produccion de antibioticos y vacunas
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Diseño de bioprocesos y microbiología microbiana
UNIVERSIDAD NACIONALPEDRO RUIZ GALLO
Alumnos: DE LA CRUZ LUCERO ESTHERLABRIN YAMPUFE HENRRYMESTANZA ESPINAL ANNA
PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS
INTRODUCCION
Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de
matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas
concentraciones.
Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioterapéuticos para
tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de
producción para la penicilina y al inicio de la era de investigación sobre los
antibióticos. En la actualidad continúa siendo una de las áreas más importante
de investigación dentro de la Microbiología Industrial.
El número de antibióticos descritos continúa aumentando debido a los
programas intensivos de búsqueda en todos los países industriales. En 1961
eran conocidos 513 antibióticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990
alrededor de 8000. Cada año se detectan aproximadamente 300 nuevas
sustancias con actividad antibiótica, de las que el 30-35% son componentes
secundarios de las fermentaciones de antibióticos conocidos. Del gran número
de antibióticos conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producían
por fermentación en 1984. Además, más de 50 antibióticos se producían como
compuestos semisintéticos y 3 antibióticos (cloranfenicol, fosfomicina y
pirrolnitrina) se producen en forma completamente sintética.
Los antibióticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos,
solamente 10 de los antibióticos conocidos se producen comercialmente y
solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico tienen
importancia clínica. En las bacterias existen muchos grupos taxonómicos que
producen antibióticos. La mayor variedad en estructura y número de
antibióticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el
género Streptomyces.
La producción mundial de antibióticos en 1979 estaba por encima de las
100.000 toneladas por año. Las ventas brutas anuales, sólo en USA, eran de
1000 millones de dólares, con la cefalosporina en la posición de cabeza,
seguida de la ampicilina y las tetraciclinas.
Antes de 1960 aproximadamente el 5% de los antibióticos recientemente
aislados eran útiles terapéuticamente. En los años siguientes fueron
descubiertos nuevos antibióticos a una velocidad aproximadamente constante,
pero el porcentaje de los nuevos antibióticos que realmente llegaban al
mercado descendió desde el 2,6% entre 1961-1965 al 1% entre 1966-1971.
Esto se debe fundamentalmente a un aumento severo en los costes del
desarrollo y de las pruebas clínicas, de forma que muchos fabricantes
producen solamente aquellos compuestos que claramente muestran un
progreso terapéutico prometedor. Por término medio se necesitan alrededor de
8-10 años para desarrollar un nuevo antibiótico a un coste medio de 10x106 -
20x106 dólares (2500 millones de pesetas; 15 millones de euros).
La obtención de mejores antibióticos se lleva a cabo por modificación de los
compuestos conocidos utilizando medios químicos o genéticos (mutasíntesis,
fusión de protoplastos, tecnología del DNA recombinante). Sin embargo,
solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibióticos
con estructuras básicas enteramente nuevas, especialmente por la utilización
de nuevos procedimientos de prueba y por la investigación en nuevos grupos
de microorganismos.
PRODUCCION DE PENICILINAS
Los antibióticos ß-lactámicos se caracterizan por poseer en su estructura el
anillo ß-lactámico que está compuesto por 3 átomos de carbono y 1 átomo de
nitrógeno. Los antibióticos ß-lactámicos se pueden dividir en cinco clases
diferentes:
Penicilinas
Clavamas
Cefalosporinas
Monobactamas
Carbapenemas
Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los más efectivos de todos los
agentes terapéuticos usados en el control de las enfermedades infecciosas.
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigación en
Oxford, bajo la dirección de Florey y Chain, la aisló a partir de cultivos
de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicación clínica de la penicilina
se realizó en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos,
particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.
Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +.
Son lábiles en medio ácido y pueden ser inactivadas por hidrólisis del anillo ß-
lactámico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas
grandes dosis de penicilina, solamente un pequeño porcentaje de pacientes
desarrollan alergia (0,5-2%).
Los antibióticos ß-lactámicos son inhibidores específicos de la síntesis de
peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son análogos
estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos
fármacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente.
Algunas penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la
membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas
sintéticas y cefalosporinas tienen efecto también frente a Bacterias G
negativas.
Estructura química
La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA),
que consiste en un anillo tiazolidínico con un anillo ß-lactámico condensado. El
6-APA lleva una parte variable acilada en la posición 6.
