CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

Los métodos más usados en la separación de moléculas son la ultracentrifugación, la

electroforesis y la cromatografía (Cardella-Hernandez, n.d.). Esta técnica incluye una

serie de métodos analíticos de separación que tienen como característica general el

de estar constituidos por una fase estacionaria y una fase móvil, entre las que se

distribuyen diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase móvil, la que

arrastra a las partículas que se van a separar, es un liquido (solvente o mezcla de

solventes) se denomina cromatografía de líquidos. Si la fase móvil es un gas se

denomina cromatografía de gases (Gonzales et al, 2008).

La cromatografía en papel (cromatografía en la que la fase estacionaria es papel), es

una técnica en la que se aplica un pequeño volumen de la muestra cerca de uno de

los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografía puede ser

ascendente, en la que el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se

sumerge en el solvente, que se encuentra en el fondo, entonces el solvente se

mueve hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la

mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo

de la solubilidad en el solvente. La relación de migración de una sustancia (Rf) puede

expresarse de acuerdo con la siguiente fórmula (Gonzales et al, 2008):

Rf= distancia recorrida por lamuestradistanciarecorrida por lamezclaeluyente

La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas pequeñas

como lípidos, nucleótidos, vitaminas, fármacos y aminoácidos; debido a que cada

sustancia exhibe un valor Rf particular, es posible separar aminoácidos y péptidos,

ya que estos presentan características particulares, de solubilidad, polaridad y

tamaño, por la composición química de sus grupos R (Koolman & Roehm, 2005).

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema

mediante su Rf, y ver sus propiedades de solubilizacion comparándolo con los Rf de

los aminoácidos que los componen.

OBJETIVOS PARTICULARES

- Separar aminoácidos y péptidos mediante el uso de la cromatografía en papel.

- Determinar el corrimiento cromatográfico de un aminoácido polar y uno no

polar, comparando el Rf de cada uno de ellos.

- Separar e identificar, por medio de la cromatografía en papel, el aspartame

presente en un refresco dietético, comparando su Rfcon el del Canderel.

HIPÓTESIS

Si se utiliza la técnica de cromatografía es posible separar las sustancias en sus

componentes esenciales.

MATERIAL Y MÉTODOPrimero, se recortó un rectángulo de papel de whatman con medidas de 20x9cm con

guantes de látex puestos para no contaminarlo. Enseguida se coloco encima de un

pliego de cartulina para su fácil manipulación.

Después, se marcaron seis puntos sobre el papel, los cuales se colocaron a un

centímetro de la base del papel y a unos 0.5 cm entre punto y punto,

aproximadamente. Posteriormente, en los espacios comprendidos entre cada punto

se pusieron las muestras de cinco sustancias diferentes: Fenilalanina, Acido

Apartico, Canderel, Refresco Normal (sin colorante) y Refresco de Dieta (sin

colorante).

Estas muestras se tomaron con un capilar para cada substancia y se pusieron cinco

gotas de cada solución entre cada espacio del papel (entre cada aplicación de las

muestras se secaba con una secadora).

Después se coloco dentro de la cámara para cromatografía que tenía una mezcla

eluyente de Butanol, Acido Acético y agua, que se encontraba dentro de la campana

de extracción con una parrilla magnética con una temperatura de 250C, ahi se dejo

por una hora y media aproximadamente.

Después se marcó con un lápiz hasta donde llego la fase móvil en el papel de

whatman, enseguida se dispuso a dejar secar dentro de la campana de extracción y

con una parrilla eléctrica se mantenía la temperatura deseada.

En el momento en el que se seco se aplico ninhidrina con un atomizador para poder

revelar el lugar donde se encontraban las muestras, solo hasta donde se marco con

el lápiz.

RESULTADOSEn el corrimiento cromatográfico (figura 1) se observan 5 bandas teñidas de color

purpura correspondientes a las 5 muestras utilizadas, en las cuales es posible

identificar manchas de diferentes tamaños y a diferentes distancias.

Figura 1: Corrimiento cromatográfico. De izquierda a derecha: Fenilalanina, ácido aspartico, refresco dietético y no dietético y Canderel. Pueden observarse manchas de diferentes tamaños y distancias recorridas diferentes, lo que permite calcular el Rf de cada una de ellas.

De acuerdo a la relación de migración para las sustancias aquí utilizadas

(aminoácidos, refrescos y canderel) se obtuvieron los valores de Rf para cada una de

ellas utilizando la fórmula siguiente:

Rf= distancia recorrida por lamuestradistanciarecorrida por lamezclaeluyente

Como la distancia recorrida por la mezcla eluyente fue de 8.8 cm y las distancias

recorridas por las muestras fueron diferentes, los Rf quedan:

Tabla 1: valores de Rf para las muestras de aminoácidos, refrescos y canderel

Muestras Distancia recorrida por la mezcla eluyente

Distancia recorridas por las muestras

Rf de las muestras

Fenilalanina

8.8 cm

7.0 cm 0.7955

Acido aspártico 1.5 cm 0.1705

Refresco dietético

1 cm

3 cm

0.113636

0.340909

Refresco no dietético

2.5 cm 0.2840

Canderel3cm

8 cm

0.340909

0.909090

R.F. de la sustancias trabajadas en el laboratorio

ANÁLISIS DE RESULTADOSNinguna muestra estudiada presentó el mismo Rf, ya que la tendencia relativa de las

moléculas en la mezcla (aminoácidos) para asociarse con mayor fuerza a una o a

otra fase no es la misma (Murray et al, 2007).

