influência do polimorfismo do gene do cd14 no resultado do
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CAMILA ARÃO DEL AGUILA
INFLUÊNCIA DO POLIMORFISMO DO GENE DO CD14 NO RESULTADO DO
TRATAMENTO ENDODÔNTICO
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).
ORIENTADORES Profª. Drª. Isabela das Neves Rôças Siqueira
Prof. Dr. José Freitas Siqueira Júnior
UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO
2013
ii
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
A282i AGUILA, Camila Arão Del. Influência do polimorfismo genético do CD14 no resultado do tratamento endodôntico./ Camila Arão Del Aguila - Rio de Janeiro, 2013.
40f; 30cm.
Dissertação (Mestrado em Endodontia) - Universidade Estácio de Sá, 2012.
Bibliografia: f.32 Orientador:. Profª.Drª. Isabela Neves Rôças Siqueira e Prof.Dr. José Freitas Siqueira Júnior
1. Periodontite apical 2. Polimorfismo genético 3. Tratamento do canal radicular I. Título
CDD 617.6342
iii
Dedico este trabalho aos meus familiares, amigos e professores que me ajudaram
na busca desta vitória e que mesmo diante das dificuldades, souberam ter paciência
e transmitiram todo apoio. AGRADECIMENTOS
A Deus que nunca me desamparou.
iv
Ao Programa de Pós-Graduação de Odontologia da Universidade Estácio de
Sá que possibilitou a realização do Curso de Mestrado.
Aos meus orientadores Profª. Drª. Isabela das Neves Rôças Siqueira e Prof. Dr.
José Freitas Siqueira Júnior pelo apoio, competência, inteligência e
compreensão, que foram fundamentais para a conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Lúcio de Souza Gonçalves pelo apoio na realização da análise
estatística e pelo exemplo de mestre.
À CMG (CD) Helena Rosa Campos Rabang, pela amizade, compreensão,
apoio, incentivo, exemplo de profissional e ser humano que foram essenciais
em toda a minha formação acadêmica.
A todos os professores do mestrado que de alguma forma contribuíram para a
minha formação.
Às minhas amigas que me ajudaram nesta caminhada e tornaram os dias
difíceis mais alegres, que enxugaram as minhas lágrimas e que me deram
palavras de incentivo. Vocês foram fundamentais! Amo vocês!
À minha família e meu noivo que todos os dias demonstram um amor
incondicional. Obrigado por tudo!
ÍNDICE
v
RESUMO................. ................................................................................................... vi
ABSTRACT............................................................................................................ .... vii
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................. .... viii
LISTA DE TABELAS.................................................................................. .................. x
1– INTRODUÇÃO.................................................................................................. .... 01
2– JUSTIFICATIVA................................................................................................ .... 13
3– HIPÓTESE............................................................................................. ............... 14
4– PROPOSIÇÃO................................................................................. ..................... 15
5– MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. ....... 16
6– RESULTADOS................................................................................................. .....22
7– DISCUSSÃO................................................................................. ........................ 26
8– CONCLUSÃO.................. ..................................................................................... 31
9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 32
10 – ANEXOS ........................................................................................................... 40
RESUMO
vi
Objetivo: Diante do consenso científico de que a lesão perirradicular é de
etiologia microbiana, questionamentos têm sido levantados acerca da influência
de outros fatores como, polimorfismo genético, na sua prevalência, severidade
e resposta ao tratamento. A proposta deste estudo foi investigar a influência do
polimorfismo genético do gene do CD14 no sucesso e fracasso do tratamento
endodôntico em indivíduos brasileiros.
Métodos: A população estudada foi composta por 42 pacientes com dentes
apresentando lesão perirradicular pós-tratamento e 41 pacientes com dentes
apresentando canal tratado e saúde perirradicular (controle). Amostras de
saliva dos pacientes foram coletadas, o DNA foi extraído e o polimorfismo
genético do gene do CD14 (-206 T/T) foi avaliado pelo método molecular da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Resultados: Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada
entre os genótipos CC, CT e TT e os alelos C e T polimórficos (p>0.05) no
sucesso/fracasso do tratamento endodôntico. Na análise bivariada entre o
tratamento endodôntico e as covariáveis, o polimorfismo do CD14 e raça não
demonstraram associação significativa com o prognóstico do tratamento
endodôntico, enquanto que para gênero (p=0,047) e tabagismo (p=0,020) foi
observada associação direta e significativa. Com relação ao gênero, foi
demonstrado que o fracasso no tratamento endodôntico é quase três vezes
maior nos homens quando comparado com as mulheres. No caso do
tabagismo, o fracasso é quatro vezes maior em pacientes fumantes do que em
não fumantes.
Conclusão: O presente estudo sugere que não há associação do polimorfismo
do gene do CD14 com o resultado do tratamento endodôntico. Tabagismo,
também considerado como modificador de doença, foi significativamente
associado com o fracasso endodôntico.
Palavras-chave: periodontite apical; polimorfismo genético; tratamento do
canal radicular.
vii
ABSTRACT
Objective: Although there is a consensus that apical periodontitis has microbial
etiology, other factors such as genetic polymorphisms may influence in the
disease prevalence, severity and response to treatment. The purpose of this
study was to investigate the influence of genetic polymorphism of the CD14
gene in the success and failure of the endodontic treatment in Brazilian
individuals.
Methods: The study population consisted of 42 patients with posttreatment
apical periodontitis and 41 patients showing root canal-treated teeth with
healthy periradicular tissues (control). Samples of saliva were taken from the
patients, DNA was extracted and the genetic polymorphism of the CD14 gene
(-206 T/T) was evaluated by the polymerase chain reaction (PCR) method.
Results: No statistically significant difference was observed between the
genotypes CC, CT e TT and the alleles C and T (p>0.05) in the outcome of the
endodontic treatment. The covariates CD14 polymorphism and race did not
show any association with the treatment outcome, whereas gender (p=0.038)
and smoking (p=0.024) were significantly associated. Regarding gender, it was
demonstrated that the treatment failure was almost three times higher for males
than for females. As for smoking, the chances for failure are four times greater
for smokers than for nonsmokers.
Conclusion: This study suggests that there is no association between
treatment outcome and the polymorphism for the CD14 gene. Smoking, which
is another disease modifier, was significantly associated with the endodontic
treatment failure.
Key Words: apical periodontitis; genetic polymorphism; root canal therapy.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
A Adenina
Alelo N Alelo Normal
Alelo R Alelo Raro
C Citosina
CD14 Cluster of Differentiation (Aglomerado
de Diferenciação)
FCɣ Fragment crystallizable (Receptor
Celular de Superfície)
g Força gravitacional
g Grama
G Guanina
NaOH Hidróxido de Sódio
h Hora
IL Interleucina
IL-1α Interleucina 1 alfa
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-6 Interleucina 6
LBP
Lipopolysaccharide Binding Protein
(Proteína Ligante de
Lipopolissacarídeos)
LPS Lipoppolysaccharide
(Lipopolissacarídeos)
µL Microlitro
µM Micromolar
mM Milimol
mM/L Milimol/Litro
Min Minuto
NFKβ Nuclear Factor Kappa β (Fator de
Transcrição Nuclear Kappa β)
ix
Bp Pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação
em Cadeia da Polimerase)
% Porcentagem
TLR-2 Receptor Tipo Toll isoforma 2
TLR-4 Receptor Tipo Toll isoforma 4
SNP Single Nucleotide Polymorphism
(Polimorfismo de um Único
Nucleotídeo)
Taq Thermus aquaticus
T Timina
TLR Toll-Like Receptor (Receptor Tipo
Toll)
TNFα Tumor Necrosis Factor Alpha (Fator
de necrose tumoral alfa)
U Unidade
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequência de primers, enzima de restrição e genótipo para o
CD14..................................................................................................................20
Tabela 2. Análise descritiva dos 83 pacientes de acordo com as variáveis
estudadas..........................................................................................................23
Tabela 3. Análise bivariada entre tratamento endodôntico e as covariáveis
estudadas..........................................................................................................24
Tabela 4. Modelo logístico não ajustado e ajustado para estimar a associação
entre o resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis estudadas........25
11
1- INTRODUÇÃO
O tratamento endodôntico pode ser definido como a combinação de uma
instrumentação mecânica no sistema de canais radiculares dentários, com
debridamento químico e obturação com material inerte, destinados a manter ou
restaurar a saúde dos tecidos perirradiculares (BERGENHOLTZ et al., 1979). O
modo de execução do tratamento é tão diverso quanto os protocolos prescritos,
tornando-se difícil definir algum protocolo mais preciso ou mais aceito no
tratamento endodôntico. De fato, o procedimento é determinado por questões
dentárias, como por exemplo, a complexidade anatômica e questões
biológicas, que são os fatores pré-operatórios. Os fatores pós-operatórios
elucidam o fato do mesmo procedimento ser realizado em duas condições
diferentes de doença: (1) a vitalidade ou doença pulpar onde o principal
objetivo é manter a saúde perirradicular e prevenir a doença; e (2) não-vital ou
necrosada associada à lesão perirradicular, onde o objetivo é restaurar a saúde
dos tecidos perirradiculares (NG et al., 2008; RICUCCI et al., 2009).
É sabido que a necrose pulpar pode ser precedida por cárie, trauma ou
procedimentos iatrogênicos, estabelecendo-se a infecção endodôntica. Um dos
fatores favoráveis que propiciam a colonização destes micro-organismos são
as alterações ambientais nos tecidos pulpares, oferecendo condições nutritivas,
umidade, calor e anaerobiose. Além destes fatores, o microambiente
endodôntico, por sua vez, é um ambiente de difícil acesso às defesas do
hospedeiro (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a). Os estudos relacionados à
diversidade da microbiota associada à lesão perirradicular atribuem à presença
de fungos, vírus e, principalmente, bactérias como os principais agentes
etiológicos envolvidos na infecção endodôntica (SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA &
RÔÇAS, 2008b). Assim, micro-organismos que colonizam o sistema de canais
radiculares, após a necrose pulpar, atingem os tecidos perirradiculares através
do forame apical, canais laterais e acessórios mais prevalentes no segmento
apical. Como consequência dessa infecção, ocorrem alterações nesses
tecidos, dando origem a diferentes tipos de lesões perirradiculares
(KAKEHASHI et al., 1965; SUNDQVIST, 1976; MÖLLER et al., 1981;
SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a). Quanto à infecção, os mecanismos de defesa
do hospedeiro desencadeiam estratégias através de uma resposta inflamatória
12
próxima ao forame apical, com o intuito de conter a disseminação da infecção
para os tecidos ósseos adjacentes (SJӦGREN et al., 1997; SIQUEIRA &
BARNETT, 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008b).
O tratamento endodôntico de elementos dentários com lesão
perirradicular tem como objetivo promover o reparo desses tecidos (RICUCCI
et al., 2000). Sinais (radiolucidez, odor) e/ou sintomas (dor) em dentes com
canais tratados indicam que a infecção pode ter surgido após o tratamento ou
ser recorrente (após o tratamento ter gerado o reparo) (SIQUEIRA, 2011).
Quando o preparo químico-mecânico não atinge padrões satisfatórios para
promover a redução dos micro-organismos a níveis incompatíveis com o
desenvolvimento da doença, a lesão perirradicular é mantida ou desenvolvida.
Erros cometidos durante o tratamento endodôntico como instrumentos
fraturados, perfurações, sobreobturações e degraus podem estar associados à
falha da terapia (SIQUEIRA, 2011).
1.1- Sucesso e fracasso em Endodontia
NG et al. (2008) destacaram os principais fatores pré, intra e pós-
operatórios necessários para o sucesso do tratamento endodôntico. Dentre os
fatores pré-operatórios, foram ressaltados: o gênero, condições sistêmicas,
grupo do dente, condições pulpares, condições perirradiculares, e o tamanho
da lesão perirradicular. Os fatores intra-operatórios que devem ser
considerados na terapia endodôntica seriam: o uso do lençol de borracha no
tratamento; o diâmetro e conicidade do canal a ser preparado; obstruções no
canal; erros na técnica, como perfurações e fraturas do instrumento; soluções
irrigadoras; medicação intracanal; testes de cultura bacteriana nos canais
radiculares; seleção do material, da técnica, da extensão e da qualidade para a
obturação; dor exacerbada durante o tratamento e o número de consultas.
Dentre os fatores pós-operatórios, temos a qualidade da restauração coronária.
Os autores também citaram quatro condições necessárias para o sucesso do
tratamento endodôntico. Dentre os fatores mais relevantes para o sucesso,
destacam-se ausência de imagem radiolúcida perirradicular, obturação
endodôntica sem falhas, extensão da obturação apical 0 a 2 mm do ápice
radiográfico e restauração coronária satisfatória. O tratamento endodôntico
13
deve manter o acesso e a anatomia apical durante o debridamento do preparo
químico-mecânico, obturando o canal através da compactação do material para
o término apical sem extrusão para os tecidos adjacentes e prevenindo a
reinfecção com uma restauração coronária de qualidade.
Além dos problemas anatômicos que consistem em áreas inacessíveis
à instrumentação, o fracasso endodôntico pode advir de resistência de
bactérias aos métodos químicos e mecânicos utilizados na terapia endodôntica
convencional (SIQUEIRA, 2001).
Micro-organismos nos canais radiculares apresentam um papel decisivo
no desenvolvimento de lesões perirradiculares (KAKEHASHI et al., 1965;
SUNDQVIST, 1976; DAHLÉN & BERGENHOLTZ, 1980; MÖLLER et al., 1981).
Isto significa que a eliminação dos mesmos durante o preparo químico-
mecânico de dentes necrosados é o fator mais almejado no tratamento
endodôntico. No entanto, o tratamento endodôntico pode falhar quando a
técnica não é capaz de agir na eliminação ou redução da microbiota a níveis
compatíveis que proporcionem o reparo dos tecidos perirradiculares (ZELDOW
& INGLE, 1963; OLIET & SORIN, 1969).
1.1.1- Etiologia do fracasso do tratamento endodôntico
O fracasso da terapia endodôntica pode ser atribuído, em grande parte,
às deficiências técnicas, como preparo químico-mecânico, onde não houve
êxito na limpeza, desinfecção e modelagem. Todavia, há casos em que os
canais radiculares apresentam-se aparentemente bem tratados e mesmo assim
o sucesso não é obtido. Nessas situações, evidências científicas relacionam
esses casos a fatores microbianos e, em algumas vezes, são relatados o
envolvimento de fatores não-microbianos (SIQUEIRA et al., 2010).
Fatores microbianos: infecção intrarradicular
A infecção intrarradicular é o fator essencial para o desenvolvimento da
lesão perirradicular, afetando dentes que não se submeteram ao tratamento
endodôntico e, provavelmente, a maior causa de persistência da mesma. O
objetivo desejado no tratamento endodôntico tem sido eliminar os agentes
14
responsáveis pela doença ou reduzir substancialmente a carga microbiana dos
canais radiculares, além de prevenir a reinfecção dos canais obturados (NAIR
et al., 2005). O reparo perirradicular da maioria dos casos ocorre somente
quando micro-organismos não estão presentes nos canais radiculares no
momento da obturação (SJӦGREN et al., 1997). Em alguns casos, bactérias
residuais ainda são encontradas, mas mesmo assim o caso resulta em
sucesso. Nestes casos, micro-organismos podem estar presentes em
quantidades consideradas subcríticas para manter a inflamação perirradicular,
ou permanecem em locais sem contato com os tecidos perirradiculares (NAIR
et al., 2005).
