comportamiento in vitro del colágeno de la unión amelo

9 Salutem Scientia Spiritus

Comportamiento in vitro del colágeno de la unión amelo-dentinaria en premolares humanos sometidos a altas

temperaturas

In vitro behavior of the dentin-enamel junction collagen in human premolars subjected to high temperatures

Sebastián Medina1,a, Carlos Mejía2,a, Freddy Moreno3,b

RESUMENObjetivo: Determinar el comportamiento in vitro del colágeno de la unión amelo-dentinaria en premolares humanos sometidos a altas temperaturas. Materiales y métodos: Estudio descriptivo pseudo-experimental in vitro de corte transversal que determinó, a través de microscopía electrónica de barrido, el comportamiento físico del colágeno de la unión amelodentinaria en 60 premolares humanos sometidos a altas temperaturas (200°C, 400°C, 600°C, 800°C y 1.000°C), para proporcionar evidencia científica que permita emplear la separación del esmalte y la dentina como un marcador fehaciente repetitivo de utilidad en los procesos de identificación odontológica y documentación de la necropsia médico-legal para el caso de cadáveres o restos humanos que resulten quemados, carbonizados o incinerados. Resultados: Se observa que el diseño micro-estructural del patrón reticular de colágeno de la dentina en relación con los cristales de hidroxiapatita resulto afectado conforme aumentaba la temperatura. Conclusiones: En conjunto, la alteración del patrón reticular del colágeno y los cambios micro-estructurales de la hidroxiapatita de calcio (fusión y sinterización de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico) de la dentina y del esmalte, explican la separación gradual y progresiva de estos dos tejidos a nivel de la unión amelo-dentinaria.

Palabras clave: Ciencias forenses, odontología forense, identificación odontológica, colágeno, unión amelo-dentinaria, altas temperaturas.

ABSTRACTObjective: To determine the behavior in vitro of collagen at the dentine-enamel junction of human premolars subjected to high temperatures. Materials and methods: Pseudo-experimental descrip-tive study, in vitro, cross-sectional, that determined by Scanning Electron Microscopy (SEM), the physical behavior of collagen at the dentine-enamel junction in 60 human premolars subjected to high temperatures (200°C, 400°C, 600°C, 800°C and 1000°C) to provide scientific evidence that allows to employ the separation of enamel and dentin as a reliable repetitive marker, useful in dental identification processes and documentation of medical-legal autopsy for bodies or human remains that were burned, charred or incinerated. Results: It was observed that the micro-structural design of reticular collagen pattern of the dentin in relation to hydroxyapatite crystals, was affected with increasing temperature. Conclusions: In general, alteration of reticular collagen pattern and the micro-structural changes of calcium hydroxyapatite (melting and sintering of the nano-spheres of octa-calcium phosphate) of dentin and enamel, explains the gradual and progressive separation of both tissues in dentine-enamel junction level.

Key words: Forensic science, forensic odontology, dental identification, collagen, dentin-enamel junction, high temperatures.

1. Odontólogo, Estudiante de maestría en Cien-cias Biomédicas, Departamento de Morfolo-gía., Escuela de Ciencias Básicas.

2. Odontólogo, Magíster en Ciencias Básicas, Profesor Escuela de Odontología.

3. Odontólogo, Magíster en Ciencias Biomédicas, Profesor Departamento de Ciencias Básicas de la Salud.

a. Facultad de Salud, Universidad del Valle (Co-lombia).

b. Facultad de Ciencias de la Salud, Pontificia Universidad Javeriana Cali (Colombia).

CORRESPONDENCIASebastián MedinaORCID ID http://orcid.org/0000-0002-7000-3499Departamento de Morfología Facultad de SaludUniversidad del ValleE-mail: [email protected]

CONFLICTO DE INTERESESLos autores del artículo hacen constar que no existe, de manera directa o indirecta, ningún tipo de conflicto de intereses que pueda poner en peligro la validez de lo comunicado.

RECIBIDO: 11 de marzo del 2015.ACEPTADO: 28 de Julio de 2015.

Artículo original de investigación

Medina S, Mejía C, Moreno F. Comportamiento in vitro del colágeno de la unión amelo-dentinaria en premolares humanos sometidos a altas temperaturas. Salutem Scientia Spiritus 2015; 1(2):9-18.

Salutem Scientia Spiritus | Volumen 1 | Número 2 | Julio-Diciembre | 2015 | ISSN: 2463-1426 (En Línea) 10

Medina S, Mejía C, Moreno F.

INTRODUCCIÓN

Teniendo en cuenta que los dientes resisten temperaturas de hasta 1.200°C sin pérdida importante de su macro estructura1 aun cuando la cremación completa de un cadá-ver se logra entre los 700°C y 800°C con un mínimo de una hora de exposición a las altas temperaturas2, es poco lo que se ha investigado sobre los cambios que ocurren en los tejidos dentales cuando son some-tidos a la acción de altas temperaturas.