Aunque las muestras de canderel (aspartame, compuesto formado por fenilanina y

acido apartico) y del refresco dietético no tengan precisamente el mismo Rf, estas

presentan la misma tendencia a disociarse en dos manchas, la mancha con un valor

mayor de Rf parece ser la fenilalanina y la otra el ácido aspártico, tal como lo

muestran las dos primeras columnas de la imagen 1 del corrimiento cromatográfico

para la fenilalanina y el ácido aspártico, respectivamente. Puesto que los dos tipos de

refresco no presentan el mismo Rf, ni el patrón de disociación es el mismo, queda

determinado que el aspartame está presente en el refresco dietético, no así en el

refresco normal.

CONCLUSIÓN Debido a que cada sustancia exhibe un Rf característico, diferente a las demás,

debido a sus propiedades de solubilizacion, es posible la separación de aminoácidos

presentes en muestras problema, como la fenilalanina y ácido aspártico, en forma de

aspartame, presentes en los refrescos dietéticos, mediante la técnica de la

cromatografía en papel.

BIBLIOGRAFÍA

- Cardella-Hernández. Bioquímica médica, tomo I: Biomoléculas. n.d.

- González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de León-

Sánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de

bioquímica 1. 3ª ed. México.

- Koolman, J. & K.H. Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2ª edición.

Thieme. New York. EU.

- Murray, R. K.; D.K. Granner; V.W. Rodwell; P.A. Mayes (2007) Harper.

Bioquímica ilustrada. 14ª ed. México, Manual Moderno

ANEXO (CUESTIONARIO)

1.- ¿que son la fase estacionaria y la fase móvil de un sistema cromatografico?La fase estacionaria de una cromatografía, consta de un sólido o un líquido

adherido a un sólido, por el cual se hace pasar un fluido.

La fase móvil de una cromatografía, consta de un líquido o un gas que es capas

de moverse a través de la fase estacionaria, a diferentes velocidades

dependiendo de su afinidad.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

2.- ¿como se puede modificar la fase móvil de un sistema cromatografico?Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografía, la fase móvil debe

elegirse de forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se

produzca una acumulación en la base de la cromatografía.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

3.- ¿Qué es el Rf de una sustancia? Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia

desde el origen y la distancia recorrida del eluyente.

El Rf es una cifra útil porque es constante cuando se reproduce el experimento en

todas las condiciones además de ser tan característico y descriptivo de un

compuesto como puede serlo el punto de fusión. Por supuesto, el Rf de un

compuesto dado será diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una

ventaja, puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más

específicamente registrando sus Rf en varios disolventes.

Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la

concentración del ambiente de la cámara y la temperatura.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

4.- investigue las características de los aminoácidos utilizados en esta práctica y como se clasifican.

Aminoácidos Esenciales vs. No Esenciales

No esenciales Esenciales

Alanina Arginina*

Asparagina Histidina

Aspartato Isoleucina

Cisteina Leucina

Glutamato Lisina

*Los aminoácidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por

razones no directamente relacionadas por la falta de síntesis. La arginina es

sintetizada por las células de mamíferos pero en un rango que es insuficiente

para resolver las necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayoría que es

sintetizada es procesada para formar urea. La metionina es requerida en grandes

cantidades para producir cisteina, si el último aminoácido no es provisto

adecuadamente en la dieta. Igualmente, la fenilalanina se necesita en grandes

cantidades para formar tirosina, si este último aminoácido no es adecuadamente

provisto en la dieta.

La fenilalanina: Es un aminoácido esencial aromático (junto con el triptófano y la

tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencénico (Ruta 2). Uno de los aspectos

más relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los anillos

aromáticos se forman a partir de precursores alifáticos. También se le clasifica,

junto con el triptófano, como un aminoácido hidrofóbico con estructura cíclica.

Según los últimos estudios sobre los aminoácidos esenciales parece que en la

fenilalanina, la estructura carbonada sería su parte considerada esencial ya que

esta estructura es transaminada con rapidez por el organismo.

La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilación, en

tirosina que es otro aminoácido, en este caso considerado como semiesencial.

Además la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si

bien acortamos el mecanismo en la síntesis de catecolaminas utilizando la

tirosina como precursor (ver Ruta 3). También es un constituyente importante de

los neuropéptidos cerebrales, como la somatostatina, vasopresina,

melanotropina, encefalina, ACTH, angiotensina, sustancia P y colecistoquinina.

Muchas drogas de las que conocemos como psicotrópicas, contienen fenilalanina.