Si la fermentación de penicilina se lleva a cabo sin adición de precursores de la
cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla
solamente es útil terapéuticamente la bencilpenicilina; los otros compuestos
deben ser eliminados durante la etapa de recuperación del producto. La
fermentación puede ser controlada mejor añadiendo un precursor de la cadena
lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Más de
100 penicilinas biosintéticas han sido producidas de esta forma. En los
procesos comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas
la penicilina G y la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O.
Utilizando el ácido fenoxiacético, como precursor de la cadena lateral, se
consiguió la obtención de penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es
particularmente estable en medio ácido y que puede, por tanto, suministrarse
por vía oral al contrario de lo que ocurre con la penicilina G ya que debido a su
sensibilidad a los ácidos no se puede administrar oralmente puesto que es
hidrolizada en el estómago.
A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintéticas incluyen diversas
penicilinas obtenidas al añadir químicamente una gran variedad de cadenas
laterales al ácido 6-APA.Penicillium chrysogenum puede sintetizar este ácido si
el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la
producción de 6-APA en estas condiciones es tan pequeña que hace inviable
este procedimiento. La deacilación química tampoco es rentable pues este
proceso comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura
y en condiciones anhidras estrictas, requiriéndose además varios solventes
químicos. Por estas razones, la producción industrial del 6-APA necesario para
la fabricación de penicilinas semisintéticas se realiza por deacilación enzimática
de la penicilina G. Este proceso biológico se basa en la producción por ciertas
bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilación se realiza
en H2O a 37°C, lo que reduce considerablemente los costes. Después de la
deacilación se obtiene una solución de sales sódicas del ácido fenilacético y 6-
APA. El fenilacético recuperado se puede utilizar posteriormente para la
producción de penicilina G. Debido a sus mejores características (estabilidad a
la acidez, resistencia a ß-lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las
penicilinas semisintéticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia.
Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas
comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43%
como material de partida para la producción de penicilinas semisintéticas.
Biosíntesis y regulación
El anillo ß-lactámico-tiazolidínico de la penicilina se produce a partir de L-
cisteína y L-valina. La biosíntesis se produce por medio de un dipéptido
compuesto de ácido L-a-aminoadípico (L-a-AAA) y L-cisteína.
Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reacción de
epimerización, dando lugar a la formación del tripéptido d-(L-a-aminoadipil)-L-
cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclación del tripéptido que puede ser
aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioquímicas
que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el
intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadípico) con ácido fenilacético activado. El
6-APA, que no es un producto intermediario de biosíntesis, se excreta en
ausencia de un precursor de la cadena lateral.
Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosíntesis de la penicilina.
El aminoácido lisina es sintetizado a partir de la vía que origina el ácido L-a-
aminoadípico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta
biosintética ramificada común. La lisina inhibe la síntesis de penicilina debido a
que inhibe por retroalimentación a la homocitrato sintasa, un enzima implicado
en la síntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse
penicilina. Sin embargo, la retrorregulación por lisina no parece ser una etapa
limitante en la biosíntesis de penicilina. La biosíntesis de penicilina se ve
afectada por la concentración de fosfato y también muestra una clara represión
catabólica, particularmente por glucosa.
Desarrollo de cepas
La producción de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de
aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un título de
penicilina de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde
0,0012 g/l hasta 50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de
selección de cepas.
La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la
cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era más
adecuado para la producción en cultivo sumergido que la cepa
original, Penicillium notatum. Mediante posterior mutagénesis fué aislada la
cepa WisQ176, la cepa original de la línea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fué
adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fué utilizada
como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas,
acerca de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los
aumentos de rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las
cepas, también han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre
la fermentación y la eficiencia de recuperación del producto.
Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a través
del screening empírico de mutantes. Hasta mitad de los años 60 los mutágenos
utilizados más frecuentemente eran los rayos X, mostaza
nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Más recientemente han
sido utilizados como mutágenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y
losnitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la
mutación había alcanzado su límite. El descubrimiento de un ciclo parasexual
en Penicillium chrysogenumproporcionó una forma de utilizar la recombinación
genética para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigóticos
que tenían títulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides
parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con producción
superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los
cruces entre mutantes de diferentes líneas. La técnica de fusión de
protoplastos abrió un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta
producción obteniéndose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por
mutación y selección. Además, algunas de las cepas resultantes han tenido
mejores características de crecimiento, como esporulación más estable y mejor
crecimiento para la producción del inóculo. El uso de la ingeniería
genética para aumentar la síntesis de enzimas que catalizan pasos limitantes,
mediante la amplificación génica o mejora de la transcripción, no ha sido
todavía posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de datos
biosintéticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vector-hospedador.
Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium
chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformación.
Métodos de producción
La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos
en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el
suministro de oxígeno no pueden ser empleados tanques mayores. La
fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de
absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de
aireación requerida está entre 0,5-1,0 vvm dependiendo de la cepa, del
biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios
impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura óptima es de
25-27°C.
Un esquema típico de producción de penicilina se muestra en la figura.
El inóculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad
de las cepas de alta producción, es necesario el mantenimiento cuidadoso de
las cepas. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de
agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere
conseguir una velocidad óptima de formación de penicilina, los agregados
(pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta.
Después de varias etapas de crecimiento está preparado el cultivo de
producción. En la fermentación típica de penicilina existe una fase de
crecimiento de c.a. 40h con un tiempo de duplicación de 6h, durante la cual se
forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxígeno es crítico en
el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la
transferencia de oxígeno. Después de la fase de crecimiento, el cultivo llega a
la fase real de producción de penicilina. Debido al aporte de distintos
componentes al medio, la fase de producción puede extenderse hasta 120-
160h.
El medio de un cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa,
y generalmente consiste en:
Líquido de maceración de maiz (4-5% peso seco).
Una fuente de Nitrógeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o
suero.
Una fuente de carbono, lactosa.
Varios tampones
El pH se mantiene constante a 6,5.
El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimentan continuamente como
precursores (0,5-0,8% del total).
Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En
estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg*m-3*h-1, con una
concentración de glucosa de 500 kg*m-3.
Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para
el mantenimiento energético, el 25% para el crecimiento y sólo el 10% para la
producción de penicilina.
Se ha intentado la producción de penicilina por fermentación continua, pero ha
sido difícil debido a la inestabilidad de las cepas de producción. Como
alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar". En este
procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentación se saca y se
reemplaza con solución fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido
hasta diez veces sin reducción del rendimiento.
Se está llevando a cabo una intensa investigación para producir penicilina
con células inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostró la
ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados,
pero esta técnica no ha sido introducida todavía a nivel comercial.
La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al
micelio. Después de la separación del micelio, la recuperación del producto se
lleva a cabo por medio de dos etapas de extracción continua en contracorriente
del caldo de fermentación con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-
3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.
PRODUCCION DE VACUNAS
INTRODUCCION
Una vacuna es una suspensión de microorganismos (o alguna parte o producto
de ellos) que produce inmunidad al ser inoculada en un huesped. Una vacuna
oral o parental induce en el huesped la formación de anticuerpos frente al
organismo causante de la enfermedad; por lo que, durante exposiciones futuras
de este microorganismo, el agente infeccioso es inactivado (neutralizado o
matado), se previene su proliferación y por lo tanto no se establece el estado
de enfermedad.
El primero en utilizar el término vacuna fué Pasteur en 1880 y proviene del
latín vacca. Usando este término Pasteur reconoció el trabajo de Edward
Jenner que en 1796 vacunó con éxito a un niño de 8 años (James Phipps) de
viruela, vacuna que obtuvo de los exudados de las pústulas de una vaca con
viruela. A partir de este momento se desarrollaron numerosas vacunas lo que
ha llevado a erradicar enfermedades como la viruela y en otros casos a una
reducción dramática en la incidencia de numerosas enfermedades graves
como la poliomielitis.
TIPOS DE VACUNAS TRADICIONALES
Las vacunas tradicionales se pueden clasificar dentro de tres tipos: vacunas
atenuadas, vacunas inactivadas y vacunas toxoides.
Vacunas atenuadas
Son preparaciones de bacterias o virus vivos que están tan debilitados o
alterados que ya no son virulentos, siendo todavía capaces de provocar una
respuesta inmune. Algunos ejemplos de vacunas vivas son la Sabin para la
polio, fiebre amarilla, sarampión, rubeola, parotiditis y la BCG para la
tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). La mayoría de las vacunas de virus
atenuados provocan inmunidad para toda la vida sin necesidad de
inmunizaciones de recuerdo.