Los primeros estudios in vitro se cen-traron principalmente en la descripción macroscópica de los cambios en el color, fisuras y grietas, fragmentación y estallido de los tejidos dentales mineralizados3-6, y no elaboraron marcadores con suficiente soporte científico macro y microscópico que permitieran aplicar estos resultados a los procedimientos de identificación de cadáveres o restos humanos quemados, carbonizados e incinerados.

Sin embargo, en algunos de estos estudios se reportó que en la medida que aumenta la temperatura el esmalte se separa de la dentina a nivel de la unión amelo- denti-naria (UAD), lo cual ha sido asociado a la combustión de los componentes de la matriz orgánica (componente no fibrilar –glicoproteínas, glucosaminoglicanos y proteoglicanos– y el componente fibrilar –colágeno–) y los cambios físico-químicos del componente inorgánico (cristales de hidroxiapatita de calcio) de dichos tejidos mineralizados dentales, lo que ocasiona disminución del volumen tisular y pérdida de la solución de continuidad de la UAD5,7.

Por tanto, el propósito de este estudio fue determinar a través de microscopía electrónica de barrido el comportamien-to in vitro del colágeno en la UAD de premolares humanos sometidos a altas temperaturas con el propósito de explicar a nivel microestructural la separación del esmalte y la dentina, la cual macroscópi-camente, se podría constituir en un mar-cador fehaciente predictor de la máxima temperatura a la que estuvo sometido un

Unión amelo-dentinaria

Desde su desarrollo, la dentina y el esmalte se encuentran unidos por una interfase punto de partida común de ambos tejidos y cuya particularidad implica que los cris-tales de hidroxiapatita de calcio de ambos tejidos nunca entran en contacto, dado que la interfase se encuentra constituida por zonas amorfas cuya matriz extracelular no fue mineralizada completamente, de-nominadas dentina del manto y esmalte aprismático respectivamente11,12.

La mineralización progresiva y en sentido contrario de ambos tejidos a partir de la UAD inicia con el depósito de iones calcio y fosfato en la matriz extracelular, por lo que la solución de continuidad de la UAD obedece al crecimiento de los cristales de hidroxiapatita de calcio y resulta de la síntesis de la matriz extracelular orgánica y su posterior mineralización en ambos tejidos, primero de la dentina e inmedia-tamente después del esmalte. Por tanto, la UAD corresponde a una zona de transición de aspecto ondulado o festoneado entre el esmalte y la dentina13,14. Dicho patrón festoneado se encuentra representado en la superficie de la dentina por una serie de crestas que se levantan hacia el esmalte creando una serie de socavones cóncavos con aspecto de “panal de abejas” que se corresponden con convexidades de la superficie del esmalte correspondiente a grupos de prismas de esmalte14,15. De esta forma, la UAD consiste en un complejo y crítico mecanismo de unión entre dos tejidos mineralizados, cuya primera fun-ción implica constituirse en la superficie de actividad para que los odontoblastos y los ameloblastos secreten la dentina y el esmalte respectivamente, para finalmente, una vez conformado el diente, contribuir en la integridad biomecánica (amortigua-dor biológico) de la interfase conformada por el esmalte y la dentina16-18.

Hidroxiapatita de calcio

El desarrollo de la ultra-estructura de los tejidos mineralizados dentales com-

diente, con fines de documentación de la necropsia médico-legal durante el proceso de identificación odontológica forense.

Dentina

Corresponde a un tejido biológico minera-lizado constituido por un 70% de material inorgánico (cristales de hidroxiapatita y oligoelementos), un 18% de material or-gánico (fibra colágena Tipo I y proteínas como osteonectina, osteopontina, proteína Gla de la dentina similar osteocalcina, fosforina dentinaria, proteína de la matriz dentinaria, sialoproteína dentinaria y pro-teína de la matriz dentinaria), y un 12% de agua. Cuenta con unos túbulos dentinarios ocupados principalmente por los procesos odontoblásticos, especializaciones celu-lares que se extienden desde los odonto-blastos de la pulpa, razón por la cual se describe el complejo dentino-pulpar como una unidad estructural integrada constitui-da por el cuerpo del odontoblasto (pulpa) y por el proceso odontoblástico (dentina)8-10.

