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INFORME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL
NOMBRE: EDITH CORTES BARBERENA
MATRICULA: 89239054
LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL. DIVISION DE C . B . S . UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - I Z T .
TRIMESTRE LECTIVO: 93-0.
HORAS SEMANA: 30 HRS.
TITULO: "DETECCION DE CELULAS RESISTENTES A LA 6- TIOGUANINA EN MEDULA OSEA DE RATAS DESNUTRIDAS DURANTE LA LACTANCIA"
ASESORES: DR. ALDA ROC10 ORTIZ MUNIZ PROFESOR TITULAR "C" DE TIEMPO COMPLETO. LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR. DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD. D I V I S I O N D E C . B . S .
LUGAR: LABORATORIO DE BIOLOGIAXELULAR. C . B . S . UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, UNIDAD IZTAPALAPA.
FECHA DE INICIO: 15 DE JUNIO DE 1993.
FECHA DE TERMINACION: 15 DE DICIEMBRE DE 1993.
C L A V E : S S . C B S . 3 7 7 . 9 3
NOMBRE DEL PROYECTO: "EFECTOS A NIVEL CELULAR DE LA DESNUTRICION"
'EDITH C ~ T E S BARBERENA (ALUMNO 1
DRA. A L O A ROC10 ORTIZ (ASESOR 1
MURIZ
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
"DETECCION DE CELULAS RESISTENTES A LA 6-TIOGUANINA EN MEDULA
OSEA DE RATAS DESNUTRIDAS DURANTE LA LACTANCIA"
INFORME FINAL DE SERVICIO FINAL
QUE PARA OBTENER LA LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL
P R E S E N T A
EDITH CORTES BARBERENA
ASESOR: DRA. ALDA ROC10 ORTIZ "I12
INDICE
I ANTECEDENTES
A 1 DESNUTRICION
1 ) D e f i n i c i b n e importancia
2 ) Estudios sobre desnutr ic ibn
B MUTACIONES
C ) GEN HPRT
1-9
1
2
5
7
I 1 J U S T I F I C A C I O N 10
I11 OBJETIVO 10
IV H I P O T E S I S 10
V METODOLOGIA 11-13
1 ) Desnutricidn experimental durante l a l a c t a n c i a 1 1
2 ) Extraccibn de medula dsea 1 1
3) Siembra de c 6 l u l a s 12
4 ) Cosecha 12
5 ) Real i zac idn de DreDaraciones y t i n c i b n 13
VI RESULTADOS 14
VI1 DISCUSION 21
VI11 CONCLUSION 24
BIBLIOGRAFIA 25
Alumna: Edith Cortes Barberena. Asesor: Dra. Alda Rocio O r t i z
MuAi z .
Labora tor io de B i o l o q j a C e l u l a r , Departamento de C ienc ias de l a
Salud, D.C.B.S.
I ANTECEDENTES
A 1 DESNUTRICION
1 ) D e f i n i c i d n e Importancia.
Actualmente se sabe que e l medio puede a f e c t a r e l d e s a r r o l l o
de l hombre, desde e l momento de su concepcibn hasta e l momento de
su muerte. En cada estadlo de su desar ro l lo , e l o rgan ismo humano
es e l Droducto de l a i n t e r a c c i d n de su dotacidn gendtica Y e l
medio que l o rodea (Crav ioto y A r r i e t a , 1985).
Una etapa importante del humano, despues de su nacimiento.
es l a i n f a n c i a . D u r a n t e e s t a e t a p a l a n u t r i c i b n es un factor muy
importante para su crecimiento y desar ro l lo bp t imos. Desde hace
tiempo se ha aceptado que para e l humano e l a l imento representa
a lgo m& que n u t r i e n t e s . Algunos a u t o r e s l a .jrlrzgan Dot- lo menos
desde t r e s b n q u l o s : e l n u t r i o l d g i c o , que comprende e l e s t u d i o de
l a d i e t a : e l d i e t o l d g i c o que es e l e s t u d i o de los al imentos que
componen l a d i e t a : y e l ps ico l¿qico que comprende l a
1
est imu lac lbn aue Dara e l desar ro l lo emoc lona l deber la ser
efectuada Dor medio de l a d l e t a . ( C r a v i o t o Y A r r i e t a . 1 9 8 5 ) .
Cuando e x i s t e un problema en l a i n t e r a c c l b n e n t r e e s t o s t r e s
aspectos se produce l a d e s n u t r i c i b n c a l b r i c o - p r o t e i c a (DCP) l a
cual es un sjndrome c l i n i c 0 que se presenta principalmente en
n i f ios lac tan tes y preescolares, debido a una ba ja inqes t ibn de
pro te inas de or igen animal, o p o r s u u t i l i z a c i d n d e f i c i e n t e ,
acompafiada de inges t iones var iab les de a l imentos r i cos en
carbohidratos. (Crav ioto y A r r i e t a . 1 9 8 5 ) .
