us 7,354,576-nov 19

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19

http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 1/36

( 1 2 ) United S t a t e s

Patent

Kakkis

US007354576B2

US 7 , 3 5 4 , 5 7 6 B2

* A p r .

8 ,

2 0 0 8

( 1 0 )

Patent

N 0 . :

( 4 5 ) Date o f P a t e n t :

( 5 4 )

( 7 5 )

( 7 3 )

( 2 1 )

( 2 2 )

( 6 5 )

( 6 3 )

( 5 1 )

METHODS

OF

TREATING

DISEASES

CAUSED BY

DEFICIENCIES OF

RECOMBINANT X-L-IDURONIDASE

I n v e n t o r : Emil

D . K a k k i s , N o v a t o ,

CA U S )

A s s i g n e e :

B i o m a r i n P h a r m a c e u t i c a l I n c . ,

N o v a t o ,

CA

( U S )

N o t i c e : S u b j e c t t o a n y d i s c l a i m e r , t h e

t e r m

o f h i s

p a t e n t i s e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5

U . S . C . 1 5 4 ( b ) b y 2 6 9 d a y s .

T h i s p a t e n t

i s

s u b j e c t

t o

a t e r m i n a l

d i s

c l a i m e r .

A p p l .

N 0 . :

1 0 / 8 9 5 , 0 1 1

F i l e d : J u l . 2 0 , 2004

Prior P u b l i c a t i o n

Data

US 005/0281804 A1

D e c .

2 2 ,

2005

R e l a t e d US. A p p l i c a t i o n

Data

C o n t i n u a t i o n

o f a p p l i c a t i o n N o . 0 9 / 9 3 , 2 4 1 , ? l e d on

Nov.

1 3 , 2 0 0 1 , noW P a t . No. 6 , 8 5 8 , 2 0 6 , Which i s

a

c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t o f

a p p l i c a t i o n N o .

0 9 / 7 1 1 , 2 0 5 ,

? l e d

o n Nov. 9 ,

2 0 0 0 ,

noW P a t .

No. 6 , 5 8 5 , 9 7 1 , Which

i s a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t

o f

a p p l i c a t i o n N o . 0 9 / 4 3 9 ,

9 2 3 , ? l e d

on

N o v . 1 2 , 1 9 9 9 , noW a t .

No.

6 , 4 2 6 , 2 0 8 .

I n t . C l .

A61K 8 / 4 7

( 2 0 0 6 . 0 1 )

C12N 1 5 / 5 6 ( 2 0 0 6 . 0 1 )

CIZN

9 / 2 4 ( 2 0 0 6 . 0 1 )

( 5 2 )

US.

l .

. . . . . . . . . . . . . . . . .

. . 424/94.61;

435/200;

536 / 2 3 2

(58) Field

of Classi?catio n

S e a r c h

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . 435/4,

4 3 5 / 6 , 6 9 . 1 ,

1 8 3 ,

2 0 0 , 2 5 2 4 3 , 3 2 0 . 1 ; 4 2 4 / 9 4 . 1 ,

4 2 4 / 9 4 . 6 1 , 9 4 3 ;

5 3 6 / 2 3 2

S e e

a p p l i c a t i o n ? l e

f o r c o m p l e t e

s e a r c h h i s t o r y .

( 5 6 )

R e f e r e n c e s C i t e d

U. . PATENT DOCUMENTS

6 , 5 8 5 , 9 7 1

B1*

7 / 2003

K a k k i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

424 / 9 4. 6 1

6 , 8 5 8 , 206

B2* 2 / 2005 K a k k i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

424/94.1

7 , 04 1 , 4 8 7

B2 5 / 2006 K a k k i s e t a 1 . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 5 /2 0 1

2005/0048047 A1* 3 / 2005 Kakkis . . . . . . . . . . 4 2 4 / 9 4 . 6 1

2005/0260185 A1* 1 1 / 2 0 0 5

Kakkis . . . . . . . .

. . 4 2 4 / 9 4 . 6 1

2 0 0 6 / 0 2 8 6 0 8 7 A1* 1 2 /2 0 0 6 K a k k i s e t a 1 . . . . . . . . . . . . 424 / 9 4. 6 1

*

c i t e d by

examiner

P r i m a r y

E x a m i n e r i R e b e c c a P r o u t y

( 7 4 ) A t t o r n e y , A g e n t ,

o r

F

rmiMarshall

G e r s t e i n

&

orun

LLP

( 5 7 )

ABSTRACT

The p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s

a

f o r m u l a t i o n c o m p r i s i n g

a

p h a r m a c e u t i c a l

c o m p o s i t i o n c o m p r i s i n g

a

human

r e c o m b i

nant o t - L - i d u r o n i d a s e o r b i o l o g i c al l y a c t i v e

o r

muteins

t h e r e o f

W i t h

a p u r i t y o f g r e a t e r t h a n 99%, o r i n c o m b i n a t i o n

W i t h a p h a r m a c e u t i c a l l y a c c e p t ab l e c a r r i e r . T h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n

f u r t h e r

p r o v i d e s

m e t h o d s t o t r e a t c e r t a i n g e n e t i c

d i s o r d e r s

i n c l u d i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y a n d m u c o

p o l y s a c c h a r i d o s i s

1 (MPS 1 ) b y a d m i n i s t e r i n g

s a i d

f o r m u

l a t i o n .

1 1

C l a i m s , 1 4

Drawing

S h e e t s

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S.

Patent A p r . 8 ,

2 0 0 8 S h e e t

2

o f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

F I G .

7 - 2

1 2 0 0

1 2 1 0 1 2 2 0 1 2 3 0 1 2 4 0 1 2 5 0

1 2 6 0

* *

“ k

‘ k

‘ k

‘ k

‘ k

k ‘ k

‘ k ‘ k ‘ k

" k “ k

1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0101001101

0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1

1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1

0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1

1000100001

1 2 7 0 1 2 8 0

1 2 9 0 1 3 0 0 1 3 1 0 1 3 2 0 1 3 3 0

*

1 1

~ 1 1 * ~ 1 1

~ 1 - 1 1 ~ 1 1 *

~ 1 1

~ 1 1

~ 1 1

~ 1 1

~ 1 1

0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0

0010001001

0010000010

1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1

1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0

1 3 1 1 0

1 3 5 0

1 3 0 0

1 3 7 0

1 3 8 0 1 3 9 0 1 1 1 0 0

*

' k

*

* i’

‘ k *

i

‘ k

* ‘ k

' k

‘k

*

0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1

1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0

1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1

0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1

1410

1 1 1 2 0 1 4 3 0 1 4 4 0 1 1 1 5 0 1 4 0 0

1470

* ‘ k *

*

*

*

i1 *

‘ k *

*

‘ k

5 %

1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0

0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0

0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0001011000

1 4 8 0

1 1 1 9 0 1 5 0 0 1 5 1 0 1 5 2 0 1 5 3 0

1 5 4 0

*

‘ k

* * ' k ‘ k ' k

‘ k

*

i’

‘ k

‘ k * 1

1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0

1 5 5 0 1 5 0 0 1 5 7 0 1 5 8 0 1 5 9 0

* ‘ k ‘ k ‘ k ‘ k k

‘ k

‘ k ‘ k ‘ k

CCCGAGCACG

CGTGGCC ATG CGT C C C CTG CGC C C C C G C GCC GCG CTG CTG GCG CTC

CTG

Met

Arg Pro Leu

Arg

Pro

Arg

A l a

Ala Leu Leu A l

a

Leu

Leu

1 6 0 0 1610 1620

1 6 3 0 1 6 4 0

1 6 5 0

, 1 ~ 1 1 ~ 1 1 - 1 1

* *

1 1 ~ 1 1 ~ 1 1

*

~ 1 1 ~ 1 1

GCC

TCG

CTC

CTG GCC GCG ( I C C 000 GTG GCC CCG GCC GAG GCC CCG CAC CTG GTG CAT

A l a Ser Leu Leu

A l

a Ala Pro Pro V a l Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu

V a l

His

1 6 6 0 1 6 7 0 1 6 8 0 1 6 9 0 1 7 0 0 1 7 1 0

*

*

~ k

*

* 1 1 '

i

‘ k

' k ‘ k *

GTG GAC GCG

GCC CGC

GCG

CTG

TGG CCC

CTG CGG

CGC TTC

TGG

AGG

AGC

ACA

GGC TTC

V a l

A s p

A l a

A l a

A r g A l a L e u

T r p

P r o L e u A r g A r g P h e

T r p

A r g

S e r

T h r

G l y

P h e

1 7 2 0 1 7 3 0 1 7 4 0 1 7 5 0 1 7 6 0 1 7 7 0

* i ‘ k i ‘ k ‘ k ‘ k * ‘ k t

T G C

CCC CCG

CTG CCA CAC AGC CAG GCT GAC CAG TAC GTC

CTC

AGC TGG

GAC

GAG CAG

C y s

Pro Pro Leu Pro H i s

Ser

G 1 1 Ala Asp

Gln

Tyr V a l

Leu

Ser

Trp Asp Gln

Gln

1780 1 7 9 0 1 8 0 0 1810 1 8 2 0

‘ k * ‘ k

i

* ‘ k

C T C

AAC C T C GCC TAT

GTG

GGC GCC GTC

CCT CAC

CGC GGC ATC

AAG CAG

GTC CGG ACC

L e u

A s n L e u A l a T y r

V a l

G l y A l a V a l P r o H i s A r g G l y

I l e

L y s G l n V a l A r g T h r

1 8 3 0 1 8 4 0

1 8 5 0 1 8 6 0 1 8 7 0

1 8 8 0

* ‘ k * i

* i - “ k *

*

* ~ k

C A C

T G G C T G C T G GAG C T T G T C ACC ACC AGG GGG TCC ACT

GGA

CGG G G C C T G AGC TAC

H i s

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L e u

L e u G l

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T h r

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A r g G l y

S e r T h r G l y

A r g

G l y L e u

S e r

T y r

1 8 9 0 1 9 0 0

1 9 1 0 1 9 2 0

1 9 3 0 1 9 4 0

,1

* 1 1

~ 1 1

= 1

~ 1 1

*

~ 1 1 ~ 1 1 ~ 1 1

~ 1 1

A A C T T C A C C

C A C CTG G A C G G G T A C C T G G A C C T T C T C AGG GAG AAC C A G

C T C

C T C CCA

A s n P h e T h r H i s L e u

A s p G l y

Tyr

L e u

Asp L e u

L e u

Arg G l

u

Asn Gln L e u L e u

P r o

1 9 5 0 1 9 6 0

1 9 7 0 1 9 8 0

1 9 9 0

,1

~ 1 1 ~ 1 1

11

~ 1 1 ~ 1 1

* k 1 1

6 6 6 T T T G A G CTG

ATG

G G C

AGC GCC TCG GGC

C A C TTC

ACT

GAC TTT GAG G A C A A G

CAG

G l y P h e G l

u L e u M e t G l y S e r A l a Ser Gly

H i s

P h e Thr Asp P h e

G l

u A s p L y s 0 1 n

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S.

Patent A p r . 8 ,

2 0 0 8

S h e e t 3

0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

F I G .