Estudos têm constatado que a microbiota oriunda de canais radiculares
com lesão perirradicular persistente difere da microbiota de dentes não tratados
e com polpa necrótica (SUNDQVIST, 1976; MOLANDER et al., 1998). A
infecção presente em canais radiculares necrosados é polimicrobiana, sendo
composta por Gram-positivos e Gram-negativos e, dentre esses, os
anaeróbicos são os mais prevalentes (SUNDQVIST, 1976; WASTY et al.,
1992). A microbiota no retratamento endodôntico é caracterizada como uma
monoinfecção composta predominantemente por micro-organismos Gram-
positivos e com proporções semelhantes de anaeróbios facultativos e estritos
(MOLANDER et al., 1998; SUNDQVIST et al., 1998). O Enterococcus faecalis
parece ser uma das espécies bacterianas mais predominantes em dentes com
insucesso na terapia endodôntica (WASTY et al., 1992), no entanto outras
espécies como: Streptococcus spp., Parvimonas micra, Pseudoramibacter
alactolyticus, Osenella uli, Actinomyces, Propionibacterium spp. e Lactobacilus
spp. também podem ser encontradas (CHAVES DE PAZ et al., 2004).
Fatores microbianos: infecção extrarradicular
As lesões perirradiculares têm sido, há muito tempo, consideradas uma
barreira de defesa contra a invasão de micro-organismos para os tecidos
perirradiculares, tornando-se concebível que os mesmos invadam os tecidos
extrarradiculares durante as fases de expansão e exarcebação do processo da
doença. Com isso, a microbiota extrarradicular na lesão perirradicular (IWU et
al., 1990) pode ser responsável por diversas falhas no tratamento endodôntico
15
e, em alguns casos uma abordagem não cirúrgica é insuficiente, exigindo
cirurgia perirradicular e/ou medicação sistêmica (NAIR, 2006).
Dentre as diferentes formas de manifestação da infecção extrarradicular
o abcesso perirradicular agudo é o mais comum (SIQUEIRA et al., 2010). Na
maioria das vezes, a infecção extrarradicular tem origem numa infecção
intrarradicular (SIQUEIRA et al., 2010). Tem sido considerado que as infecções
extrarradiculares podem ser tanto dependentes quanto independentes da
infecção intrarradicular (SIQUEIRA, 2011). Frente ao exposto, diversos estudos
utilizando métodos de cultura, moleculares e microscópicos têm pesquisado a
ocorrência de micro-organismos extrarradiculares tanto em canais tratados
quanto nos não-tratados (HAPPONEN, 1986; NAIR, 1987; IWU et al., 1990;
TRONSTAD et al., 2000).
Devido ao estabelecimento de micro-organismos nos tecidos
perirradiculares, os mesmos tornam-se inacessíveis aos procedimentos de
desinfecção endodôntica, confirmando a suposição de que a infecção
extrarradicular pode ser a causa do fracasso na terapia endodôntica. Uma
pequena parte dos micro-organismos orais tem a capacidade de superar os
mecanismos de defesa do hospedeiro e também de se estabelecerem em uma
infecção extrarradicular. Atualmente, tem sido considerado que alguns micro-
organismos orais como algumas espécies de Actinomyces e Propinobacterium
propionicus podem estar envolvidos na infecção extrarradicular (HAPPONEN,
1986; NAIR, 1987; IWU et al., 1990; TRONSTAD et al., 2000).
Fatores não- microbianos
SIQUEIRA & BARNETT (2004), em revisão de literatura, constataram
que fatores antimicrobianos podem induzir uma inflamação perirradicular
transitória. Constataram também que nem sempre é desencadeada por uma
agressão microbiana concomitante. Apesar de ser transitória, a inflamação
gerada por fatores antimicrobianos pode ser a causa de dor. As causas
antimicrobianas são representadas por fatores químicos e físicos que podem
impor um dano aos tecidos perirradiculares e, além do mais, podem ser
responsáveis pelo desenvolvimento de dor. De fato, as causas antimicrobianas,
geralmente, estão associadas a eventos iatrogênicos, como por exemplo:
16
sobreinstrumentação, sobreobturação, extrusão de substâncias químicas-
auxiliares e medicação intracanal.
NAIR (2003) sugeriu que cristais de colesterol podem invocar uma
reação de corpo estranho e contribuir para o desenvolvimento de uma
inflamação crônica. Os cristais de colesterol são passíveis de serem
precipitados, acumulados e são liberados a partir da desintegração de células
hospedeiras. Eles podem também ser oriundos de lipídeos circulantes no
plasma. Se as células de defesa são ineficazes em remover os cristais, estes
continuam se acumulando e contribuindo para a manutenção da lesão
perirradicular. No entanto, o autor não constatou evidências do envolvimento
direto dos cristais de colesterol na falha do tratamento endodôntico e tal
participação na lesão perirradicular é bastante especulativa. O “cisto
verdadeiro” é um exemplo de lesão que pode reparar ou não após tratamento
endodôntico adequado. Esta suposição é mantida através da teoria que o “cisto
verdadeiro” pode ser autossustentável em virtude de se manter independente
da presença ou ausência de infecção bacteriana no sistema de canais
radiculares (NAIR, 2003).
RICUCCI et al. (2009), contrariando o estudo de NAIR (2003), não
verificaram nenhuma associação dos cristais de colesterol com o fracasso do
tratamento endodôntico. Diante dos estudos realizados, tem sido estabelecido
que a lesão perirradicular – independente de ser uma infecção primária ou pós-
tratamento – é uma doença causada primariamente por micro-organismos que
podem ser detectados concomitantemente com o cisto. Além disso, não há
nenhuma evidência consistente supondo que cristais de colesterol e cistos
verdadeiros podem ser a causa de doença após o tratamento endodôntico
(NAIR, 2003; RICUCCI & SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA et al., 2010).
1.1.2- Polimorfismo genético: definição e influência na resposta do
hospedeiro
Locus gênicos são locais específicos do cromossomo onde podem ser
encontradas as formas variantes dos genes (polimorfismos). Um locus
polimórfico está presente quando os alelos estão numa distribuição tal que a
variante normal (alelo N) tem frequência menor que 99% na população. Diante
17
disto, em casos de um locus ser dialélico, o alelo mais raro (alelo R) deve ter
uma frequência maior que 1% na população. Frente a estas condições, quando
encontramos diferentes alelos de um gene na população, podemos caracterizar
um polimorfismo genético. Apesar de o indivíduo estar constantemente exposto
a mutações, nem sempre elas são manifestadas. A alteração genética mais
comum é a que muda apenas um único par de bases e é denominada de
mutação de ponto. As transições são o subtipo mais comum de mutação de
ponto, sendo caracterizadas por substituições do par G-C (guanina-citosina)
pelo par A-T (adenina- timina) ou vice-versa (SCHORK et al., 2000).
Fatores de risco genético podem aumentar diretamente a probabilidade
do desenvolvimento de lesão perirradicular e, se ausente, reduzem ou inibem
esta possibilidade. Eles são partes de um risco casual ou exposição do
hospedeiro a este risco. Sendo assim, pode ser possível afirmar que um alelo,
no qual é originalmente definido como R-alelo, está associado com a ausência
de doença e, em alguns casos, o fator genético pode ser considerado protetor
(LOOS et al., 2005).
Há diversos argumentos usados para justificar o motivo pelo qual os
genes modificados para o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-
1α (IL-1α) e interleucina-1β (IL-1β) aparentam ser bons candidatos para os
estudos genéticos em periodontite (KORNMAN et al., 1997). Dentre eles,
destaca-se uma evidência sugestiva que a IL-1 e o TNF-α são potentes
mediadores imunológicos com propriedades pró-inflamatórias (GRAVES &
COCHARAN, 2003). Além do mais, a IL-1 e o TNF-α têm a capacidade de
estimular a reabsorção óssea e regularem a proliferação celular de fibroblatos.
Fatores determinados geneticamente, através de diferenças interindividuais,
podem ser observados na produção de IL-1α, IL-1β e TNF-α de indivíduos com
periodontite e saudáveis. Logo, é concebível que níveis diferenciados desses
mediadores químicos podem ser denominados de fatores de risco (GENCO et
al., 1999).
A lesão perirradicular é a consequência de uma interação genética,
ambiental, fatores microbiológicos e do hospedeiro (WOLFF et al., 1994;
TURNER et al., 1997). A presença de micro-organismos é um fator
determinante na doença periodontal inflamatória, mas a progressão da doença
pode ser determinada através de fatores de risco do hospedeiro como, por
18
exemplo: genética, idade, gênero, tabagismo, fatores socioeconômicos e certas
doenças sistêmicas.
Tabagismo (BERGSTRÖM, 1989; KORNMAN et al., 1997; CULINAN et
al., 2001; LAINE et al., 2001) e diabetes mellitus (COLLIN et al., 1998) são
fatores de risco relatados na literatura como influenciadores da patogênese das
doenças periodontais. Além disso, a capacidade do indivíduo de lidar com o
estresse tem sido associada com o aumento da severidade da doença
periodontal e tem sido sugerida como um fator de risco (GENCO et al., 1999).
Diversas linhas de evidência científica tem enfatizado a influência de fatores
genéticos do hospedeiro na patogênese e no curso clínico da doença
periodontal em adultos (MICHALOWICZ, 1994; LOOS et al., 2005; YOSHIE et
al., 2007).
O mecanismo pelo qual se considera o tabagismo um importante
modificador da doença é relatado por pesquisadores através de sua ação na
vascularização, ao gerar constantes vasoconstricções e diminuir o suprimento
de oxigênio; no sistema imune humoral, ao reduzir a proliferação de células B,
T e imunoglobulinas; na inflamação, ao estimular a destruição tecidual e
aumentar a secreção de mediadores químicos; e, na quimiotaxia, alterando a
fagocitose pelos neutrófilos (BERGSTRÖM, 1989; KORNMAN et al., 1997;
CULINAN et al., 2001; LAINE et al., 2001; SIQUEIRA, 2011).
Atualmente, existem poucos estudos relacionando genes modificadores
de doença com a patogênese da periodontite. Logo, as investigações têm se
concentrado na identificação de polimorfismos genéticos envolvidos em
diferentes aspectos da resposta do hospedeiro e na sua capacidade de gerar
um comprometimento imunológico (LOOS et al., 2010).
Polimorfismo Genético
Cluster of Differentiation 14 (CD14)
O CD14 é uma proteína descrita como o maior receptor de endotoxina e
atuante no sistema imune inato durante o reconhecimento de
lipopolissacarídeos (LPS), um elemento constitutivo da membrana externa da
parede celular de bactérias Gram-negativas. Essa ligação permite o início da
19
resposta imune frente à invasão bacteriana. Essa proteína é expressa,
primeiramente, na superfície de monócitos, macrófagos e neutrófilos, podendo
ser também expresso na superfície de células mielóides, e, em números
reduzidos nos linfócitos B, basófilos e células mamárias. O seu papel na
resposta do hospedeiro é constatado durante a sua participação na fagocitose
de bactérias Gram-negativas, na reabsorção óssea e na interação dos
monócitos com as células endoteliais. Além do mais, mudanças na expressão
do CD14 e dos seus níveis plasmáticos têm sido associadas ao
desenvolvimento de lesões periradiculares (GRUNWALD et al., 1996; ANTAL-
SZALMÁS, 2000; HOLLA et al., 2002; DE SÁ et al., 2007; SIQUEIRA, 2011).
No entanto, o CD14 não consegue se ligar diretamente ao LPS. Uma
molécula chamada proteína ligante de LPS (LBP) necessita primeiro se ligar ao
LPS (YAMAZAKI et al., 1992). O complexo formado pelo LPS-LPB permite a
sua interação com o CD14 e, assim, o complexo receptor-ligante é
internalizado. Todo este processo é responsável por transferir o LPS para o
receptor tipo toll-4 (TLR4). Os receptores TLR têm sido identificados como
sensores primários de infecções microbianas e permitem avanços significativos
na compreensão dos mecanismos envolvidos na imunidade inata e adquirida
(POLTORAK et al., 1998; AKIRA et al., 2001). A ativação de receptores TLR4
pode desencadear diversas vias de sinalização no interior das células de
defesa. Uma das principais vias ativadas pelo LPS é a via do Fator de
transcrição Nuclear β (NFKβ) que, ao se translocar para o núcleo, promove a
transcrição de diversos genes que participam de processos fisiológicos
caracterizados pelos processos inflamatórios e imunes (RAETZ & WHITFIELD,
2002; YOSHIE et al., 2007; SIQUEIRA, 2011).
WANG et al. (2003) destacaram que os TLRs medeiam a sinalização
intracelular, a resposta antimicrobiana, a identificação de patógenos e exercem
um papel central na imunidade inata. TLR2 e TLR4, ambos com o co-receptor
para CD-14, estão envolvidos na identificação de patógenos padrões Gram-
positivos e Gram-negativos, formando um grupo de interesse para a
abordagem genética. A ligação desses receptores resulta na ativação de NFKβ,
seguido pela transcrição de diversas citocinas genéticas pró-inflamatórias,
como por exemplo, TNF-α, IL-1α e IL-1β, nas quais codificam proteínas que
têm sido associadas com periodontites. Logo, a expressão de CD14, TLR4 e
20
TLR2 nos tecidos periodontais suportam a importância desses receptores na
patogênese das lesões perirradiculares (JAMES et al., 2007).
HUBACEK et al. (1999) buscaram a identificação do polimorfismo do
CD14 e examinaram o quanto este marcador genético influência na expressão
do CD14 nos monócitos de pacientes com predisposição ao infarto do
miocárdio. Os resultados moleculares revelaram que a região promotora do
polimorfismo do CD14 (-206 C/T) exibiu aumento da transcrição do gene para o
CD14. Indivíduos portadores do genótipo T/T demonstraram níveis
significativamente aumentados do CD14 em monócitos, quando comparados
com os portadores do genótipo C/C e C/T. Frente aos resultados, estes autores
concluíram que além dos fatores de risco bem estabelecidos, uma reação
geneticamente determinada de monócitos/macrófagos a estímulos infecciosos
podem desempenhar um papel importante no processo da aterosclerose.
LAINE et al. (2005) realizaram um estudo com o intuito de avaliar a
influência de genes polimórficos do CD14 e TLR4 em pacientes adultos e com
periodontite. No mesmo, foi realizada a coleta do material genético de 100
pacientes portadores de periodontite e 99 pacientes saudáveis. O polimorfismo
genético foi analisado com auxílio da Reação em Cadeia Polimerase (PCR) e
os resultados permitiram que os autores afirmassem que o genótipo do CD14
(- 206 T/T) contribuiu para a susceptibilidade da periodontite em caucasianos.
Diversos autores têm reconhecido que a produção de medidores
químicos e que a expressão do gene CD14 em células receptoras variam
amplamente entre os indivíduos. Essas diferenças entre os indivíduos podem
ser explicadas, parcialmente, pela presença do polimorfismo genético em
muitos genes (DI GIVIONE et al., 1992; MC DOWELL et al., 1995; TURNER et
al., 1997; YAMAZAKI et al., 2003). Formas variantes do material genético
podem resultar numa expressão alterada dos genes ou em mudanças
funcionais nas moléculas codificadas. E assim, tornando os indivíduos com
aberrações genotípicas mais susceptíveis a adquirirem uma doença ou o
aumento na severidade da mesma (DE SÁ et al., 2007).
O mesmo fato pode ser verificado com o CD14. O gene para o receptor
do CD14 tem sido localizado no cromossomo 5 (região 5q23-21) (ANTAL-
SZALMÁS, 2000; HOLLA et al., 2002). Na região promotora, o gene polimórfico
está presente através da transição da base nucleotídea C-T identificada na
21
posição -159 (HOLLA et al., 2002; TERVONEN et al., 2007). Logo, a alteração
genética supracitada pode exercer forte influência na expressão desta proteína
nos monócitos, neutrófilos e macrófagos (HOLLA et al., 2002; TERVONEN et
al., 2007).