Vacunas inactivadas
Son suspensiones de bacterias o virus muertos por la acción de desinfectantes
como el fenol o formaldehido. En este tipo de vacunas es necesario dividir la
cantidad total que se necesita para inducir la protección en varias dosis con
intervalos de días o semanas debido a la alta concentración de
microorganismos muertos que se deben administrar ya que no se replican
como ocurre con las vacunas atenuadas. Algunos ejemplos de vacunas
muertas son la Salk para la polio, rabia, gripe y la tosferina (Bordetella
pertussis).
Vacunas toxoides
Son preparaciones obtenidas a partir de toxinas bacterianas inactivadas.
Generalmente se utiliza el formol (c.a. 38% de formaldehido en H2O). Los
toxoides son muy efectivos en la prevención de la difteria (Corynebacterium
diphtheriae) y el tétanos (Clostridium tetani).
A pesar de los logros obtenidos con este tipo de vacunas, existen una serie
de limitaciones en la producción de vacunas según el modelo tradicional:
a) No todos los agentes infecciosos pueden crecerse en cultivo, por lo que
todavía no se han desarrollado vacunas para estas enfermedades.
b) La producción de virus animales y humanos requiere cultivos celulares,
los cuales son caros, obteniéndose además bajos rendimientos.
c) Son necesarias grandes medidas de seguridad para asegurar que tanto
el personal de laboratorio como de producción no van a estar expuestos
al agente patógeno.
d) Se corre el riesgo de que los lotes de vacunas no estén completamente
muertos o atenuados durante el proceso de producción por lo que se
pueden introducir organismos virulentos en las vacunas y dispersar la
enfermedad inadvertidamente.
e) Las cepas atenuadas pueden revertir, una posibilidad que requiere
continuos ensayos para asegurar que no ha ocurrido una readquisición
de la virulencia.
f) No todas las enfermedades (p.ej. SIDA) se pueden prevenir a través del
uso de vacunas tradicionales.
g) La mayor parte de las vacunas actuales tienen una vida media limitada y
a menudo requieren refrigeración para mantener su potencia. Estos
requerimientos originan problemas de almacenamiento en aquellos
paises con grandes áreas rurales sin electrificar.
En la última década, la tecnología del DNA recombinante ha supuesto la
creación de una nueva generación de vacunas que permiten obviar las
limitaciones de las clásicas. La disponibilidad de clonación de genes ha
permitido a los investigadores contemplar nuevas estrategias en el desarrollo
de vacunas:
1. Se pueden eliminar (curar) los genes de virulencia de un agente
infeccioso y que mantenga la habilidad de estimular una respuesta
inmune. En este caso, el organismo modificado genéticamente puede
usarse como una vacuna viva sin las preocupaciones acerca de la
reversión a la virulencia, ya que es imposible que un gen completo
pueda ser readquirido espontáneamente durante el crecimiento en
cultivo puro.
2. Se pueden crear sistemas vivos no patógenos que transporten
determinantes antigénicos de un agente patógeno con el que no estén
relacionados. De esta forma el sistema transportador facilita la inducción
de una fuerte respuesta inmunológica dirigida contra el agente patógeno.
3. Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en
cultivo, los genes que codifican para las proteínas que tienen
determinantes antigénicos se pueden aislar, clonar y expresar en un
huesped alternativo tal como Escherichia coli, Saccharomyces
cerevisiae o líneas celulares de mamíferos. Estas proteínas pueden ser
formuladas en vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades
utilizan sólamente aquellos fragmentos antigénicos más adecuados para
estimular una respuesta inmunitaria potente. Los genes de estas
subunidades proteicas pueden ser introducidos en el genoma de una
bacteria o levadura mediante las técnicas de ingeniería genética. La
bacteria o levadura produce estas subunidades en cantidad y son
después recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas.
PRODUCCION DE VACUNAS
Producción de toxoides bacterianos
Las toxinas bacterianas se inactivan para producir toxoides de tal manera que
pierdan su toxicidad pero que retengan su antigenicidad. La vacunación a gran
escala no comenzó hasta que Ramon halló en 1924 una forma segura y
reproducible de inactivación de las toxinas y los microorganismos patógenos
mediante su tratamiento con formaldehido y después de conseguir la
atenuación de los patógenos mediante pasos sucesivos en medios de cultivo in
vitro.
A. Cepas: La vacunación con toxoides se utiliza en humanos para
enfermedades causadas por Clostridium tetani y Corynebacterium diphtheriae.
Cada productor ha llevado a cabo a lo largo del tiempo una selección de
aquellas cepas que producen un máximo de producción de toxina en el medio
de cultivo que él mismo ha desarrollado. La mayoría de las cepas son estables
en liófilos.