1 - 3

2 0 0 0 2 0 1 0 2 0 2 0 2 0 3 0 2 0 4 0

2 0 5 0

*

ir

*

1 '

: 1 ’ *

1 : 1 ' k

*

‘ k

*

C A G

GTG TTT

G A G T G G A A G G A C T T G G T C

T C C

A G C C T G G C C

AGG AGA T A G

A T C

GGT AGG

G l n

V a l P h e G l u T r p

L y s

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L e u V a l S e r

S e r L e u

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A r g T y r I l e G l y A r g

2 0 6 0 2 0 7 0 2 0 8 0

2 0 9 0

2 1 0 0 2 1 1 0

‘ k

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~ k

k t k i i’ i ‘ k

T A E GGA C T G G C G

C A T G T T T C C A A G T G G A A C

T T C

G A G

A C G T G G A A T GAG

CCA

GAC GAC

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L e u A l a H i s V a l

S e r

L y s T r p A s n P h e G l u

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G l u

P r o

A s p

H i s

2 1 2 0 2 1 3 0

2 1 4 0 2 1 5 0 2 1 6 0

, 1 * * * * * * * *

C A C

G A C T T T G A C A A C G T C T C C A T G A C C

A T G

C A A G G C

T T C

C T G A A C T A C T A C G A T G C C

H i s

A s p P h e A s p A s n

V a l

S e r M e t T h r M e t G l n G l y P h e L e u A s n

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A l a

2170 2180

2190

2200 2210

2220

i i

- A -

t * *

1 '

T G C TCG GAG GGT

C T G C G C GCC

G C C AGC C C C G C C

C T G

CGG

CTG GGA GGC CCC GGC GAC

C y s S e r G l u G l y L e u

A r g

A l a A l a

S e r

P r o A l a L e u

A r g

L e u G l y Gly P r o G l y A s p

2 2 3 0 2 2 4 0

2250

2 2 6 0

2270 2280

* * *

" k

T C C T T C C A C A C C C C A C C G

CGA

T C C C C G C T G AGC T G G GGC C T C C T G CGC C A C T G C CAC

S e r

P h e

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P r o A r g S e r P r o L e u S e r T r p G l y L e u L e u

A r g

H i s C y s H i s

2 2 9 0

2 3 0 0

2 3 1 0 2 3 2 0

2330 2340

* *

*

*

* * * *

* *

*

*

G A C G G T A C C A A C T T C T T C

ACT

G G G G A G G C G G G C GTG CGG CTG GAC TAC ATC T C C CTC

A s p G l y T h r A s n P h e P h e T h r G l y G l u A l a G l y

V a l

A r g L e u A s p Tyr

I l e

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2350 2360 2370 2380 2390

‘ k

~ k 1 :

it

C A C

AGG AAG GGT GCG CGC AGC TCC

ATC TCC

ATC CTG GAG

CAG

GAG AAG GTC GTC GCG

H i s A r g L y s Gly A l a A r g

Ser

Ser I l e Ser l l e L e u G l u Gln Glu L y s V a l V a l Ala

2400 2410 2420

2430 2440 2450

' k

‘ k

C A G C A G A T C C G G

CAG

C T C

TTC

C C C

AAG

T T C G C G

GAC

ACC

CCC

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G l n

G 1

n l l e A r g G l n L e u

P h e

P r o L y s

P h e

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2 4 6 0 2 4 7 0 2 4 8 0

2490 2500 2510

* i ‘ k 1 r ‘ 1 '

‘ k

i ’ " k ‘ k * *

G C G G A C

C C G

C T G G T G G G C T G G T C C C T G C C A

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CCG TGG AGG

G C G G A C G T G A C C

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2 5 2 0

2 5 3 0 2 5 4 0 2550 2560

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* i 1 r 1 ' * 1 E

G C G G C C

A T G

G T G G T G A A G G T C A T C GCG C A G

C A T

C A G

AAC

C T G CTA CTG G C C A A C AC6

A l a

A l

a

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V a l V a l

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I l e

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Leu Leu Leu Ala Asn Thr

2 5 7 0

2580 2590 2600 2610 2620

* *

3 i ’

* *

‘ A ’ ‘ k

ACC

T C C G C C TTC

CCC

T A C GCG CTC CTG

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A A C GAC

AAT

GCC

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AGC

TAC CAC

Thr

Ser A l a Phe

Pro

Tyr

A l a

Leu Leu Ser

Asn Asp

Asn

A l a Phe

Leu Ser

Tyr

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2630 2640 2650 2660 2670 2680

* ir ‘ k * 1 : ‘ k * ‘ k * ‘ A * *

C C G . C A C

C C C

T T C GCG CAG CGC ACG CTC ACC G C G CGC TTC CAG GTC AAC AAC ACC CGC

P r o H i s P r o

Phe

Ala

G l n Arg

Thr

Leu Thr Ala

Arg

Phe G l

n

V a l Asn Asn Thr

Arg

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S.

Patent A p r . 8 ,

2 0 0 8 S h e e t 4 o f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

F I G .

7 - 4

2690

2 7 0 0

2 7 1 0

2 7 2 0

* ' k

2 7 3 0

‘ k

*

C C G CCG C A C GTG C A G C T G TTG

C G C

A A G C C G

G T G

C T C A C G GCC ATG GGG CTG

CTG GCG

P r o P r o H i s V a l

G l n

L e u

L e u

A r g L y s P r o V a l L e u

T h r

A l a Met Gly

L e u

Leu Ala

2 7 4 0

2 7 5 0

2760 2 7 7 0 2780

2 7 9 0

* *

* * ' A -

1 ‘

* * ~ k

*

a -

*

C T G CTG GAT GAG GAG CAG CTC

T G G

G C C GAA G T G T C G CAG GCC GGG

ACC

GTC CTG GAC

Leu

Leu

Asp

G l u G l u

Gln Leu Trp

Ala

6 1

u

V a l Ser G l

n

Ala

Gly Thr V a l

Leu

Asp

2800 2810 2 8 2 0 2 8 3 0 2840

2850

' k

*

AGC AAC CAC ACG GTG GGC GTC

CTG GCC

AGC G C C

CAC

CGC CCC CAG

GGC

CCG GCC

GAC

Ser Asn H i s Thr

V a l

Gly V a l L e u A l a Ser A l a H i s Arg Pro Gln

Gly

Pro A l

a

Asp

2860 2870 2 8 8 0 2890 2900 2910

GCC

TGG

CGC GCC

GCG GTG CTG

ATC TAC GCG A G C

GAC GAC

ACC

CGC GCC

CAC

CCC AAC

Ala

Trp

Arg A l a

A l

a V a l Leu I l e

Tyr

A l

a

S e r

Asp Asp

Thr

Arg

Ala

H i s

Pro

Asn

2920

2930

2 9 4 0

2950

2960

*

*

*

‘ k

‘ k

i

- k

i * *

C G C

AGC

GTC

GCG GTG ACC CTG

CGG

CTG

C G C G G G

GTG CCC CCC GGC CCG GGC CTG GTC

A r g

Ser

V a l A l

a V a l

T h r L e u A r g L e u A r g G l y V a l P r o P r o

Gly

P r o G l y

Leu V a l

2 9 7 0

2980

2990 3 0 0 0

3010 3020

* ‘ k

* *

*

T A C

GTC ACG CGC T A C CTG

GAC

AAC

GGG

C T C

l G C

AGC CCC GAC GGC

GAG TGG CGG CGC

T y r V a l T h r A r g T y r L e u A s p A s n

G l y

L e u C y s S e r P r o

A s p

G l y G l u T r p A r g A r g

3 0 3 0 3 0 4 0 3050 3060 3070 3080

*

‘ k

*

‘ k

‘ k

i ’

*

~ k

C T G

GGC CGG CCC GTC

TTC

CCC ACG GCA

GAG C A G

TTC

. C G G

CGC ATG CGC GCG GCT GAG

L e u Gly

A r g

P r o V a l P h e Pro T h r Ala

6 1 u G l n Phe

Arg

Arg Met

Arg

A l a

Ala

Glu

3 0 9 0 3100 3 1 1 0 3120 3 1 3 0

* * * * * * *

G A C CCG GTG GCC GCG

GCG

CCC CGC CCC TTA

C C C GCC GGC GGC CGC CTG

ACC

CTG CGC

A s p P r o

V a l

A l

a

A l a

A l a P r o

A r g

P r o L e u P r o A l a Gly Gly

Arg L e u T h r L e u

A r g

3 1 4 0 3150 3160 3 1 7 0 3180 3 1 9 0

* ‘ k i :

i * i ’

C C C G C G

C T G

C G G C T G C C G T C G C T T T T G C T G

G T G

C A C GTG T G T GCG C G C

C C C

G A G AAG

P r o A l a L e u A r g L e u P r o Ser L e u Leu L e u V a l H i s V a l C y s Ala Arg P r o G l

u

L y s

3200 3210

3220 3230

3240 3250

*

' k

* ‘ k ‘ k ' k ‘ k

‘ k ' k

t

*

C C G C C C G G G

C A G

G T C

A C G C G G

C T C

CGC

G C C C T G

C C C

CTG

A C C CAA

GGG

C A G C T G

GTT

P r o P r o G l y G l n

V a l Thr Arg

L e u

Arg

Ala

L e u Pro Leu Thr

G l n

Gly

G l n Leu V a l

3 2 6 0 3270 3280 3290

3300

‘ k ‘ k

" k i ’

*

C T G

G T C T G G

TCG GAT

GAA

CAC GTG GGC T C C A A G TGC CTG TGG ACA

TAC

GAG A T C CAG

L e u V a l l r p

S e r

A s p G l

u

H i s V a l

G l y

S e r L y s C y s L e u T r p

T h r

T y r G l u I l e

G l

n

3 3 1 0

3 3 2 0 3330

3 3 4 0 3 3 5 0 3 3 6 0

1 1 '

k

**

i i * *

i:

* *

T T C T C T C A G GAC G G T AAG GCG T A C ACC C C G G T C AGC AGG AAG C C A T C G A C C T T C AAC

P h e

S e r 6 1

n A s p

G l y

L y s A l a

T y r

Thr

P r o

V a l Ser Arg

L y s P r o S e r T h r P h e

A s n

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S.

Patent A p r . 8 ,

2 0 0 8

S h e e t 8

0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

t

i d a s e 3 pg

nm

I d u r o n

C o n t a m i n a n

7234

L a n e

4

G a l / i

P r o c e s s E n z y m e

t h

few c o n t a m i n a n t s

i

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S.

Patent A p r . 8 ,

2 0 0 8

S h e e t 9

0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

—

r o d u c t i v i t y

( m g / d a y )

I d u r o n i d o s e E n z y m e A c t i v i t y

D u r i n g

P r o d u c t i o n

2 5 0 0 . 0 0

1 %

2 0 0 0 . 0 0

3

U‘

5 A

3

1 5 0 0 0 0

B e g i n P e r f u s i o n P e o k p e r f u s i o n r o t e

1 ; , ( i . e . c t l o n g e o ’ u t f r o m

s e r u m

8 0 p r o em r e e

1 : 1000.00

5 l /_l/ K

5 0 0 . 0 0

0 00

f I I

7

l f I l I I

l?’

l | l I

I I I

0 9 2 6 0 0 0 9 2 9 0 0

1 0 0 2 0 0

1 0 0 5 0 0

1 0 0 8 0 0

1 0 1

1 0 0

1 0 1 4 0 0 1 0 1 7 0 0

D a t e

5 0 0 0 I d u r o n i d o s e P r o d u c t i o n

L e v e l i n

P r o d u c t i o n

R u n P 0 2

E +36 i t e r F l o s k A

3

4 0 0 0 - -<>-36 L i t e r

F l o s k B

3

9 ?

E 3 0 0 0

“ 6

g

2 0 0 0

E

1 0 0 0

G)

g 0-

.

.

E

S e r u m

I

P r o t e i n - F r e e M e d i u m I

§

— 1 0 0 0 '

|

" ‘ C e l l G r o w t h

S t a b l e C e l l

M a s s

w i t h

P r o d u c t i o n

“ 6 — 2 0 0 0 ' P h a s e

E 4 0 0 -

llllllllll

B u t y r o t e

I n d u c t i o n E v e n t s

I I I | I I

5 1 0

1

5

2 0 2 5 3 0 3 5

D a y s

o f P r o d u c t i o n

F I G .

5 8

C D 4

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U . S .

Patent

A p r . 8 ,

2 0 0 8 S h e e t

1 1 0 f

1 4 US

, 3 5 4 , 5 7 6 B2

F /G° 6

E l b o w

0 n d

K n e e

E x t e n s i o n i n H A C O 0 2

1 8 0

1 7 5 '

1 7 0 “

1 6 5 i

g

1 5 0 l

E ‘ 1 5 5

1 5 0 '

1 4 5 ' — < > -

R i g h t

E i b o w

1 4 0 W 0 ' - L e f t E l b o w

—v— R i g h t

K n e e

1 5 5 1 —v—

R i g h t

K n e e

0

T o

2 ' 0 3 ' 0 4 0 5 b

s o

1 5 D

1 4 0 ‘

1 3 0 '

1 2 0 '

1 1 0 1

e g r e e s

1 0 0 +

s o l

8 0

F / G . 7

1 ' 0

2 b

5 0 4 b 5 0 6 b

7 ? a 5 9 E 1

1 6 0 1 1 6 1 1 2

W e e k s

0 . .

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S. Patent

A p r . 8 ,

2 0 0 8 S h e e t 1 2

0 f

1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

S l e e p

A p n e a

I m p r o v e s

1 0 0

8 0

0

w e e k s

S A O Z

A p n e o s

+

H y p o p n e o s D u r i n g S l e e p

P r e

a n d

P o s t

T r e a t m e n t

[ 3

P r e t r e a t m e n t ‘ 2 . ?