1.1.3. Aplicação de métodos moleculares
Antes do advento dos métodos moleculares, o método de cultura tinha
significativa preferência para a análise da microbiota endodôntica. Os métodos
de cultura permitem a análise de uma gama de informações sobre a etiologia
da lesão perirradicular, composição da microbiota em diferentes condições
clínicas, efeitos terapêuticos na eliminação da microbiota, suscetibilidade dos
micro-organismos endodônticos aos antibióticos, dentre outras (SIQUEIRA &
RÔÇAS, 2004). Estudos que utilizam cultivo apresentam limitações que
dificultam uma análise completa da microbiota endodôntica. A identificação de
micro-organismos não cultiváveis, através de métodos moleculares tem
causado uma revolução no estudo da Microbiologia (SCHORK et al., 2000;
SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009).
O método da PCR representa um tipo de método molecular. Este
método possibilita identificar qualquer gene de diferentes organismos, o que
torna esta técnica a mais importante nos projetos de sequenciamento do
genoma. Um grande avanço tecnológico no diagnóstico clínico tem sido
oriundo da aplicação da PCR para a detecção de micro-organismos
patogênicos. Este método é caracterizado pela replicação in vitro do ácido
desoxirribonucleico (DNA) através de repetitivos ciclos de desnaturação do
material genético, anelamento e extensão de novas cadeias de DNA. A análise
da PCR é realizada utilizando-se gel de agarose e visualizado através de um
transiluminador de ultravioleta. Geralmente um padrão de peso molecular é
adicionado em uma das fileiras do gel sendo possível assim avaliar o tamanho
do fragmento amplificado (PEAKE, 1989; LEE & TIRNADY, 2003; SIQUEIRA &
RÔÇAS, 2004).
Variações da tecnologia da PCR têm sido desenvolvidas. As mais
utilizadas são: PCR espécie-específica, PCR multiplex, nested PCR, reverse
22
transcriptase-PCR, PCR quantitativa em tempo real, PCR genotipagem por
PCR e broad-range PCR (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004).
23
2- JUSTIFICATIVA
Modificadores de doença podem influenciar a resposta do hospedeiro ao
tratamento endodôntico. Não há estudos avaliando a associação do
polimorfismo do gene do CD14 com a resposta pós-tratamento endodôntico.
Estudos desta natureza têm o potencial de contribuir para o entendimento da
patogênese das lesões perirradiculares.
24
3- HIPÓTESE
O polimorfismo genético do CD14 tem influência na resposta do
hospedeiro durante o tratamento das lesões perirradiculares, tendo em vista
resultados observados na literatura referente à doença periodontal.
25
4- PROPOSIÇÃO
O objetivo deste estudo retrospectivo foi avaliar se há associação entre
os diferentes genótipos e alelos do gene do CD14 com a resposta ao
tratamento endodôntico.
26
5- MATERIAIS E MÉTODOS
Os critérios de inclusão e a coleta das amostras deste estudo estão de
acordo com a metodologia aplicada por PROVENZANO (2008) e GUILHERME
et al. (2011) e aprovada pelo Comitê de Ética desta Universidade (Anexo 1). Os
pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo
2).
5.1- Seleção de pacientes
Os pacientes que participaram deste estudo apresentaram o tratamento
endodôntico concluído por especialistas ou por alunos de especialização, há
pelo menos um ano antes da coleta da amostra em uma das seguintes
instituições: Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá
(UNESA) – RJ, Odontoclínica Central do Exército (OCEX) e Hospital Central da
Aeronáutica (HCA). Foram incluídas, neste estudo, alíquotas das amostras da
saliva de 67 pacientes de casos retrospectivos, coletados em estudos prévios
(PROVENZANO, 2008; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009; GUILHERME et al., 2011).
Com a finalidade de aumentar o número de casos e permitir análise estatística
mais robusta, foram também adicionados 16 pacientes oriundos da
Odontoclínica Central da Marinha (OCM). Todas as amostras coletadas e
analisadas seguiram estritamente os critérios de inclusão quanto à qualidade
do tratamento endodôntico e da restauração coronária.
5.1.2- Critérios de Inclusão
Foi preenchido um Questionário de Acompanhamento Clínico
Endodôntico (Anexo 5), o qual contém aspectos gerais de saúde e de hábitos
adquiridos dos pacientes. Os critérios de inclusão e de classificação do
tratamento endodôntico propostos para este estudo foram preconizados por
SIQUEIRA et al. (2009) como descritos a seguir:
Cada indivíduo apresentou somente um dente com canal tratado, ou
mais de um dente tratado, desde que revelasse a mesma condição
27
perirradicular na radiografia de acompanhamento do tratamento
endodôntico (reparo, em reparo ou não reparado).
Todos os indivíduos apresentaram o diagnóstico inicial de necrose
pulpar com lesão perirradicular associada na ocasião do tratamento
endodôntico.
Foram incluídos neste estudo, somente pacientes com tratamento
realizado há mais de um ano.
Os dentes incluídos neste estudo, por sua vez, deveriam apresentar
obturação endodôntica adequada. Foi considerado tratamento
endodôntico adequado quando todos os canais radiculares estavam
obturados, sem espaço vazio (obturação homogênea) e com limite
apical da obturação de 0 a 2 mm aquém do ápice radiográfico. Foi
considerado tratamento endodôntico inadequado quando os canais
radiculares estavam obturados a mais de 2 mm aquém do ápice
radiográfico, apresentaram sobreobturação grosseira, obturação com
espaços vazios, densidade radiográfica inadequada ou dentes
multirradiculares com algum canal radicular não tratado.
Foram incluídos apenas dentes com restauração coronária adequada. A
restauração coronária foi considerada adequada quando não havia lesão
cariosa, estava clínica e radiograficamente intacta e com boa adaptação
marginal. Foi considerada inadequada quando a restauração
apresentava falta de selamento marginal ou cárie recorrente.
5.2- Exame Clínico e Radiográfico
A condição perirradicular dos dentes em questão, bem como a condição
do tratamento endodôntico e da restauração coronária, foram avaliados por
exames clínicos e radiográficos.
Para a realização do exame clínico, foram empregados a sonda
exploradora dupla, o espelho bucal e a pinça clínica. No exame radiográfico,
foram realizadas radiografias periapicais com o auxílio de posicionadores
radiográficos (Maquira, Maringá, PR). As radiografias foram avaliadas por dois
examinadores previamente calibrados com um kit de 100 radiografias. Os
28
casos foram classificados de acordo com a metodologia proposta como
sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico.
5.3- Classificação do resultado do tratamento endodôntico
O resultado do tratamento endodôntico foi classificado de acordo com
evidências clínicas e radiográficas. Foi utilizada uma radiografia do término do
tratamento e uma radiografia de acompanhamento do dente tratado para
categorizar o resultado do tratamento endodôntico de acordo com os critérios
de STRINDBERG (1956):
a) Reparo: contorno e espessura do espaço do ligamento periodontal normais,
ou o contorno do espaço do ligamento periodontal espessado, principalmente
em torno de excesso apical da obturação (se presente). Nos casos de
sobreobturação, o osso circunvizinho ao material extravasado deverá
apresentar espessura normal.
b) Em reparo: radioluscência perirradicular claramente em processo de redução
de tamanho.
c) Não reparo: radioluscência perirradicular inalterada ou aumentada na
radiografia de acompanhamento clínico, quando comparada com a radiografia
final ao término do tratamento endodôntico. Também foram categorizados
como não reparados, os casos com mais de quatro anos em que a
radioluscência perirradicular tivesse diminuído, mas não desaparecido
totalmente.
Em dentes com mais de um canal radicular, a referência do resultado do
tratamento foi o canal que apresentou o resultado mais desfavorável.
Desta forma, após o exame clínico e radiográfico, foram julgados como
sucesso os casos em que ocorreu reparo total ou regressão evidente do
diâmetro inicial da lesão perirradicular, quando comparado ao exame
radiográfico inicial à época do tratamento endodôntico. Além disso,
clinicamente não havia presença de dor, tumefação, fístula e mobilidade.
Por outro lado, nos casos tidos como fracasso, houve a presença de dor
espontânea, sensibilidade dolorosa à percussão ou à palpação da região
apical, desconforto à mastigação, presença de tumefação, fístula e/ou o
diâmetro inicial da lesão perirradicular permaneceu igual ou aumentou, quando
29
comparado ao diâmetro à época do tratamento endodôntico. Os casos que
apresentaram lesões perirradiculares com o tamanho reduzido, ou seja, sem a
remissão total da lesão após quatro anos, também foram considerados como
fracasso. Todos os casos de fracasso foram agrupados em lesão perirradicular
≤ 5 mm e lesão > que 5 mm.
5.4- Coleta da Amostra
Os procedimentos de coleta das amostras clínicas foram realizados de
acordo com estudos anteriores (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009; GUILHERME et
al., 2011). Cada indivíduo realizou um bochecho com 10 ml de solução salina
estéril (NaCl) a 0,9% por 1 min. Após o bochecho, o paciente depositou a
saliva em um coletor universal estéril. As amostras foram armazenadas em
temperatura de -20°C até a etapa da extração do DNA.
Cada amostra foi identificada com o nome do paciente e instituição de
origem através de um número sequencial e seus dados serão organizados
numa planilha de Excel 2007 (Microsoft Brasil, São Paulo, SP).
5.5- Extração do DNA
As amostras foram descongeladas por 10 min a uma temperatura de
37°C; então, as células epiteliais orais foram centrifugadas (Eppendorf 5415 C,
Hamburg, Alemanha) em 300 g por 10 min. O pellet foi lavado duas vezes: uma
por centrifugação em solução salina a 0,9%, ressuspenso em 100 µL com 50
mM de hidróxido de sódio (NaOH) e fervido por 10 min. As amostras de saliva
foram neutralizadas com 14 µL de tampão a 1 mol/L Tris (pH 7,5) e
centrifugadas em 14.000 g por 3 min. Os sobrenadantes foram coletados e
armazenados a 4°C até análise posterior (LAINE et al., 2000).
5.6- Análise do polimorfismo genético
O polimorfismo genético foi avaliado pela PCR. A sequência de primers
da PCR com os seus respectivos tamanhos de amplicons é apresentada na
Tabela 1. A PCR foi realizada em um termociclador de DNA (Mastercycler
30
Personal Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). A solução para a reação de PCR
consistiu em 2 µL do DNA extraído das amostras, 5 µL de tampão de PCR 10X
(Fermentas, Burlington, Canada), 1 µM de cada primer, 1 U Taq DNA
polimerase (Fermentas), 25 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,2 mM de
cada de cada desoxirribonucleosídeo trifosfatado (Biotools, Madri, Espanha). A
reação foi sujeita a 40 ciclos de amplificação utilizando-se o seguinte perfil de
temperatura: desnaturação a 95°C por 30 s, anelamento dos primers a 59°C
por 30 s e extensão do produto da PCR a 72°C por 1 min. Em seguida, os
produtos da PCR foram analisados em gel de agarose a 2%. Os produtos
foram então digeridos com a enzima de restrição HaeII (New England Labs,
Ipswich, MA, EUA) a 37°C/3h. Os fragmentos gerados foram visualizados em
eletroforese em gel de agarose a 4%. A digestão por Haell gera dois
fragmentos (83 e 24bp) para o alelo C e um fragmento para o alelo T (107bp).
Tabela 1. Sequência de primers, enzima de restrição e genótipos para o CD14
Gene Primer Enzima de
Restrição
Genótipos
(Tamanho dos
Amplicons)
CD14
- 260
(C/T)
5’-TCACCTCCCCACCTCTCTT-3’
5’-CCTGCAGAATCCTTCCTGTT-3’
(LAINE et al.,2005)
HaeIII
(37ºC/3h)
TT= 107 bp
CT=24 +83 +
107bp
CC=24+83bp
5.7- Controle da PCR
Para verificar a disponibilidade de DNA humano nas amostras para
análise, alíquotas de 5 µL de DNA extraído de amostras clínicas foram
submetidas a PCR através da aplicação de primers direcionados ao receptor
da célula T do gene Vα22 (V22f:5’-GAT TCA GTG ACC CAG ATG GAA GGG-
3’ e V22r:5’-AGC ACA GAA GTA CAC CGC TGA GTC-3’), o qual amplifica um
fragmento de 270bp (VAN DEN BERG et al., 2001). A amplificação da PCR foi
31
realizada em 50 µL de uma reação de mistura contendo 5 µL de tampão 10X
(Fermentas), 3 mM MgCl2, e 0,2 mM de cada deoxirribonucleosídeo
trifosfatado (Biotools). As condições da PCR foram 94ºC/5 min seguidos de 45
ciclos de 94ºC/45 s, 60°C/30 s, e 72°C/1,5 min, e uma etapa final de extensão
de 72°C/10 min.
5.9- Análise Estatística
Toda a análise estatística empregada no presente estudo foi realizada
utilizando-se o programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences, versão 17.0). Na primeira etapa, foi realizada uma análise descritiva
incluindo a variável tratamento endodôntico (fracasso ou sucesso) (variável
dependente, variável desfecho ou variável de interesse), além das covariáveis
(variáveis independentes ou variáveis explicativas) estudadas, tais como
gênero, raça, tabagismo e polimorfismo genético do CD14. Os dados
descritivos foram obtidos através do cálculo da frequência e percentagem das
categorias dentro de cada variável. Na segunda etapa da análise dos dados, foi
aplicado o teste Qui-quadrado (ou teste Exato de Fisher) para cada covariável
em relação ao tratamento endodôntico, com a finalidade de verificar a
existência de associação significativa (p<0,05).
Na etapa seguinte, um modelo logístico binário não ajustado entre o
resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis foi aplicado com o
objetivo de medir a associação para o polimorfismo genético do CD14, além
das outras covariáveis, através do cálculo da razão de chances (RC) (Odds
Ratio – OR) e do intervalo de confiança (IC 95%).
A última etapa da análise estatística utilizou um modelo logístico binário
ajustado multivariado para estimar a influência do polimorfismo genético do
CD14 no resultado do tratamento endodôntico, ajustado para as covariávies
gênero, raça e tabagismo. Para esta análise múltipla, só foram utilizadas as
variáveis que apresentaram p<0,20 na análise não ajustada. O método
utilizado para inserir as variáveis no modelo foi o backward stepwise, o qual
envolve inicialmente todas as variáveis escolhidas. Posteriormente, estas vão
sendo gradativamente excluídas até formar o modelo final.
32
6- RESULTADOS
Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada entre os
genótipos CC, CT e TT e os alelos C e T polimórficos (p>0.05) no
sucesso/fracasso do tratamento endodôntico. A Tabela 2 apresenta as
características descritivas dos 83 pacientes incluídos no estudo. A maioria era
branca (69,9%), não tabagista (82,7%) e pertencia ao sexo feminino (57,8%).
Os pacientes portadores de dentes definidos como fracasso do tratamento
endodôntico representavam 49,4%. No que diz respeito ao polimorfismo do
CD14, o genótipo CT (42,2%) e o alelo C (53,6%) foram detectados com maior
frequência.
O grupo de pacientes portadores de dentes definidos como fracasso do
tratamento endodôntico foi comparado com aquele portador de dentes
considerado sucesso, para todas as variáveis estudadas. Diferença
statisticamente significante foi observada somente para as variáveis gênero
(p=0,047, teste Qui-quadrado) e tabagismo (p=0,020, teste exato de Fisher)
(Tabela 3).
Os resultados da regressão logística binária não ajustada (modelo
simples) e ajustada (modelo multivariado) para estimar a influência do
resultado do tratamento endodôntico estão apresentados com as covariáveis
na Tabela 4. No modelo logístico binário não ajustado, as covariáveis
polimorfismo do CD14 e raça não demonstraram associação significativa com o
resultado do tratamento endodôntico, enquanto para gênero (p=0,038) e
tabagismo (p=0,024) foi observada associação direta significativa. Com relação
ao gênero, foi demonstrado que a chance de fracasso do tratamento
endodôntico é quase três vezes maior nos homens quando comparado com as
mulheres. No caso do tabagismo, a chance de fracasso é quatro vezes maior
em pacientes fumantes do que em não fumantes.