La DCP es uno de los Drincipales problemas de salud pllrblica
en Dajses subdesarrollados. Estudios sobre l a m o r t a l i d a d i n f a n t i l
en palses lat inoamericanos revelan que l a DCP es responsable
d i r e c t a o ind i rectamente de mbs de un t e r c i o de las muertes de
n iRos en t re las edades de O a 5 afios de edad. ( A r r i e t a y
Crav ioto, 1982 1.
2 1 Estudios sobre desnutr ic ibn.
Los es tud ios en humanos son ind ispensables. s in embargo.
para entendimiento de los efec tos de l a DCP en diversos aspectos
son imposibles e inaceptab les es te t ipo de e s t u d i o s en nifios,
ademas l a d e s n u t r i c i d n v i e n e acompafiada de o t r o s padecimientos
(p r inc ipa lmente in fecc iones) . Es por esta razdn que se proponen a
estudios en animales desnutr idos experimentalmente como modelos,
de esta manera se pueden con t ro la r d i ve rsas va r iab les . Los
2
animales u t i l i z a d o s e n e s t e t i o o de estuldios san Drlncioalmente
ratdn, r a t a , cone.)o, cerdo Y mono. ( O r t i z , 1 9 8 7 ) .
La desnut r i c idn en animales se ha inducido en d i f e r e n t e s
grados, disminuyendo l a c a n t i d a d o ca l idad de l a l imento . Tambien
se ha provocado en d i fe ren tes e tapas de l a v i d a de l organismo.
desde l a prenatal hasta l a a d u l t a . La l a c t a n c i a se considera
como l a e t a p a c r i t i c a , ya que en e s t a e l crecimiento es muy
acelerado y corresponder fa a l a etapa de nifiez temprana donde l a
desnu t r i c i bn es prevalente. ( O r t i z , 1 9 8 7 ) .
La d e s n u t r i c i h ha s ido ob. je to de va r ios es tud ios , t an to a
n i v e l de e fec tos de organismos, t ratamientos, y e fec tos a n i v e l
ce lu la r , b ioqu im ico , c i t ogene t i co , e t c .
Estudios en humanos y en animales muestran aue los t e j i d o s
l i n f o i d e s s u f r e n a t r o f i a . Se han d e s c r i t o cambios anatbmicos en
l o s t e j i d o s l i n f o j d e s d u r a n t e l a d e s n u t r i c i b n . E l t imo t iene una
reduccibn en peso y tamafio, adernas p i e r d e d i f e r e n c i a c i b n
cort icomedular. encontrandose muy Docas c e l u l a s l i n f o i d e s . E l
bazo t a m b i b se ve a fectado, ya que p i e r d e c e l u l a s l i n f o i d e s
a l rededor de los vasos sanguineos. En los n b d u l o s l i n f a t i c o s , l a s
areas paracort icales dependientes del t imo no t i e n e n l i n f o c i t o s .
Tambidn se ha observado que l o s l i n f o c i t o s T maduros se reducen
en ndmero. (Chandra, 1991 ) .
Tambidn se han r e a l i z a d o e s t u d i o s con metodos c i t o g e n e t i c o s
como son : l a e v a l u a c i b n d e l c i c l o c e l u l a r t a n t o i n v i v o como i n
3
v i t ro , aber rac iones cromosdmlcas e intercambio entre cromat idas
hermanas. (Betancourt M. Y O r t i z R . . 1 9 9 1 1 .
Con los es tud ios de aberraclones cromosdmicas se han
obtenido di ferentes resul tados. Algunos autores encontraron
d i fe renc ias s ign i f i ca t i vas en t re los o rgan ismos desnut r idos y l os
tes t igo , pero o t ros no encontraron d i ferenc ia a lguna ent re las
aberraciones presentes entre los dos grupos. (Betancourt M. y
O r t i z R. , 1 9 9 1 )
E l es tud io de la f recuenc ia de in te rcambios de cromdtidas
hermanas ( I C H ) es complementario a l e s t u d i o de las aberraciones,
pues imp l i ca un proceso de daRo y reparac ibn de l ADN. Se han
rea l i zado en c e l u l a s de medula dsea. en ratas desnutr idas durante
l a l a c t a n c i a . En c e l u l a s de medula &sea de ratas desnutr idas
durante l a l a c t a n c i a t i e n e n un inc remento en la f recuenc ia de ICH
(Betancourt y c o l . , 1986). E l es tud io de Gonzhlez y c o l . en 1983
se h i zo en c u l t i v o s de l i n f o c i t o s de nifios desnutr idos y e l l o s no
mostraron aumento en l a f r e c u e n c i a de ICH p o r c k l u l a , a l i g u a l
que en o t r o t r a b a j o de Mutchinick en 1979 . Mient ras tanto, en
o t ros t raba jos , l os au to res s i obse rva ron aumento en l a
f recuencia de ICH en l o s l i n f o c i t o s de nif ios desnutr idos (Murthy
y c o l . , 1 9 8 0 : O r t i z y c o l . , en prensa) .