E ]

2 6

w e e k s

T r e a t m e n t

N L I J - P ~ U I O I \ I C D

D O O O O O O

0 5 : 7 5 : : 5 1 5 ? 1 . . 2

T i ; r - a f - ‘ l é

O M 0 0 1

R C D O U 3 S W D O Q 5 J A N O O 7 C E L O O Q

A H C D D Z S S H O O 4 CMDOOB N-M008 B 8 6 0 1 0

F / G . 9

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S. Patent

A p r . 8 ,

2 0 0 8

S h e e t 1 3 o f

1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

P u l m o n a r y F u n c t i o n T e s t s i n G M D O O G

1 . 6

5 2 w k s

1

. 4

2 3 0 %

I m p r o v e m e n t

0 . 8

0.4

0 . 2 4

F

V 1 F E V 3

F I G ,

7 0

I n c r e a s e d

H e i g h t

G r o w t h

V e l o c i t y

85% M e a n I n c r e a s e i n G r o w t h R a t e

1 10 Post-treatment

O

o

I d g r o w t h r a t e

e r c e n t

r i g i n a le i g h t

5

r

9 6 *

P r e t r e a t m e n t

8 8

F I G . 7 7

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


U.S. Patent

A p r . 8 ,

2 0 0 8 S h e e t 1 4

0 f

1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2

C h i n z s ‘ e z H a m s t e r O v a r y H o s t P r o t e i n C o n t a m i n a t i o n

b y

E L I S A A s s a y

S O U R C E

A N D B A T C H 8 8 3 0 1 1 1 1 1 1 5 1 1

P E R C E N T

C H O P

2 1 1 2 5 1 5 0 5 1 1 3 0

N U M B E R ( m i c r o g m m p e r

m m i g m m )

C O N T A M I N A T I O N

C H O P

P r i o r P r o c e s s ( C a r s o n / R E D

0 9 0 0 2

1 4 1 . 4 2 »

9 8 . 6 %

0 9 0 0 3 2 4 2 . 4 %

9 7 . 6 %

0 9 0 0 4 1 6 1

. 6 2 5

9 8 . 4 %

N e w P r o c e s s

( G a l l i )

P 1 0 0 3 ( 1 . 3

< 0 . 1 3 %

> 9 9 . 9 %

P 1 0 0 6

1 . 2 0 . 1 2 %

9 9 . 9 %

P 1 0 0 7 <06 < 0 . 0 6 % > 9 9 . 9 %

P 1 0 0 8 < 0 . 6 7 < 0 . 0 6 7 %

> 9 9 . 9 %

C o m p a r i s o n

o f G a l l i

a n d C a r s o n

M a t e r i a l

1 2 3

1 7 5 1 7 5

8 3 8 3

6 2 6 2

4 8 4 8

3 3 3 3

2 5 2 5

1 7 1 7

a n t i - I D U W e s t e r n b l o t S D S - P A G E s i l v e r s t a i n

1 : 5 0 , 0 0 0

1 M a r k e r

2 6 0 1 1 5

R e f e r e n c e d - 0 2 0 1

3

C a r s o n C 9 0 0 2

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


US

7 , 3 5 4 , 5 7 6

B2

1

METHODS

OF TREATING DISEASES

CAUSED

BYDEFICIENCIES OF

RECOMBINANT t-L-IDURONIDASE

T h i s a p p l i c a t i o n i s a c o n t i n u a t i o n o f

US.

p a t e n t a p p l i c a

t i o n S e r .

No.

0 9 / 9 9 3 , 2 4 1 , ? l e d N o v . 1 3 , 2 0 0 1 , now US.

P a t .

N o . 6 , 8 5 8 , 2 0 6 ,

Which

s

a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t

o f US.

a t e n t

a p p l i c a t i o n

S e r .

N o . 0 9 / 7 1 1 , 2 0 5 , ? l e d

N o v .

9 , 2 0 0 0 , n o w

US. P a t .

No. 6 , 5 8 5 , 9 7 1 , Which

i s a

c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t

o f

US.

p a t e n t a p p l i c a t i o n

S e r . N o .

0 9 / 4 3 9 , 9 2 3 ,

? l e d N o v .

1 2 ,

1 9 9 9 ,

n o w

US. P a t . No. 6 , 4 2 6 , 2 0 8 .

FIELD

OF THE INVENTION

The p r e s e n t i n v e n t i o n

i s i n t h e

? e l d

o f m o l e c u l a r b i o l o g y ,

e n Z y m o l o g y , b i o c h e m i s t r y

a n d

c l i n i c a l m e d i c i n e .

I n p a r t i c u

l a r ,

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

p r o v i d e s a human r e c o m b i n a n t

o t - L - i d u r o n i d a s e , m e t h o d s o f

l a r g e - s c a l e p r o d u c t i o n

a n d

p u r i ? c a t i o n o f c o m m e r c i a l g r a d e human r e c o m b i n a n t

o t - L

i d u r o n i d a s e

enzyme,

and methods

t o

t r e a t

c e r t a i n

g e n e t i c

d i s o r d e r s i n c l u d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e

d e ? c i e n c y a n d

m u c o

p o l y s a c c h a r i d o s i s I ( M P S I ) .

BACKGROUNDOF THE INVENTION

C a r b o h y d r a t e s

p l a y a number

o f

i m p o r t a n t

r o l e s i n

t h e

f u n c t i o n i n g o f l i v i n g

o r g a n i s m s . I n a d d i t i o n

t o

t h e i r m e t a

b o l i c

r o l e s , c a r b o h y d r a t e s

a r e

s t r u c t u r a l

c o m p o n e n t s

o f t h e

human

body c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o numerous o t h e r e n t i t i e s

s u c h a s p r o t e i n s a n d l i p i d s ( c a l l e d g l y c o c o n j u g a t e s ) .

F o r

e x a m p l e ,

h uman c o n n e c t i v e t i s s u e s

a n d c e l l

membranes

c o m p r i s e p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s

a n d a p r o t e o g l y c a n a t r i x .

T h e

c a r b o h y d r a t e p o r t i o n

o f

t h i s p r o t e o g l y c a n m a t r i x p r o

v i d e s i m p o r t a n t p r o p e r t i e s t o t h e b o d y ’ s s t r u c t u r e .

A

e n e t i c

d e ? c i e n c y o f

t h e c a r b o h y d r a t e - c l e a v i n g , l y s o

somal enZyme o t - L - i d u r o n i d a s e c a u s e s a

lysosomal

s t o r a g e

d i s o r d e r

knoWn s m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I (MPS ) ( N e u

f e l d

a n d M u e n Z e r ,

p p .

1 5 6 5 - 1 5 8 7 ,

i n

T h e

M e t a b o l i c B a s i s

o f

I n h e r i t e d

D i s e a s e ,

E d s . , C . R .

S c r i v e r , A .

L .

B e a u d e t , W. S .

S l y ,

a n d D . V a l l e , M c G r a W - H i l l ,

NeW York

( 1 9 8 9 ) )

I n a

s e v e r e f o r m , MPS i s

c o m m o n l y

knoWn s H u r l e r syndrome

a n d i s a s s o c i a t e d W i t h m u l t i p l e p r o b l e m s s u c h a s m e n t a l

r e t a r d a t i o n ,

c l o u d i n g

o f t h e

c o r n e a ,

c o a r s e n e d

f a c i a l

f e a

t u r e s , c a r d i a c d i s e a s e ,

r e s p i r a t o r y

d i s e a s e , l i v e r a n d

s p l e e n

e n l a r g e m e n t , h e r n i a s ,

a n d

j o i n t

s t i f f n e s s . P a t i e n t s s u f f e r i n g

from H u r l e r

syndrome u s u a l l y d i e b e f o r e a g e 1 0 . I n a n

i n t e r m e d i a t e fo r m k n oWn a s

H u r l e r - S c h e i e syndrome,

men

t a l

f u n c t i o n i s g e n e r a l l y n o t s e v e r e l y a f f e c t e d , b u t p h y s i c a l

problems m a y

l e a d

t o d e a t h by t h e t e e n s

o r

t W e n t i e s . S c h e i e

syndrome s t h e

m i l d e s t

f o r m o f MPS .

I t

i s c o m p a t i b l e W i t h

a

n o r m a l

l i f e s p a n ,

b u t

j o i n t s t i f f n e s s ,

c o r n e a l c l o u d i n g a n d

h e a r t v a l v e d i s e a s e c a u s e s i g n i ? c a n t p r o b l e m s .

The

f r e q u e n c y o f MPS i s

e s t i m a t e d

t o b e 1 : 1 0 0 , 0 0 0

a c c o r d i n g

t o

a

B r i t i s h

Columbia s u r v e y

of a l l neWboms

( L o W r y ,

e t

a l . , H u m a n

G e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 - 3 9 0

( 1 9 9 0 ) ) a n d

1 : 7 0 , 0 0 0

a c c o r d i n g

t o a n r i s h s t u d y ( N e l s o n , H u m a n G e n e t

i c s 101:355-358

( 1 9 9 0 ) ) .

There a p p e a r s t o be no e t h n i c

p r e d i l e c t i o n

f o r

t h i s

d i s e a s e .

I t i s l i k e l y t h a t W o r l d W i d e t h e

d i s e a s e

i s

u n d e r d i a g n o s e d

e i t h e r b e c a u s e t h e p a t i e n t d i e s

o f

a

c o m p l i c a t i o n

b e f o r e t h e d i a g n o s i s

i s made

o r

b e c a u s e

t h e

m i l d e r f o r m s o f t h e syndrome m a y b e m i s t a k e n f o r a r t h r i t i s

o r

m i s s e d e n t i r e l y . E f f e c t i v e

neWbo m s c r e e n i n g

f o r MPS

Would

l i k e l y ?nd some

p r e v i o u s l y

u n d e t e c t e d p a t i e n t s .

E x c e p t

f o r a feW p a t i e n t s Which q u a l i f y f o r bone

marroW

t r a n s p l a n t a t i o n , t h e r e a r e n o s i g n i ? c a n t t h e r a p i e s a v a i l a b l e

f o r a l l MPS p a t i e n t s .

H o b b s , e t

a l .

( L a n c e t

2 :

7 0 9 - 7 1 2

( 1 9 8 1 ) )

? r s t

r e p o r t e d t h a t

bone

marroW

t r a n s p l a n t a t i o n s u c

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

2

c e s s f u l l y t r e a t e d

a H u r l e r p a t i e n t . S i n c e t h a t t i m e ,

c l i n i c a l

s t u d i e s a t s e v e r a l t r a n s p l a n t c e n t e r s

h a v e

shoWn i m p r o v e

ment

i n

p h y s i c a l d i s e a s e a n d s l o W i n g o r s t a b i l i Z i n g o f

d e v e l o p m e n t a l d e c l i n e i f p e r f o r m e d e a r l y . ( W h i t l e y , e t a l . ,

Am. . Med. G e n e t .

4 6 :

2 0 9 - 2 1 8

( 1 9 9 3 ) ; V e ll o d i,

e t

a l . , A r c h .

D i s . C h i l d . 7 6 : 9 2 - 9 9 ( 1 9 9 7 ) ; P e t e r s , e t a l . ,

Blood

9 1 :

2 6 0 1 - 2 6 0 8

( 1 9 9 8 ) ; G u l f o n , e t a l . , J . P e d i a t r i c s

1 3 3 : 1 1 9 - 1 2 5

( 1 9 9 8 ) ) H o W e v e r ,

t h e

s i g n i ? c a n t

m o r b i d i t y a n d m o r t a l i t y ,

and t h e

need

f o r matched d o n o r m a r r o W ,

l i m i t s

t h e u t i l i t y

o f

bone marroW t r a n s p l a n t s . An

l t e r n a t i v e

t h e r a p y a v a i l a b l e t o

a l l

a f f e c t e d

p a t i e n t s

Would

p r o v i d e a n i m p o r t a n t

b r e a k

t h r o u g h

i n

t r e a t i n g

a n d m a n a g i n g t h i s

d i s e a s e .

EnZyme r e p l a c e m e n t

t h e r a p y

h a s b e e n c o n s i d e r e d

a

p o t e n t i a l

t h e r a p y

f o r M P S

I f o l l o W i n g

t h e

d i s c o v e r y

t h a t

o t - L - i d u r o n i d a s e

can c o r r e c t

t h e

e n z y m a t i c

d e f e c t i n H u r l e r

c e l l s

i n c u l t u r e ,

b u t t h e d e v e l o p m e n t

o f

human

t h e r a p y

h a s

been

t e c h n i c a l l y u n f e a s i b l e u n t i l noW. I n t h e c o r r e c t iv e

p r o c e s s ,

t h e

enZyme

c o n t a i n i n g a m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e

r e s i d u e i s t a k e n u p

i n t o

c e l l s t h r o u g h

r e c e p t o r - m e d i a t e d

e n d o c y t o s i s

a n d t r a n s p o r t e d

t o t h e l y s o s o m e s W h e r e

t

c l e a r s

t h e s t o r e d s u b s t r a t e s ,

h e p a r a n

s u l f a t e a n d d e r m a t an

s u l f a t e .