La fuente más importante de fenilalanina son los alimentos ricos en proteínas,

como es la carne y los productos lácteos. La fenilalanina tiene utilidades en la

industria de la alimentación, por ejemplo, en la elaboración de edulcorantes

artificiales.

Acido aspártico: Aminoácido glucogénico (puede convertirse en glucosa y

glucógeno) cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un

compuesto muy hidrofílico, y como tal se encuentra casi siempre en la superficie

externa de las proteínas globulares. Es un compuesto metabólicamente activo

debido a su interconversión con los ácidos dicarboxílicos tetracarbonados del

ciclo de los ácidos tricarboxílicos, después de sufrir una transaminación. Es el

precursor de la asparagina. También interviene en otras reacciones como dador

de aminos en la síntesis de urea y de purinas, y como precursor de los anillos

pirimidínicos a través de la formación de carbamoilaspartato en el citosol. Es,

junto con el glutámico, el principal neurotransmisor excitatorio de la corteza

cerebral.

http://www.biopsicologia.net/fichas/page_592.html

http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/amino-acid-metabolism-sp.html

5.- investigar los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí

utilizados. Anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizado para

obtenerlos.

Rf de los aminoácidos de referencia

Aminoácido Rf

Lisina 0.24 Ácido

glutámico 0.47

Glicina 0.49 Cisteina 0.12 Serina 0.31

Metionina 0.59 Fenilalanina 0.66

Arginina 0.28

Valina 0.59 Triptófano 0.60 Histidina 0.29 Treonina 0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=135478

6.- hacer una investigación sobre el uso actual del aspartame. Anote posibles beneficios y perjuicios del uso de este producto.

Comunicado de la FDA sobre el Estudio Europeo de aspartameCFSAN / Oficina de Seguridad Alimentaría de aditivos

20 de abril 2007

La FDA ha concluido su examen sobre el estudio de carcinogenicidad a largo

plazo de aspartame titulado, "a largo plazo de carcinogenicidad bioensayos para

evaluar el potencial de los efectos biológicos, en particular cancerígenos, del

aspartame administrado en la alimentación de ratas Sprague-Dawley", realizado

por el Ramazzini Europea Fundación (ERF), con sede en Bolonia, Italia. La FDA

revisó los datos del estudio puestos a su disposición por el ERF y considera que

no es compatible con la conclusión de la ERF que el aspartame es un agente

carcinógeno. Además, estos datos no proporcionan evidencia para alterar la

conclusión de la FDA que el uso del aspartame es seguro.

El aspartame fue aprobado por primera vez en los Estados Unidos en 1981 y es

uno de los edulcorantes artificiales más utilizados. Cuando metabolizado por el

organismo, el aspartame se descompone en dos aminoácidos comunes, ácido

aspártico y fenilalanina, y una tercera sustancia, el metanol. Estas tres sustancias

están en cantidades similares o mayores al comer alimentos comunes.

Al primero de aprendizaje de los resultados del estudio ERF, la FDA pidió a los

datos de la ERF para evaluar los resultados. El 28 de febrero de 2006, la agencia

recibió sólo una parte de los datos del estudio solicitado. En junio de 2006, la FDA

pidió ERF para proporcionar el resto de los datos del estudio solicitado

inicialmente y también se ofreció a revisar muestras de patología del estudio. ERF

no presentó datos adicionales a la FDA y no está de acuerdo a la revisión de la

FDA de las muestras de patología.

La FDA no pudo llevar a cabo una revisión completa y definitiva del estudio

porque ERF no proporcionó los datos del estudio completo. Con base en los

datos disponibles, sin embargo, hemos identificado deficiencias significativas en

el diseño, realización, presentación de informes, y la interpretación de este

estudio. La FDA considera que la fiabilidad y la interpretación de los resultados

del estudio se ve afectada por estas deficiencias y variables no controladas, tales

como la presencia de la infección en los animales de experimentación.

Además, los datos que fueron proporcionados a la FDA no parecen apoyar los

hallazgos relacionados con el aspartame informado por el ERF. Basado en

nuestra revisión, los cambios patológicos fueron incidentales y apareció

espontáneamente en el estudio, los animales, y ninguno de los cambios

histopatológicos informó parecen estar relacionados con el tratamiento con

aspartame. La FDA considera que una visión adicional sobre los resultados del

estudio podrían ser proporcionadas por una patología a nivel internacional de

trabajo respaldado por el examen conjunto de las muestras de tejido apropiado en

el estudio.

Teniendo en cuenta los resultados de la gran cantidad de estudios sobre la

seguridad del aspartame, incluyendo cinco con anterioridad a cabo estudios

negativos carcinogenicidad crónica, un estudio recientemente la epidemiología

grande con asociaciones negativas entre el uso de aspartame y la aparición de

tumores, y los resultados negativos de una serie de transgénicos tres ensayos del

ratón, la FDA no encuentra ninguna razón para modificar su conclusión anterior

de que el aspartame es seguro como edulcorante de uso general en los

alimentos.