Tambien ha s i d o e s t u d i a d a l a d u r a c i d n d e l c i c l o c e l u l a r
t an to en c u l t i v o s de l i n f o c i t o s de niRos desnutr idos como en
c k l u l a s de medula 6sea de ra tas desnu t r i das . En estos traba.jos se
4
han obtenldo resul tados diferentes. Dues alqunos autores
encuentran un incremento en l a d u r a c i 6 n d e l c i c l o c e l u l a r en l os
orqanismos desnutr idos (Murthy Y c o l . . 1982: O r t i z Y Betancourt,
1990 ) , Y otros observan o e r i odos mbs co r tos de l c i c lo en l o s
organismos desnutr idos con resoecto a los b i e n n u t r i d o s
(Mutch in ick Y c o l . , 1 9 7 9 : Gonzdlez Y c o l . , 1990: Y O r t i z Y c o l . ,
1993, en prensa).
B MUTACIONES
E l mater ia l genht ico. a pesar de l o s mecanismos de
Droteccidn. puede su f r i r cambios que no se deben a l a
recombinacidn. Estos cambios son mutaciones y a l t e r a n l a
secuencia de ADN o l a c a n t i a d de ADN (Ayala y Kiger, 1984). Las
mutaciones se c l a s i f i c a n en gknicas y en cromosbmicas.
1 . - Gbni cas, que son modi f i caci ones causadas por s u s t i t u c i d n ,
a d i c i b n o e l im inac ibn de nuc lko t idos dent ro de l ADN o de l ARN de l
gen.
2 . - Cromos6micas. que pueden s u b d i v i d i r s e en:
a) Rearreglos cromosdmicos estructurales que a f e c t a n e l modo de
agruoarse de l os genes en l o s cromosomas, debido a l a Dhrdida de
un segmento cromos6mico ( d e l e c i 6 n ) . o oor l a d u p l i c a c i d n de un
segmento, l a i n v e r s i b n de un segmento o por su t r a s l o c a c i 6 n .
b ) Cambios en e l ndmero de los cromosomas, en donde algunos no
5
a l t e r a n l a c a n t i d a d t o t a l d e l m a t e r l a l hereditario ( fus iones Y
f i s i o n e s ) , Der0 o t r o s s i l o hacen (aneuoloidla, monoDlojdia y
D o l i o l o i d i a ) . ( A y a l a y K i q e r . 1 9 8 4 )
Las mutaciones cromosdmicas son las mas estudiadas y algunas
de e l l a s ya han sido observadas en DCP. S in embargo, no se sabe
como a f e c t a r l a l a d e s n u t r i c i d n s o b r e l a f r e c u e n c i a de mutaciones
gbnicas, s i es capaz de aumentar l a f r e c u e n c i a o no.
La de tecc idn de las mutaciones genicas en e l hombre debidas
a enfermedades o a l a e x p o s i c i d n de substanc ias tdx icas. es de
gran importancia, debido a Que estos implican procesos
p a t o l b g i c o s t a l e s como transformaciones mal ignizantes. as1 como
tambien algunos aspectos de d i f e r e n c i a c i b n c e l u l a r normal i n v i v o
( A l b e r t i n i y c o l . , 1990) . Algunas de estas mutaciones se han
estudiado en a l t e r a c i o n e s de l o s genes de l a hemoglobina o en e l
gen de l a g l i c o f o r i n a . Los genes de l a hemoglobina estan en dos
grupos de l o c i l i g a d o s en e l b razo cor to de l cromosoma 11 (llp) Y
- e l b razo cor to de l cromosoma 16 ( 1 6 ~ ) Y e l gen de l a g l i c o f o r i n a
e s t d en e l b razo l a rgo de l cromosoma 4 ( 4 q ) . Los an ter io res son
muy clrt i les en e r i t r o c i t o s . p e r o e n los l i n f o c i t o s se han
u t i 1 izado los s igu ien tes genes: e l gen de l a enzima
hipoxant ina-guanina fos for r ibos i l t ransferasa (HPRT) y uno de los
genes para los ant igenos de l e u c o c i t o s humanos ( H L A ) . E l gen HPRT
se encuentra en e l brazo largo de l cromosoma X ( X q ) ; los genes
HLA estdn en e l b r a z o c o r t o d e l cromosoma 6 ( 6 p ) . ( A l b e r t i n i y
c o l * 1990).
6
C ) GEN HPRT
Un sen aue ha sido ampliamente estudiado y Que ha s i d o b t i l
Dara e l e s t u d i o de mutaciones en c b l u l a s humanas es e l gen HPRT.