A p p l i c a t i o n o f

t h i s

t h e r a p y t o

humans h a s

p r e v i o u s l y

n o t

been

p o s s i b l e

due

t o

i n a d e q u a t e s o u r c e s

o f


i n t i s s u e s .

For

o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme

t h e r a p y i n MPS , a recom

b i n a n t

s o u r c e

of

enZyme h a s

been

needed i n o r d e r t o o b t a i n

t h e r a p e u t i c a l l y

s u ? i c i e n t s u p p l i e s

o f

t h e

e n Z y m e . The

cDNA

f o r

t h e c a n i n e enZyme Was

c l o n e d

i n

1 9 9 1

( S t o l t Z f u s , e t a l . ,

J . B i o l .

Chem.

2 6 7 : 6 5 7 0 - 6 5 7 5 ( 1 9 9 2 ) a n d f o r

t h e

h uman

enZyme i n

t h e

same y e a r . ( S c o t t , e t

a l . ,

P r o c . N a t l . A c a d . S c i .

USA.

8 8 : 9 6 9 5 - 9 6 9 9

( 1 9 9 1 ) ,

M o s k o W i t Z ,

e t a l . ,

FASEB

J

6 : A 7 7

( 1 9 9 2 ) ) . F o l l o w i n g t h e

c l o n i n g

o f

cDNA f o r

o t - L

i d u r o n i d a s e ,

t h e

p r o d u c t i o n

o f a d e q u a t e q u a n t i t i e s o f r e c o m

b i n a n t


a l l o W e d

t h e

s t u d y

o f

enZyme

r e p l a c e m e n t

t h e r a p y i n c a n i n e

M P S

. ( K a k k i s , e t a l . ,

P r o t e i n

E x p r . P u r i f : 2 2 5 - 2 3 2

( 1 9 9 4 ) )

E n Z y m e r e p l a c e m e n t s t u d i e s

i n t h e

c a n i n e

MPS

model d e m o n s t r a t e d

t h a t

i n t r a v e n o u s l y

a d m i n i s t e r e d

r e c o m b i n a n t


d i s t r i b u t e d

W i d e l y

a n d

r e d u c e d l y s os o m al s t o r a g e

f r o m

many t i s s u e s .

( S h u l l ,

e t

a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA. 9 1 : 1 2 9 3 7 - 1 2 9 4 1

( 1 9 9 4 ) ; K a k k i s ,

e t

a l . ,

B i o c h e m . M o l .

M e d . 5 8 : 1 5 6 - 1 6 7

( 1 9 9 6 ) )

BRIEF

SUMMARY OF THE INVENTION

I n one a s p e c t , t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

f e a t u r e s a

method

t o

mass

p r o d u c e

human

r e c o m b i n a n t


i n l a r g e

s c a l e a m o u n t s W i t h

a p p r o p r i a t e

p u r i t y t o

e n a b l e

l a r g e s c a l e

p r o d u c t i o n f o r l o n g t e r m p a t i e n t u s e o f

t h e enZyme

t h e r a p y .

I n a b r o a d

e m b o d i m e n t ,

t h e

method c o m p r i s e s

t h e s t e p o f

t r a n s f e c t i n g a

cDNA

ncoding

f o r

a l l o r p a r t

o f an

o t - L


i n t o

a c e l l s u i t a b l e f o r t h e e x p r e s s i o n t h e r e o f . I n

s o m e

embodiments,

a cDNA ncoding f o r a complete

o t - L

i d u r o n i d a s e i s u s e d , p r e f e r a b l y a h uman

o t - L - i d u r o n i d a s e .

HoWever, i n o t h e r embodiments, a cDNA n c o d i n g f o r a

b i o l o g i c a l l y a c t i v e

f r a g m e n t o r m u t e i n t h e r e o f m a y b e u s e d .

S p e c i ? c a l l y , one

o r

m o r e

amino a c i d s u b s t i t u t i o n s

may e

made

W h i l e p r e s e r v i n g o r e n h a n c i n g t h e b i o l o g i c a l

a c t i v i t y

o f t h e enZyme. I n o t h e r p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s ,

an e x p r e s

s i o n v e c t o r i s used to t r a n s f e r t h e cDNA n t o a s u i t a b l e c e l l

o r c e l l l i n e f o r

e x p r e s s i o n t h e r e o f .

I n

one

p a r t i c u l a r l y

p r e

f e r r e d embodiment, t h e cDNA s t r a n s f e c t e d i n t o a

C h i n e s e

hamster o v a r y

c e l l

t o c r e a t e c e l l l i n e

2 . 1 3 1 .

I n

y e t o t h e r

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e

p r o d u c t i o n p r o c e d u r e f e a t u r e s

one o r m o r e of t h e folloWing c h a r a c t e r i s t i c s

Which

have

d e m o n s t r a t e d

p a r t i c u l a r l y h i g h p r o d u c t i o n l e v e l s : ( a )

t h e

pH

o f t h e c e l l

groWth

c u l t u r e m a y e l o W e r e d t o a b o u t 6 . 5 t o

7 . 0 ,

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


US

7 , 3 5 4 , 5 7 6

B2

3

p r e f e r a b l y

t o

a b o u t 6 . 8 - 7 . 0

d u r i n g t h e

p r o d u c t i o n

p r o c e s s ,

( b ) a s m a ny a s 2

t o

3 . 5

c u l t u r e v o l umes

of h e m e d i u m may

b e c h a n g e d d u r i n g e a c h 2 4 - h o u r p e r i o d b y

c o n t i n u o u s

p e r f u s i o n , ( c ) o x y g e n s a t u r a t i o n

may b e

o p t i m i Z e d

t o

a b o u t

40

u t m a y

be

a s

h i g h

a s

80%,

( d )

macroporous

c e l l u l o s e

m i c r o c a r r i e r s

W i t h a b o u t

5 erum i n t h e

m e d i u m n i t i a l l y ,

m a y be u s e d t o p r o d u c e

c e l l mass

f o l l o W e d

by a r a p i d

W a s h o u t s h i f t

t o

p r o t e i n - f r e e medium

f o r

p r o d u c t i o n , ( e ) a

p r o t e i n - f r e e

o r loW protein-medium such a s a JRH Bio

s c i e n c e s PF-CHO p r o d u c t

may

b e o p t i m i Z e d t o

i n c l u d e

supplemental

amounts

of one o r m o r e

i n g r e d i e n t s s el e c t e d

f r o m

t h e g r o u p c o n s i s t i n g

o f : g l u t a m a t e , a s p a r t a t e , g l y c i n e ,

r i b o n u c l e o s i d e s , a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ;

( f )

a s t i r r e d

t a n k

s u s p e n s i o n

c u l t u r e m a y b e

p e r f u s e d

i n a

c o n t i n u o u s

p r o c e s s

t o

p r o d u c e i d u r o n i d a s e .

I n a

s e c o n d

a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a

t r a n s f e c t e d c e l l

l i n e , W h i c h f e a t u r e s

t h e a b i l i t y t o

p r o d u c e

o t - L - i d u r o n i d a s e i n

a m o u n t s ,

Which e n a b l e u s i n g t h e enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y .

I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

f e a t u r e s a recombinant Chinese hamster ovary c e l l

l i n e s u c h a s

t h e

2 . 1 3 1

c e l l

l i n e

t h a t

s t a b l y a n d

r e l i a b l y

p r o d u c e s a m o u n t s o f o t - L - i d u r o n i d a s e W h i c h e n a b l e

u s i n g

t h e

enZyme

h e r a p e u t i c a l l y . I n

some

r e f e r r e d


t h e c e l l l i n e m a y

c o n t a i n

m o r e t h a n 1

copy

of an e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t . I n

even

m o re

r e f e r r e d embodiments, t h e c e l l l i n e

e x p r e s s e s

recombinant o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts of a t

l e a s t

2 0

m i c r o g r a m s

p e r 1 0 7 c e l l s p e r d a y .

I n a t h i r d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s

n o v e l

v e c t o r s s u i t a b l e

t o produce


i n

amounts

W h i c h e n a b l e u s i n g t h e enZyme h e r a p e u t i c a l l y .

I n p r e f e r r e d


t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

f e a t u r e s a n

e x p r e s s i o n

v e c t o r

c o m p r i s i n g a c y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h a n c e r

e l e m e n t , a

5 '

i n t r o n c o n s i s t i n g of a

murine

C O . i n t r o n , a

cDNA ncoding a l l

o r

a fragment

o r mutein of an

o t - L

i d u r o n i d a s e , a n d a 3 ' b o v i n e g r o W t h hormone p o l y a d e n y l a

t i o n s i t e . A l s o , p r e f e r a b l y

t h e

cDNA n c o d i n g

a l l

o r

a

fragment o r mutein

o f

an o t - L - i d u r o n i d a s e i s

a b o u t

2 . 2 kb

i n

l e n g t h .

T h i s e x p r e s s i o n v e c t o r

may

b e

t r a n s f e c t e d

a t ,

f o r

e x a m p l e , a 50 t o 1 r a t i o With any

a p p r o p r i a t e common

s e l e c t i o n

v e c t o r

s u c h a s pSV2NEO, t o enhance

m u l t i p l e

c o p y i n s e r t i o n s .

A l t e r n a t i v e l y , g e n e a m p l i ? c a t i o n may b e

u s e d t o

i n d u c e

m u l t i p l e copy

i n s e r t i o n s .

I n a f o u r t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s

n o v e l

o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n

a c c o r d a n c e

W i t h t h e m e t h o d s

o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a n d t h e r e b y p r e s e n t i n a m o u n t s

W h i c h e n a b l e u s i n g

t h e

e n Z y m e

t h e r a p e u t i c a l l y . T h e s p e c i ? c

a c t i v i t y o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o

t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n i s i n

e x c e s s

o f

2 0 0 , 0 0 0

u n i t s p e r m i l l i g r a m p r o t e i n .

P r e f e r a b l y ,

i t

i s i n e x c e s s o f

a b o u t

2 4 0 , 0 0 0 u n i t s p e r m i l l i

gram r o t e i n . The m o l e c u l a r

W e i g h t o f

t h e o t - L - i d u r o n i d a s e

o f

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n i s a b o u t 8 2 , 0 0 0 d a l t o n s , a b o u t

7 0 , 0 0 0 d a l t o n s

b e i n g

a m i n o a c i d ,

a n d

a b o u t 1 2 , 0 0 0

d a l t o n s

b e i n g c a r b o h y d r a t e s .

I n a ? f t h

a s p e c t ,


f e a t u r e s

a n o v e l

method

to p u r i f y


According t o a ? r s t

embodiment, a c e l l mass may be groWn

i n

about

5

s e r u m - c o n t a i n i n g

medium,

f o l l o W e d by a s W i t c h t o a

modi

? e d p r o t e i n - f r e e p r o d u c t i o n medium W i t h o u t a n y s i g n i ? c a n t

a d a p t a t i o n t o p r o d u c e a

h i g h

s p e c i ? c

a c t i v i t y s t a r t i n g

m a t e

r i a l

f o r p u r i ? c a t i o n . I n o n e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , a

t h r e e

s t e p

column

c h r o m a t o g r a p h y

may

b e u s e d t o

p u r i f y t h e

enZyme. Such a t h r e e s t e p

column

c h r o m a t o g r a p h y m a y

i n c l u d e u s i n g a b l u e s e p h a r o s e

F F ,

a

Cu++

c h e l a t i n g

s e p h a r o s e

c h r o m a t o g r a p h y

a n d a p h e n y l

s e p h a r o s e

H P h r o

m a t o g r a p h y . I n a n o t h e r p r e f e r r e d


a n

a c i d

p H

t r e a t m e n t

s t e p

i s u s e d

t o i n a c t i v a t e p o t e n t i a l v i r u s e s

W i t h o u t

h a r m i n g

t h e e n Z y m e . C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e , H e p a r i n

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

4

S e p h a r o s e a n d

S e p h a c r y l 200

c o l u m n s

a r e

removed a n d

B l u e - S e p h a r o s e

a n d

c o p p e r

c h e l a t i n g

c o l u m n s a d d e d t o

i n c r e a s e

t h e

c a p a c i t y

o f t h e

l a r g e

s c a l e p u r i ? c a t i o n p r o c e s s ,

t o r e d u c e u n d e s i r a b l e

l e a c h a b l e s i n a p p r o p r i a t e

f o r

l o n g t e r m

p a t i e n t u s e , a n d

t o

i m p r o v e t h e p u r i t y o f t h e p r o d u c t .

