaes: SSCPes: SSCP

MMtodotodo maismais usadousado

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GTA GTA GTA ACTGTTA......AGCATTATCC

GTA GTA GTA GTA GTA ACTGTTA......AGCATTATCC

(GTA)n, n=3

(GTA)n, n=5

primer primer

primer primer

AnAnlise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: AplicaesesCCaracterizao de STRs

PCR com um primer marcado

Electroforese capilar em condies desnaturantes:- Diluio da amostra em gua

- Diluio da amostra em formamida

- Desnaturao 96C 3min

- 4C sobre glo 3min

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266 pb + nx4

(TTTA)n

STRsSTRs ((ShortShort TandemTandem RepeatsRepeats)) CYP19CYP19 (TTTA)n(TTTA)n (intro 4) identificado por electroforese(intro 4) identificado por electroforese

capilar, em sequenciador automcapilar, em sequenciador automtico, de produtos de PCR obtidos utilizando o primertico, de produtos de PCR obtidos utilizando o primer

proximalproximal marcado com 6FAM. Amostra demarcado com 6FAM. Amostra de heterozigotoheterozigoto, sendo vis, sendo visveis a azul dois picos deveis a azul dois picos de

302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repeti302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repeties, respectivamente. Utilizoues, respectivamente. Utilizou--se o marcadorse o marcador

de peso molecularde peso molecular 500 LIZ500 LIZ (picos a laranja).(picos a laranja).

SequenciaSequenciao que confirma a existncia de 12o que confirma a existncia de 12

repetirepeties TTTA correspondendo a um fragmentoes TTTA correspondendo a um fragmentode 314pb de um indivde 314pb de um indivduoduo homozigotohomozigoto..

AnAnlise de fragmentos:lise de fragmentos: Caracterizao deSTRs

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AnAnlise de fragmentos:lise de fragmentos: STRsSTRs

Identifiler

AplicaAplicaeses

Estudos de associaEstudos de associaoo

Medicina ForenseMedicina Forense

Controlo de transplantesControlo de transplantesmedularesmedulares

Controlo de linhasControlo de linhascelularescelulares

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AnAnlise de fragmentos: Pesquisa delise de fragmentos: Pesquisa de IndelsIndels

AplicaAplicao: Pesquisa deo: Pesquisa de delecdeleceses (9 a 24pb) do(9 a 24pb) do exoexo 19 do19 do EGFREGFR emem

carcinoma epidermcarcinoma epidermide do pulmoide do pulmo

Tecido normalTecido tumoral

del1515 pbpb

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Pao W et al. PNAS 2004;101:13306-13311

AnAnlise de fragmentos: Pesquisa delise de fragmentos: Pesquisa de IndelsIndels

Deleces no exo 19 do EGFR de NSCLCs sensveis aos ITKs, gefitinib ouerlotinib

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AnAnlise de fragmentos: MLPAlise de fragmentos: MLPA

EstudoEstudo quantitativo do nquantitativo do n de cde cpiaspias mmltiplas sequncias (DNAltiplas sequncias (DNAou RNA) em simultneoou RNA) em simultneo

BaseiaBaseia--se na utilizase na utilizao de sondas especo de sondas especficas para cadaficas para cadasequncia, com prolongamentos comuns a todas as sondas,sequncia, com prolongamentos comuns a todas as sondas,

desenhados de modo a criar sequncias de dimensesdesenhados de modo a criar sequncias de dimensesdiferentes;diferentes;

OsOs primersprimers so universais e vo ligarso universais e vo ligar--se aos prolongamentosse aos prolongamentosdas sondasdas sondas

As sequncias so identificadas pelo seu comprimentoAs sequncias so identificadas pelo seu comprimentoespecespecfico;fico;

A intensidade do sinal vai ser proporcional ao nA intensidade do sinal vai ser proporcional ao n de cde cpias dapias dasequncia alvosequncia alvo