Este gen se encuentra en l a r e g i b n a del cromosoma X , mi@e 44 kb
y cont iene 9 exones ( A l b e r t i n i y c o l . , 1 9 9 0 ) . Su l o c a l i z a c i b n en
e l cromosoma X hace a l a s c e l u l a s de los organismos machos
hemic igdt icas, y este hecho permi te que es te gen sea ampliamente
usado en los estudios de c u l t i v o s de mamiferos (Stout and
Caskey , 1985 l .
E l gen HPRT c o d i f i c a p a r a una enzima que c a t a l i z a l a
f o s f o r i l a c i b n de l a h i p o x a n t i n a y guanina en l a r u t a de ahorro o
a l t e r n a t i v a de las pur inas . Es ta enzima tambihn f o s f o r i l a l o s
andlogos de l a s p u r i n a s , t a l e s como l a 8-azaguanina y l a 6-
t i oguan ina (6 -TG) . l os cua les i nh iben l a p ro l i f e rac idn ce lu la r .
Los l i n f o c i t o s T normales est imulados con f i tohemaglutinina en
c u l t i v o , no son capaces de p r o l i f e r a r cuando estdn en contac to
con l a 6-TG. m ien t ras l as cb lu las de f i c ien tes en e l gen HPRT son
r e s i s t e n t e s a este andlogo, debido a que no es incorporado al 1
se muestra en l a f i qu ra 1 :
7
Cdlula normal:
HPRT
6-TG ---_--__- > Nucledtidos del analog0 -------- > Toxic idad
C h l u l a d e f i c i e n t e :
6-TG --------- > No hay formacibn de ----------- > ADN normal
nucleotide del analog0
F igu ra l .
La de tecc idn de las ce lu las res is ten tes se ha rea l i zado por
medio de l a a d i c i d n de t i m i d i n a t r i t i a d a (3H-TdR). S i l a c e l u l a
no s i n t e t i z a l a ~" enzima del gen HPRT. no incorpora 6-TG, de este
modo l a c b l u l a puede p r o l i f e r a r e incorporar 3H-TdR: cuando l a
enzima de e s t e gen funciona, l a c d l u l a i n c o r p o r a 6-TG y muere
antes de i n c o r p o r a r 3H-TdR. P a r a i d e n t i f i c a r a l as cd lu las
r e s i s t e n t e s , e s d e c i r l a s c d l u l a s p r o l i f e r a n t e s , s e hace una
eva luac ibn con au to r rad iog ra f i a (A lbe r t i n i y c o l , 1 9 8 8 ) .
Un metodo a l t e r n a t i v o c o n s i s t e en l a i n c o r p o r a c i b n de
bromodesoxiuridina (BrdU) en el ADN de c e l u l a s e n p r o l i f e r a c i b n ,
8
se hace una tincibn diferencial con el metodo de fluorescencla
m& Giemsa, para poder identificar tres clases d e ndcleos de
linfocitos y as? distinquir los Que habjan incorDorado BrdU. Los
ndcleos que han incorDorado BrdU representarian a las CklulaS
resistentes a 6-TG en un cultivo (Ostrosky-Wegman y col. 1987).
Posteriormente, la tincidn fue modificada, se uti 1 izaron
anticuerpos monoclonales contra BrdU para la identificacibn de
los nlrcleos de las chlulas que Droliferaron. facilitando de esta
manera la identificacidn de las cdlulas resistentes (Montero y
col 9 1991 1 .
Norman y colaboradores en 1988 propusieron una metodologla
alternativa para evaluar a las chlulas resistentes , la cual
utiliza la citocalasina B ( C B ) que se une a los extremos de los
microfilamentos inhibiendo as1 la adicibn de moldculas de actina,
Drovocando un desequilibrio dinAmico entre los filamentos de
actina y molkulas de actina libres, y causando asi la
despolimerizacidn de los filamentos (Vorgias y col, 1988) . Por
medio de este mecanismo, la CB inhibe la citocinesis (divisibn
citoplasmAtica) de cc3lulas en divisibn. pero permite que la
celula complete la carioghesis (divisibn nuclear): de esta
manera se pueden identificar a las c6lulas proliferantes en
Dresencia de 6-TG por ser celulas binucleadas.
9
I1 JUSTIFICACION
Dentro del Droqrama "Efectos a n i v e l c e l u l a r de l a
d e s n u t r i c i b n " . se han e s t u d i a d o l a D r o l i f e r a c i d n c e l u l a r y l a
f recuencia de in te rcambio de cromAtidas hermanas en c e l u l a s de
medula bsea ( M . O . 1 , encontrandose d i ferenc ias ent re los
organismos desnutr idos Y l os b ien nu t r i dos . Ahora r e s u l t a de
i n t e r & e s t u d i a r e l n i v e l de mutaci6n genica en donde se a fecta
un gen en p a r t i c u l a r i n a c t i v a n d o l o o cambiando su expres idn, por
lo aue ahora se pretende determinar l a frecuencia de ct3lulas
va r ian tes en un locus somatico en c b l u l a s de organismos
desnutr idos. Se e l i g i b e l gen HPRT dado que ha sido ampliamente
carac ter izado y p o r l a f a c i l i d a d de de tec tar a l a s c d l u l a s
d e f i c i e n t e s en e s t e gen.