B. Medio de cultivo: Generalmente las toxinas bacterianas no se producen en
grandes cantidades en medios sintéticos, por lo que es necesario añadir una
fuente de proteínas como la carne, caseína y como alternativa soja. La carne
se digiere con papaína o tripsina y la caseina se digiere con ácido o tripsina.
Este medio debe ser suplementado con varios aminoácidos y vitaminas por lo
que se añade extracto de levadura. La fuente de carbono es glucosa aunque
también se puede utilizar sacarosa y maltosa.
C. Condiciones de cultivo: La mayoría de las vacunas toxoides se producen a
partir de Clostridium (anaerobio) por lo que no hay ningún requerimiento
especial para la introducción de gases en el cultivo. Puesto que también son
sacarolíticos, son organismos que producen ácidos a partir del azúcar por lo
que se debe controlar el pH. El tiempo de incubación se debe determinar en
función de la cantidad de toxina que se produce, para lo cual existen diversas
técnicas tanto enzimáticas (lecitinasa, hemólisis, proteolisis) como ensayos en
animales (cobayas, ratones, conejos) usando como indicadores la muerte o
lesiones en la piel.
D. Inactivación: Las toxinas bacterianas se inactivan siempre con formaldehido.
E. Aislamiento: El toxoide de Clostridium tetani se purifica por ultrafiltración
utilizando membranas con un tamaño de poro de 0,001-0,05 µm. La
purificación enCorynebacterium diphtheriae difiere en que la toxina se purifica
primero y después se convierte en toxoide. Para la purificación primero se
elimina la mayor parte de las proteínas por precipitación con 25% de sulfato
amónico en presencia de carbón activo y en condiciones alcalinas. Después de
filtrar, la toxina presente en el filtrado se precipita por adición de sulfato
amónico al 20%, se recoge por filtración, se redisuelve y se elimina el sulfato
amónico por diálisis.
2.- Producción de vacunas virales
El primer paso esencial en la producción de vacunas víricas, sean vivas o
inactivadas, es la obtención de una gran cantidad de material rico en antígenos
virales. Debido a que las células vivas son esenciales para la replicación de los
virus, las fuentes de tales materiales están limitadas a tejidos de animales
infectados, embriones de pollos y cultivos celulares. Independientemente del
sustrato utilizado, es de vital importancia para la producción el mantener un lote
de virus como inoculante. Estos lotes se suelen conservar bien liofilizados o
congelados en Nitrógeno líquido. Los microbiólogos cultivan los virus para
aislar y producir cantidades suficientes tanto para su estudio como para la
producción de vacunas. En general, existen 3 métodos para cultivar virus
animales: animales vivos, huevos embrionados de pollo (o pato) y cultivos
celulares.
A.- Animales vivos: En la actualidad, el uso de animales vivos para la
producción de vacunas víricas está prácticamente abandonado. Sin embargo,
se ha utilizado para la obtención de vacunas contra la viruela, rabia y fiebre
amarilla.
B.- Huevos embrionados: Uno de los métodos más económico y práctico para
cultivar una gran variedad de virus animales es el uso de huevos de pollo
embrionados. El descubrimiento de que los virus se podían cultivar por esta
sencilla técnica fue hecho en 1931. Los huevos embrionados pueden ser
inoculados asépticamente con virus, usando una aguja y jeringa, a través de un
agujero que se realiza en la cáscara. Este agujero se sella con parafina y los
huevos se incuban a 36°C durante 2 a 3 días para permitir que los virus se
multipliquen.
Los embriones de pollo contienen diferentes tipos de células y tejidos en los
que varios virus pueden replicarse. Por ejemplo, la membrana corioalantoica
permite el crecimiento de herpesvirus y varicela. La cavidad amniótica permite
el crecimiento del virus de la gripe y de la parotiditis. El virus de la gripe
también tiene afinidad por la cavidad alantoica.
C.- Cultivo de tejidos: Es el método más usado para el cultivo de virus
animales. Una vez que el cultivo celular ha crecido, es posible usarlo como un
hospedador in vitro para un virus. Los virus invaden las células causando
normalmente algún tipo de cambio visible en el crecimiento de las células de la
monocapa cercanas al sitio de la infección inicial. Este cambio localizado,
denominado efecto citopático (CPE), es un deterioro de las células del cultivo
de tejidos causado por el virus. La CPE puede tener diferentes apariencias
dependiendo de un virus particular y del tipo de células en el cultivo.