Esmalte

Es un tejido biológico acelular altamente mineralizado que reviste a manera de un casquete la superficie externa de los dientes de los mamíferos. Siendo el teji-do más duro y resistente del organismo, tiene como función proteger el órgano dentino-pulpar. Se encuentra constitui-do por un 95% de material inorgánico (cristales de hidroxiapatita de calcio), un 2% de material orgánico (proteínas como amelogenina, enamelina, ameloblasti-na y tuftelina entre otras), y un 3% de agua. Como tejido mineralizado cuenta con una unidad funcional denominada prisma, bastón o varilla de esmalte, la cual corresponde una serie de cristales de hidroxiapatita de calcio paralelos al eje longitudinal del prisma, empaquetados en un patrón de organización de forma cilíndrica y dispuestos en forma de hileras con alineación horizontal. Esta disposición ocupa todo el espesor del esmalte excepto el que se encuentra adyacente a la dentina el cual es aprismático8-10.


Comportamiento del colágeno a altas temperaturas

prende series de sub-unidades esféricas con un diámetro muy similar al cristal de hidroxiapatita que conforman (entre 300 y 500 nm), de tal forma que cada nano-esfera se constituye en un centro de enu-cleación que contiene fosfatos de calcio amorfos estabilizados por los componen-tes proteicos de la matriz extracelular. La fusión longitudinal de dichas nano-esferas constituye un cristal de hidroxiapatita característico19.

La hidroxiapatita de calcio corresponde entonces a un bio-mineral constituido por fosfato de calcio cristalino que representa el depósito el 99% del calcio el 80% del fósforo total, almacenado en los tejidos bio-mineralizados. Estos fosfatos de calcio corresponden a glóbulos esféricos de fosfato octa-cálcico que se arreglan tridimensionalmente para constituir los cristales de hidroxiapatita de calcio, los que finalmente constituyen los prismas de esmalte8-10. Por tanto el fosfato octa-cálci-co ha sido reconocido como el precursor de la hidroxiapatita20, dado que contribuye a la constitución de la fase mineral inicial de la matriz extracelular durante la bio-mineralización y a la posterior formación, por cristalización, de la hidroxiapatita de calcio21.

Colágeno

El colágeno corresponde a una familia de proteínas constituidas por una superestruc-tura de tres cadenas de polipéptidos orga-nizadas en una triple hélice, la cual forma parte del componente fibrilar de la matriz extracelular de los tejidos conectivos, dentro de los cuales se incluye la dentina. Su función es proporcional estabilidad dimensional, resistencia tensil y mantener la integridad estructural de los tejidos22.

En la dentina, el colágeno tipo I es sinte-tizado por los odontoblastos y constituye el 90% de la matriz extracelular. En la UAD, la dentina del manto se evidencia la presencia de fibras perpendiculares de colágeno, gruesas y desordenadas, deno-minadas fibras de Von Korf8-10.

proceso secuencial y de crecimiento longitudinal y progresivo se inicia desde la UAD y termina en la superficie del esmalte26-28.

En cuanto a la dentinogénesis, la minera-lización de la dentina difiere bastante del mecanismo de mineralización del esmalte. Los odontoblastos dan inicio a los proce-sos de bio-mineralización, que incluyen siete pasos consecutivos: 1. Síntesis de la matriz extracelular proteica (armazón de colágeno tipo I); 2. Captación y almacena-miento de calcio intra-celular; 3. Concen-tración local de iones calcio y fosfatos; 4. Formación de vesículas matriciales bases de la calcificación de la matriz; 5. Salida de las vesículas desde el odontoblasto a la matriz extracelular (dentro de estas vesículas se conforman “dots” de fosfato cálcico amorfo, luego muchos “dots” se unen uno tras otro para conformar cristales de hidroxiapatita de calcio); 6. Ruptura de las vesículas y liberación de los cristales de hidroxiapatita; 7. Orientación de los cristales de hidroxiapatita respecto a las fibras de colágeno26,29.

MATERIALES Y METODOS

Éste es un estudio descriptivo pseudo-ex-perimental in vitro de corte transversal que describió a través de microscopía electró-nica de barrido (MEB) el comportamiento del colágeno en la UAD de premolares humanos para generar evidencia científica que explique la separación del esmalte y la dentina, la cual podría constituir un marca-dor fehaciente repetitivo de utilidad en los procesos de identificación odontológica y documentación de la necropsia médico-legal para el caso de cadáveres o restos humanos que resulten quemados, carboni-zados o incinerados. La hipótesis nula de este estudio es que al someter premolares humanos in vitro a altas temperaturas, no se presentan cambios microscópicos significativos en el colágeno.