33
Tabela 2. Análise descritiva dos 83 pacientes de acordo com as variáveis
estudadas
Variáveis N %
Gênero
Feminino 48 57,8
Masculino 35 42,2
Raça
Pardo 12 14.4
Branco 58 69,9
Negro 13 15,7
Tabagismo
Não 67 82,7
Sim 14 17,3
Tratamento endodôntico
Sucesso 42 50,6
Fracasso 41 49,4
Polimorfismo genético do CD14
Genótipo
CC 27 32,5
CT 35 42,2
TT 21 24,3
Alelos
C 89 53,6
T 77 46,4
34
Tabela 3. Análise bivariada entre tratamento endodôntico e as covariáveis
estudadas
Covariáveis Tratamento Endodôntico P valor*
Sucesso Fracasso
N(%) N(%)
Gênero¶
0,047
Feminino 29 (60.4) 19 (39,6)
Masculino 13 (37,1) 22 (62,9)
Raça* 0,237
Pardo 4 (33,3) 8 (66,7)
Branco 33 (56,9) 25 (43,1)
Negro 5 (38,5) 8 (61,5)
Tabagismo* 0,020
Não 38 (56,7) 29 (43,3)
Sim 3(21,4) 11 (78,6)
Polimorfismo genético do
CD14
Genótipo¶ 0,308
CC 17 (63,0) 10 (37,0)
CT 16 (45,7) 19 (54,3)
TT 9 (42,9) 12 (57,1)
Alelos¶ 0,909
C 50 (56,2) 39 (43,8)
T
34 (44,2) 43 (55,8)
¶ Teste Qui-quadrado,
*Teste exato de Fisher;
35
No modelo logístico ajustado, foram incluídas todas as covariáveis
estudadas (gênero, raça, tabagismo e polimorfismo genético do CD14), pois
apresentaram p<0,20 no modelo não ajustado. O método backward stepwise
exclui as variáveis gradativamente até chegar ao modelo final. As covariáveis
polimorfismo genético do CD14 e raça foram excluídas no primeiro e segundo
passos, respectivamente. A modelagem se encerrou no terceiro passo e
manteve a associação significativa com o resultado do tratamento endodôntico
somente para as covariáveis gênero (p=0,048) e tabagismo (p=0,030),
demonstrando resultados semelhantes para os valores das RC observados no
modelo não ajustado.
Tabela 4. Modelo logístico não ajustado e ajustado para estimar a associação
entre o resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis estudadas
Covariáveis RC não ajustada
(IC 95%)
P
valor*
RC ajustada
(IC 95%)
P valor*
Gênero
Feminino 1 1
Masculino 2,58 (1,05 – 6,34) 0,038 2,6 (1,01 – 6,70) 0,048
Raça
Pardo 1
Branco 0,38 (0,10 – 1,40) 0,146
Negro 0,80 (0,15 – 4,12) 0,790
Tabagismo
Não 1
Sim 4,8 (1,23 – 18,81) 0,024 4,66 (1,16 – 18,75) 0,030
Genótipo
CD14
CC 0,44 (0,14 – 1,41) 0,169
CT 0,89 (0,30 – 2,65) 0,835
TT 1
36
7- DISCUSSÃO
O presente estudo buscou verificar se a susceptibilidade ao fracasso da
terapia endodôntica está ou não associada ao polimorfismo do gene CD14
(-260 T/T). Tal hipótese parte do pressuposto que o fator microbiano é o
principal agente etiológico e que os fatores ambientais e genéticos podem
determinar a predisposição, resistência e severidade de um processo
inflamatório (WOLFF et al., 1994; TURNER et al., 1997; LOSS et al., 2005;
SIQUEIRA, 2011).
A escassez de estudos avaliando a influência do polimorfismo genético
do CD14 no desenvolvimento de lesão perirradicular ou no prognóstico do
tratamento endodôntico prevalece na literatura científica (SIQUEIRA, 2011). No
entanto, as evidências científicas relatadas sugerem que a expressão do
receptor do CD14 pode estar associada com a doença periodontal (HUBACEK
et al., 1999; LAINE et al., 2005; JAMES et al., 2007).
Diante dos aspectos mencionados, as diversidades encontradas nas
frequências dos genótipos TT, CT e CC podem estar fortemente relacionadas
com o fator geográfico (SIQUEIRA et al., 2009). HOLLA et al. (2002) avaliaram
o polimorfismo genético do CD14 em uma população caucasiana e relataram
uma possível associação com a severidade da periodontite marginal. LAINE et
al. (2005) avaliaram a frequência do gene polimórfico CD14 em pacientes
holandeses, adultos e com periodontite severa. Frente aos resultados, os
autores constataram forte associação do polimorfismo na doença periodontal.
YAMAZAKI et al. (2003) encontraram uma significante diferença na distribuição
do genótipo entre os pacientes japoneses com menos de 35 anos quando
comparados com pacientes maiores de 35 anos. Assim, os autores sugeriram
que o polimorfismo pode estar relacionado com a patogenicidade da doença na
fase precoce. A variabilidade de etnias e raças torna-se um grande obstáculo
para os estudos comparativos e obtenção de populações homogêneas. Fato
que não foi observado neste estudo, onde apesar da variabilidade racial
presente no local de coleta das amostras, não foi constatada influência
significativa (p=0,237) da raça com a presença ou ausência de lesão
perirradicular, ou seja, no sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico.
37
DE SÁ et al. (2007) não encontraram associação de genótipos e alelos
do CD14 com o desenvolvimento de quadros sintomáticos. Os autores
ressaltaram não haver indícios que poderiam propor uma associação de dor
com as covariáveis raça, gênero e a idade.
LOOS et al. (2005) mencionaram que o alelo-R para o CD14 está
localizado na região promotora (-206) e que o mesmo está vinculado com o
aumento da atividade do gene. Logo, indivíduos homozigotos para o alelo-R
apresentam aumento dos níveis séricos do CD14 na sua forma solúvel e
também na parede dos macrófagos. HOLLA et al. (2002) constataram que nos
pacientes com periodontite marginal severa, indivíduos homozigotos para o
alelo-R do gene do CD14 (-159) apresentavam prevalência de 47,5% e os que
apresentavam periodontite moderada 38,9%. Apesar dos resultados não terem
apresentado diferença estatística, os autores detectaram uma tendência ao
aumento da frequência do alelo-R nos pacientes com a manifestação severa da
doença. Tais resultados corroboram com o presente estudo, que não encontrou
diferença entre as variáveis em casos de fracasso do tratamento endodôntico e
a prevalência do alelo raro (T) (p=0,909).
Neste estudo, nos casos de sucesso após a terapia endodôntica, a
prevalência do genótipo TT foi de 42,9%, e nos que fracassaram a prevalência
foi de 57,1%. Quando os alelos foram avaliados em casos de fracasso do
tratamento endodôntico, a frequência do alelo-R (T) foi de 55,8% e do alelo-N
(C) foi de 44,2%. Apesar dos nossos resultados sugerirem que há um aumento
dos níveis do gene polimórfico (TT) nos casos de fracasso do tratamento
endodôntico, os resultados não foram estatisticamente significativos para a
associação do polimorfismo do CD14 com o sucesso/fracasso do tratamento
endodôntico na avaliação genotípica (p=0,308) e nos alelos avaliados
(p=0,909).
A associação dos níveis elevados do CD14 com a doença periodontal
não é consensual entre os pesquisadores (HOLLA et al., 2002; FOLWACZNY
et al., 2004; LAINE et al., 2005). Estudos comparativos relacionando a
frequência de citocinas e receptores moleculares, como por exemplo para o
CD14 em pacientes com a doença, têm sido realizados (HUBACEK et al.,
1999; LAINE et al., 2005; DE SÁ et al., 2007). Os resultados obtidos nestes
estudos demonstram ausência de diferença estatisticamente significativas e
38
assim condizentes com os resultados observados em nosso estudo (p>0.05).
Diante dos aspectos discutidos, permanece a necessidade de dados adicionais
para que o polimorfismo genético do CD14 possa ser confirmado ou não como
modificador de doença (HOLLA et al., 2002; FOLWACZNY et al., 2004;
TREVONEN et al., 2007).
O polimorfismo genético tem apresentado forte influência em patologias
de caráter sistêmico, visto que também podem interferir na resposta
imunológica e, consequentemente, na patogênese da doença. HUBACEK et al.
(1999) avaliaram a influência do polimorfismo do CD14 como um fator de risco
para o infarto do miocárdio e constataram uma alta frequência do alelo T (-260)
quando comparados com pacientes saudáveis. GAZOULI et al. (2005) reforçam
a questão da interferência do polimorfismo nas doenças sistêmicas. Os autores
buscaram associação deste polimorfismo com a doença de Crohn e
constataram que as frequências do alelo T (50,4%) e do genótipo TT (28,3%)
foram elevadas em pacientes portadores da doença quando comparados com
pacientes saudáveis. Portanto, não há consenso neste aspecto. MOHAMED
ALIZADEH et al. (2006) estudaram o polimorfismo do CD14 em relação à
hepatite B e os resultados não revelaram associação do gene polimórfico TT
(38,1%), pelo contrário, foram encontrados maiores frequências do genótipo
CC (61,9%), que é considerado um genótipo protetor. PASQUALINI et al.
(2012), ao avaliarem a associação entre saúde oral, lesão perirradicular,
polimorfismo do CD14 e doença cardíaca em pacientes de meia idade,
constataram uma relação positiva entre a lesão perirradicular, a periodontite
marginal crônica e a doenças cardíacas. No entanto, quando a relação era feita
com o polimorfismo de gene CD14, os resultados não foram estatisticamente
significativos.
Frente ao exposto, parece válido sugerir que os fatores sistêmicos
influenciam no comportamento da doença. Apesar desses fatores não terem
sido incluídos nas variáveis do presente estudo, torna-se relevante à correlação
dos fatores sistêmicos no prognóstico do tratamento endodôntico.
Para a obtenção de amostras do DNA no presente estudo, o método
aplicado já foi descrito na literatura (LAINE et al., 2000; DE SÁ et al., 2007;
SIQUEIRA et al., 2009; GUILHERME et al., 2011). Sendo caracterizado pela
coleta da saliva do paciente, este procedimento demonstra uma alternativa
39
menos invasiva e consideravelmente econômica (LAINE et al., 2005; DE SÁ et
al., 2007; SIQUEIRA et al., 2009). No entanto, alternativas de obtenção do
material genético como: a coleta de fluido gengival (HOLLA et al., 2002) e de
sangue (HUBACEK et al., 1999; PASQUALINI et al., 2012) são amplamente
utilizadas.
Em busca de adequada padronização dos pacientes, os estudos que
avaliam a influência dos polimorfismos em genes relacionados à inflamação na
susceptibilidade ou severidade das lesões perirradiculares relatam a dificuldade
de obtenção de casos dentro dos critérios estabelecidos (PROVENZANO,
2008; SIQUEIRA et al., 2009; GUILHERME et al., 2011). Dificuldade também
encontrada no presente estudo, o que justifica o tamanho amostral
relativamente baixo.
Dentre os fatores que justificam tal ocorrência, seriam: as amostras
serem obtidas por indivíduo e não por dente e a presença de condições
perirradiculares opostas no mesmo indivíduo (um tratamento adequado
associado à saúde e um tratamento com doença). Esses foram excluídos do
estudo. Os fatores de inclusão também contribuíram para a obtenção reduzida
das amostras. A qualidade da obturação endodôntica, selamento coronário e
as dificuldades na obtenção de radiografias no período de realização do
tratamento, de acordo com os autores, podem afetar significativamente a
aquisição de amostras padronizadas (HOLLA et al., 2002; DE SÁ et al., 2007;
SIQUEIRA et al., 2009).
Os pacientes inseridos neste trabalho foram oriundos da mesma região
(Brasil) e se enquadravam em características socioeconômicas semelhantes. A
seleção consistiu na coleta de dados pessoais dos pacientes como: sexo,
idade, hábitos adquiridos, raça, doenças sistêmicas e aspecto clínico do
elemento em análise. Este estudo demonstrou que dentre todos os pacientes
tabagistas 78,6% estavam diretamente associados com o fracasso da terapia
endodôntica, estabelecendo assim uma diferença estatisticamente significativa
e a constatação da influência do tabagismo no prognóstico do tratamento.
Um grande obstáculo encontrado na literatura tem sido os estudos que
investigam a interferência dos fatores genéticos no prognóstico do tratamento
sem considerar outros aspectos como o tabagismo e o sexo. Indivíduos
fumantes parecem ter um risco aumentado para o desenvolvimento de doença
40
periodontal (LAINE et al., 2001). Isso indica que a interação gene-tabagismo é
fortemente aceita na determinação da susceptibilidade para a doença
(BERGSTRӦM, 1989; KORNMAN et al., 1997; CULLINAN et al., 2001).
Similarmente, o presente estudo constatou que, no caso do tabagismo, a
chance de fracasso é aproximadamente quatro vezes maior em pacientes
fumantes do que em não fumantes. Isto está de acordo com estudos prévios
(KIRKEVANG & WENZEL, 2003; SIQUEIRA et al., 2009).
O presente estudo encontrou associação positiva entre o sexo masculino
e a presença de lesão perirradicular em dentes com canal tratado. Não há
razões aparentes para tais resultados. O sexo do paciente não tem sido um
fator relacionado com o fracasso do tratamento (FRIEDMAN, 2009). Em
doença periodontal, desconsiderando a higiene oral entre os gêneros, os
autores ressaltam que fatores fisiológicos (p.ex., níveis de estrogênio) podem
contribuir para o menor risco da doença em mulheres do que em homens
(FOLWACZNY et al., 2004).
Fatores modificadores da doença não são agentes etiológicos, mas
podem amplificar alguns mecanismos patológicos e, consequentemente, gerar
uma resposta imunológica alterada. Além do CD14, outros mediadores
químicos têm sido analisados, como por exemplo, a IL-1, IL-6 (interleucina -6),
TLR-4, TNF –α (WANG et al., 2003; LOOS et al., 2005; YOSHIE et al., 2007).
Esses e tantos outros mediadores têm o potencial de servir como fatores de
risco para as lesões perirradiculares. HOLLA et al. (2002) estão entre os
primeiros autores que documentaram o polimorfismo do CD14 na periodontite
marginal. Em Endodontia, os estudos associando o polimorfismo do gene
CD14 com o sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico são escassos
(PASQUALINI et al., 2012). Logo, mais estudos devem ser realizados com uma
amostragem maior de pacientes e em diferentes populações, com o intuito de
gerar mais entendimento da patogênese das lesões perirradiculares.
41
8-CONCLUSÃO
Diante da metodologia empregada e dos resultados obtidos, destacamos
as seguintes conclusões:
1. Não foi constatada interferência significativa do polimorfismo do gene do
CD14 no sucesso/ fracasso do tratamento endodôntico;
2. Pacientes tabagistas demonstraram predisposição quatro vezes maior
para o fracasso da terapia quando comparados com pacientes não-
tabagistas;
3. Pacientes do sexo masculino apresentaram, estatisticamente, maior
predisposição para o insucesso quando comparados com o sexo
feminino.
42
9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Akira S, Takeda K, Kaisho T (2001). Toll-like receptors: critical proteins linking
innate and acquired immunity. Nat Immunol 2: 675-680.
Antal-Szalmás P (2000) Evaluation of CD14 in host defence. Eur J Clin Invest
30: 167-179.
Bergenholtz G, Lekholm U, Milthon GH, Ödesejö BE, Engström B (1979).
Retreatment of endodontic filings. Scand J Dent Res 87: 217-224.
Bergström J (1989). Cigarette smoking as risk factor in chronic periodontal
disease. Comunity Dent Oral Epidemiol 17: 245-247.
Chaves de Paz LE, Molander A, Dahlén G (2004). Gram-positive rods prevaling
in teeth with apical periodontitis undergoing root canal treatment. Int Endod J
37: 579-587.
Collin HL, Uusitupa M, Niskanen L, Kontturi-Närhi V, Markkanen H, Kosivisto
AM (1998). Periodontal findings in elderly patients with non-insulin dependent
diabetes melitus. J Periodontol 69: 962- 966.