La elección del sustrato celular para la producción de una vacuna vírica
depende de varios factores siendo el más importante la habilidad del virus para
multiplicarse en el cultivo de tejidos. Además las células seleccionadas deben
estar disponibles en suficiente cantidad, deben provenir de una fuente
bacteriológicamente estéril y debe estar libre de otros virus. Los cultivos
celulares más utilizados para la producción de vacunas víricas son los
preparados a partir de riñón de mono aunque últimamente se están utilizando
bastante células diploides humanas. Una vez que se han multiplicado los virus,
se recoge el líquido que se clarifica por filtración para eliminar los restos
celulares.
Si lo que se pretende obtener es una vacuna vírica inactivada, se tratan con
formaldehido cuyo exceso se neutraliza con metabisulfito sódico. En el caso de
las vacunas víricas vivas normalmente se liofilizan después de filtrar el cultivo
de tejidos.
D.- Control de calidad: El propósito de los controles de calidad es asegurar
tanto la seguridad como la eficacia de estas vacunas. En el caso de las
vacunas víricas inactivadas los peligros potenciales son debidos a la
incompleta inactivación de los virus. El ensayo utilizado para detectar virus
vivos consiste en la inoculación de estas vacunas en cultivos de tejidos y
animales susceptibles. Los cultivos se examinan para detectar efectos
citopáticos y los animales para síntomas de la enfermedad y evidencias
histológicas de infección en la autopsia. Con vacunas víricas atenuadas el
peligro potencial son aquellos asociados con la reversión del virus a un grado
de virulencia capaz de causar enfermedad con las vacunas. Esta posibilidad se
reduce usando lotes estables de cultivos en stock aunque siempre son
necesarios ensayos de virulencia en el producto final; por ejemplo, en la
producción de la vacuna atenuada de la poliomielitis se compara la
neurovirulencia de cada lote con el de una vacuna control por inoculación
intraespinal en monos.
La mayoría de los problemas asociados con la producción de las vacunas
virales, particularmente los relacionados con la seguridad, pueden desaparecer
mediante el uso de la tecnología del DNA recombinante ya que permite
producir subunidades víricas en bacterias o levaduras.
3.- Producción de vacunas recombinantes (Hepatitis B)
La hepatitis B es una enfermedad vírica que mata cada año a dos millones de
personas. En 1976 un equipo de investigación de los laboratorios Merck (Dr.
Hilleman) demostró experimentalmente la viabilidad de una vacuna contra el
virus de esa forma de hepatitis (VHB); la inyección de antígeno particulado
purificado, procedente del plasma de personas infectadas, protegía a los
animales de la infección por el VHB. La vacuna era eficaz, pero no podía
producirse en grandes cantidades dada la limitación de donantes. La solución
vino de la mano de la clonación del genoma del VHB y la expresión de las
partículas del VHB en Saccharomyces cerevisiae. La manipulación genética de
la levadura permitió producir elevadas cantidades del antígeno de superficie
con la misma conformación que las partículas derivadas de los donantes de
plasma. En la actualidad la vacuna se administra a varios millones de personas
en todo el mundo, la enfermedad está desapareciendo y cabe esperar que la
insuficiencia hepática y el cáncer causados por esta infección pasen pronto a la
historia.
Dentro de la estructura del virus de la hepatitis B, se sabía que la glicoproteína
de la superficie del virus era una vacuna efectiva, por lo que el primer paso en
producir esta vacuna era clonar el gen que codifica para esta proteína del
genoma viral. El genoma del virus de la hepatitis B consiste en un DNA de
doble cadena parcial, una de las cadenas está incompleta aunque mantiene su
forma circular por puentes de hidrógeno. A pesar de su pequeño tamaño (una
media de 3200 pares de bases) el genoma codifica para varias proteínas: P, X,
C y S (con PreS2 y PreS1). La proteína P es una DNA polimerasa que sintetiza
una cadena de DNA por transcripción inversa a partir del mayor mRNA
(preC/C). La función precisa de la proteína X, la cual se presenta en pequeñas
cantidades, es desconocida. La proteína C es el mayor componente de la
cápsida interna (HBc) y la proteína S es la proteína mayoritaria de la envuelta.
Algunos transcritos traducen sólamente la región S, produciendo el antígeno de
superficie que en la figura se denomina SHBs, otros traducen también preS2
(MHBs) o ambos preS1 y preS2 (LHBs) originando proteínas mayores aunque
minoritarias en la superficie del virión.