Población y muestra

Obtenida la autorización por parte del

Mineralización de los tejidos dentales

La bio-mineralización es el proceso por el cual se establecen los tejidos conectivos especializados mineralizados (hueso, car-tílago, esmalte, dentina y cemento) a partir del depósito de una fase mineral u inor-gánica en la matriz extracelular orgánica. Respecto a los tejidos mineralizados de los dientes, la bio-mineralización ocurre por el depósito de cristales de hidroxiapatita de calcio en la matriz extracelular durante los procesos de amelogénesis (esmalte), dentinogénesis (dentina), cementogénesis (cemento) y osteogénesis (hueso alveolar), mediada por ameloblastos, odontoblastos, cementoblastos y osteoblastos respectiva-mente, y regulada genéticamente por un grupo de proteínas de la mineralización de la matriz extracelular reconocidas como SCPP (Secretory Calciumbinding Phospho Protein)23-25.

Durante la amelogénesis, la mineraliza-ción de la matriz extracelular del esmalte, implica la formación biológica de cristales a partir de seis pasos sucedáneos: 1. Deli-mitación del espacio (los ameloblastos son estimulados y comienzan la secreción de la matriz extracelular a partir de sus prolon-gaciones de Tomes); 2. Existencia de una matriz orgánica preformada (se constituye un armazón estructural de proteínas secre-tadas por los ameloblastos que se ensam-blan en nano-esferas de amelogenina); 3. Sobre-saturación de la matriz extracelular (creación de una solución saturada de iones calcio y fosfato secretados por los ameloblastos); 4. Control de la formación de núcleos cristalinos (enucleación o auto-ensamblaje de los cristales para configurar núcleos de cristales controlados por las proteínas matriciales enamelina, tuftelina, amelogeninas, ameloblastinas y sialofos-foproteínas dentinales); 5. Control del crecimiento, morfología y orientación de los cristales por parte de la matriz extra-celular; y 6. Control de la finalización del crecimiento de los cristales (maduración de los cristales de hidroxiapatita y degra-dación proteolítica de contenido orgánico excesivo de la matriz extracelular). Este



Comité de Ética en Humanos de la Uni-versidad del Valle, de acuerdo a la Reso-lución 8430 del Ministerio de Salud30 y a la Declaración de Helsinki31, y verificado el riesgo mínimo de los sujetos humanos, se procedió a recolectar 60 dientes pre-molares, clínicamente sanos (sin caries ni fracturas), sin ningún tipo de tratamiento odontológico, obtenidos de pacientes atendidos en las clínicas de cirugía oral y maxilofacial de la Universidad del Valle que requirieran extracciones de premo-lares con motivos ortodónticos y que autorizaron la donación de los dientes con fines de investigación mediante la firma del consentimiento informado.

Una vez extraídos los dientes se procedió a lavarlos profusamente con agua no estéril para eliminar los restos de sangre y teji-dos, y fueron incluidos en cloramina T al 5% (100 gramos de tosilcloramida sódica diluidos en 2 litros de agua destilada) para fijación. Los dientes permanecieron en cloramina T por una semana de acuerdo a la Norma ISO/DIS 11405:200332.

Posteriormente se incluyeron en solución salina a temperatura ambiente para man-tener condiciones de 100% de humedad hasta que se iniciaron los procedimientos de las muestras. La solución salina se cam-bió cada dos semanas por un máximo de dos meses antes de someter los dientes a altas temperaturas. Finalmente los dientes se clasificaron y se distribuyeron de forma aleatoria de acuerdo a la temperatura a la que fueron sometidos. Como grupo control se tomaron diez dientes, que no fueron sometidos a altas temperaturas para esta-blecer criterios de normalidad (Tabla 1).

Aplicación de altas temperaturas

Una vez recolectada la muestra, los dientes del grupo intervención se colocaron indi-vidualmente en bandejas confeccionadas en material de revestimiento (Cera-fina® Whipmix®) y se procedió a introducirlos en grupos de 10 dientes, cada uno en su respectiva bandeja, en un horno-mufla (Thomas® Small Benchtop 1256®) pre-

Tabla 1. Clasificación y distribución de la muestra antes de ser sometida a altas tem-peraturas

Grupos Control IntervenciónTemperatura 0°C 200°C 400°C 600°C 800°C 1.000°C

Dientes 10 10 10 10 10 10

viamente calibrado a cinco diferentes rangos de temperatura (200ºC, 400ºC, 600ºC, 800ºC, 1000ºC) con una tasa de ascenso de 10ºC por minuto desde una temperatura inicial de 28ºC hasta alcanzar cada una de las temperaturas propuestas. Por ejemplo, se introdujeron los 10 dien-tes correspondientes al grupo de 200ºC en un rango de temperatura de 28ºC a 200ºC, se dejó enfriar el horno de nuevo a temperatura ambiente y se procedió a sacar los dientes. Luego se introdujeron 10 dientes del grupo 400ºC en un rango de temperatura de 28ºC a 400ºC, se dejó enfriar el horno de nuevo a temperatura ambiente y se procedió a sacar los dientes. Así sucesivamente para los grupos de los dientes de 600ºC, 800ºC y 1.000ºC. Este protocolo fue estandarizado por el Grupo de Investigación Cirugía oral y Maxilo-facial de la Escuela de Odontología de la Universidad del Valle33.