I11 OBJETIVO
E l p r o p d s i t o de es te es tud io es la determinacibn de l a
f recuencia de - va r ian tes (HPRT de f ic ien tes) , por med io de l a
r e s i s t e n c i a a 6- t ioguanina, en c b l u l a s de medula bsea de ra tas
desnutr idas experimentalmente durante l a l a c t a n c i a .
IV H I P O T E S I S
S i l a d e s n u t r i c i d n s e v e r a Droduce a l t e r a c i 6 n en e l gen HPRT,
se de tec tar& mayor ntlrmero de cd lu las va r ian tes en l o s c u l t i v o s de
medula &ea de r a t a d e s n u t r i d a que en los c u l t i v o s de r a t a s b i e n
nu t r i das .
10
V METODOLOGIA
1 ) Desnutr icibn Exoerimental Durante l a L a c t a n c i a
Ratas de l a ceDa w is ta r rec ien nac idas se l es d i s t r i buye ron
en dos l o tes : lo te exoer imenta l (desnut r idas) y l o t e t e s t i g o
( b i e n n u t r i d a s ) . La desnu t r i c i bn se indujo oor comoetencia de
a l i m e n t o d u r a n t e l a l a c t a n c i a , y p a r a l o g r a r l o se colocaron 15
c r l a s con una n o d r i z a ( l o t e e x p e r i m e n t a l 1 y e l l o t e t e s t i g o s o l o
t u v o c i n c o c r l a s con su nodriza. Se determind e l peso cada dos
d las , has ta los 21 d l a s de edad.
Se consideraron desnutr idas aquel las aue t u v i e r a n un d e f i c i t
de peso mayor a l 40 % en r e l a c i h a r a t a s de l a m i s m a edad. Se
emDlearon solo r a t a s macho. E l nlrmero de ra tas en es te es tud io
f u e de 6 b ien nu t r i das Y 6 desnutr idas.
2 ) Extracc idn de medula dsea
Cuando las ra tas cumpl ie ron los 21 d las de edad ( f i n a l de l a
l a c t a n c i a ) , se s a c r i f i c a r o n con &ter . Poster iormente se d isectd
el femur en condic iones de e s t e r i l i d a d Y se co locd dentro de una
c a j a de p e t r i con medio McCoy 5a. Modi f icado.
La medula se ext ra jo de l femur. cor tando las dos cabezas e
introduciendo en un extremo la aguja de una je r i nga con 5 m1 de
11
medio McCoy su~lementado con 2%3% de suero fetal bcv lno . 2% de
qlutamina v 0 . 1 de a n t i b i b t i c o s . Se resusDendi6 suavemente con
3 ) Siembra de c e l u l a s
DesDues de l a r e f r i g e r a c i d n . l a suspensidn c e l u l a r se l l e v d
a 10 m1 con medio McCoy suplementado, se resusDendi6 y 5 m1 se
colocaron en dos ca jas de p e t r i . A una de 1 as ca jas se l e
aRadieron 3 gotas de Hepes, y 0.5 m1 de 6-TG en una concentracibn
de 2 mM.
Los c u l t i v o s se incubaron a 370C con atmdsfera de CO a l 2
5%. A l a s 24 horas de efectuada l a siembra, se l e agregd a todos
los c u l t i v o s C8 Dara tener una concentracibn de 3 ug/ml. Despuks
de 28 horas de haber puesto l a CB. l a s c k l u l a s se cosecharon.
4 1 Cosecha
La susoensidn ce lu lar se c e n t r i f u g b a 1000rDm durante 10
min. Se r e t i r d l a mayor parte del sobrenadante, dejando solamente
0 .5 mL. E l paquete ce lu lar se resuspendid y se l e aRadid gota a
go ta e l f i . j ado r f r f o , (me tano l -Ac ido ace t i c0 3:1), hasta tener
4mL y se d e j 6 reDosando 15 minutos. La suspensi6n celular se
c e n t r i f u g d a 1 0 0 0 r D m durante 10 min. Se r e t i r 6 e l sobrenadante Y
se af iadieron otros 4 mL de f i j a d o r f r l o , se resusoendid Y se
1 2
centr- i fuqb de i g u a l manera. Se a u i t 6 el sabrenadante Y e l oaauete
celular se resusoend16 en 3 mL de f i l a d a r . Se h l c l e r o n l a s
oreoaraciones.