I n

a s i x t h a s p e c t , t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e l

methods

o f

t r e a ti n g d i s e a s e s

c a u s e d

a l l

o r i n p a r t

by

a

d e ? c i e n c y i n


I n o n e e m b o d i m e n t ,

t h i s

method

f e a t u r e s

a d m i n i s t e r i n g a r e c o m b i n a n t o t - L - i d u

r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment

o r

mutein t h e r e o f

a l o n e o r

i n

combination With a p h a r m a c e u t i c a l l y s u i t a b l e

c a r r i e r .

I n

o t h e r


t h i s method f e a t u r e s

t r a n s

f e r r i n g

a

n u c l e i c a c i d

encoding a l l o r a

p a r t

of

an o t - L

iduronidase

i n t o one

o r m o r e h o s t

c e l l s i n

v i v o . P r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s i n c l u d e o p t i m i Z i n g t h e d o s a g e t o t h e n e e d s o f

t h e

o r g a n i s m

t o

b e

t r e a t e d , p r e f e r a b l y

mammals o r

h u m a n s ,

t o e f f e c t i v e l y a m e l i o r a t e t h e d i s e a s e s y m p t o m s . I n p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s , t h e

d i s e a s e i s M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I (MPS

I ) ,

H u r l e r s y n d r o m e , H u r l e r - S c h e i e

s y n d r o m e o r S c h e i e

s y n d r o m e .

I n a s e v e n t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

f e a t u r e s

n o v e l

p h a r m a c e u t i c a l c o m p o s i t i o n s

c o m p r i s i n g


u s e f u l f o r t r e a t i n g a d i s e a s e

c a u s e d a l l

o r

i n

p a r t by a

d e ? c i e n c y

i n o t - L - i d u r o n i d a s e . S u c h c o m p o s i t i o n s may b e

s u i t a b l e

f o r a d m i n i s t r a t i o n

i n a n u mbe r

of

Ways

such a s

p a r e n t e r a l , t o p i c a l , i n t r a n a s a l ,

i n h a l a t i o n

o r o r a l a d m i n i s t r a

t i o n . Within

t h e

s c o p e of t h i s

a s p e c t

a r e embodiments

f e a t u r i n g

n u c l e i c

a c i d s e q u e n c e s encoding l l o r a

p a r t

of an

o t - L - i d u r o n i d a s e , Which

m a y b e a d m i n i s t e r e d i n v i v o i n t o

c e l l s ,

a f f e c t e d

w i t h

a n

o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .

DESCRIPTION

OF

THE FIGURES

F I G .

1 r e p r e s e n t s t h e

n u c l e o t i d e and deduced

amino

a c i d

s e q u e n c e s o f

cDNA

n c o d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e (SEQ I D

NOS:1 a n d

2 ) .

N u c l e o t i d e s 1

t h r o u g h

6200 a r e p r o v i d e d .

Amino a c i d s a r e

p r o v i d e d s t a r t i n g W i t h

t h e ? r s t

m e t h i o n i n e

i n

t h e o p e n r e a d i n g

f r a m e .

FIG.

2

r e p r e s e n t s t h e r e s u l t s from

S DS-PAGE

r u n s of

e l u a t e o b t a i n ed a c c o r d i n g

t o t h e

p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e d

b e l o W .

The

t o p p a n e l s h o W s t h e SDS-PAGE r e s u l t s o f

p u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s e

( 3 m i c r o g r a m s )

a n d

c o n t a m i n a n t s

f r o m t h e

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n scheme d i s c l o s e d

i n Kak

k i s ,

e t

a l . ,

P r o t e i n E x p } : P u r i f . ‘ 5 : 2 2 5 - 2 3 2 ( 1 9 9 4 ) . I n t h e

b o t t o m p a n e l , SDS-PAGE r e s u l t s

o f p u r i ? e d

o t - L - i d u

r o n i d a s e W i t h

c o n t a m i n a n t s f r o m a n

u n p u b l i s h e d

p r i o r

p r o

d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s

( U S . p a t e n t a p p l i c a t i o n

S e r .

N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9

and

0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 )

r e f e r r e d t o a s t h e

Carson

method i n L a n e s

2

( 7 . 5

m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e )

a n d

L a n e 3 ( 5 . 0 m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e )

a r e

c o m p a r e d

t o

t h a t

o f

t h e

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n

p r o c e s s o f t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n r e f e r r e d t o a s t h e G a l l i

P r o c e s s

(Lane

4

5 micro

g r a m s

o t - L - i d u r o n i d a s e ) .

Lane 1

c o n t a i n s t h e

m o l e c u l a r

W e i g h t m a r k e r . F I G . 2 s h o W s t h a t t h e

G a l l i

p r o d u c t i o n /

p u r i ? c a t i o n method o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n y i e l d s a h i g h l y

p u r i ? e d

o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c t

W i t h f e W e r


i n c o m p a r i s o n

W i t h

p r i o r p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n

s c h e m e s .

F I G .

3 d e m o n s t r a t e s t h e o t - i d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n l e v e l

o v e r a

3 0 - d a y

p e r i o d , d u r i n g Which t i m e c e l l s a r e s W i t c h e d

at day 5 from a serum4containing m e d i u m

t o

a s e r u m - f r e e

medium.

o t - I d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n Was c h a r a c t e r i Z e d b y :

( 1 ) a b s e n c e

o f a

need

f o r a d a p t a t i o n When e l l s a r e

s W i t c h e d

from s e r u m - c o n t a i n i n g t o s e r u m - f r e e m e d i u m a t 100200

( t o p

a n d b o t t o m p a n e l s )

W i t h a n

u n i n t e r r u p t e d i n c r e a s e

i n

p r o d u c t i v i t y

( t o p

p a n e l ) ;

( 2 ) a h i g h l e v e l o f

p r o d u c t i o n

i n

e x c e s s o f 4 mg e r l i t e r ( 1 0 0 0 p e r mL)

i n

a p r o t e i n - f r e e

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


US

7 , 3 5 4 , 5 7 6

B2

5

medium ( b o t t o m p a n e l ) ; a n d ( 3 ) a b o o s t i n o t - i d u r o n i d a s e

p r o d u c t i o n W i t h

b u t y r a t e i n d u c t i o n e v e n t s ( b o t t o m p a n e l ) .

F I G .

4

d e m o n s t r a t e s

a d e c r e a s e i n

l i v e r v o l u m e

d u r i n g

enZyme

t h e r a p y

i n

M P S

p a t i e n t s .

F I G .

5

d e m o n s t r a t e s u r i n a r y GAG e x c r e t i o n

d u r i n g

e n Z y m e

t h e r a p y .

F I G .

6 d e m o n s t r a t e s elbow and

knee

e x t e n s i o n

i n

HAC002 d u r i n g e n Z y m e

t h e r a p y .

F I G .

7

d e m o n s t r a t e s s h o u l d e r

?exion

to

104

Weeks

i n

f o u r

p a t i e n t s

W i t h

t h e m o s t r e s t r i c t i o n d u r i n g enZyme t h e r a p y .

F I G . 8 d e m o n s t r a t e s i m p r o v e m e n t i n s l e e p a p n e a b e f o r e

a n d a f t e r s i x

Weeks

o f t h e r a p y .

F I G . 9


t h e improvement i n

a p n e a s

and

h y p o p n e a s

d u r i n g s l e e p

W i t h

e n Z y m e t h e r a p y

i n e a c h

i n d i

v i d u a l

p a t i e n t .

F I G .

1 0

d e m o n s t r a t e s t h e i m p r o v e m e n t i n p u l m o n a r y

f u n c t i o n t e s t s

b e f o r e

and a f t e r

1 2

and 52 Weeks of

enZyme

t h e r a p y

i n o n e

p a t i e n t .

F I G . 1 1


i n c r e a s e d h e i g h t g r o W t h

v e l o c i t y

W i t h

enZyme t h e r a p y .

F I G . 1 2 s h o W s t h e

d e g r e e

o f c o n t a m i n a t i o n

by

C h i n e s e

H a m s te r O v a r y P r o t e i n (CHOP)

a n d d e g r e e o f p u r i t y o f

o t - L - i d u r o n i d a s e ,

p r o d u c e d

b y

( 1 )

t h e

C a r s o n

m e t h o d ,

a n

u n p u b l i s h e d

p r i o r p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s

( U S .

p a t e n t a p p l i c a t i o n S e r . N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9 a n d 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 a n d

( 2 ) t h e G a l l i m e t h o d , t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a ti o n p r o c e s s o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n .

T h u s ,

F I G . 1 2 s h o W s t h a t

o t - L - i d u

r o n i d a s e

p r o d u c e d

a n d p u r i ? e d

by

t h e

G a l l i

method

h a s a

h i g h e r

d e g r e e o f u r i t y a n d l o W e r d e g r e e o f

CHOP

o n t a m i

n a t i o n i n

c o m p a r i s o n t o

t h a t o f

t h e

C a r s o n m e t h o d .

F I G . 1 3

shoWs a c o m p a r i s o n

o f


p r o d u c e d

by t h e G a l l i

method v e r s u s

t h e

C a r s o n

m e t h o d . On t h e l e f t

s i d e o f t h e F i g u r e ,

r e s u l t s

from a Western B l o t shoW t h a t t h e

G a l l i m a t e r i a l ( l e f t s i d e , c o l u m n 2 ) c o m p r i s e f e W e r c o n t a m i

n a t i n g p r o t e i n

b a n d s ( b e t W e e n 4 8

kDa

a n d

1 7 k D a ) i n

c o m p a r i s o n W i t h

t h e

C a r s o n m a t e r i a l ( l e f t s i d e , c o l u m n 3 ) .

On t h e

r i g h t s i d e o f

t h e F i g u r e ,

r e s u l t s from a n

SDS-PAGE

s i l v e r s t a i n

shoW

t h e

a b s e n c e of

a

band

t

t h e

62

kDa

i n

t h e

G a l l i

m a t e r i a l

( c o l u m n 2 ) i n c o m p a r i s o n t o t h e p r e s e n c e

o f

s u c h a band i n t h e C a r s o n m a t e r i a l ( c o l u m n 3 ) .

DETAILED

DESCRIPTION

OF THE

INVENTION

I n

one a s p e c t ,

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s

a

method t o

p r o d u c e


a m o u n t s

W h i c h e n a b l e u s i n g t h e

enZyme t h e r a p e u t i c a l l y .

I n

g e n e r a l ,

t h e

method f e a t u r e s

t r a n s f o r m i n g

a

s u i t a b l e c e l l l i n e W i t h

t h e cDNA

n c o d i n g f o r

a l l

of o t - L - i d u r o n i d a s e o r a

b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o r

mutein t h e r e o f . Those

o f s k i l l

i n

t h e

a r t

m a y r e p a r e e x p r e s

s i o n c o n s t r u c t s o t h e r

t h a n t h o s e e x p r e s s l y d e s c r i b e d h e r e i n

f o r o p t i m a l p r o d u c t i o n

o f


s u i t a b l e c e l l

l i n e s

t r a n s f e c t e d t h e r e W i t h .

M o r e o v e r ,

s k i l l e d a r t i s a n s m a y

e a s i l y

d e s i g n

f r a g m e n t s

o f

cDNA

e n c o d i n g

b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

f r a g m e n t s a n d m u t e i n s o f t h e

n a t u r a l l y

o c c u r r i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e Which

p o s s e s s t h e

same o r s i m i l a r

b i o l o g i

c a l a c t i v i t y

t o

t h e n a t u r a l l y

o c c u r r i n g

f u l l - l e n g t h e n Z y m e .

To c r e a t e

a recombinant source

f o r

o t - L - i d u r o n i d a s e, a

l a r g e

s e r i e s

o f e x p r e s s i o n v e c t o r s m a y

b e

c o n s t r u c t e d a n d

t e s t e d

f o r

e x p r e s s i o n of

o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA.