El modelo in vitro planteado se realiza en un horno y no en flama directa, teniendo en cuenta que en los diferentes reportes de la literatura la temperatura máxima alcan-zada es de 1.000°C, pico que se alcanza entre los 25 y 30 minutos, para luego man-tenerse aproximadamente entre los 500°C hasta que se consume todo el oxigeno (combustión), o todo el material orgánico es reducido a carbón (carbonización) o a compuestos de calcio, fosfatos, sílice u otros oligoelementos (incineración)34.

Además, este “efecto de mufla” in situ, es lo que comparativamente harían los tejidos periorales, la musculatura facial, el tejido óseo y los tejidos dentales y periodontales3.

Manejo de los dientes después de la aplicación de las altas temperaturas

A los dientes del grupo control que no fueron sometidos a altas temperaturas y los dientes del grupo intervención sometidos a 200°C y 400°C, se les realizó una base en resina acrílica de autopolimerización (New Stetic®), se montaron en una má-quina de ensayos universal (Tinius Olsen® H50KS®) del Laboratorio de Ensayos Físicos y Mecánicos de la Escuela de Ingeniería de Materiales (EIMAT) de la Universidad del Valle con capacidad de 50 Kilo-Newtons y se les aplicó fuerza compresiva vertical constante a una velo-cidad de cruceta de 1 milímetro por minuto a través de una punta redondeada de acero templado de 3 milímetros de diámetro localizada entre las cúspides vestibular y palatino o lingual hasta que el software de la máquina (Tinius Olsen Horizon®) detectara una fractura y la corona fuera fragmentada, con el propósito de ocasionar una falla adhesiva para separar por fuerzas tensionales mal distribuidas el esmalte de la dentina. El resto de dientes del grupo intervención sometidos a 600°C, 800°C y 1.000°C, se separó el esmalte de la dentina con ayuda de un bisturí con cuchilla Brad-Parker® No. 15 y un tallador de Lecron Medix®, favorecido por la debilidad estructural y fractura natural espontánea de la UAD por acción de las altas tempe-raturas. Con esto quedaron constituidas las muestras de esmalte y dentina.

Observación de las muestras de esmalte y dentina

Los fragmentos de esmalte y dentina correspondientes entre sí, fueron fijados en un porta-objetos con cianocrilato, recubiertos con una película de oro, y observados y fotografiados a través de SEM mediante un microscopio JEOL® JSM 6490 LV® de la Escuela de Ingeniería



de Materiales (EIMAT) de la Facultad de Ingeniería de la Universidad del Valle, con un display de alta resolución de 20 pulgadas, a un rango de aceleración de voltaje de 0.3 KV hasta 30 KV, y desde una fuente de electrones vacío de 3 nm a alta aceleración de voltaje en modo de electrones secundarios y de 4 nm para modo de electrones retro-dispersados en bajo vacío.

RESULTADOS

Cuando un diente resulta expuesto a altas temperaturas puede sufrir cambios estructurales que dependen de la tempe-ratura máxima alcanzada, de esta forma puede quedar intacto (200°C), quemado –cambio de color y formación de fisuras y grietas (400°C)–, carbonizado –reduci-do a carbón por combustión incompleta (600°C)–, incinerado–reducido a cenizas (800°C y 1.000°C)–, y estallado –estallido radicular y coronal (1.200°C)–. Es por ello que los resultados de este estudio y la posterior discusión de los mismos se realizaran a partir de la descripción de dichos cambios, específicamente en la región de la UAD.

Cristales de hidroxiapatita de calcio del esmalte y de la dentina

Se empleó un SEM para observar el comportamiento microscópico del com-ponente inorgánico (fase mineral) del esmalte aprismático y de la dentina del manto (superficies respectivas de la UAD) representado en los cristales de hidroxia-patita de calcio. En las muestras de los dientes que no fueron sometidas a ninguna temperatura se observó en el esmalte un patrón regular de la hidroxiapatita de cal-cio constituida por nano-esferas de fosfato octa-cálcico de tamaño y distribución homogénea. En la dentina se observa la presencia de del patrón en red de fibras de colágeno (Figura 1). A los 200°C se obser-vó en el esmalte un patrón más compacto de la hidroxiapatita de calcio, asociado a la deshidratación y al inicio de la combustión del escaso componente orgánico. En la