5 ) Real izac idn de PreDaraciones Y T inc idn
Las preparaciones se rea l izaron de jando caer 3 gotas de l a
suspensidn celular sobre un por taobJetos l imp io Y se t i f l i e r o n con
May-Grunwald a l 10% durante 20 minutos, Doster iormentese t i f ieron
con Giemsa a l 5% durante 5 minutos, se montaron con Entellan y se
revisaron al microscoDio con e l o b j e t i v o de 4 0 x . En cada
oreparacibn se contaron 2000 ck lu las reg is t rando cuantas de e l l a s
eran mononucleadas Y cuantas mul t inuc leadas (ck lu las con dos
n k l e o s o mas).
E l ndmero de var iantes a l a 6-TG s e c a l c u l d con las
s igu ien tes fb rmulas :
13
VI RESULTADOS
En e l cuadro 1 se presentan los pesos de l a s r a t a s BN v DN a
l a edad de 21 djas. Las ra tas desnut r idas tuv ie ron un d e f i c i t de
peso del 40% o mAs, con resoecto de l as b ien nu t r i das . E l
promedio del peso de l a r a t a s EN fue de 53.58 g ~f: 2 . 9 2 : l a s r a t a s
DN t u v i e r o n un peso promedio de 22.66 g 2 3 . 1 1 . lo aue
rep resen ta un de f i c i t de aproximadamente de l 57 % aue i n d i c a
desnu t r i c i dn de tercer grado. Se r e a l i z b una prueba de "t". l a
c u a l m o s t r d d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a en e l peso e n t r e ambos
l o t e s . E n l a g r d f i c a 1 se presenta la curva de aumento de peso
de las ra tas duran te los 21 d l a s de lac tanc ia ; en es ta g rd f i ca se
ouede a o r e c i a r l a d i f e r e n c i a e n l a ganancia de peso e n t r e l o s dos
1 o tes .
Los datos de l porcenta je de c e l u l a s monoucleadas.
binucleadas y mult inucleadas se muestran en los cuadros 2 y 3 .
En c u l t i v o s s i n 6-TG e l promedio de ce lu las mononucleadas fue de
87.98 2 2 . 7 3 en ra tas BN Y 86.36 2 2.88 en DN: l a s c b l u l a s
binucleadas tuvieron un promedio de 10.83 2.35 en BN y 12.06 2
2.50 en DN; Y las mult inucleadas tuvieron un promedio de 1.38 k
0.60 en BN y 1 . 5 7 0.71 en DN. En c u l t i v o s en presencia de 6-TG,
e l promedio de cdlulas mononucleadas fue de 93.48 2 2 . 2 6 en r a t a s
BN Y 92 .79 2 2.47 en DN: b inucleadas 5 . 8 0 k 2 .12 en BN y 6.70 2
2.25 en DN: multinucleadas 0.71 5 0.42 en BN y 0.76 5 0.25 en DN.
~ ~.. ..~
14
E l ndmero de ce lu las va r ian tes en los cultivos se c a l c u l 6
segllln l a fd rmula descr i ta en l a metodologla. E l Drornedio de
va r ian tes f ue de 0 . 5 2 3 5 0 . 1 5 9 en ratas BN Y 0 . 5 3 7 % 0 . 1 8 9 en
r a t a s DN. E l cuadro 4 m u e s t r a l a s c i f r a s de c&lulas va r ian tes en
cada ra ta ; es tos da tos t ienen una g r a n d i s p e r s i h , Dor l o t a n t o
se us6 l a Drueba U de Mann-Withney. Esta Drueba no mostr6
d i f e renc ia es tadAs t i ca en t re l os dos lotes de animales estudiados
( D > 0 . 0 5 ) .
1 5
CUADRO I
PESO DE LAS RATAS BIEN NUTRIDAS Y DESNUTRIDAS A LOS 21 DIAS DE
EDAD.
Rata Bien Nutridas Desnutridas
""""""""""""""""""""""""""""""""
5 1 . 3
5 4 . 2
5 0 . 2
5 6 . 9
5 7 . 0
5 1 . 9
"
2 1 . 2
2 4 . 3
1 8 . 5
2 3 . 9
2 0 . 6
28.1
2 2 . 0
""""""""""""""""""""""""""""""""
x = 5 3 . 5 8
D . E . = 2 . 9 2
~~
t = 1 8 . 4
D < 0 . 0 5
22 .66
3 . 1 1
\
1 6
n, ", n LJi -Ub L
pCRCiYiA?E DE CELyLAS U C N C H U C : E \ D A S , B I N U C L E A E A S 7 Y b L T I N L C L E A D A S E N C5LT:JOS Oi H E 2 U L A O S E 4 3E R A T A S
B I E N N U T R I D A S S I N 6 - T G Y CON 5 - i G .