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Electroforese capilar em condies desnaturantes:- Diluio da amostra em formamida- Desnaturao 96C 3min- 4C sobre glo 3min

/cDNA

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AplicaAplicaeses

Estudo de expressoEstudo de expresso ggnicanica (RNA)(RNA)

exex: prote: protenas inflamatnas inflamatriasrias

IdentificaIdentificao deo de delecdeleceses e duplicae duplicaes em genes responses em genes responsveisveis

por doenpor doenas hereditas hereditriasriasexex: cancro da mama heredit: cancro da mama hereditrio,rio, neurofibromatoseneurofibromatose;;

-- IdentificaIdentificao deo de delecdeleceses e duplicae duplicaes em genes dees em genes demetabolismometabolismo

exex:: farmacogenfarmacogenmicamica

IdentificaIdentificao deo de delecdeleceses e duplicae duplicaeses cromosscromossmicasmicas

ex. atraso mental de causa desconhecidaex. atraso mental de causa desconhecida


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Reaco multiplex:

- cDNA de 45 protenas inflamatrias

AnAnlise de fragmentoslise de fragmentos MLPA: aplicaMLPA: aplicao ao cancro da mama heredito ao cancro da mama hereditriorio

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Anlise doBRCA1 por MLPA

A diminuio daaltura dos picosidentifica deleces

AnAnlise de fragmentoslise de fragmentos MLPA: aplicaMLPA: aplicao ao cancro da mama heredito ao cancro da mama hereditriorio

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AnAnlise de fragmentos : MLPAlise de fragmentos : MLPA

Diagnstico demicrodeleo de novo

em 1p

Com sonda marcada e primers especficos de sequncias de regies

subtelomricas de vrios cromossomas

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AnAnlise de fragmentos:lise de fragmentos: OligonucleotideOligonucleotide LigationLigation AssayAssay(OLA)(OLA)

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DeterminaDeterminao das 31 mutao das 31 mutaes mais frequentes do genees mais frequentes do gene CFTR,CFTR, presentespresentes

nana mucoviscidosemucoviscidose, por OLA, por OLA

realizada uma PCR multiplex a que se segue a ligao de sondas. As sondasso desenhadas de modo a que as sequncias mutadas e no mutadas se

distingam por diferentes comprimentos e diferentes fluorescncias.

Mutao emheterozigotia emlocal de splicing

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Objectivos:Objectivos:AnalisarAnalisar electroferogramaselectroferogramas

Identificar mutaIdentificar mutaeses

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AnalisarAnalisar electroferogramaselectroferogramas

TroubleshootingTroubleshooting

Dyeblobs

Regies difceis

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Pouca descriminao perto dos primers

Mltipla ligao de primer

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Pouco DNA, DNAses, primer ineficaz

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Sobreposio de mltiplos picos: dois produtos PCR no detectveis em gel de agarose a 1,5%

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NAT2NAT2GenotipagemGenotipagem

DNANAT2 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase)