dentina la hidroxiapatita de calcio inició su proceso de compactación (Figura 2). A los 400°C se observa en el esmalte la fusión de la hidroxiapatita de calcio, asociado a la coalescencia de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico se encuentran prácticamente fusionadas. En la dentina, la hidroxiapatita de calcio se aprecia compacta (Figura 3). A los 600°C se observa en el esmalte la fusión completa de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico de la hidroxiapatita de calcio. En la dentina, el componente inorgánico se aprecia totalmente fusionado y se pueden apreciar algunas nano-esferas de fosfato-octacálcico aisladas (Figura 4). A los 800°C se observa en el esmalte pér-dida de la micro-morfología y aumento de tamaño de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico de la hidroxiapatita de calcio. En la dentina se observa un patrón homogéneo de fusión de la hidroxiapatita (Figura 5). Finalmente a los 1.000°C se observa en el esmalte la integración de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico en clústers inde-pendientes y más grandes. En la dentina se mantiene el patrón homogéneo de fusión de la hidroxiapatita de calcio (Figura 6).

Colágeno

Se empleó MEB para observar la presencia y el comportamiento microscópico del componente orgánico (fase proteica) de la dentina, representado en el patrón reticular del colágeno. En la muestra del grupo 1 que no fue sometida a ninguna tempera-tura y que fue fracturada en la máquina de ensayos universal, a través de MEB, se observa en el fragmento de la dentina (superficie de la UAD) un arreglo reticular del colágeno adherido a la superficie de la dentina (Figura 1). En la muestra del grupo 2 que fue sometida a 200°C y fracturada en la máquina ensayos universal, a través de MEB, se observan las fibras de colágeno emergiendo de entre las nano-esferas de los cristales de hidroxiapatita que cons-tituyen el componente inorgánico de la dentina (Figura 2). En la muestra del grupo 3 que fue sometida a 400°C y fracturada con ayuda de instrumentos manuales, a través de MEB, se observa pérdida de inte-

gridad y colapso de las fibras de colágeno (Figura 3). En la muestra del grupo 4 que fue sometida a 600°C y fracturada con ayuda de instrumentos manuales, a través de MEB, se observa pérdida de integridad de las fibras de colágeno (Figura 4). En la muestra del grupo 5 que fue sometida a 800°C y fracturada prácticamente de forma espontánea por acción de las altas temperaturas, a través de MEB, en la su-perficie de la dentina que se corresponde con la UAD se observa destrucción del patrón reticular del colágeno (Figura 5). En la muestra del grupo 6 que fue sometida a 1.000°C y fracturada prácticamente de forma espontánea por acción de las altas temperaturas, a través de MEB, la super-ficie de la dentina que se corresponde con la UAD presenta desintegración del patrón reticular del colágeno (Figura 6).

DISCUSIÓN

Separación de la dentina y del esmalte a nivel de la UAD

La separación de la UAD fue descrita por Merlati et al4 desde los 400°C. Moreno et al35, discutieron que la separación de la UAD empieza a ocurrir desde los 200°C haciéndose más evidente desde los 400°C cuando ocurre el estallido cervical del es-malte; ya a los 600°C y 800°C se observa una separación completa esmalte-dentina a nivel de los tercios cervical y medio, hasta que a los 1.000°C el esmalte se fragmenta y se separa de la dentina a manera de un casquete. Estos autores atribuyen este fenómeno de separación a la composición química del esmalte y la dentina. Dado que el esmalte presenta un alto contenido inorgánico representado en fosfato octa-cálcico en forma de cristales de hidroxia-patita de calcio y un escaso contenido orgánico y de agua que sufre combustión y evaporación respectivamente, el aumento de temperatura altera la organización de dichos cristales aumentando su cohesión (contracción térmica), lo que genera la aparición inicial de fisuras y grietas que le proporcionan un aspecto cuarteado y que finalmente ocasionan su fractura.



Asimismo, la dentina, con alto contenido orgánico y agua, se demora algún tiempo en deshidratarse, y como la protegen el mismo esmalte, cuenta con cierto margen de contracción térmica en comparación con el esmalte, lo que ocasiona que en la UAD el esmalte se fracture y que haya una separación de este y de la dentina en la región del margen cervical35.

En el análisis macroscópico de las mues-tras sometidas a 200°C no se observan cambios visibles en la región del tercio cervical coronal, tal como lo manifestaron Merlati et al7 y Moreno et al35 a los 400°C y a los 600°C, el esmalte y la dentina ini-cian su proceso de carbonización.