Una vez conocidas estas circunstancias se construyó un plásmido que
expresara el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en levaduras. Se
escogió este hospedador para que la levadura pudiera glicosilar la proteína de
superficie tal como ocurre en el virus. A partir del plásmido pHVB-3200 que
contenía tanto el gen que codifica para el antígeno de superficie (sAg) como el
gen que codifica para el antígeno del núcleo (cAg) del virus de la hepatitis B se
construyó un clon que contenía sólo el gen sAg, pHBS-5. El gen SAg se insertó
entre un promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1) en el plásmido pMA-56
para producir el plásmido pHBS-16. Este plásmido final contiene el origen de
replicación funcional enEscherichia coli que proviene del plásmido pBR322 y
además el origen del plásmido 2µ que le permite replicarse en levaduras.
También contiene TRP1 que es un gen de levadura que codifica para un
enzima de la ruta biosintética del triptófano y que sirve como marcador
selectivo en levaduras.
A pesar de elegir como huesped las levaduras para así glicosilar la proteína de
superficie, esta proteína expresada en levadura no se glicosilaba. A pesar de
ello estas proteínas se autoensamblaban en una forma que asemejaba a la
cubierta del virus con un diámetro de c.a. 22 nm que no se distinguía de la que
se encuentra en el plasma de los pacientes. La manipulación genética
de Saccharomyces cerevisiae permitió producir elevadas cantidades del
antígeno de superficie con la misma conformación que las partículas derivadas
de los donantes de plasma.
Esta vacuna producida en levaduras, a la que le faltaban los oligosacáridos, era
tan efectiva como la vacuna derivada del plasma humano, y en 1986 se
convirtió en la primera vacuna recombinante apta para su uso en Estados
Unidos. Antes de esto se necesitaban 40 litros de suero humano para producir
una única dosis de la vacuna de la hepatitis B; actualmente se obtienen
muchas dosis de la vacuna recombinante a partir del mismo volumen de cultivo
de levaduras.
En la actualidad, la vacuna se administra a varios millones de personas en todo
el mundo, la enfermedad está desapareciendo y cabe esperar que la
insuficiencia hepática y el cáncer causados por esta infección pasen pronto a la
historia.
NUEVAS VACUNAS MÁS SEGURAS Y EFICACES
Vacunas fabricadas por biotecnología para prevenir
enfermedades
Algunas de las vacunas actuales se producen mediante
técnicas de ingeniería genética. Son más eficaces y
seguras. Incluso se estudian vacunas comestibles.
Desde la década de 1980 se desarrollan vacunas mediante técnicas de
ingeniería genética. La vacuna contra la hepatitis B fue el primer exponente de
esta nueva generación de inoculantes. La investigación biotecnológica aplicada
a la inmunización propone mejorar las vacunas tradicionales, aumentar la
eficacia preventiva y encontrar nuevas vías de administración. Incluso, se
ensayan vacunas comestibles.
Las vacunas y la prevención de enfermedades
Las vacunas, junto a la potabilización del agua y el uso del jabón, son
fundamentales para la prevención y el control de las enfermedades infecciosas.
Históricamente, las vacunas lograron detener el avance de la fiebre amarilla, la
peste negra, la difteria, el tifus y la viruela, entre otras enfermedades que
diezmaron poblaciones.
El descubrimiento de la vacunación, en el siglo XVII, estuvo ligado al ganado
vacuno (de allí la "vacuna") de donde se extrajo el primer inoculante que probó
ser efectivo contra la viruela. Actualmente los laboratorios utilizan componentes
microscópicos, de virus y bacterias, para la producción de las vacunas.
El modo de acción de las vacunas consiste en inocular el agente causante de
la enfermedad que se quiere combatir. Pero, previamente se lo modifica en el
laboratorio de modo que quede inactivo. Al vacunar a una persona con el
agente inactivo se evita la enfermedad, pero se estimula la reacción inmune
que deja al cuerpo en alerta para evitar el desarrollo de la enfermedad ante
futuras infecciones.
Producción de vacunas y seguridad
Si bien las vacunas que contienen el agente extraño resultan eficaces,
presentan dificultades en el proceso de producción. Se requieren medidas muy
estrictas para asegurar la completa inactivación del agente infeccioso y,
además, implica el manejo en el laboratorio de microorganismos patógenos.