Cullinan MP, Westerman MV, Hamlet SM, Palmer JE, Faddy MJ, Lang NP,
Seymour GJ (2001). A longitudinal study of interleukin-1 gene polymorphisms
and periodontal disease in a general adult population. J Clin Periodontol 28:
1137-1144.
Dahlén G, Bergenholtz G (1980). Endotoxic activity in teeth with necrotic pulps.
J Dent Res 59: 1033-1040.
De Sá AR, Moreira PR, Xavier GM, Sampaio I, Kalapothakis E, Dutra WO,
Gomez RS (2007). Associantion of CD14, IL1β, IL6, IL10 and TNFα functional
gene polymorphism with symptomatic dental abcesses. Int Endod J 40: 563-
572.
43
Di Giovine FS, Takhsh E, Blakemore AI, Duff GW (1992). Single base
polymorphism at -511 in the human interleukin-1 beta gene (IL1beta). Hum Mol
Genet 1: 450.
Folwaczny M, Glas J, Torok HP, Fricke K, Folwaczny C (2004). The CD14 -
159C-to-T promoter polymorphism in periodontal disease. J Clin Periodontol 31:
991-995.
Friedman S (2009). Prognosis in the treatment of teeth with endodontic
infections. In: Fouad AF. Endodontic microbiology. Ames, Iowa: Wiley-
Blackwell, 281-319.
Gazouli M, Mantzaris G, Kotsinas A, Zacharatos P, Papalambros E,
Archimandritis A, Ikonomopoulos J, Gorgoulis VG (2005). Association between
polymorphisms in the Toll-like receptor 4, CD14, and CARD15/NOD2 and
inflammatory bowel disease in the Greek population. World J Gastroenterol 11:
681-685.
Genco RJ, HO AW, Grossi SG, Dunford RG, Tedesco LA (1999). Relationship
of stress, distress and inadequate coping behaviors to periodontal disease. Clin
Exp Immunol 135: 330-335.
Graves DT, Cocharan D (2003). The contribuition of interleukin-1 and tumor
necrosis factor to periodontal tissue destruction. J Periodontol 74: 391-401.
Grunwald U, Fan X, Jack RS, Workalemahu G, Kallies A, Stelter F, Schütt C
(1996). Monocytes can phagocytose Gram-negative bacteria by a CD14-
dependent mechanism. J Immunol 157: 4119-4125.
Guilherme BP, Ferreira DC, Rôças IN, Provenzano JC, Santos KR, Siqueira JF
Jr (2011). Herpesvirus carriage in saliva and post-treatment apical periodontitis:
searching for association. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol and Endod 112:
678-683.
Happonen RP (1986). Periapical actinomycosis: a follow-up study of 16
surgically treated cases. Endod Dent Traumatol 2: 205-209.
44
Holla LI, Buckova D, Fassmann A, Halabala T, Vasku A, Vacha J (2002).
Promoter polymorphism in the CD 14 receptor gene and their potential
association with the severity of chronic periodontitis. J Med Gent 39: 844-848.
Hubacek JA, Rothe G, Pit’ha J, Skodova Z, Poledene E, Schmitz G (1999).
C (-260) T polymorphism in the promoter of the CD14 monocyte receptor
gene as a risk factor for myocardial infarction. Circulation 99: 3218-3220.
Iwu C, MacFarlane TW, MacKenzie D, Stenhouse D (1990) The microbiology of
periapical granulomas. Oral Surg Oral Med and Oral Pathol 69: 502-505.
James JA, Poulton KV, Haworth SE, Payne D, MCKay IJ, Clarke FM, Hughes
FJ, Linden GJ (2007). Polymorphism of TLR4 but not CD14 are associated with
decreased risk of aggressive periodontitis. J Clin Periodontol 34: 111-117.
Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ (1965). The effects of surgical
exposures of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol 20: 340–349.
Kirkevang LL, Wenzel A (2003). Risk indicators for apical periodontitis.
Community Dent Oral Epidemiol 31: 59-67.
Kornman KS, Crane A, Wang HY, Di Giovine FS, Newman MG, Pirk FW,
Wilson TG Jr, Higginbottom FL, Duff GW (1997). The interleukin-1 genotype as
a severity factor in adult periodontal disease. J Clin Periodontol 71: 1315-1318.
Laine ML, Farre MA, Crusius JBA, Van Winkelhoff A-J, Pefia AS (2000). The
mouthwash: a non-invasive sampling method to study cytokine gene
polymorphisms. J Periodontol 71: 1315-1318.
Laine ML, Farre MA, Gonzalez G, van Dijk LJ, Ham AJ, Winkel EG, Crusius
JBA, Vandenbroucke JP, van Winkelhoff AJ, Peña AS (2001). Polymorphism of
the interleukin-1 gene family, oral microbial pathogens, and smoking in adult
periodontitis. J Dent Res 80: 1695-1699.
45
Laine ML, Morré SA, Murillo LS, van Winkelhoff AJ, Peña AS (2005). CD14 and
TLR4 gene polymorphisms in adult periodontitis. J Dent Res 84: 1042-1046.
Lee HC, Tirnady F (2003). Blood Evidence. How DNA is revolutionizing the way
we solve crimes. Cambridge, MA: Perseus Publishing.
Loos BG, John RP, Laine ML (2005). Identification of genetic risk factors for
periodontitis and possible mechanisms of action. J Clin Periodontol 32: 159-
179.
Loos BG, Velden UVD, Laine ML. In: Lindhe J (2010). Tratado de Periodontia
Clínica e Implantodontia Oral. 5ª. ed [S.l.]: Guanabara Koogan, 312-326.
Mc Dowell TL, Symons JA, Ploski R, Forre O, Duff GW (1995). A genetic
association between juvenile rheumetoid arthritis and a novel interleukin-1
alpha polymorphism. Arthritis and Rheum 38: 221-228.
Michalowicz BS (1994). Genetic and heritable risck factors in periodontal
disease. J Periodontol 65: 479-488.
Mohammad Alizadeh AH, Ranjbar M, Hajilooi M, Fallahian F (2006).
Association of promoter polymorphism of the CD14 C (-159) T endotoxin
receptor gene with chronic hepatitis B. World J Gastroenterol 12: 5717-5720.
Molander A, Reit C, Dahlén G, Kvist T (1998). Microbiological status of root-
filled teeth with apical periodontitis. Int Endod J 31: 1–7.
Möller AJ, Fabricius L, Dahlén G, Öhman AE, Heyden G (1981). Influence on
periapical tissues of indigenous oral bacteria and necrotic pulp tissue. An
experimental study in monkeys. Scand J Dent Res 89: 475-484.
Nair PNR (1987). Light and electron microscopic studies of root canal flora and
periapical lesions. J Endod 13: 29–39.
Nair PNR (2003). Non-microbial etiology: periapical cysts sustain post-treatment
apical periodontitis. Endod Topics 6: 96-113.
46
Nair PNR, Henry S, Cano V, Vera J (2005). Microbial status of apical root canal
system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after
‘one-visit’ endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
and Endod 99: 231-252.
Nair PNR (2006). Endodontic failures: the pathobiology of posttreatment apical
periodontitis. In Cohen S, Hargreaves KM. Pathways of the pulp. 9a ed. St.
Louis: Mosby, 918-943.
Ng YL, Mann V, Rahbaran S, Lewsey J, Gulabivala K (2008). Outcome of
primary root canal treatment: systematic review of the literature – Part 2.
Influence of clinical factors. Int Endod J 41: 6-31.
Oliet S, Sorin SM (1969). Evaluation of clinical results based upon culturing root
canals. J Br Endod Soc 3: 3-6.
Pasqualini D, Bergandi L, Palumbo L, Borracino A, Dambra V, Alovisi M,
Migliaretti G, Ferraro G, Ghigo D, Bergerone S, Scotti N, Aimetti M, Berutti E
(2012). Association among oral health, apical periodontitis, CD14
polymorphism, and coronary heart disease in middle-aged adults. J Endod 38:
1570-1577.
Peake I (1989). The polymerase reaction. J Clin Pathol 42: 673-676.
Poltorak A, Smirnova I, He X, Liu MY, Van Huffel C, McNally O, Birdwell
D, Alejos E, Silva M, Du X, Thompson P, Chan EK, Ledesma J, Roe B, Clifton
S, Vogel SN, Beutler B (1998). Genetic and physical mapping of the Lps locus:
identification of the toll-4 receptor as a candidate gene in the critical region.
Blood Cells Mol Dis 24: 340-355.
Provenzano JC (2008). Influência do polimorfismo genético do receptor
FcγRIIIβ no resultado do tratamento endodôntico. Dissertação de Mestrado em
Odontologia (Endodontia), Faculdade de Odontologia, Universidade Estácio de
Sá. 78p.
Raetz CR, Whitfield C (2002). Lipopolysacharide endotoxin. Annu Rev Biochem
71: 635-700.
47
Ricucci D, Grondhal K, Bergenholtz G (2000). Periapical status of root-filled
teeth exposed to the oral enviromment by loss of restoration or caries. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 90: 354-359.
Ricucci D, Siqueira JF Jr (2008). Anatomic and microbiologic challenges to
achieving success with endodontic treatment: a case report. J Endod 34: 1249-
1254.
Ricucci D, Siqueira JF Jr, Bate AL, Pitt Ford TR (2009). Histologic investigation
of root canal-treated teeth with apical periodontitis: a retrospective study from
twenty-four patients. J Endod 35: 493-502.
Schork NJ, Fallin D, Lanchburry S (2000). Single nucleotide polymorphisms and
the future of genetic epidemiology. Clin Genet 58: 250-264.
Siqueira JF Jr (2001). Aetiology of root canal treatment failure: why well-treated
teeth can fail. Int Endod J 34: 1–10.
Siqueira JF Jr, Barnett F (2004). Interappointement pain mechanisms,
diagnosis, and treatment. Endod Topics 7: 93-109.
Siqueira JF Jr, Rôças IN (2004). Polymerase chain reaction – based of
microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 97: 85-94.
Siqueira JF Jr (2008). Microbiology of apical periodontitis. In: Orstavik D, Pitt
Ford T, eds. Essential Endodontology. 2ª ed., Oxford, UK: Blackweh
Munksgaard Ltd, 135-196.
Siqueira JF Jr, Rôças IN (2008a). Clinical implications and microbiology of
bacterial persistence after treatment procedures. J Endod 34: 1291-1301.
Siqueira JF Jr, Rôças IN (2008b). Update on endodontic microbiology:
candidate pathogens and patterns of colonisation. Endod Prac 2: 7-20.
Siqueira JF Jr, Rôças IN (2009). Molecular analysis of endodontic infections. In:
Fouad AF. Endodontic microbiology. Ames, Iowa: Wiley-Blackwell, 68-107.
48
Siqueira JF Jr, Rôças IN, Provenzano JC, Daibert FK, Silva MG, Lima KC
(2009). Relationship between Fcγ receptor and interleukin-1 gene polimorphism
and post-treatment apical periodontitis. J Endod 35: 1186-1192.
Siqueira JF Jr, Rôças IN, Lopes HP (2010). Microbiologia Endodôntica. In:
Lopes HP, Siqueira JF Jr. Endodontia: biologia e técnica. 3ªed., Rio de Janeiro,
RJ: Guanabara Koogan, 103-146.
Siqueira JF Jr (2011). Treatment of endodontic infections. Berlim: Quintessence
Publishing Co., 139-185.
Sjögren U, Figdor D, Persson S, Sundqvist G (1997). Influence of infection at
the time of root filling on the outcome of endodontic treatment of teeth with
apical periodontitis. Int Endod J 30: 297–306.
Strindberg LZ (1956). The dependence of the results of pulp therapy on certain
factors. Acta Odontol Scand 14 (Suppl 21): 1-175.
Sundqvist G (1976). Bacteriological studies of necrotic pulps. Umeå University
odontological Dissertation no.7. Umeå: University of Umeå, 1976.
Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjögren U (1998). Microbiologic analysis of
teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative
retreatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 85: 86-93.
Tervonen T, Raunio T, Knuuttila M, Karttunen R (2007). Polymorphism in the
Cd14 and IL-6 genes associated with pwriodontal disease. J Clin Periodontol
34: 377-383.
Tronstad L, Asbjorsen K, Doving L, Pedersen I, Eriksen HM (2000). Influence of
coronal restoration on the periapical health of endodontically treated teeth.
Endod Dent Traumatol 16: 218-221.
Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M, Sinnott PJ, Hutchinson IV
(1997). An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter.
Eur J Immunogenet 24: 1-8.
49
Van Den Berg L, Myhr K-M, Kluge B, Vedeler CA (2001). Fcɣ receptor
polymorphism in populations in Ethiopia and Norway. Imumnol 104: 87-91.
Wang PL, Ohura K, Fujii T, Oido-Mori M, Kowashi Y, Kikuchi M, Suetsugu
Y, Tanaka J (2003). DNA microarray analysis of human gingival fibroblasts from
healthy and inflammatory gingival tissues. Biochem Biophys Res Commun 305:
970-973.
Wasty MO, Mc Mahon KT, Minah GE, Falker WA (1992). Microbiological
evaluation of periapical infections in Egypt. Oral Microbiol Immunol 7: 100-105.
Wolff L, Dahlen G, Aeppli D (1994). Bacteria as risk markers for periodontitis. J
Periodontol 65: 498-510.
Yamazaki K, Ikarashi F, Aoyagi T, Takahashi K, Nakajima T, Hara K, Seymour
GJ (1992). Direct and indirect effects of Porphyromonas gingivalis
lipopolysaccharide on interleukin-6 production by human gingival fibroblasts.
Oral Microbiol Immunol 7: 218-224.
Yamazaki K, Ueki-Maruyama K, Oda T, Tabeta K, Shimada Y, Tai H, Nakajima
T, Yoshie H, Herawati D, Seymour GJ (2003). Single-nucleotie polymorphism in
the CD14 promoter and periodontal disease expression in a Japonese
population. J Dent Res 82: 612-616.
Yoshie H, Kobayashi T, Tai H, Galicia JC (2007). The role of genetic
polymorphisms in periodontitis. Periodontol 2000 43: 102-132.
Zeldow BJ, Ingle JI (1963). Correlation of the positive culture to the prognosis of
endodontically treated teeth: a clinical study. J Am Dent Assoc 66: 9-13.
50
10-ANEXOS
51
ANEXO 1
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
Projeto - CAAE - 0018.0.308.000-08
Título do Projeto de Pesquisa
IDENTIFICAÇÃO DE FATORES RELACIONADOS AO SUCESSO DO
TRATAMENTO ENDODÔNTICO
Situação Data Inicial no
CEP
Data Final no
CEP
Data Inicial
na CONEP
Data Final na
CONEP
Aprovado no CEP 18/03/2008
07:50:58
16/04/2008
11:05:41
Descrição Data Documento Nº do Doc Origem
2 - Recebimento de
Protocolo pelo CEP
(Check-List)
18/03/2008
07:50:58
Folha de
Rosto
0018.0.308.000-
08 CEP
1 - Envio da Folha de
Rosto pela Internet
10/03/2008
14:49:57
Folha de
Rosto FR180529 Pesquisador
3 - Protocolo Aprovado
no CEP
16/04/2008
11:05:41
Folha de
Rosto 0029 CEP
52
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PÓS-
INFORMAÇÃO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA, CONFORME
RESOLUÇÃO NÚMERO 196 DE 10/10/96, DO CONSELHO NACIONAL DE
SAÚDE.