Genebank accession: NT_030737

6102361 tacctataat tagtcacacg aggaaatcaa atgctaaagt atgatatgtt tttatgtttt

6102421 gtttttcttg cttag[gggat catggacatt gaagcatatt ttgaaagaat tggctataag

6102481 aactctagga acaaattgga cttggaaaca ttaactgaca ttcttgagca ccagatccgg

6102541 gctgttccct ttgagaacct taacatgcat tgtgggcaag ccatggagtt gggcttagag

6102601 gctatttttg atcacattgt aagaagaaac cggggtgggt ggtgtctcca ggtcaatcaa

6102661 cttctgtact gggctctgac cacaatcggt tttcagacca caatgttagg agggtatttt

6102721 tacatccctc cagttaacaa atacagcact ggcatggttc accttctcct gcaggtgacc

6102781 attgacggca ggaattacat tgtcgatgct gggtctggaa gctcctccca gatgtggcag

6102841 cctctagaat taatttctgg gaaggatcag cctcaggtgc cttgcatttt ctgcttgaca

6102901 gaagagagag gaatctggta cctggaccaa atcaggagag agcagtatat tacaaacaaa

6102961 gaatttctta attctcatct cctgccaaag aagaaacacc aaaaaatata cttatttacg

6103021 cttgaacctc gaacaattga agattttgag tctatgaata catacctgca gacgtctcca

6103081 acatcttcat ttataaccac atcattttgt tccttgcaga ccccagaagg ggtttactgt

6103141 ttggtgggct tcatcctcac ctatagaaaa ttcaattata aagacaatac agatctggtc

6103201 gagtttaaaa ctctcactga ggaagaggtt gaagaagtgc tgaaaaatat atttaagatt

6103261 tccttgggga gaaatctcgt gcccaaacct ggtgatggat cccttactat ttagaataag

6103321 gaacaaaata aacccttgtg tatgtatcac ccaactcact aattatcaac ttatgtgcta

6103381 tcagatatcc tctctaccct cacgttattt tgaagaaaat cctaaacatc aaatactttc

6103441 atccataaaa atgtcagcat ttattaaaaa acaataactt tttaaagaaa cataaggaca

6103501 cattttcaaa ttaataaaaa taaaggcatt ttaaggatgg cctgtgatta tcttgggaag

6103561 cagagtgatt catgctagaa aacatttaat attgatttat gttgaattc]

Segmento 1 Segmento 2

111T>C 191G>A 282C>T 341T>C 434A>C 481C>T 590G>A 803A>G 845A>C 857G>A

Base n 1 [DNA=RNA]

Identificar mutaIdentificar mutaes: Casos pres: Casos prticosticos

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Polimorfismo/Mutao em homozigotia

DUPLICADODUPLICADO S iSequenciao casos

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DUPLICADODUPLICADO SequenciaSequenciaoo -- casoscasos

prprticosticos

Polimorfismo/Mutao em heterozigotia


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Wild-typeaaaatt cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga


Escreva qual o alelo mutado.

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Mutant

aaaatt cccgtcgcta tcaagacatctccga

Del15pbDel15pb


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Wild typeaatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat



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Mutantaatgcacctggttcttttactatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat

c.2231_2259dup20.c.2231_2259dup20. FrameshiftFrameshift


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Wild-typeagaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgtatgaaaata attcaaacag tactatagct



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Mutantagaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgaaaata attcaaacag tactatagct

c.5374_5377delTATG.c.5374_5377delTATG. FrameshiftFrameshift


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BRCA2 - c.2624A>G. p.K1132K.

Wild type:

ttt gaa ttt act cag ttt aga aaa cca agc tac ata ttg cag aag agtF E F T Q F R K P S Y I L Q K S

Mutada:

ttt gaa ttt act cag ttt aga aag cca agc tac ata ttg cag aag agt

F E F T Q F R K P S Y I L Q K S

Como classifica a mutao?

MutaMutao em local deo em local de splicingsplicing no geneno gene LCA5LCA5associadaassociada amauroseamaurose congcongnita denita de LeberLeber

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associadaassociada amauroseamaurose congcongnita denita de LeberLeber

Doente Paisaudvel

Qual a mutao?

A doena dominante ou recessiva?

Causa frequente de dfice visual grave congnito. Situao monognica comheterogeneidade gentica, com mutaes descritas em mais de 13 genes .

A mutao localiza-se na ltima base do exo 6. Como poderemos verificarse interfere com o splicing?

RT-PCR para caracterizao do mRNA( i )

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(continuao)

Exo 7Exo 7 Exo 6Exo 6

A sequenciao do produto de RT-PCR mostrou que a mutao levou utilizao deum segundo local de splicing, localizado no intro 6, do que resultou a insero de 5bases (GTATG) do intro 6, efeito de frameshift e a criao de um codo stop

prematuro.

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Documents

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