Esto cambió cuando se comprendió que no es necesaria la presencia de los
microorganismos enteros para la inmunización. Alcanza con introducir en la
vacuna solo los componentes específicos que despiertan las defensas del
cuerpo.
Desde entonces, se comenzaron a fabricar las “vacunas de subunidades” que
incluyen una fracción del microorganismo, en lugar del agente infeccioso
completo. Las primeras vacunas de este tipo fueron contra el tétanos y la
difteria.
Nuevas vacunas obtenidas por biotecnología
Si bien el diseño de las vacunas de subunidades representó un gran avance al
evitar inocular microorganismos enteros, no solucionaba el inconveniente de
cultivar microorganismos potencialmente peligrosos en el laboratorio.
Fue en la década de 1980, con el avance de la ingeniería genética y el
conocimiento del ADN de virus y bacterias, que se empezaron a desarrollar las
“vacunas recombinantes”. Surgía la nueva generación de vacunas
biotecnológicas, y la vacuna contra la hepatitis B fue la primera en
desarrollarse. La hepatitis B es una infección potencialmente mortal causada
por el virus de la hepatitis B (VHB).
Según la Organización Mundial de la Salud “se calcula que en el mundo hay
2000 millones de personas infectadas por el VHB y más de 350 millones con
infección hepática crónica”, informa la OMS. Además, indica que la vacuna
contra la hepatitis B tiene una eficacia del 95% en la prevención de la
enfermedad y sus consecuencias.
Originalmente, la vacuna contra la hepatitis B se fabricaba extrayendo de la
sangre de los enfermos la subunidad del virus responsable de la infección. La
vacuna era eficaz, pero no podía producirse en grandes cantidades debido a la
escasez de donantes. La solución llegó con las vacunas recombinantes, o
biotecnológicas.
La técnica de producción de la vacuna recombinante consiste en extraer del
virus de la hepatitis B el gen que tiene la información para fabricar las
partículas infecciosas. Ese fragmento de ADN viral se introduce dentro de
levaduras. Al multiplicarse en el laboratorio, las levaduras modificadas
genéticamente fabrican enormes cantidades de partículas virales de la hepatitis
B, capaces de satisfacer la demanda mundial de vacunas.
Investigaciones científicas y nuevas vacunas
En la actualidad se están estudiando vacunas contra diferentes enfermedades,
como la malaria, el herpes, el sida, el cólera y el dengue, entre otras, y se están
mejorando vacunas tradicionales. Existen, además, otros desarrollos
novedosos. Por ejemplo, el doctor Rudolf Valenta de la Universidad de
Medicina de Viena, está usando las técnicas de ingeniería genética para crear
una vacuna contra la alergia al polen, con resultados exitosos.
"Estos resultados podrían ser el puntapié inicial para el desarrollo de vacunas
más efectivas para el tratamiento de las formas más comunes de alergia, e
inclusive para la vacunación profiláctica”, señaló el investigador. Otra línea de
investigación se orienta a encontrar nuevas vías de administración de vacunas.
Una opción que está en desarrollo son las “vacunas comestibles”.
Vacunas comestibles, nuevas tendencia
La idea de las vacunas comestibles es desarrollar alimentos transgénicos que
posean en su composición la sustancia que desencadena las defensas del
cuerpo. Es decir que, al ingerir el alimento en la dosis indicada, se estaría
incorporando la vacuna y previniendo la enfermedad.
Una ventaja de estas vacunas es que podrían administrarse en forma oral, lo
que evitaría los molestos pinchazos. Además, podrían fabricarse localmente,
utilizando los cultivos regionales. Esto permitiría el acceso masivo a la
vacunación, incluso en zonas alejadas de centros sanitarios. La posibilidad de
acceder a la vacunación es fundamental si se consideran los datos que aporta
un estudio publicado en 2009 por la OMS, “Vacunas e inmunización: situación
mundial”.
Según este informe, si no se generaliza el uso de las vacunas en un promedio
de más del 90% de la población mundial, hacia el año 2015 se sumarían por
año más de dos millones de muertes de niños y niñas menores de cinco
años. “A pesar de todo ello, el panorama general es de prudente optimismo,
entusiasmo, energía y dedicación”, indica el estudio.
“La obtención de vacunas se encuentra en una fase dinámica y las vacunas
llegan a un número cada vez mayor de personas”, expresa el documento y
finaliza: “Hay muchos motivos para creer que la inmunización seguirá siendo
durante mucho tiempo uno de los pilares fundamentales de la salud pública”.