Título da pesquisa: Fatores modificadores da doença em Endodontia
Pesquisador responsável: Camila Arão Del Aguila
Orientadores: José Freitas Siqueira Júnior
Isabela das Neves Rôças Siqueira
Introdução: Antes de consentir com a sua participação nesta pesquisa como
voluntário (a) é importante e necessário que você leia atentamente as
informações contidas neste documento. Aqui estão os esclarecimentos sobre
os objetivos, os benefícios, os riscos, os desconfortos e os procedimentos
deste estudo. Esclarece-se também o seu direito de interromper a sua
participação no estudo a qualquer momento, bem como liberdade de se
recusar a participar sem qualquer prejuízo para você. Sempre que quiser
poderá pedir mais informações sobre a pesquisa através do telefone de contato
dos pesquisadores responsáveis e, se necessário, por meio do telefone do
Comitê de Ética em Pesquisa.
Objetivos: Este estudo tem por objetivos avaliar se algumas condições
sistêmicas apresentadas pelo paciente como diabetes tipo 2 ou tabagismo
influenciam o resultado do tratamento endodôntico como fatores de severidade
da doença ou modificadores da doença.
Procedimentos: Foram selecionados para esta pesquisa indivíduos que
apresentem tratamento endodôntico realizado há pelo menos um ano. Estes
deverão ter o diagnóstico inicial de necrose pulpar com lesão perirradicular na
época da realização do tratamento. Será realizado exame clínico e radiográfico,
com o intuito de verificar as condições clínicas e radiográficas do(s) dente(s)
em questão, para certificar que estes estão dentro do “critério de inclusão”
proposto no protocolo de pesquisa. Após os exames clínico e radiográfico,
cada indivíduo deverá realizar um bochecho com 10ml de solução salina estéril
53
a 0.9% (soro fisiológico) por 1minuto, que será coletado em um frasco coletor
universal estéril.
Risco e Desconforto: Os procedimentos realizados nesta pesquisa não
oferecem risco e desconforto para você. Estes obedecem aos Critérios da Ética
na Pesquisa com Seres Humanos conforme resolução n.196/96 do conselho
Nacional de Saúde – Brasília – DF
Confidencialidade: Todas as informações coletadas neste estudo são
estritamente confidenciais. Os dados do(a) voluntário(a) serão identificados
com um código, e não com o nome. Apenas os membros da pesquisa terão
conhecimento dos dados, assegurando assim sua privacidade.
Benefícios: Estes procedimentos irão avaliar se o resultado do tratamento
endodôntico pode ser alterado por condições sistêmicas apresentadas pelos
pacientes. Desta forma estas podem atuar como fatores de severidade ou
modificadores da doença. Esperamos que este estudo traga informações
importantes sobre os fatores de severidade da doença em Endodontia, de
forma que o conhecimento que será construído a partir desta pesquisa possa
contribuir para um diagnóstico mais preciso evitando a indicação errônea da
necessidade de retratamento endodôntico e a perda do dente permanente.
Deste modo, os pesquisadores se comprometem a divulgar os resultados
obtidos.
Pagamento: Você não terá nenhum tipo de despesa ao autorizar sua
participação nesta pesquisa, bem como não receberá qualquer remuneração
por esta participação.
Liberdade de recusar ou retirar o consentimento: Você tem a liberdade de
retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo
sem penalidades.
Contato com os pesquisadores: Poderá ser feito através da Clínica de
Endodontia da Odontoclínica Central da Marinha cujo telefone é 2104-6595, e
da secretaria de PPGO da UNESA cujo telefone é 2497-8988. Em caso de
dúvidas quanto aos seus direitos como participante da pesquisa, você deverá
ligar para o Comitê de ética em Pesquisa da UNESA cujo telefone é 3231-
6153.
Consentimento: Li e entendi as informações contidas neste documento. Tive a
oportunidade de fazer perguntas e todas as minhas dúvidas foram respondidas
54
satisfatoriamente. Estou participando desta pesquisa por minha vontade, até
que eu decida o contrário.
Após estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma
nome livre para permitir sua participação nesta pesquisa. Portanto, preencha
os itens que seguem:
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu________________________________________, RG____________
após a leitura e compreensão destas informações, entendendo que a
participação do(a) menor, ________________________________ sob minha
responsabilidade, é voluntária, e que ele(a) pode sair a qualquer momento do
estudo, sem prejuízo algum. Confiro que recebi cópia deste termo de
consentimento, e autorizo a execução do trabalho de pesquisa e a divulgação
dos dados obtidos neste estudo.
Obs.: Não assine este termo se ainda tiver dúvidas a respeito.
Rio de Janeiro,___/___/______.
Telefone para contato:____________________________________________.
Nome do Voluntário:______________________________________________.
Assinatura do Voluntário ou do Responsável pelo Voluntário:_______________
______________________________________________________________.
Assinatura do Pesquisador:_________________________________________.
Assinatura do Orientador:__________________________________________.
55
ANEXO 3
CASOS RETROSPECTIVOS
Radiografia de
Proservação Dados Gerais Dados Clínicos Resultado
Caso: 1P
Idade: 65
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 31
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 2P
Idade: 48
Sexo: Feminino
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 15
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 3P
Idade: 14
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 12 / 14
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: 12 –
Boa / 14 – ausente
Sucesso
56
Caso: 4P
Idade: 12
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 22
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação: além
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 5P
Idade: 50
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 12
Lesão após:
Regredindo
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 6P
Idade: 49
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertireoidismo
Hábitos: Não
Dente: 12
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 8P
Idade: 57
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Dente: 34
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Sucesso
57
Hábitos: Não Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Caso: 9P
Idade: 36
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 27
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 10P
Idade: 48
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 12
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 11P
Idade: 11
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 46
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ruim
definitiva
Sucesso
58
Caso: 13P
Idade: 54
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Dente: 11
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 14P
Idade: 30
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Dente: 22
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 15P
Idade: 48
Sexo:Masculino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos:
Fumante
Dente: 44
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 16P
Idade: 58
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 35
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Sucesso
59
Restauração: Boa
definitiva
Caso: 18P
Idade: 14
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 11
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 20P
Idade: 41
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Onicofagia
Dente: 15
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
provisória
Sucesso
Caso: 21P
Idade: 10
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 36
Lesão após:
Regredindo
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 22P
Idade: 32
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Dente: 14 / 15
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Sucesso
60
Hábitos:
Onicofagia
Obturação:
Satisfatória
Restauração: 14 -
Boa provisória / 15 –
Ausente
Caso: 24P
Idade: 41
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Onicofagia
Dente: 24
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
provisória
Sucesso
Caso: 25P
Idade: 18
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Dente: 45
Lesão após:
Regredindo
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 26P
Idade: 22
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes
Hábitos:
Bruxismo
Dente: 36
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Sim
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
provisória
Fracasso
61
Caso: 28P
Idade: 22
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Bruxismo
Dente: 46
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 30P
Idade: 46
Sexo:Masculino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Dente: 16
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 31P
Idade: 66
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Dente: 41
Lesão após:
Regredindo
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 33P
Idade: 43
Sexo: Masculino
Raça: Negra
Doenças: Não
Dente: 46
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Fracasso
62
Hábitos: Não Obturação:
Satisfatória
Restauração:Boa
definitiva
Caso: 34P
Idade: 56
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 45
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Ausente
Sucesso
Caso: 35P
Idade: 65
Sexo: Masculino
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão/
Diabetes
Hábitos: Não
Dente: 14
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 36P
Idade: 77
Sexo:Masculino
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 26
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
63
Caso: 37P
Idade: 40
Sexo: Feminino
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 41
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 38P
Idade: 62
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 44
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 39P
Idade: 44
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Dente: 43 / 44
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação: 43-
aquém/ 44-além
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 40P
Idade: 65
Sexo: Feminino
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 37
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Sucesso
64
Restauração: Boa
definitiva
Caso: 42P
Idade: 73
Sexo:Masculino
Raça: Branca
Doenças: Câncer
de próstata
Hábitos: Não
Dente: 34
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 43P
Idade: 68
Sexo:Masculino
Raça:Negra
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Dente: 32
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação: Satisfatória
Restauração:Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 44P
Idade: 31
Sexo:Masculino
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 34
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 1R
Idade: 27
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Dente: 26
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Fracasso
65
Hábitos: Não Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Caso: 7R
Idade: 45
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente:13
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 10R
Idade: 32
Sexo: Feminino
Raça:Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 11
Lesão após: Não
Dor: Sim
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 11R
Idade: 53
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes
Hábitos:
Fumante
Dentes: 37 e 38
Lesão após: Sim
Dor: Sim
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
66
Caso: 12R
Idade: 50
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Dente: 22
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 13R
Idade: 30
Sexo:Masculino
Raça:Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente: 36
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 16R
Idade: 31
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Dente:36
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
67
Caso: 17R
Idade: 50
Sexo: Feminino
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes
Hábitos:
Fumante
Dente: 23 e 25
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 18R
Idade: 52
Sexo: Feminino
Dente: 13
Raça: Branca
Doenças:
Hipotireoidismo
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 19R
Idade: 40
Sexo: Feminino
Dente: 24
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 20R
Idade: 36
Sexo: Feminino
Dente: 11
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Temporária
Sucesso
68
Caso: 21R
Idade: 62
Sexo: Feminino
Dente: 12
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
(Em reparo)
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 22R
Idade: 50
Sexo:Feminino
Dente: 45
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hipotireoidismo
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Definitiva
Sucesso
Caso: 23R
Idade: 50
Sexo: Masculino
Dente: 25
Raça: Pardo
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 24R
Idade: 50
Sexo: Feminino
Dente: 45
Raça: Branca
Doenças:
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Sucesso
69
Diabetes
Hipertensa
Hábitos: Não
Restauração: Boa e
Definitiva
Caso: 25R
Idade: 34
Sexo: Feminino
Dente: 37
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 26R
Idade: 74
Sexo: Masculino
Dente: 43
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes
Hipertensão
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 27R
Idade: 49
Sexo: Masculino
Dente: 27
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
70
Caso: 28R
Idade: 72
Sexo: Feminino
Dente: 15
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes (?)
Nódulos na
Tireóide
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula:Não
Obturação:Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
Caso: 29R
Idade: 56
Sexo: Masculino
Dente: 22
Raça: Branco
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Sim ( usa
prótese com apoio
neste dente)
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
definitiva
Sucesso
Caso: 30R
Idade: 59
Sexo: Feminino
Dente: 45
Raça: Branca
Doenças:
Hipertensão
Hábitos: Não
Lesão após: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Sucesso
71
Caso: 31R
Idade: 38
Sexo: Feminino
Dente: 11
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Definitiva
Fracasso
Caso: 32R
Idade: 45
Sexo: Masculino
Dente: 11
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor:Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 33R
Idade: 33
Sexo: Feminino
Dente: 12
Raça: Negra
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 34R
Idade: 67
Sexo: Feminino
Dente:32
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
72
Caso: 35R
Idade: 41
Sexo: Masculino
Dente: 41/ 31
Raça: Pardo
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: 41- Sim/
31- Sim
Dor: Não
Mobilidade: 41 e 31-
Sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 36R
Idade: 39
Sexo: Feminino
Dente: 16
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 37R
Idade: 45
Sexo: Masculino
Dente: 27
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos:
Fumante
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 38R
Idade: 54
Sexo: Masculino
Dente: 22
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa/
Fracasso
73
Definitiva
Caso: 39R
Idade: 69
Sexo: Masculino
Dente: 23/22
Raça: Branca
Doenças:
Diabetes
Hipertensão
Hábitos: Não
Lesão após: 23/22
SIM
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa e
Definitiva
Fracasso
Caso: 40R
Idade: 45
Sexo: Masculino
Dente: 41
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor: Não
Mobilidade: sim
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Temporária
Fracasso
Caso: 41R
Idade: 78
Sexo: Feminino
Dente: 22/23
Raça: Branca
Doenças: Não
Hábitos: Não
Lesão após: 22/23-
Sim
Dor: Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Definitivas
Fracasso
Caso: 42R
Idade:50
Sexo:Masculino
Raça:Negra
Doença:Não
Hábitos: fumante
Dente:11
Lesão após: Sim
Dor:Não
Mobilidade: Não
Fístula:Não
Obturação:
Fracasso
74
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Caso: 43R
Idade:30
Sexo:Feminino
Raça: Branca
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:24
Lesão após: Não
Fístula:Não
Dor:Não
Mobilidade: Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração:
Temporária
Sucesso
Caso: 44R
Idade:37
Sexo:Masculino
Raça: Branco
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:21
Lesão após: Sim
Fístula:Não
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 45R
Idade:36
Sexo:Masculino
Raça: Branco
Doença:Não
Hábitos:
Fumante
Dente:36
Lesão após: Não
Fístula:Não
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
temporária (NP)
Sucesso
75
Caso: 46R
Idade:28
Sexo:Feminino
Raça: Negra
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:41 e 42Lesão
após: Não
Fístula:Não
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula: Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 48R
Idade:46
Sexo:Masculino
Raça: Negra
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:46
Lesão após: Não
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula:Não
Obturação: 0-2mm
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 49R
Idade:42
Sexo:Masculino
Dente:11
Raça: Negro
Doença:Não
Hábitos: Não
Lesão após: Sim
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula:Não
Obturação:
Satisfatória
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 52R
Idade:52
Sexo:Masculino
Raça:Pardo
Doença:hiperten
so e diabético
Hábitos: Não
Dente:14
Lesão após: Sim
Dor:Não Fístula:Não
Mobilidade:Não
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
76
Caso: 53R
Idade:50
Sexo:Feminino
Raça: Negro
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:12
Lesão após:Sim
Dor:Não
Mobilidade: Não
Fístula:Não
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 55R
Idade:45
Sexo:Maculino
Raça: Branco
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:31
Lesão após:Sim
Dor:Sim
Mobilidade:Sim
Fístula:Sim
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 56R
Idade:35
Sexo:Feminino
Raça:Branca
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:46
Lesão após:Sim
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula:Não
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 57
Idade:28
Sexo:Feminino
Raça: Negra
Doença:Não
Hábitos: Não
Dente:16
Lesão após:Sim
Dor:Não
Mobilidade: Não
Fístula:Não
Restauração: Boa
definitiva
Sucesso
Caso: 59R
Idade:29
Sexo:Feminino
Raça: Negra
Doença:Não
Dente:36
Lesão após:Sim
Dor:Sim
Mobilidade: Não
Fístula:Não
Fracasso
77
Hábitos: Não Restauração: Boa
definitiva
Caso: 61R
Idade:45
Sexo:Masculino
Raça: Negro
Doença: Nega
Hábitos: Nega
Dente:46
Lesão após:Sim
Fístula:Não
Dor:Não
Mobilidade: Não
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 63R
Idade:48
Sexo:Feminino
Raça: Negro
Doença:Nega
Hábitos:
Fumante
Dente:22
Lesão após: Sim
Fístula: Não
Dor: Não
Mobilidade: Não
Restauração: Boa
definitiva
Fracasso
Caso: 64R
Idade:34
Sexo:Masculino
Raça: Branco
Doença:Nega
Hábitos: Nega
Dente:46
Lesão após: Sim
Dor:Não
Mobilidade:Não
Fístula:Não
Restauração: Ruim
Fracasso
78
ANEXO 5
CLÍNICA DE ENDODONTIA
FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO ENDODÔNTICO
Nome:
Endereço:
Idade:
Sexo: ( )Fem. ( )Masc.