__"""___""_"__"""""""""""""""""""""""""""""""""""-"-----------
Ratas sin 6 - T G :on 5-TG
Monanuceladas Blnucleadas Multinucleadas Mononucleadas fl~nucieadas Uultlnucleadas
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""-""---------
1 88.50 11.00 0.50 90.55 a. 90 0.55
2 89,15 9.55 1.30 95.30 3.d5 O .85
3 92 ,O5 1.00 0,95 95.90 3.50 0.60
4 83.80 14,20 2.00 90 I90 7.60 1.50
5 8 7 I 7 0 10.80 1.50 94.50 5.10 0,40
6 86,70 11,25 2.05 93.75 5.37 0.37
"""""""_""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""~ x : 87.98 10.63 1.38 93.48 5.80 0.11
D . E . = 2.13 2.35 0.60 2.26 2.12 0.42
18
____"""_~_""_~_""""""""""~"""""""""""""""~"""---"---"------------"--
1 82.60 16.10 1-30 91.90 7,20 0.90
2 89.15 9.90 0.95 91 -30 8.00 0.10
3 a4 I 70 1 2 , 6 0 2.70 89.20 9.60 1.20
4 87.10 11.45 1.15 94.80 4.15 0.45
5 89.15 9.45 1.40 96 85 2,65 0.50
6 83.05 14.55 2.40 93.00 6.20 0.80
7 88.80 10.40 0.80 92.50 6,70 0.80
_______"_"__""""""""""""""""""""""""""""""""""""""----"""""
X : 86.36 12,06 131 92.79 6.70 0.76
D . E . :: 2.88 2.50 0,ll 2.41 2.25 0.25
U :: 13
19
CUADRO 4
NUMERO DE VARIANTES EN MEDULA OSEA EN RATAS BIEN NUTRIDAS y EN
RATAS DESNUTRIDAS
"~"""""""""""""~""""""-""--------------- -"
R a t a B ien nutr idas D e s n u t r i d a s
""""""""""""""""""""""""""-------------
1 0.82 0.47
2 0 . 4 3 0.80
3 0.51 0 . 7 1
4 0.56 0.40
5 0.45 0.29
6 0.47 0.42
7 " 0.67
""""""""""""""""""""""""""""""""
X - 0.523 0.537
D . E . = o. 159 O. 189
-
U = 14
p < 0.183
2 0
V I 1 DISCUSION
Los modelos animales avudan a rea . l i zar es tud los aue en
humanos ser fa impos ib le de r e a l l z a r , ademas se Dueden con t ro la r
d iversas var iab les . las cua les Dodr jan in te r fe r i r con los e fec tos
d i r e c t o s aue causa l a d e s n u t r i c i b n . La desnut r i c ibn en l as ra tas
se indu.jo durante l a l a c t a n c i a dado que es ta reDresen ta r ia l a
ni f iez temprana en humanos. E l metodo de inducc idn de
desnu t r i c i bn Dor competencia de alimento es adecuado, ya que se
logrd obtener en es tas ra tas un d e f i c i t de peso mayor a l 40 X, e l
cua l ind ica desnut r i c idn severa d de tercer qrado. Ademas e l
porcenta je de mor ta l idad en es tas camadas fue de 3%. que es
s i m i l a r a lo normalmente observado en e l B i o t e r i o de l a UAM-I Y
es aCeDtad0 en o t r o s b i o t e r i o s .
Los estudios reportados de aberraciones cromosdmicas , I C H (
Murthy y co l . , 1 9 8 1 : Betancourt . y c o l . , 1986) y c i c l o c e l u l a r
i nd i can aue l a d e s n u t r i c i d n p r o v o c a dafio en l a s c e l u l a s d e l
orqanismo, pero no se han reoor tado estud ios en donde se
demuestre aue a l t e r e l a f r e c u e n c i a de mutaciones en un gen. En
es te t raba jo se u t i 1 i z d e l gen HPRT para detectar dafio a este. ya
aue es de f a c i l manejo y p o r e l l o se ha u t i l i z a d o ampliamente
oara detectar e l e fecto sustanc ias genotdx icas. caDaces de
provocar mutac iones (A lber t in i y c o l . , 1 9 9 0 ) . Pero, en ambos
l o t e s . se Dudo observar gran d ispers idn de los datos de l a s
Var iantes, y no se e n c o n t r b d i f e r e n c i a e n t r e e l l o s . E s t e hecho
i n d i c a que l a d e s n u t r i c i d n no a f e c t a l a f r e c u e n c i a de c e l u l a s
r e s i s t e n t e s a l a 6-TG ( de f i c ien tes en el qen HPRT) . Po r l o
~~
2 1
t a n t o , e l dafio Drevlamente reDortado
d e s n u t r i c i d n no t i enen re lac idn con l a ve
e l locus HPRT en organismos desnut r idos .
en los estud ios de
locidad de mutacibn en
Una e x p l i c a c i b n p a r a entender l a causa de l dafio observado
po r o t ros au to res a n i v e l c e l u l a r y c i t o g e n k t i c o , s e r i a aue
e x i s t e una d e f i c i e n c i a en l a s i n t e s i s de prote inas. debido a l
ba jo apor te de n u t r i e n t e s . E s t o e x p l i c a r l a Dor quk los te . j idos de
a l t o recambio, no permanecen dafiados cuando e l organismo se
recupera de l a d e s n u t r i c i b n ( B e t a n c o u r t y col . , 1989).