Based

o n

t r a n s i e n t

t r a n s f e c t i o n

e x p e r i m e n t s , a s W e l l

a s s t a b l e t r a n s

f e c t i o n s ,

an

e x p r e s s i o n c o n s t r u c t m a y

be

i d e n t i ? e d t h a t

p r o v i d e s a p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l o f e x p r e s s i o n . I n o n e

embodiment o f t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n , a C h i n e s e h a m s t e r e l l

l i n e

2 . 1 3 1 d e v e l o p e d b y t r a n s f e c t i o n o f

t h e


e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t

a n d s e l e c t i o n f o r a h i g h e x p r e s s i o n

c l o n e

p r o v i d e s p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l

e x p r e s s i o n . S u c h

a

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

6

C h i n e s e h a m s t e r c e l l l i n e a c c o r d i n g t o t h i s embodiment o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y s e c r e t e a b o u t 5 , 0 0 0 t o 7 , 0 0 0 f o l d

m o r e o t - L - i d u r o n i d a s e t h a n n o r m a l . The o t - L - i d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

t h e r e b y

may b e

p r o p e r l y

p r o c e s s e d , t a k e n u p i n t o

c e l l s W i t h h i g h

a f ? n i t y

a n d i s

c o r r e c t i v e

f o r o t - L - i d u r o n i d a s e

d e ? c i e n t

c e l l s , s u c h

a s

t h o s e

f r o m

p a t i e n t s s u f f e r i n g

f r o m

H u r l e r ’ s

S y n d r o m e .

The method

f o r

p r o d u c i n g


amounts

t h a t

e n a b l e u s i n g t h e enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y

f e a t u r e s

a

p r o d u c t i o n

p r o c e s s s p e c i ? c a l l y

d e s i g n e d

t o m a s s p r o d u c e

c o m m e r c i a l g r a d e e n Z y m e , W h e r e i n t h e q u a l i t y o f t h e

enZyme h a s

been

deemed

a c c e p t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n t o

humans

b y

r e g u l a t o r y

a u t h o r i t i e s

o f

v a r i o u s

c o u n t r i e s .

The

l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f c o m m e r c i a l g r a d e

enZyme

n e c e s

s i t a t e s

m o d i ? c a t i o n s

o f t h e

c e l l

c u l t u r e s c a l e ,

m i c r o c a r r i e r

s y s t e m s ,

a n d

p u r i ? c a t i o n s c h e m e . I n

p r e f e r r e d e m b o d i

m e n t s , t h e

c e l l

c u l t u r e s c a l e

i s

i n c r e a s e d from 4 5 l i t e r s t o

1 1 0

l i t e r s o r m o r e ,

W i t h

a change t o

c o n t i n u o u s

p e r f u s i o n . The

i n c r e a s e

i n s c a l e i s n e c e s s a r y t o p r o d u c e

s u f ? c i e n t m a t e r i a l

f o r p o t e n t i a l l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n f o r l o n g

t e r m

p a t i e n t u s e .

A c c o r d i n g

t o

p r e f e r r e d

embodiments o f s u c h

a

p r o c e s s ,

microcarriers are

us ed

a s

a

l oW

cost scalable surface

o n

Which t o groW a d h e r e n t c e l l s . I n

p a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d

embodiments, such


a r e macroporo us and a r e

s p e c i ? c a l l y composed

o f modi?ed c a r b o h y d r a t e s s u c h

as

c e l l u l o s e ,

e . g . , C y t o p o r e

b e a d s

m a n u f a c t u r e d

b y P h a r m a c i a .

M a c r o p o r o u s c e l l u l o s e m i c r o c a r r i e r s a l l o W

i m p r o v e d

c e l l

a t t a c h m e n t

and

p r o v i d e

a

l a r g e r

s u r f a c e

a r e a f o r a t t a c h m e n t ,

W h i c h i s

e x p e c t e d

t o

y i e l d

a n

i n c r e a s e d c e l l

d e n s i t y d u r i n g

t h e c u l t u r e p r o c e s s . H i g h e r c e l l

d e n s i t i e s

a r e

e x p e c t e d

t o

i n c r e a s e

p r o d u c t i v i t y .

I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , h e p a r i n

S e p h a r o s e

a n d S e p h a c r y l

2 0 0 c o l u m n s a r e r e p l a c e d

W i t h

B l u e - S e p h a r o s e a n d

C o p p e r

c h e l a t i n g c o l u m n s t o

i n c r e a s e

t h e

c a p a c i t y o f

t h e l a r g e s c a l e p u r i ? c a t i o n p r o c e s s a n d t o

i m p r o v e t h e p u r i t y o f t h e p r o d u c t . I n a p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t , t h e c o p p e r c h e l a t i n g

column s

u s e d

t o r e d u c e

C h i n e s e h a m s t e r

o v a r y

c e l l p r o t e i n


t o

v e r y loW

l e v e l s


f o r

l a r g e s c a l e d i s t r i b u t i o n . U s i n g

e m b o d i m e n t s o f t h e

p r e s e n t

method f e a t u r i n g m o d i ? c a t i o n s

a n d i n d u c t i o n d e s c r i b e d b e l o W , a p p r o x i m a t e l y

1 5

mg

e r

l i t e r o f

c u l t u r e p e r d a y , o r m o re t peak c u l t u r i n g

d e n s i t y

c a n

b e

p r o d u c e d s t a r t i n g

W i t h a 1 1 0 l i t e r c u l t u r e

s y s t e m .

A c c o r d i n g t o o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f t h e

method

f o r p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n , a c u l t u r e s y s t e m

i s

o p t i m i Ze d . I n a ? r s t

embodi

m e n t , t h e

c u l t u r e p H

s l o W e r e d t o a b o u t 6 . 5 t o 7 . 0 , p r e f e r

a b l y

t o a b o u t

6 . 7 - 7 . 0

d u r i n g

t h e

p r o d u c t i o n

p r o c e s s .

One

a d v a n t a g e o f s u c h a p H

i s

t o

e n h a n c e

a c c u m u l a t i o n o f

lysosomal

enZymes

t h a t a r e

m o r e

s t a b l e a t a c i d i c pH.

I n

a

second

embodiment, a s m a n y a s

2

t o

3 . 5

c u l t u r e v o l umes

of

t h e medium may b e

c h a n g e d

d u r i n g

e a c h 2 4 - h o u r

p e r i o d

b y

c o n t i n u o u s p e r f u s i o n . One

a d v a n t a g e o f

h i s p r o c e d u r e

i s

t o

enhance

t h e

s e c r e t i o n r a t e of r e c o m b i n a n t


and t o c a p t u r e

m o r e

a c t i v e enZyme.

I n a t h i r d

embodiment,

oxygen s a t u r a t i o n i s o p t i m i Z e d a t a b o u t 40%. I n a f o u r t h

e m b o d i m e n t, m a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s W i t h

a b o u t

5

serum i n i t i a l l y i n t h e

medium,

a r e used t o produce a c e l l

mass f o l l o W e d by

a

r a p i d Washout s h i f t

t o a


medium

f o r

p r o d u c t i o n ( F I G . 3 ) . I n a ? f t h


a

p r o t e i n - f r e e g r o W t h medium, s u c h

a s

a JRH

B i o s c i e n c e s

PF-CHO

r o d u c t , may

e

o p t i m i Z e d

o i n c l u d e

s u p p l e m e n t a l

amounts o f one

o r

m o r e

i n g r e d i e n t s

s e l e c t e d f r o m t h e group

c o n s i s t i n g o f :

g l u t a m a t e ,

a s p a r t a t e ,

g l y c i n e , r i b o n u c l e o s i d e s

and d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s . I n a s i x t h embodiment, a s m a n y

a s 2

t o

3 . 5

c u l t u r e volumes

o f t h e

m edi u m m a y

be

changed

d u r i n g

e a c h

2 4 - h o u r p e r i o d

b y

c o n t i n u o u s

p e r f u s i o n . S u c h

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


US

7 , 3 5 4 , 5 7 6

B2

7

an

i n d u c t i o n p r o c e s s

m a y

p r o v i d e

a b o u t

a t W o - f o l d i n c r e a s e

i n p r o d u c t i o n W i t h o u t

s i g n i ? c a n t l y

a l t e r i n g

p o s t - t r a n s l a

t i o n a l

p r o c e s s i n g .

P a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f t h e m e t h o d f o r

p r o d u c i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o t h e

p r e s e n t i n v e n

t i o n f e a t u r e

o n e , m o r e

t h a n

o n e , o r a l l of t h e

o p t i m i Z a t i o n s

d e s c r i b e d

h e r e i n

and m a y be employed a s d e s c r i b e d i n m o r e

d e t a i l b e l o W . The p r o d u c t i o n

method

o f

t h e p r e s e n t i n v e n

t i o n m a y , t h e r e f o r e ,

p r o v i d e a p r o d u c t i o n

c u l t u r e p r o c e s s

h a v i n g t h e f o l l o W i n g

f e a t u r e s :

1 . A i c r o c a r r i e r b a s e d c u l t u r e u s i n g m a c r o p o r o u s m i c r o

c a r r i e r beads made of modi?ed c e l l u l o s e

o r

an

e q u i v a l e n t

t h e r e o f

i s

p r e f e r a b l y

u s e d i n l a r g e s c a l e c u l t u r e ? a s k s

W i t h

o v e r h e a d s t i r r i n g o r an e q u i v a l e n t t h e r e o f . Attachment

o f

c e l l s t o

t h e s e

b e a d s

m a y be a c h i e v e d by

c u l t u r e i n

a

5

e t a l

bovine serum may

e

added t o DME/F12 : 1 o r a p r o t e i n

f r e e medium

modi?ed W i t h i n g r e d i e n t s i n c l u d i n g r i b o

n u c l e o s i d e s ,

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ,

p y r u v a t e ,

n o n - e s s e n t i a l

amino

a c i d s ,

a n d HEPES. A f t e r a b o u t

3 - 6

d a y s

i n

t h i s

m e d i u m , a W a s h o u t

p r o c e d u r e

s b e g u n

i n

W h i c h p r o t e i n - f r e e

medium r e p l a c e s t h e

s e r u m - c o n t a i n i n g medium

a t a n

i n c r e a s i n g p e r f u s i o n

r a t e

d e p e n d e n t

o n

t h e

g l u c o s e

c o n t e n t

a n d

c u l t u r e c o n d i t i o n .

S u b s e q u e n t l y ,

a n d

t h r o u g h o u t

t h e

e n t i r e

r e m a i n i n g c u l t u r e

p e r i o d , t h e c e l l s a r e c u l t i v a t e d i n a

p r o t e i n - f r e e medium. The u s e o f a p r o t e i n - f r e e m e d i u m i n

enZyme

p r o d u c t i o n i s

b e n e ? c i a l

i n r e d u c i n g

t h e e x p o s u r e

r i s k o f b o v i n e s p o n g i f o r m

e n c e p h a l o p a t h y

( B S E ) a n d

o t h e r

i n f e c t i o u s

b i o l o g i c

a g e n t s s u c h a s

v i r u s e s

t o p a t i e n t s b e i n g

t r e a t e d

With t h e enZyme, Wherein

t h e

r i s k of BSE

r o t h e r

h a r m f u l a g e n t s

i s d e p e n d e n t

on t h e amount o f p o t e n t i a l

s e r u m

e x p o s u r e . I n

p r i o r

p u b l i s h e d s t u d i e s ,

t h e c a r r i e r s

u s e d

t o groW t h e c e l l s Were b o v i n e g e l a t i n

m i c r o c a r r i e r s ,

u s e d a t

1

gr a m p e r

l i t e r

o r

100

t i m e s t h e p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n .

L e a c h i n g

o f

1 %

o f t h e g e l a t i n

p r o t e i n f r o m

t h e


Would r e p r e s e n t

a

r e l a t i v e

10 0 % c o n t a m i n a t i o n

and t h e r e b y

c o n t r i b u t e to t h e

r i s k

of BSE. T h u s , neW c a r r i e r s a r e e i t h e r

d e x t r a n

o r c e l l u l o s e - b a s e d

and

c o n s i s t o f c a r b o h y d r a t e s , and

n o t a n i m a l - d e r i v e d

m a t e r i a l s .

FIG.

3 shoWs t h a t t h e c e l l s a r e groWn to a d e n s i t y i n

5

serum

c o n t a i n i n g

medium and t h e n s W i t c h e d W i t h o u t any

a d a p t a t i o n

t o a p r o t e i n - f r e e

medium. F I G .

3

s p e c i ? c a l l y

s h o W s

t h a t :

1 )

C e l l s

s u r v i v e

a n d c o n t i n u e

t o p r o d u c e i d u

r o n i d a s e When

s h i f t e d

W i t h o u t

a d a p t a t i o n . I n c o n t r a s t ,

o t h e r

s t u d i e s

Would

s u g g e s t t h a t a d a p t a t i o n t o a p r o t e i n - f r e e

medium s n e c e s s a r y . I n t h e method

o f

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ,

enZyme p r o d u c t i o n

c o n t i n u e s

a t l e v e l s comparable t o serum

c o n t a i n i n g m e d i u m .