Fumante: ( )SIM ( )Não Ex fumante há______anos
Etnia:
Condição Sistêmica:
PRÉ-TRATAMENTO (caso Clínico na época do Tratamento Endodôntico)
Elemento Dentário:
Diagnóstico:
Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)
( )Sintomático ( )Assintomático ( )VAS
Presença de tumefação: ( )SIM ( )Não
Observações:
Presença de fístula: ( )SIM ( )NÃO
TRATAMENTO
Início do tratamento endodôntico: _____/_____/_____
Término do tratamento endodôntico:____/____/____
Técnica de instrumentação:
Preparo Apical:
Medicação Intracanal:
Sensibilidade Pós- PQM: ( )SIM ( )NÃO
VAS:
Técnica de obturação:
Material obturador:
Limite Apical da obturação: ( ) 0 a 2mm ( ) aquém-sobreobturação
79
Sensibilidade Pós-Obturação: ( )SIM ( )NÃO
VAS:
Observações:
PÓS-TRATAMENTO (Proservação 1)
Data do retorno: ___/___/___
Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO
Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO
Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO
Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO
Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO
Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva
( )Temporária
Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO
Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)
Observações:
PÓS-TRATAMENTO (Proservação 2)
Data do retorno: ___/___/___
Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO
Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO
Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO
Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO
Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO
Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva
( )Temporária
Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO
Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)
Observações:
PÓS-TRATAMENTO (Proservação 3)
Data do retorno: ___/___/___
Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO
Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO
80
Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO
Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO
Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO
Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva
( )Temporária
Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO
Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)
Observações:
81
ANEXO 6
Elsevier Editorial System(tm) for Journal of Endodontics
Manuscript Draft
Manuscript Number:
Title: Polymorphism of the CD14 and TLR4 genes and post-treatment apical
periodontitis
Article Type: Clinical Research
Keywords: post-treatment apical periodontitis; genetic polymorphism; CD14;
TLR4
Corresponding Author: Dr. Jose F. Siqueira, Jr., Ph.D.
Corresponding Author's Institution: Estacio de Sa University
First Author: Isabela Rôças
Order of Authors: Isabela Rôças; Jose F. Siqueira, Jr., Ph.D.; Camila Del
Aguila; José Provenzano; Bianca Guilherme; Lucio Gonçalves
Manuscript Region of Origin: Latin & South America
Abstract: Introduction This study investigated the association of
polymorphisms of the CD14 and TLR4 genes with post-treatment apical
periodontitis in Brazilian individuals.
Methods The study population consisted of 41 patients with post-treatment
apical periodontitis and 42 individuals with root canal-treated teeth exhibiting
healed/healing periradicular tissues (controls). All teeth had apical periodontitis
lesions at the time of treatment, which was completed at least 1 year previously.
Saliva was collected from the participants, DNA was extracted and used for
CD14 and TLR4 genotyping. Results No specific genotype or allele of the CD14
and TLR4 genes nor any
combination thereof was positively associated with post-treatment apical
periodontitis (p>0.05).
82
ANEXO 7
Conclusions Data from the present study suggest that polymorphism in the
CD14 and TLR4 genes does not influence the response to endodontic
treatment of teeth with apical periodontitis.
Polymorphism of the CD14 and TLR4 genes and post-treatment
apical periodontitis
Isabela N. Rôças, PhD 1
José F. Siqueira Jr, PhD 1
Camila A. Del Aguila, MSc 1
José C. Provenzano, MSc 1
Bianca P. S. Guilherme, MSc 1
Lúcio S. Gonçalves, PhD 1
1 Department of Endodontics and Molecular Microbiology Laboratory, Estácio
de Sá University, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Author’s address:
José F. Siqueira Jr, DDS, MSc, PhD
Faculty of Dentistry, Estácio de Sá University
Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580/cobertura
Recreio, Rio de Janeiro, RJ
Brazil 22790-710
e-mail: [email protected]; [email protected]
Running title: Polymorphisms of CD14 and TLR4 genes
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by grants from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação Carlos
Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ),
Brazilian Governmental Institutions.
The authors deny any conflicts of interest.
83
ABSTRACT
Introduction This study investigated the association of polymorphisms of the
CD14 and TLR4 genes with post-treatment apical periodontitis in Brazilian
ndividuals.
Methods The study population consisted of 41 patients with post-treatment
apical periodontitis and 42 individuals with root canal-treated teeth exhibiting
healed/healing periradicular tissues (controls). All teeth had apical periodontitis
lesions at the time of treatment, which was completed at least 1 year previously.
Saliva was collected from the participants, DNA was extracted and used for
CD14 and TLR4 genotyping.
Results No specific genotype or allele of the CD14 and TLR4 genes nor any
combination thereof was positively associated with post-treatment apical
periodontitis (p>0.05).
Conclusions Data from the present study suggest that polymorphism in the
CD14 and TLR4 genes does not influence the response to endodontic
treatment of teeth with apical periodontitis.
Key words: post-treatment apical periodontitis; genetic polymorphism; CD14;
TLR4
84
INTRODUCTION
Persistence of apical periodontitis following adequate root canal treatment can
occur in approximately 10% to 15% of the cases (1). Intraradicular bacterial
infection is the primary cause of persistent disease (2), but the possibility
certainly exists that acquired habits and host-related factors, collectively
referred to as disease modifiers, can influence the healing of apical periodontitis
lesions (3). Disease modifiers include habits (eg, smoking), systemic conditions
(eg, diabetes, stress, other immunocompromising conditions, etc) and the
genetic background (eg, gene polymorphism). Disease modifiers may help
explain the different responses to treatment in different patients (4).
Polymorphism of a gene related to inflammation, repair or host defense
to infection may result in an altered response to treatment among individuals.
Only a few studies have searched for relationships between genetic
polymorphism and post-treatment apical periodontitis (5-7). Our group
investigated the association of polymorphisms in the genes for two Fc
receptors, interleukin(IL)-1α and IL-1β with post-treatment apical periodontitis.
The only genetic conditions associated with persistent disease were carriage of
allele H131 of the Fc RIIa gene and a combination of this allele with allele Na2
of the Fcɣ RIIIb gene (5). Further, we failed to show any association between
the specific genotypes or alleles of Fc RIIIA and posttreatment apical
periodontitis (7). In another study, Morsani et al. (6) observed that individuals
with the polymorphic allele (allele 2) of IL-1β were 7 times more likely to exhibit
post-treatment disease as compared with individuals homozygous for allele 1.
Innate immunity has components capable of recognizing structures
typical of microbial substances, which are known as pathogen-associated
molecular patterns (PAMPs). These components are in turn called pattern
recognition receptors (PRRs) and trigger the innate immune response after
binding to PAMPs. Two important PRRs are CD14 and Toll-like receptor 4
(TLR4), which are involved in recognition and host response to
lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria. LPS is an important
bacterial virulence factor and its concentration in endodontic infections has
been associated with diverse clinical conditions (8). After released from
bacteria, LPS initially binds to a plasm protein called LPS-binding protein and is
then delivered to CD14, a cell receptor for LPS expressed primarily on the
85
macrophage surface (9). CD14 can also occur in a soluble form present in
serum, which mediates the response to LPS in cells lacking membrane-bound
CD14, including endothelial and epithelial cells (10). Subsequent activation of
the macrophage by LPS is a result of signal triggered by the signal-transducing
receptor TLR4. Therefore, in the response of macrophages to LPS, CD14 acts
as the recognizing receptor, while TLR4 functions as the signal-transducing
component (11). Recognition of LPS by engagement to these PRRs leads to
activation of transcription factors, and consequent expression of
proinflammatory cytokines and chemokines.
A single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region of the
CD14 gene at position -260 (CD14-260C>T) has been shown to influence the
transcriptional activity of the gene and the density of CD14 in monocytes, with
the rare allele showing an increase in both effects and leading to increased
inflammation (12). Furthermore, subjects carrying the T allele have significantly
higher soluble CD14 levels than carriers of the C allele (13). This SNP has been
associated with increased risk of myocardial infarction (12), Crohn’s disease
(14) and marginal periodontitis (15-18). TLR4+896A>G SNP is probably the
most intensively investigated polymorphism in the TLR4 gene, and has been
shown to affect the extracellular domain of the TLR4 protein, resulting in
reduced efficacy of LPS signaling and a consequent decrease in the ability to
evoke inflammation (19). TLR4+896A>G SNP has been correlated with
hyporesponsiveness to inhaled LPS (20), sepsis and infections caused by
Gram-negative bacteria (21), and risk for some types of cancer (22). This TLR4
gene polymorphism has also been suggested as a potential genetic risk factor
for susceptibility to chronic marginal periodontitis (23).
Because there is a paucity of studies reporting on the influence of
disease modifiers on the endodontic treatment outcome, this study was
undertaken to evaluate the relationship between CD14 and TLR4 genotypes
and allele carriage rates and the occurrence of post-treatment apical
periodontitis in a Brazilian population. The hypothesis was that individuals with
CD14-260C>T and TLR4+896A>G gene polymorphisms have an increased
response to LPS contributing to altered response to endodontic treatment.
86
MATERIAL AND METHODS
Study population and inclusion criteria
Eighty-three adult Brazilian individuals (48 females and 35 males; 58
white and 25 African-Brazilians) who lived in the city of Rio de Janeiro and met
the inclusion criteria described below were included in this study. Information
was gathered about general health and acquired habits that might serve as
potential disease modifiers (and thereby as covariates), including diabetes (9
individuals), hypertension (13 individuals), HIV infection (none reported), and
smoking (14 individuals). The protocol for this study was approved by the Ethics
Committee of the Estácio de Sá University.
Individuals were selected according to rigid inclusion criteria as
determined previously (5,7). Each individual should exhibit at least one tooth
with endodontic treatment ranked as adequate according to the following
radiographic parameters: all canals were filled, having no voids in the filling
mass, and with the apical terminus of the filling located at 0 to 2 mm short of the
radiographic apex. No obvious reason for post-treatment disease was apparent
based on the radiographic and clinical observations. All individuals presented
with pulp necrosis and apical periodontitis at the time of treatment, which was
finished at least one year previously. Teeth were treated either by graduate
students or specialists under faculty supervision. Treated teeth had coronal
restorations ranked as adequate according to the following parameters: the
restoration was permanent and appeared clinically and radiographically intact,
with no detectable signs of overhangs, open margins or recurrent caries.
Finally, individuals with only one root canal-treated tooth or more than one
treated teeth exhibiting the very same periradicular status at the follow-up
examination were selected. For instance, if the individual had two teeth
adequately treated and restored but with ambiguous periradicular conditions, ie,
one healed and the other diseased, then he or she was excluded from the
study.
Determination of the periradicular status of treated teeth was made
based on radiographic and clinical evaluations. Recall radiographs were
compared with immediate postoperative radiographs taken at the time of
87
treatment. All radiographs were taken using film holders. On the basis of
radiographs, the periradicular status was classified as follows:
a) Healed: contour and width of the periodontal ligament space (PDL)
were normal or PDL contour was widened mainly around excess
filling. Appearance of the surrounding bone was normal. These cases
were categorized as favorable outcome (controls);
b) Healing: periradicular radiolucency was clearly decreasing in size. For
the purpose of this study, these teeth were also categorized as
favorable outcome (controls), because a significant level of healing
was observed. Cases with uncertain healing were excluded;
c) Diseased (not healed): periradicular radiolucency was unchanged or
increased in size.
Radiographs were analyzed independently and under magnification by 2
experienced endodontists and a third observer was consulted for the discordant
cases. Multirooted teeth were classified according to the root with the worst
outcome. Determination of treatment outcome was also based on clinical
examination, and cases presenting with signs or symptoms typical of active
infection, such as pain, swelling and sinus tracts, were classified as diseased.
Following the inclusion criteria, the diseased group was composed of 41
patients and the healed/healing group had 42 individuals.
Sample taking and processing
Saliva was used as a source of host cells for genotyping and was
collected from the individuals at the time of follow-up examination. Sampling
and DNA extraction procedures were performed as described previously
(5,7,24). Samples from 68 individuals, stored at -20°C and available from
previous investigations (5,7,24), were used along with fresh saliva samples
taken from 15 additional individuals.
CD14-260C>T Gene Polymorphism
CD14 genotyping (NCBI SNP CLUSTER ID: rs2569190) was performed
by PCR with specific primers followed by restriction length fragment
polymorphism analysis as described elsewhere (16). Aliquots of 2 µl of DNA
extract was added to 50 μl polymerase chain reaction (PCR) mixture containing
5 µl of 10X PCR buffer (Fermentas, Burlington, ON, Canada), 1 μM each of
forward (5´- TCA CCT CCC CAC CTC TCT T– 3´) and reverse (5´- CCT GCA
88
AA TCC TTC CTG TT – 3´’) primers, 5 U Taq DNA polymerase (Fermentas),
2.5 mM MgCl2, and 0.2 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate
(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR conditions were as follows:
initial denaturation at 95°C/30 sec followed by 36 cycles at 95°C/30 sec,
59°C/30 sec, and 72°C/1 min, ending with an extension step at 72°C/10 min.
One negative control consisting of sterile ultrapure water instead of the sample
was included for every 10 samples in all batches of samples analyzed. To
confirm amplification, PCR products were subjected to electrophoresis on a 2%
agarose gel in Tris-borate/EDTA buffer. Next, the PCR products were digested
with HaeIII (New England Labs, Ipswich, MA) and the restriction pattern
visualized by electrophoresis in a 4% agarose gel which was stained with
GelRed (Biotium, Hayward, CA) and visualized under UV illumination. HaeIII
digestion yields two fragments of 83 bp and 24 bp (normal C allele) or 107 bp
(rare T allele).
TLR4 +896A>G gene polymorphism
TLR4 genotyping (NCBI SNP CLUSTER ID: rs4986790) was performed
on DNA extracted from saliva samples using a pre-designed Taqman SNP
Genotyping assay (rs4986790, assay code C_11722238_20)(Applied
Biosystems, Foster City, CA). The assay uses two TaqMan® probes that differ
in nucleotide sequence only at the SNP site; one probe labeled with VIC dye
that detects the normal allele A and the other labeled with FAM dye to detect
the rare allele G. Reactions and allelic discrimination were carried out on an ABI
7500 real-time PCR instrument (Applied Biosystems). Genotyping was done in
duplicate and negative controls (ultrapure water instead of samples) in triplicate.
Data acquisition and analysis were performed using the ABI 7500 software
v2.0.6 (Applied Biosystems).
PCR Controls
In order to determine that human DNA was really available for
genotyping, 2 μl of the DNA extract were subjected to separate PCR reactions
using primers directed to the T-cell receptor Vα22 gene (25) and the β-globin
gene (26). Negative controls consisted of sterile ultrapure water instead of the
sample. PCR products were subjected to electrophoresis in a 2% agarose gel–
89
Tris-borate-EDTA buffer, which was stained with GelRed (Biotium) and
visualized under UV illumination.
Statistical analysis
The data concerning distribution of CD14 and TLR4 alleles and
genotypes between disease (post-treatment apical periodontitis) and control
(healed/healing teeth) groups were statistically analyzed by means of the
Pearson chi-square test (3x2 contingency tables for specific genotype
frequencies and 2x2 contingency tables for allele frequencies). Composite
CD14 and TLR4 genotypes were also evaluated as to the association with
disease. All possible combinations involving alleles and genotypes of CD14 and
TLR4 genes were evaluated. Other factors (systemic conditions, and smoking)
were also evaluated for associations with treatment outcome in order to check if
they could act as covariates by using the chi-square and the Fisher´s exact
tests. Unadjusted univariate logistic regression was applied between the
dependent variable and the covariates in order to evaluate the association of
the polymorphisms and each covariate with healthy periradicular conditions
through calculation of odds ratio and 95% confidence interval (CI 95%). Finally,
adjusted multivariate logistic regression was used to deduce the influence of the
genetic polymorphisms on treatment outcome, adjusted for covariates that
presented p<0.2 in the unadjusted analysis. The method used to insert the
variables in the logistic model was the backward stepwise, which involved all
variables chosen. Further, these variables were gradually excluded until the
final model was formed. Significance level was set at p<0.05. Statistical
analyses were performed using the SPSS software (Statistical Package for the
Social Sciences, version 17.0, IBM, Chicago, IL).
RESULTS
The results of genotyping for the CD14-260C>T and TLR4+896A>G
gene polymorphisms of individuals with post-treatment apical periodontitis and
healed/healing controls are depicted in Table 1. Genotyping for the CD14-
260C>T SNP revealed that the most frequent allele found in the study
population was allele C (53.6%) and the heterozygous genotype was the most
prevalent (42.2%). No significant associations were found between the 3
90
specific genotypes of CD14-260C>T (p=0.3) or the 2 alleles (p=0.1) and
posttreatment apical periodontitis.