El esmalte aprismático con menor cantidad de sustancia inorgánica, pierde rápidamen-te su escaso contenido de agua y proteínas y sufre un fenómeno de coalescencia de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico que componen la hidroxiapatita de calcio aumentando gradualmente de tamaño y fu-sionándose entre si. Caso contrario sucede con la dentina del manto, quien cuenta con un componente orgánico mucho mayor, razón por la cual en la medida que va perdiendo agua y se va desnaturalizando el componente proteico, va perdiendo volumen, lo que ocasiona que ocurra un estallido del esmalte por la contracción dimensional de la dentina a nivel de la UAD, primero en el tercio cervical y posteriormente, de forma gradual, hasta el tercio medio. A los 800°C y a los 1.000°C, el esmalte se ha compactado totalmente y la dentina gradualmente comienza el proceso de incineración del componente orgánico, con lo que el fenómeno de contracción se hace mucho más evidente, razón por la cual el esmalte se separa com-pletamente de la dentina coronal a manera de un casquete, tal como fue descrito por Moreno et al35.

Esta separación espontánea entre el esmal-te y la dentina es el resultado de un proceso gradual que inicia entre los 200°C y 400°C y se hace más evidente conforme aumenta la temperatura hasta llegar a la separación

Figura 1. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de dentina de una muestra del grupo 1 que no fue sometido a ninguna temperatura y en la que se observa el en-tramado de las fibras de colágeno.

Figura 2. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de dentina de una muestra del grupo 2 sometida a 200°C y en la que se observan las fibras de colágeno en íntima relación con la hidroxiapatita de calcio de la dentina.

Figura 3. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de dentina de una muestra del grupo 3 sometida a 400°C y en la que se observa colapso del patrón reticular de colágeno.



total a los 1.000°C. La explicación de este cambio macroscópico se puede hallar en el patrón festoneado de la UAD, el cual según Gallagher et al12, Marshall et al14, Habelitz et al16, Imbeni et al17 y Radlanski y Renzen18, es muy marcado en la UAD de la zona de las cúspides y va atenuándose gradualmente hasta desaparecer en la re-gión cervical, de allí que esta última sea la región de menor resistencia al choque térmico entre el esmalte y la dentina y sea el sitio en el que la UAD pierde su solu-ción de continuidad inicialmente, aún en la temperatura más baja12,14,16-18.

Comportamiento de los cristales de hidroxiapatita de calcio del esmalte y de la dentina

Los reportes iniciales sobre el compor-tamiento de la hidroxiapatita de calcio se realizaron en tejido óseo. Diferentes autores han sometido a altas temperaturas fragmentos de tejido óseo, concluyendo que conforme aumenta la temperatura se afecta la organización microestructural de los cristales de hidroxiapatita. Entre 200°C y 600°C la matriz extracelular del hueso, incluidas la malla de fibras de colágeno. A partir de los 600°C, el número y tamaño de los cristales de hidroxiapatita –de forma esférica– aumenta a través de un proceso denominado re-cristalización y el entrama-do de colágeno queda expuesto totalmente. Ya entre los 800°C y 1.000°C los cristales de hidroxiapatita –más grandes que los anteriores– pueden presentar dos morfo-logías diferentes, unos esféricos y otros hexagonales. Y finalmente a partir de los 1.000°C hasta los 1.600°C, los cristales de hidroxiapatita se funden entre sí asociado a un proceso de sinterización (coalescencia a muy altas temperaturas), de tal forma que se descomponen en óxido de calcio, por encima de los 1.200°C en trifosfato de calcio y por encima de los 1.400°C en fosfato de óxido de calcio35-37.

Ya en el caso de los tejidos mineralizados dentales, Moreno et al38 evidenciaron que la hidroxiapatita de calcio del esmalte aprismático y de la dentina del manto, que

Figura 4. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de dentina de una muestra del grupo 4 sometida a 600°C y en la que se pérdida y colapso del patrón reticular de colágeno.

Figura 5. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de esmalte de una muestra del grupo 5 sometida a 800°C y en la que se observa fraccionamiento de las fibras de colágeno.

Figura 6. MEB de la superficie de la UAD de un fragmento de dentina de una muestra del grupo 6 sometida a 1.000°C y en la que se observa la destrucción del colágeno.



confrontados constituyen la interfase es-malte-dentina, sufren los mismos cambios descritos en el tejido óseo. El esmalte y la dentina a los 200°C inician la combustión de la matriz extracelular orgánica, a los 400°C se inicia la carbonización queda paso a la incineración entre los 600°C y 1.000°C. Con el aumento de temperatura, la hidroxiapatita de calcio se torna de un aspecto redondeado y aumentan de tamaño mientras de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico. Dicho proceso es mucho más evidente en el esmalte aprismático dado su alto contenido inorgánico; mientras que en la dentina, dado su alto contenido orgánico, los cambios en la hidroxiapatita de calcio se observaron evidentes desde los 800°C.