2 ) o t - L - l d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n

a p r o

t e i n - f r e e m edi u m r e t a i n s a l e v e l of

r o d u c t i o n i n

e x c e s s of

4 mg e r l i t e r

o r

1 , 0 0 0 u n i t s p e r

m l . 3 ) o t - L - i d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

i n

a p r o t e i n - f r e e

medium

h a s h i g h

u p t a k e

i n d i c a t

i n g t h a t t h e

s h i f t

i n

medium

a n d ,

h e n c e ,

a

s h i f t

i n

c a r b o h y

d r a t e s b e i n g f e d t o c e l l s ,

d o e s

n o t a d v e r s e l y a f f e c t t h e

h i g h

u p t a k e

c h a r a c t e r

o f

t h e

e n Z y m e .

E i g h t l o t s

o f o t - L - i d u

r o n i d a s e have been produced

and

r e l e a s e d i n

t h i s manner

W i t h

an u p t a k e

h a l f

maximal v a l u e o f l e s s t h a n 2

nM

n

a l l

l o t s .

2 .

The c u l t u r e c o n d i t i o n s a r e p r e f e r a b l y

maintained a t

a

d i s s o l v e d oxygen

of

40

f

i r s a t u r a t i o n a t a

pH

f a b o u t

6 . 8 - 7 . 0

and at a

t e m p e r at u r e o f a b o u t 3 5 - 3 7 0 C .

T h i s m a y be

a c h i e v e d

u s i n g a c o n t r o l u n i t , m o n i t o r i n g

u n i t

a n d a p p r o

p r i a t e p r o b e s s u c h a s t h o s e

p r o d u c e d b y

A p p l i k o n ® o r

M e t t l e r ® . H o W e v e r , s k i l l e d a r t i s a n s

W i l l

r e a d i l y a p p r e c i a t e

t h a t t h i s c a n

e a s i l y b e a c h i e v e d

by e q u i v a l e n t

c o n t r o l s y s

t e m s

p r o d u c e d

by

o t h e r m a n u f a c t u r e r s . An i r s a t u r a t i o n o f

a b o u t 4 0 %

r e s u l t s

i n

i m p r o v e d o t - L - i d u r o n i d a s e s e c r e t i o n

t h o u g h up t o 80 i r s a t u r a t i o n m a y

b e

u s e d .

HoWever,

f u r t h e r i n c r e a s e s

i n

oxygen

t o ,

f o r

e x a m p l e ,

9 0 %

a i r

s a t u

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

8

r a t i o n ,

d o n o t p r o v i d e s i g n i ? c a n t l y e n h a n c e d s e c r e t i o n

o v e r

8 0 % a i r

s a t u r a t i o n . The d i s s o l v e d

oxygen m a y b e

s u p p l i e d

by i n t e r m i t t e n t o r

c o n t i n u o u s

oxygen

s p a r g i n g u s i n g

a

5

m i c r o n s t a i n l e s s

s t e e l o r l a r g e r

o p e n i n g

s p a r g e r , o r e q u i v a

l e n t t h e r e o f . A

p H o f a b o u t

68-70

i s

o p t i m a l f o r

t h e

a c c u m u l a t i o n o f

t h e o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme. The enZyme

i s p a r t i c u l a r l y u n s t a b l e

a t

pHs a b o v e a b o u t 7 . 0 .

BeloW

a

p H

o f

a b o u t

6 . 7 , t h e s e c r e t i o n r a t e may d e c r e a s e , p a r t i c u l a r l y

beloW a

pH

f a b o u t

6 . 5 .

The c u l t u r e i s t h e r e f o r e m a i n t a i n e d

o p t i m a l l y

betWeen a

p H

o f

a b o u t

6 . 8 - 7 . 0 .

3 .

The

p r o d u c t i o n c u l t u r e

m e d i u m

m a y

be

a modi?ed

f o r m

o f t h e c o m m e r c i a l l y

a v a i l a b l e

p r o p r i e t a r y medium

from JRH B i o s c i e n c e s c a l l e d

E x c e l l

PF CHO. T h i s medium

s u p p o r t s l e v e l s

o f s e c r e t i o n

e q u i v a l e n t t o

t h a t o f serum

s i n g

a c e l l

l i n e

such a s t h e 2 . 1 3 1 c e l l l i n e . I t m a y

be

p r e f e r a b l y

modi?ed o

i n c l u d e

an

a c i d i c

p H o f a b o u t 68-70 ( 1 0 . 1 ) ,

and

b u f f e r e d

With HEPES t

7 . 5 mM r 1 5 mM. The m e d i u m

m a y c o n t a i n

0 . 0 5

t o 0.1% of

P l u r o n i c s

F-68

(BASF),

a

n o n - i o n i c s u r f a c t a n t o r an e q u i v a l e n t t h e r e o f Which f e a t u r e s

t h e a d v a n t a g e

o f

p r o t e c t i n g

c e l l s

f r o m s h e a r f o r c e s a s s o c i

a t e d

W i t h

s p a r g i n g . The

m e d i u m

m a y

f u r t h e r

c o n t a i n a

p r o p r i e t a r y s u p p l e m e n t

t h a t

i s i m p o r t a n t i n

i n c r e a s i n g t h e


o f

t h e

medium

o v e r

o t h e r p r o t e i n - f r e e

media

t h a t a r e

p r e s e n t l y a v a i l a b l e .

Those s k i l l e d i n

t h e a r t W i l l

r e a d i l y u n d e r s t a n d t h a t t h e

c h o i c e

o f c u l t u r e medium m a y e

o p t i m i Z e d c o n t i n u a l l y a c c o r d i n g t o p a r t i c u l a r c o m m e r c i a l

e m b o d i m e n t s a v a i l a b l e a t p a r t i c u l a r p o i n t s i n t i m e .

S u c h

c h a n g e s encompass

no m o re

t h a n

r o u t i n e e x p e r i m e n t a t i o n

and a r e i n t e n d e d

t o be

W i t h i n

t h e

s c o p e

of t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n .

4 .

The p r o d u c t i o n

medium may

b e a n a l y Z e d u s i n g a n

a m i n o a c i d

a n a l y z e r c o m p a r i n g s p e n t medium W i t h s t a r t i n g

medium. Such a n a l y s e s h a v e d e m o n s t r a t e d

t h a t

t h e 2 . 1 3 1

c e l l l i n e

d e p l e t e s a

s t a n d a r d

PF

CHO edium o f g l y c i n e ,

g l u t a m a t e

and

a s p a r t a t e t o a l e v e l o f around 1 0 % o f t h e

s t a r t i n g

c o n c e n t r a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o n o f

t h e s e

a m i n o

a c i d s

t o

h i g h e r l e v e l s m a y e s u l t i n e n h a n c e d c u l t u r e d e n s i t y

a n d


t h a t

m a y

l e a d

t o

a 2 - 3 f o l d h i g h e r

p r o d u c

t i o n

t h a n

a t b a s e l i n e . S k i l l e d

a r t i s a n s

W i l l a p p r e c i a t e

t h a t

o t h e r c e l l l i n e s W i t h i n t h e

s c o p e o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y

b e

e q u a l l y

u s e f u l

f o r

p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o t h e p r e s e n t

method. Hence,

m o re o r

l e s s

s u p p l e m e n t a l

n u t r i e n t s may b e

r e q u i r e d t o o p t i m i Z e

t h e

medium. Such

o p t i m i Z a t i o n s

a r e

i n t e n d e d t o be W i t h i n t h e s c o p e

of

t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n

a n d m a y b e p r a c t i c e d W i t h o u t u n d u e

e x p e r i m e n t a t i o n .

5 . The medium m a y b e s u p p l e m e n t e d W i t h t h e f o u r

r i b o n u c l e o s i d e s a n d f o u r

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s e a c h

a t

a b o u t 1 0

m g / l i t e r

t o

s u p p o r t t h e

d i h y d r o f o l a t e

r e d u c t a s e

d e ? c i e n t

c e l l

l i n e

2 . 1 3 1 . S k i ll e d a r t i s a n s W i l l a p p r e c i a t e t h a t

o t h e r c e l l l i n e s W i t h i n t h e

s c o p e o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y

b e

e q u a l l y u s e f u l

f o r

p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o

t h e

p r e s e n t

method. Hence,

m o r e

o r

l e s s r i b o n u c l e o s i d e s

a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s may b e

r e q u i r e d

t o

o p t i m i Z e t h e

medium,

a n d a l t e r n a t i v e s o u r c e s

o f

p u r i n e s a n d p y r m i d i n e s

f o r n u c l e i c a c i d

s y n t h e s i s

m a y e u s e d s u c h a s h y p o x a n t h i n e

a n d

t h y m i d i n e .

Such o p t i m i Z a t i o n s a r e

i n t e n d e d W i t h i n

t h e

s c o p e

o f


a n d m a y

b e

p r a c t i c e d W i t h o u t

u n d u e e x p e r i m e n t a t i o n .

6 . A f t e r r e a c h i n g c o n ? u e n c e a t a b o u t 3 - 6 d a y s o f u l t u r e ,

an

i n c r e a s i n g

r a t e o f c o n t i n u o u s p e r f u s i o n i s i n i t i a t e d . A

c h a n g e o f medium may

e

a c c o m p l i s h e d , f o r

e x a m p l e ,

u s i n g

a s l a n t

f e e d

t u b e

c o n s t r u c t e d

and

p o s i t i o n e d to a l l o W t h e

u p t a k e

o f

m e d i u m

i t h o u t removal o f t h e m i c r o c a r r i e r s e v e n

W h i l e t h e c u l t u r e i s s t i r r e d .

By

pumping o u t medium h r o u g h

t h e s l a n t f e e d

t u b e ,

m i c r o c a r r i e r s s e t t l e W i t h i n t h e

body

o f

t h e t u b e

i n s i d e

t h e

c u l t u r e

and a r e n o t removed from

t h e

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


US

7 , 3 5 4 , 5 7 6

B2

9

c u l t u r e d u r i n g

t h e

c h a n g e

on medium.

I n

t h i s m a n n e r ,

t h e

m i c r o c a r r i e r s With t h e c e l l mass a r e s e p a r a t e d

fr o m

s u p e r

n a t a n t

c o n t a i n i n g t h e e n z y m e .

7 .

The r a p i d

a n d

f r e q u e n t

t u r n o v e r o f t h e

medium h a s

b e e n shown

b y

p r o d u c t i v i t y s t u d i e s t o r e s u l t i n

i m p r o v e d

o v e r a l l

c o l l e c t i o n

o f enZyme from t h e

c e l l

c u l t u r e . L e s s

t u r n o v e r o f

medium

r e s u l t s i n l e s s t o t a l

p r o d u c t i o n

o f

enZyme on

a

d a i l y b a s i s . Using t h e p e r f u s i o n o f

2 - 3 . 5

c u l t u r e

volumes p e r

d a y , t h e c e l l s

m a y

b e m a i n t a i n e d i n e x c e l l e n t

c o n d i t i o n

W i t h h i g h d e g r e e s

o f

v i a b i l i t y

a n d a

h i g h

l e v e l

o f

p r o d u c t i v i t y .

8 .

P r o d u c t i o n

o f

o t - L - i d u r o n i d a s e m a y

e e n h a n c e d

by t h e

u s e

o f s o d i u m b u t y r a t e i n d u c t i o n o f

g e n e

e x p r e s s i o n

( F I G .

3 ) . T W e n t y l o t s o f


W e r e p r o d u c e d

u s i n g

b u t y r a t e i n d u c t i o n a t

2 nM

o n c e n t r a t i o n W i t h

2 / 3

Washout

e v e r y

1 2

h o u r s

a f t e r

i n d u c t i o n

and r e i n d u c t i o n

e v e r y

48

h o u r s f o r

a

2 1 - d a y p r o d u c t i o n

p e r i o d

i n F I G . 3 ,

t h e v e r t i c a l

a r r o W s a t t h e

bottom

i n d i c a t e

b u t y r a t e

i n d u c t i o n e v e n t s .

Each i n d u c t i o n t r i g g e r e d a b o o s t i n o t - L - i d u r o n i d a s e

con

c e n t r a t i o n i n t h e medium.