A l b e r t i n i y co l . (1988) most ra ron la impor tanc ia de los
ensayos de au to rad iog ra f i a y de incorporac ibn de BrdU p a r a e l
monitoreo basado en l a r e l a t i v a s i m p l i c i d a d , ba.jo costo y a l
po tenc ia l de au tomat izac idn . Es ta carac ter is t i ca hace p o s i b l e
real izar estas metodologias en pajses subdesarrol lados. Sin
embargo se sugieren que es tos es tud ios se comDlementen con
a n a l i s i s mas deta l lados como l a s e l e c c i b n c l o n a l ( A l b e r t i n i y
c o l . . 1988) o con ensayos moleculares (Albert in i Y c o l . . 1990) .
E l metodo de bloqueo de l a c i t o c i n e s i s p r o p u e s t o p o r Norman y
c o l . en 1988, pa ra de tec ta r l a f recuenc ia de c k l u l a s r e s i s t e n t e s .
se cons idera fac t ib le , y a que las cc j lu las en p r o l i f e r a c i b n en
medio conteniendo 6-TG son fAc i lmente iden t i f i cadas por su
aPar ienc ia b inuc leada o mul t inuc leada, hac iendo a l metodo una
a l te rna t i va pa ra eva lua r e l p o t e n c i a l mutageno i n v i v o .
2 2
En es tud ios o rev ios , las ch lu las se han congelado antes del
c u l t i v o para e l im ina r a l a s c e l u l a s en o ro l i f e rac idn an tes de l a
ad ic i6n de l a 6-TG. loqrando as j l a s inc ron izac ibn ce lu la r y l a
e l im inac ibn de las denominadas “ fenocooias” (Albert in i y c o l .
1981). En es te es tud io , l as ck lu las sblc se r e f r i g e r a r o n a 4 C .
un metodo menos a g r e s i v o . s i n embargo e f e c t i v o p a r a s i n c r o n i z a r
l a p r o l i f e r a c i d n c e l u l a r i n v i t r o . Resul tados previos real izados
con c u l t i v o s s i n r e f r i g e r a c i d n m o s t r a r o n una f recuencia de
cd lu las b inuc leadas s ign i f i ca t i vamente menor, lo cual estA
indicando que a l r e f r i g e r a r l a s c d l u l a s estamos s inc ron izando e l
c u l t i v o ,
O
En e s t e t r a b a j o , l a f r e c u e n c i a de cd lu las var iantes es mayor
que l a observada por A l b e r t i n i y col. (1988) y Ostrosky y c o l .
(19901, es to podr ia deberse a l t ipo ce lu la r , dado que e l l o s
a n a l i z a r o n l i n f o c i t o s de sangre pe r i f e r i ca de humanos, mient ras
que en e l Dresente estudio se emplearon cdlulas de medula bsea de
r a t a , e l c u a l es un t e j i d o con a l t o recambio c e l u l a r y l a espec ie
es d i f e ren te .
Algunas investigaciones han ido mas a l l a de observar e l daRo
por medio de l a r e s i s t e n c i a a 6-TG, ya aue han u t i l i z a d o l a s
tdcnicas de c lonacic jn (Nick las y c o l . , 1990) y de b i o l o g j a
molecular Dara detectar e l l u g a r d e l gen afectado (Hou y col..
1 9 9 3 ) .
Nuestros resul tados son s i m i l a r e s a los obtenidos Dor Norman
y colaboradores en 1988. quienes obtienen valores uno a dos
2 3
drdenes de magnitud mayor aue los reportados DOT Strauss Y
A l b e r t i n i ( 1 9 7 9 ) .
VI11 CONCLUSION
E l mhtodo de induccidn de la desnutricidn fue adecuado Dara
este estudio, cumple con las necesidades de los estudios
real i zados en este 1 aboratorio.
La desnutricidn severa no afecta la frecuencia de mutaciones
en el gen HPRT, mesto aue la frecuencia de variantes fue similar
en las ratas desnutridas y bien nutridas. De esta manera, se
puede concluir aue el la alteracibn en el ciclo celular, el
incremento en la frecuencia de aberraciones cromosdmicas e ICH.
Dreviamente reportado en cblulas de organismos desnutridos, se
deberia a un daRo postranscriDciona1 temporal.
24
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