Colágeno

Lin et al39, habían manifestado que en la UAD se pueden observar fibras de coláge-no tipo I que se proyectan desde la dentina y se unen para formar fibras más gruesas que cruzan la UAD y se introducen entre el esmalte de tal forma que este arreglo en red del colágeno constituye un ele-mento fibrilar que emerge desde la matriz extracelular de la dentina para insertarse de forma dispersa en la fase mineral del esmalte. Estas fibras de colágeno, que guiaron el proceso de calcificación de la dentina tienen un diámetro de 80 a 120 nm y se asocian para conformar una red densa de fibras que se encuentran en los socavados y micro-socavados, de allí que definen la UAD como una interfase refor-zada con una gran concentración de fibras de colágeno y que se mineraliza durante la odontogénesis en menor grado, lo que le permite absorber las fuerzas tensionales y disiparlas a lo largo de la unión durante la función masticatoria del sistema esto-matognático.

Asimismo, la morfología (estructura) y función (bio-mecánica) del colágeno de-pende en gran medida de la presencia de agua y el grado de mineralización. Las mo-léculas de agua tiene la gran capacidad de formar puentes de hidrógeno que se unen

en el interior de la fibra de colágeno a las cadenas de péptidos, de tal forma que per-mite el aumento dimensional de cada fibra. La pérdida de agua de las fibras de coláge-no ocasiona que la fibra sea más apretada, lo que aumenta su rigidez disminuyendo su módulo elástico y por tanto resistencia a la fractura. Por ello, ante la pérdida de hidratación, las fibras de colágeno sufren cambios en su estructura que ocasionan a su vez cambios en la rigidez de la dentina y de la UAD, lo cual los autores demostraron al someter a nano-indentación láminas de dientes deshidratados y describir el patrón de fracturas, que desde el esmalte, cruza-ban la UAD hasta la dentina40.

De esta forma, ante las altas temperaturas, el colágeno se desnaturaliza; inicialmente a los 60°C la estructura molecular de triple hélice del colágeno se desenrolla debido al acortamiento de cada una de las tres cadenas (ésta desnaturalización depende del contenido de prolina e hidroxiproli-na, es decir, a mayor contenido de estos aminoácidos mayor temperatura será necesaria para alterar la súper-estructura helicoidal del colágeno ya que le confieren estabilidad térmica). A los 70°C con la liberación de agua captada y mantenida por los otros componentes de la matriz extracelular (glucosaminoglicanos) las cadenas desnaturalizadas del colágeno se disuelven hasta transformarse en gelatina3. Entre 500°C y 600°C, en tejido óseo so-metido a altas temperaturas, el colágeno se descompone completamente42.

En este estudio se observaron cambios estructurales del colágeno a las altas temperaturas, de tal forma que desde los 600°C el patrón reticular del colágeno se observa desorganizado por la pérdida de continuidad de las fibras de colágeno, las cuales finalmente se observan destruidas a los 800°C y a los 1.000°C.

El mantenimiento del patrón fibrilar del colágeno se asocia a que la muestra no fue desmineralizada, y dado que el patrón de mineralización de la matriz extracelular durante la dentinogénesis implica que los

cristales de hidroxiapatita de calcio se orienten respecto a fibras de colágeno con-figurando la fase inorgánica o mineral de la dentina8-10, las cual las fibras de colágeno quedaron protegidas por dicha fase mine-ral de hidroxiapatita soportanto por mas tiempo la acción e las altas temperaturas.

CONCLUSIONES

En este estudio se pudo evidenciar que el colágeno de la dentina del manto ve afectada su estructura en la medida que aumenta la temperatura, y en conjunto con los cambios micro-estructurales de la hidroxiapatita de calcio (fusión y sinteri-zación de las nano-esferas de fosfato octa-cálcico) del esmalte y la dentina, explican la separación gradual y progresiva de estos dos tejidos a nivel de la UAD.

La separación del esmalte y de la dentina a nivel de la UAD se puede, eventualmente y conforme se genere mas evidencia científi-ca, constituir en un marcador médio-legal fehaciente para lograr una aproximación a la temperatura a la que estuvieron someti-dos los dientes, durante la documentación de la necropsia médico-legal en el proceso de identificación odontológica forense en caso de individuos quemados, carboniza-dos e incinerados. En este sentido, este estudio solo contribuye con la explicación a nivel microscópico de la separación de la UAD en lo referente al colágeno.

Se recomienda ampliar el análisis del comportamiento del colágeno a las altas temperaturas en los otros tejidos minerali-zados dentales (cemento, hueso compacto alveolar y hueso compacto esponjoso) tanto en la zona de interfases como en las superficies libres.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por la Convocatoria Interna 2012-2013 de la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad del Valle (Cali, Colombia).

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comportamiento in vitro del colágeno de la unión amelo

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