As for TLR4+896A>G, the most prevalent allele in the study population
was also allele A (79.4%), and the homozygous genotype for this same allele
was the most common (62%). No significant associations were found between
any specific genotype of TLR4+896A>G (p=0.7) or allele (p=0.4) and
posttreatment apical periodontitis. It was not possible to successfully genotype
4 individuals for the TLR4+896A>G polymorphism (3 from the diseased group
and one from the healed/healing group).
No possible genotype combinations of CD14 and TLR4 exhibited
significant association with disease (p>0.05) (Table 2). Individuals presenting
the composite genotype comprising at least one rare allele of each target gene
were not linked to disease either (p>0.05)(Table 3).
Of the other factors tested for association with post-treatment disease
(systemic conditions, race and smoking), only smoking showed a significant
result (p=0.02). Of the 14 smokers, only 3 (21%) showed a favorable outcome,
while 39/69 (56.5%) of the nonsmokers showed healed/healing conditions.
Association of smoking with post-treatment disease was confirmed in the
unadjusted logistic regression, which showed that smokers were 4 times more
likely to have post-treatment disease than nonsmokers. Adjusted multivariate
logistic regression analysis kept the association of smoking with post-treatment
disease (p=0.03). Because smoking could be a confounding factor, statistical
analysis was also performed after exclusion of smokers. Data revealed no
significant effects on the results, since no significant associations for the
genotypes and alleles under study and post-treatment disease were still evident
(p>0.05).
DISCUSSION
It has been demonstrated that polymorphism in certain genes related to
inflammation, pathogen recognition and healing may influence the development,
progression, severity and healing of several inflammatory diseases. As for
marginal periodontitis, a disease that shares some similarities with apical
periodontitis, some of these genetic polymorphisms have been shown to serve
as potential disease modifiers (19). Regarding apical periodontitis, it has been
91
shown that the polymorphism of some genes related to inflammatory mediators
may influence the development of symptoms (27-28). Response to endodontic
treatment is another situation where polymorphism may lead to different
responses between individuals. Polymorphisms in receptors for the Fc portion
of immunoglobulin G and pro-inflammatory cytokines has been recently
suggested as potential factors influencing host response to root canal treatment
(5-6).
Genetic polymorphism affecting the response to treatment might help
explain why some cases with adequately treated root canals still result in failure
and why some lesions may take too long to completely heal. Bacterial infection
of the apical root canal is the main cause of treatment failure (29), but it has
been proposed that the bioburden inflicted by residual bacteria must be kept
above a certain threshold for disease to persist (2). The possibility exists that
this threshold, in addition to depending upon the virulence of residual bacterial,
is also related to the ability of the host to cope with infection. This ability may
differ from individual to individual because diverse factors, including
polymorphism in certain genes (3).
The two polymorphisms analyzed in this study are related to molecules
involved with pathogen recognition. Actually, both CD14 and TLR4 play an
essential role in the host response to LPS, the main virulence factor of Gram-
egative bacteria. No previous study has as of then tested the association of
these genetic polymorphisms and post-treatment apical periodontitis. Our
findings revealed that no genotype or allele of both the CD14-260C>T and the
TLR4+896A>G SNPs, nor any combination thereof, was significantly associated
with a poor outcome of the endodontic treatment. Although marginal and apical
periodontitis are different in some aspects, including the anatomy of infection,
shared features included most bacterial species involved and host immune
response. As for the periodontal literature, some studies have reported an
association of CD14 and TLR4 polymorphisms with some forms of marginal
periodontitis (16-18,23); however, our findings are in line with many others that
found no associations (16,30-33).
One possible reason for the lack of association of these
polymorphisms with persistent disease might be related to the low prevalence of
Gram-negative bacteria among the species that usually are found in
92
persistent/secondary infections. Studies have demonstrated that Gram-positive
bacteria are more prevalent and dominant in samples taken after treatment
procedures and in retreatment cases (34-35). Even so, Gram-negative bacteria
have also been detected in many cases (36). Bacterial identification was not
performed in this study because it should also have included samples taken
from the canals of teeth from the healed/healing group, which represents an
obvious ethical restriction. Further studies evaluating the bacteria persisting in
the root canals and the concomitant host responses in genotyped individuals
would provide an interesting contribution to the understanding of the host-
pathogen relationship.
One important limitation of this study is the relatively small sample size.
Case selection followed extremely rigid inclusion criteria in order to avoid
conditions that clearly affect treatment outcome, ie, inadequately
treated/restored cases. Also, to eliminate ambiguity, only cases with the very
same periradicular status were included. These specific criteria substantially
reduced the sample size, especially for the diseased group, since teeth
presenting those adequate conditions of root canal treatment and restoration
have a high success rate (37). In addition, healed and healing individuals were
grouped together to minimized the problem of low sensitivity of radiographs to
detect subtle bone chances.
Of the possible disease modifiers that could act as confounding factors,
only smokers were positively associated with post-treatment disease. Previous
reports on association of tobacco using with post-treatment apical periodontitis
are conflicting (38-39). The number of smokers in this study is too low for a
robust statistical analysis, since this was not the purpose of this study, and
further investigations should address this specific issue. In the present study,
smoking was not found to affect the results for the gene polymorphisms under
analysis, since exclusion of smokers did not alter the results in statistical terms.
In conclusion, the current study found no association between CD14 and
TLR4 genotypes or alleles and post-treatment apical periodontitis. Future
studies targeting other genetic polymorphisms that may influence disease
severity and response to treatment are encouraged in order to serve as
potential biomarkers to project prognosis.
93
REFERENCES
1. Friedman S. Expected outcomes in the prevention and treatment of apical
periodontitis. In: Ørstavik D, Pitt Ford T, eds. Essential endodontology. Oxford,
UK: Blackwell Munksgaard Ltd, 2008: 408-69.
2. Siqueira JF, Jr., Rôças IN. Clinical implications and microbiology of bacterial
persistence after treatment procedures. J Endod 2008; 34: 1291-301 e3.
3. Siqueira JF, Jr. Treatment of endodontic infections. London: Quintessence
Publishing, 2011.
4. Fouad AF, Huang GT. Inflammation and immunological responses. In: Ingle
J, Bakland LK, Baumgartner JC, eds. Ingle´s endodontics. 6th ed. Hamilton: BC
Decker Inc, 2008: 343-75.
5. Siqueira JF, Jr., Rôças IN, Provenzano JC, Daibert FK, Silva MG, Lima KC.
Relationship between Fcgamma receptor and interleukin-1 gene polymorphisms
and post-treatment apical periodontitis. J Endod 2009; 35: 1186-92.
6. Morsani JM, Aminoshariae A, Han YW, Montagnese TA, Mickel A. Genetic
predisposition to persistent apical periodontitis. J Endod 2011; 37: 455-9.
7. Siqueira JF, Jr., Rôças IN, Provenzano JC, Guilherme BP. Polymorphism of
the FcgammaRIIIa gene and post-treatment apical periodontitis. J Endod 2011;
37: 1345-8.
8. Gomes BP, Endo MS, Martinho FC. Comparison of endotoxin levels found in
primary and secondary endodontic infections. J Endod 2012; 38: 1082-6.
9. Siqueira JF, Jr, Rôças IN. Bacterial pathogenesis and mediators in apical
periodontitis. Braz Dent J 2007; 18: 267-80.
10. Hayashi J, Masaka T, Ishikawa I. Increased levels of soluble CD14 in sera
of periodontitis patients. Infect Immun 1999; 67: 417-20.
11. Akira S. Mammalian Toll-like receptors. Curr Opin Microbiol 2003; 15: 5-11.
12. Hubacek JA, Rothe G, Pit'ha J, Skodova Z, Stanek V, Poledne R, Schmitz
G. C(-260)-->T polymorphism in the promoter of the CD14 monocyte receptor
gene as a risk factor for myocardial infarction. Circulation 1999; 99: 3218-20.
13. Guo QS, Xia B, Jiang Y, Morre SA, Cheng L, Li J, Crusius JB, Pena AS.
Polymorphisms of CD14 gene and TLR4 gene are not associated with
ulcerative colitis in Chinese patients. Postgrad Med J 2005; 81: 526-9.
94
14. Klein W, Tromm A, Griga T, Fricke H, Folwaczny C, Hocke M, Eitner K,
Marx M, Duerig N, Epplen JT. A polymorphism in the CD14 gene is associated
with Crohn disease. Scand J Gastroenterol 2002; 37: 189-91.
15. Laine ML, Loos BG, Crielaard W. Gene polymorphisms in chronic
periodontitis. Int J Dent 2010; 2010: 324719.
16. Laine ML, Morre SA, Murillo LS, van Winkelhoff AJ, Pena AS. CD14 and
TLR4 gene polymorphisms in adult periodontitis. J Dent Res 2005; 84: 1042-6.
17. Folwaczny M, Glas J, Torok HP, Fricke K, Folwaczny C. The CD14 - 159C
to-T promoter polymorphism in periodontal disease. J Clin Periodontol 2004; 31:
991-5.
18. Donati M, Berglundh T, Hytonen AM, Hahn-Zoric M, Hanson LA, Padyukov
L. Association of the -159 CD14 gene polymorphism and lack of association of
the -308 TNFA and Q551R IL-4RA polymorphisms with severe chronic
periodontitis in Swedish Caucasians. J Clin Periodontol 2005; 32: 474-9.
19. Loos BG, John RP, Laine ML. Identification of genetic risk factors for
periodontitis and possible mechanisms of action. J Clin Periodontol 2005; 32
Suppl 6: 159-79.
20. Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC, Zabner J, Kline JN, Jones M, Frees K,
Watt JL, Schwartz DA. TLR4 mutations are associated with endotoxin
hyporesponsiveness in humans. Nat Genet 2000; 25: 187-91.
21. Agnese DM, Calvano JE, Hahm SJ, Coyle SM, Corbett SA, Calvano SE,
Lowry SF. Human toll-like receptor 4 mutations but not CD14 polymorphisms
are associated with an increased risk of gram-negative infections. J Infect Dis
2002; 186: 1522-5.
22. Zhang K, Zhou B, Wang Y, Rao L, Zhang L. The TLR4 gene polymorphisms
and susceptibility to cancer: a systematic review and meta-analysis. Eur J
Cancer 2013; 49: 946-54.
23. Ozturk A, Vieira AR. TLR4 as a risk factor for periodontal disease: a
reappraisal. J Clin Periodontol 2009; 36: 279-86.
24. Laine ML, Farre MA, Crusius JB, van Winkelhoff AJ, Pena AS. The
mouthwash: a non-invasive sampling method to study cytokine gene
polymorphisms. J Periodontol 2000; 71: 1315-8.
95
25. Van Den Berg L, Myhr KM, Kluge B, Vedeler CA. Fcgamma receptor
polymorphisms in populations in Ethiopia and Norway. Immunology 2001; 104:
87-91.
26. Boulet GA, Horvath CA, Berghmans S, Moeneclaey LM, Duys IS, Arbyn M,
Depuydt CE, Vereecken AJ, Sahebali S, Bogers JJ. Cervical cytology
biobanking: quality of DNA from archival cervical Pap-stained smears. J Clin
Pathol 2008; 61: 637-41.
27. de Sá AR, Moreira PR, Xavier GM, Sampaio I, Kalapothakis E, Dutra WO,
Gomez RS. Association of CD14, IL1B, IL6, IL10 and TNFA functional gene
polymorphisms with symptomatic dental abscesses. Int Endod J 2007; 40: 563-
72.
28. Amaya MP, Criado L, Blanco B, Gomez M, Torres O, Florez L, Gonzalez CI,
Florez O. Polymorphisms of pro-inflammatory cytokine genes and the risk for
acute suppurative or chronic nonsuppurative apical periodontitis in a Colombian
population. Int Endod J 2013; 46: 71-8.
29. Ricucci D, Siqueira JF, Jr., Bate AL, Pitt Ford TR. Histologic investigation of
root canal-treated teeth with apical periodontitis: a retrospective study from
twenty-four patients. J Endod 2009; 35: 493-502.
30. Noack B, Gorgens H, Lorenz K, Schackert HK, Hoffmann T. TLR4 and IL-18
gene variants in chronic periodontitis: impact on disease susceptibility and
severity. Immunol Invest 2009; 38: 297-310.
31. Imamura Y, Fujigaki Y, Oomori Y, Kuno T, Ota N, Wang PL. Polymorphism
of genes encoding toll-like receptors and inflammatory cytokines in periodontal
disease in the Japanese population. J Int Acad Periodontol 2008; 10: 95-102.
32. Emingil G, Berdeli A, Baylas H, Saygan BH, Gurkan A, Kose T, Atilla G.
Toll-like receptor 2 and 4 gene polymorphisms in generalized aggressive
periodontitis. J Periodontol 2007; 78: 1968-77.
33. Yamazaki K, Ueki-Maruyama K, Oda T, Tabeta K, Shimada Y, Tai H,
Nakajima T, Yoshie H, Herawati D, Seymour GJ. Single-nucleotide
polymorphism in the CD14 promoter and periodontal disease expression in a
Japanese population. J Dent Res 2003; 82: 612-6.
34. Chavez de Paz LE, Dahlen G, Molander A, Moller A, Bergenholtz G.
Bacteria recovered from teeth with apical periodontitis after antimicrobial
endodontic treatment. Int Endod J 2003; 36: 500-8.
96
35. Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjogren U. Microbiologic analysis of
teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative
retreatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998; 85: 86-
93.
36. Rôças IN, Siqueira JF, Jr. Characterization of microbiota of root canal
treated teeth with posttreatment disease. J Clin Microbiol 2012; 50: 1721-4.
37. Gillen BM, Looney SW, Gu LS, Loushine BA, Weller RN, Loushine RJ,
Pashley DH, Tay FR. Impact of the quality of coronal restoration versus the
quality of root canal fillings on success of root canal treatment: a systematic
review and meta-analysis. J Endod 2011; 37: 895-902.
38. Segura-Egea JJ, Jimenez-Pinzon A, Rios-Santos JV, Velasco-Ortega E,
Cisneros-Cabello R, Poyato-Ferrera MM. High prevalence of apical periodontitis
amongst smokers in a sample of Spanish adults. Int Endod J 2008; 41: 310-6.
39. Bergstrom J, Babcan J, Eliasson S. Tobacco smoking and dental periapical
condition. Eur J Oral Sci 2004; 112: 115-20.
97
Table 1
Distribution of CD14 and TLR4 genotypes and alleles in subjects with treated
root canals associated or not with apical periodontitis
Genotype Patients
(diseased)
Controls
(healed/healing) Total
N % N % N %
CD14 41 42 83
C/C 10 24.4 17 40.5 27 32.5
T/T 12 29.3 9 21.4 21 25.3
C/T 19 46.3 16 38.1 35 42.2
Allele 82 166
C 39 47.6 50 59.5 89 53.6
T 43 52.4 34 40.5 77 46.4
TLR4 38 41 79
A/A 25 65.8 24 58.5 49 62
G/G 1 2.6 2 4.9 3 3.8
A/G 12 31.6 15 36.6 27 34.2
Allele 76 82 158
A 62 81.6 63 76.8 125 79.1
G 14 18.4 19 23.2 33 20.9
98
Table 2
Distribuition of CD14 and TLR4 genotype combinations in individuals with treat
root canals associated or not with apical periodontitis
Patients with disease
TLR4 A/A TLR4 A/G TLR4 G/G
Patients with no disease
TLR4 A/A TLR4 A/G TLR4 G/G
CD14 C/C 6 3 1 9 6 1
14 C/T 12 5 0 12 3 1
CD14 T/T 7 4 0 3 6 0
Table 3
Frequency of composite CD14 and TLR4 genotype in individuals with treat root
canals associated or not with apical periodontitis
Genotype
Patients with disease
Patients with no disease
N % N %
Positive* 9 53 8 47
Negative** 6 60 4 40
*Carryng both rare alleles of CD14 and TLR4. **Not carryng any rare allele of
CD14 and TLR4.
99
ANEXO 8