S y s t e m a t i c s t u d i e s o f a

2 . 1 3 1

c e l l l i n e d e m o n s t r a t e d t h a t

a b o u t

2 mM

u t y r a t e c a n be

a p p l i e d and

r e s u l t i n a b o u t

a

t W o - f o l d o r

g r e a t e r

i n d u c t i o n

o f

enZyme

p r o d u c t i o n

W i t h

m i n i m a l e f f e c t s on c a r b o h y d r a t e p r o c e s s i n g . LoWer e v e l s o f

b u t y r a t e have

n o t

been

shoWn t o

i n d u c e

a s

W e l l ,

and

s u b s t a n t i a l l y

h i g h e r

l e v e l s may r e s u l t i n

h i g h e r

i n d u c t i o n ,

b u t d e c l i n i n g a f f i n i t y o f t h e p r o d u c e d enZyme o r c e l l s

f r o m

p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m o t - L - i d u r o n i d a s e

d e ? c i e n c y . B u t y r a t e

i n d u c t i o n performed i n

v i t r o

a t 2 mM o r 24 h o u r s o r 5 mM,

a m o re

c o m m o n l y used

c o n c e n t r a t i o n r e s u l t e d

i n

u p t a k e s

i n

excess of 3 nM

r

40 U/ml, o r an

average

o f

h r e e

times t h e

v a l u e

o b s e r v e d i n

p r o d u c t i o n l o t s . I n a d d i t i o n , commonly

used t i m e s of 24 hours o r m o r e and c o n c e n t r a t i o n of

5

mM

Were t o x i c t o o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c i n g

c e l l s

and r e s u l t e d

i n detachment

and

l o s s

of

c e l l

m a s s .

R e s u l t s s u g g e s t t h a t t W o - f o l d

o r

g r e a t e r i n d u c t i o n r e s u l t s

i n l e s s p r o c e s s i n g o f t h e c a r b o h y d r a t e s a n d l e s s p h o s p h a t e

a d d i t i o n

to

t h e

enZyme,

a s

W e l l

a s

i n c r e a s i n g

t o x i c i t y .

With

r e s p e c t

t o

c a r b o h y d r a t e p r o c e s s i n g

a n d t h e

a d d i t i o n o f

p h o s p h a t e

g r o u p s ,

t h e i m p o r t a n c e o f m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e

i n e n Z y m e r e p l a c e m e n t t h e r a p y i s d e m o n s t r a t e d b y t h e

o b s e r v a t i o n s t h a t

r e m o v a l

o f t h e p h o s p h a t e

o f

t W o

l y s o s o m a l

e n Z y m e s ,

g l u c o s i d a s e a n d

g a l a c t o s a m i n e

4 - s u l f a t a s e l e a d s t o

d e c r e a s e d

u p t a k e

( V a n d e r P l o e g , e t a l . , J . C l i n . I n v e s t . 8 7 :

5 1 3 - 5 1 8 ( 1 9 9 1 ) ;

C r a W l e y ,

e t a l . , J

C l i n . I n v e s t .

9 7 : 1 8 6 4

1 8 7 3 ( 1 9 9 6 ) ) . I n

a d d i t i o n , e n Z y m e W i t h l o W p h o s p h a t e

( V a n

H o v e , e t

a l . , P r o c .

N a t l .

A c a d .

S c i .

USA

9 3 : 6 5 - 7 0 ( 1 9 9 6 )

r e q u i r e s 1 , 0 0 0 u n i t s p e r

m l

f o r

u p t a k e

e x p e r i m e n t s ( n e a r l y

1 0 0

t i m e s

u s e d

f o r

i d u r o n i d a s e ) a n d e f f e c t i v e d o s e s i n

a n i m a l models r e q u i r e

1 4 m g / k g ,

o r 2 8

t i m e s

t h e d o s e u s e d

W i t h h i g h p h o s p h a t e c o n t a i ni n g i d u r o n i d a s e ( K i k u c h i , e t a l . ,

J .

C l i n . I n v e s t .

1 0 1 :

8 2 7 - 8 3 3 ( 1 9 9 8 ) ) .

One a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d a s p e c t

o f

t h e

i n v e n t i o n m e t h o d

u s e s

2 mM u t y r a t e a d d i t i o n e v e r y 48 h o u r s

t o t h e

c u l t u r e

s y s t e m .

T h i s

embodiment r e s u l t s i n a b o u t

a t W o - f o ld i n d u c

t i o n o f e n Z y m e p r o d u c t i o n u s i n g

t h i s

m e t h o d

W i t h o u t

s i g

n i ? c a n t e f f e c t o n t h e

u p t a k e

a f f i n i t y o f t h e enZyme

( K - u p t a k e

o f

l e s s t h a n 30 U/m l

o r

2 . 0 m M ) .

I n a

s e c o n d

a s p e c t , t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n p r o v i d e s a

t r a n s f e c t e d c e l l l i n e , W h i c h p o s s e s s e s t h e

u n i q u e

a b i l i t y t o

p r o d u c e o t - L - i d u r o n i d a s e

i n a m o u n t s ,

W h i c h e n a b l e

u s i n g

t h e

e n Z y m e

t h e r a p e u t i c a l l y .

I n p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s , t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a recom binant Chinese hamster

o v a r y c e l l l i n e s u c h a s t h e

2 . 1 3 1

c e l l l i n e

t h a t

s t a b l y

and

r e l i a b l y

p r o d u c e s

a m o u n t s o f o t - L - i d u r o n i d a se . I n

p r e f e r r e d

embodiments, t h e

c e l l l i n e

m a y

c o n t a i n

m o re t h a n

1 copy of

an e x p r e s s i o n c o n s t r u c t

comprising

a CMV

r o m o t e r ,

a

C O .

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

1 0

i n t r o n ,

a h u m a n

o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA, and

a

bovine

groWth hormone p o l y a d e n y l a t i o n

s e q u e n c e .

I n even m o re

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s , t h e c e l l l i n e e x p r e s s e s o t - L - i d u

r o n i d a s e

a t amounts

of

t l e a s t a b o u t

20-40

micrograms p e r

1 0 7 c e l l s p e r d a y

i n

a p r o p e r l y p r o c e s s e d , h i g h u p t a k e

f o r m


f o r

e n Z y m e

r e p l a c e m e n t

t h e r a p y .

A c c o r d i n g t o

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s

o f t h i s a s p e c t o f t h e i n v e n t i o n , t h e

t r a n s f e c t e d c e l l l i n e a d a p t e d t o

p r o d u c e


i n

a m o u n t s Which e n a b l e u s i n g t h e enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y ,

possesses

one o r m o r e o f t h e folloWing

f e a t u r e s :

1 . The

e l l

l i n e

o f

p r e f e r r e d embodiments

s

d e r i v e d

from

a p a r e n t c e l l l i n e Wherein t h e

c e l l s

a r e

passaged

i n

c u l t u r e

u n t i l

t h e y

h a v e

a c q u i r e d

a s m a l l e r

s i Z e

a n d

more

r a p i d

g r o W t h r a t e a n d u n t i l

t h e y

r e a d i l y a t t a c h t o s u b s t r a t e s .

2 .

The

c e l l

l i n e

o f p r e f e r r e d embodiments

i s

t r a n s f e c t e d

W i t h a n

e x p r e s s i o n

v e c t o r c o n t a i n i n g

t h e

c y t o m e g a l o v i r u s

p r o m o t e r / e n h a n c e r

e l e m e n t ,

a 5 ' i n t r o n c o n s i s t i n g o f t h e

murine

C O . i n t r o n

betWeen

exons 2

and ,

a h u m a n cDNA f

a b o u t

2 . 2 kb i n l e n g t h , and

a

3 ' b o v i n e g r o W t h hormone

p o l y a d e n y l a t i o n

s i t e . T h i s e x p r e s s i o n

v e c t o r m a y b e t r a n s

f e c t e d

a t ,

f o r

e x a m p l e , a

50 to

1

r a t i o W i t h

a n y


common e l e c t i o n v e c t o r such a s pSV2NEO. he s e l e c t i o n

v e c t o r

pSV2NEO

n

t u r n c o n f e r s

G 4 1 8

r e s i s t a n c e

o n

s u c

c e s s f u l l y t r a n s f e c t e d

c e l l s . I n p a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d e m b o d i

m e n t s , a r a t i o of

a b o u t

50 t o

1 i s

used

s i n c e

t h i s r a t i o

e n h a n c e s

t h e a c q u i s i t i o n

o f

m u l t i p l e c o p y number i n s e r t s .

According

t o

one embodiment

Wherein

t h e

Chinese hams ter

o v a r y

c e l l l i n e 2 . 1 3 1 i s p r o v i d e d , t h e r e

i s

a t l e a s t 1 copy o f

t h e e x p r e s s i o n v e c t o r f o r o t - L - i d u r o n i d a s e . Such a c e l l l i n e

h a s

d e m o n s t r a t e d

t h e

a b i l i t y

t o

p r o d u c e l a r g e q u a n t i t i e s o f

human o t - L - i d u r o n i d a s e (minimum 2 0 m i c r o g r a m s p e r 1 0

m i l l i o n c e l l s p e r

d a y ) . P a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d


s u c h a s t h e 2 . 1 3 1

c e l l

l i n e p o s s e s s t h e a b i l i t y

t o

p r o d u c e

p r o p e r l y

p r o c e s s e d e n Z y m e t h a t c o n t a i n s N - l i n k e d o l i g o s a c

c h a r i d e s c o n t a i n i n g

h i g h

mannose c h a i n s

modi?ed

W i t h

p h o s p h a t e a t t h e 6 p o s i t i o n i n s u ? i c i e n t q u a n t i t y t o p r o d u c e

a n enZyme

W i t h h i g h a f ? n i t y

( K - u p t a k e o f l e s s t h a n

3 n M ) .

3 .

The enZyme

p r o d u c e d

from

t h e

c e l l l i n e s

o f

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n such a s

a

Chinese hams ter ovary

c e l l

l i n e

2 . 1 3 1

i s

r a p i d l y a s s i m i l a t e d

i n t o

c e l l s , e l i m i n a t e s g l y c o s a m i n o g l y c a n

s t o r a g e and h a s a

h a l f - l i f e

o f

a b o u t 5

d a y s

i n c e l l s from

p a t i e n t s

s u f f e r i n g f r o m o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .

4 . The e l l l i n e of r e f e r r e d embodiments such

a s

a 2 . 1 3 1

c e l l

l i n e

a d a p t s

t o l a r g e s c a l e c u l t u r e a n d s t a b l y p r o d u c e s

h u m a n


u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . The e l l s o f

p r e f e r r e d

embodiments a r e

a b l e t o

groW

and s e c r e t e o t - L


a t

t h e

a c i d pH of a b o u t 6 . 6 t o

7 . 0

a t Which

enhanced accumulation of


can

o c c u r .

5 .

P a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d


o f t h e

c e l l l i n e

a c c o r d i n g

t o

t h e

i n v e n t i o n ,

such

a s

a 2 . 1 3 1 c e l l

l i n e

a r e a b l e

t o s e c r e t e

h u m a n

o t - L - i d u r o n i d a s e a t

l e v e l s e x c e ed i n g 2 , 0 0 0

u n i t s p e r m l ( 8

m i c r o g r a m s

p e r m l ) h a r v e s t e d t W i c e p e r d a y

o r

e x c e e d i n g

1 5

mg e r l i t e r o f

c u l t u r e

p e r

day

u s i n g a

s p e c i a l l y

f o r m u l a t e d


m e d i u m .

I n a t h i r d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s n o v e l

v e c t o r s

s u i t a b l e t o produce o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts

W h i c h e n a b l e u s i n g

t h e e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y .

T h e

p r o d u c

t i o n o f a d e q u a t e q u a n t i t i e s o f r e c o m b i n a n t


i s a c r i t i c a l

p r e r e q u i s i t e f o r s t u d i e s o n

t h e

s t r u c t u r e

of

t h e

enZyme

a s

W e l l

a s f o r

enZyme

e p l a c e m e n t t h e r a p y . The e l l

l i n e s

a c c o r d i n g t o

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n p e r m i t

t h e p r o d u c

t i o n o f s i g n i ? c a n t q u a n t i t i e s o f r e c o m b i n a n t o t - L - i d u

r o n i d a s e

t h a t i s a p p r o p r i a t e l y p r o c e s s e d

f o r

u p t a k e . O v e r

e x p r e s s i o n i n

C h i n e s e h a m s t e r

o v a r y (CHO) c e l l s h a s b e e n

d e s c r i b e d f o r

t h r e e o t h e r

l y s o s o m a l

e n Z y m e s , o t - g a l a c t o s i

d a s e ( I o a n n o u , e t a l . ,

J

e l l . B i o l . 1 1 9 : 1 1 3 7 - 1 1 5 0 ( 1 9 9 2 ) ) ,

i d u r o n a t e

2 - s u l f a t a s e

( B i e l i c k i , e t

a l . ,

B i o c h e m . J . 2 8 9 :

8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19


us 7,354,576-nov 19

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