us 6,426,208-nov 19

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

1/36

1 2 ) United S t a t e s

Patent

Kakkis e t a l .

US006426208B1

( 1 0 ) P a t e n t

N 0 . :

( 4 5 )

Date o f P a t e n t :

US 6 , 4 2 6 , 2 0 8

B1

J u l . 3 0 ,

2 0 0 2

( 5 4 )

RECOMBINANT

( X - L - I D U R O N I D A S E ,

METHODS

FOR PRODUCING

AND

PURIFYING THE

SAMEAND METHODS

FOR TREATING

ISEASES CAUSED

BY

DEFICIENCIES THEREOF

( 7 5 ) I n v e n t o r s : E m i l D .

K a k k i s ,

L o n g B e a c h ; B e c k y

T a n a m a c h i , S i g n a l

H i l l , b o t h

o f

CA

( U s )

( 7 3 )

A s s i g n e e : Harbor-UCLA

R e s e a r c h

a n d

E d u c a t i o n I n s t i t u t e , T o r r a n c e ,

CA

( U S )

( * )

N o t i c e : S u b j e c t t o a n y d i s c l a i m e r , t h e t e r m o f t h i s

p a t e n t

i s e x t e n d e d

o r a d j u s t e d u n d e r

3 5

U . S . C . 1 5 4 ( b ) b y

0

d a y s .

( 2 1 ) A p p l .

N o . :

0 9 / 4 3 9 , 9 2 3

( 2 2 ) F i l e d : N o v . 1 2 , 1 9 9 9

( 5 1 ) I n t . C l . 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . C12N / 0 0 ;

C12N

/ 0 4 ;

C12N

9 / 2 4 ; C12N 9 / 2 6 ; C12N

9 / 4 4

( 5 2 ) US.

l .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. .

435/201; 435/183; 435/190;

4 3 5 / 2 0 0 ; 4 3 5 / 2 0 6 ; 4 3 5 / 2 1 0

( 5 8 ) Field of Search . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. .

435/183, 1 9 0 ,

4 3 5 / 2 0 0 , 2 0 1 , 2 1 0 , 2 0 6

( 5 6 ) R e f e r e n c e s C i t e d

U . S .

PATENT

DOCUMENTS

3 , 4 7 2 , 9 3 1

A

3 , 8 9 1 , 7 5 7 A

5 , 2 7 0 , 0 5 1

A

FOREIGN

PATENT DOCUMENTS

GB 1001949 8 / 1 9 6 5

W0 WO 3 / 1 0 2 4 4

5 / 1 9 9 3

W0 WO 9 / 5 1 7 2 4

1 0 / 1 9 9 9

W0 WO 9 / 5 8 6 9 1 1 1 / 1 9 9 9

OTHER

PUBLICATIONS

1 0 / 1 9 6 9 S t o u g h t o n

6 / 1 9 7 5 H i g u c h i

1 2 / 1 9 9 3 H a r r i s

C l e m e n t s , e t a l . , Human a l p h a L i d u r o n i d a s e 1 . P u r i ? c a

t i o n , m o n o c l o n a l a n d

a n t i b o d y

p r o d u c t i o n , n a t i v e a n d s u b

u n i t

m o l e c u l a r m a s s ,

E u r o p e a n

J o u r n a l

o f

B i o c h e m i s t r y ,

1 5 2 ( 1 ) : 4 3 4 9 ( 1 9 9 4 ) .

K a k k i s , e t a l . , E n z y m e r e p l a c e m e n t t h e r a p y i n muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s 1 . ,

New E n g l a n d

J o u r n a l

o f M e d i c i n e ,

3 4 4 ( 3 ) : 1 8 2 1 8 8 ( 2 0 0 1 ) .

A n s o n ,

D .

S . , e t

a l . , C o r r e c t i o n o f Human M u c o p o l y s a c

c h a r i d o s i s TypeVI F i b r o b l a s t s W i t h R e c o m b i n a n t

N A c e t y l g al a c t o s a m in e 4 S u p l p h a t a se , B i o c h e m

J . 2 8 4 : 7 8 9 7 9 4 ( 1 9 9 2 ) .

B a r t o n , R . W . , e t a l . , T h e H u r l e r C o r r e c t i v e F a c t o r , J . B i o l .

C h e m . 2 4 6 ( 2 4 ) : 7 7 7 3 7 7 7 9 ( 1 9 7 1 ) .

B i e l i c k i ,

J . ,

e t a l . , R e c o m b i n a n t

Human

I d u r o n a t e 2 S u l p h a t a s e : C o r r e c t i o n o f

M u c o p o l y s a c c h a r i

d o s i s T y p e I I

F i b b r o b l a s t s

a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e

P u r i

? e d E n z y m e ,

B i o c h e m .

J . 2 8 9 : 2 4 1 2 4 6

( 1 9 9 3 ) .

F r i e d m a n , T . ,

P r o g r e s s

T o W a r d Human

G e n e T h e r a p y ,

S c i e n c e 2 4 4 : 1 2 7 5 1 2 8 1 ( 1 9 8 9 ) .

H o o g e r b r u g g e , P . M . ,

e t

a l . , A l l o g e n e i c B o n e

MarroW

T r a n s p l a n t a t i o n

f o r

L y s o s o m a l S t o r a g e D i s e a s e s , L a n c e t

3 4 5 : 1 3 9 8 ( 1 9 9 5 ) .

I o a n n o u ,

Y . A . ,

e t a l . , O v e r e x p r e s s i o n o f

Human

o t G a l a c

t o s i d a s e

A

e s u l t s i n

I t s

I n t a c e l l u l a r A g g r e g a t i o n ,

C r y s t a l

l i z a t i o n i n L y s o s o m e s , a n d S e l e c t i v e S e c r e t i o n ,

J . C e l l

B i o l . 1 1 9 ( 5 ) : 1 1 3 7 1 1 5 0

( 1 9 9 2 ) .

K a k k i s ,

E . D . , e t

a l . , L o n g T e r m a n d

H i g h D o s e

T r i a l s

o f

Enzyme R e p l a c e m e n t

T h e r a p y

i n

t h e

C a n i n e

Model o f

M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s 1 , 5 8 ( 2 ) : 1 5 6 1 5 7 ( 1 9 9 6 ) .

K a k k i s , E . , e t

a l . ,

S t r o n g

T r a n s c r i p t i o n a l A c t i v a t i o n o f

T r a n s l o c a t e d

CMyc

Genes O c c u r s W i t h o u t a

S t r o n g

Nearby

E n h a n c e r

o r

P r o m o t e r , N u c l e i c A c i d s

Res.

1 6 ( 1 ) : 7 7 9 6 ( 1 9 8 8 ) .

L e d l e y , F . D . , C l i n i c a l

A p p l i c a t i o n o f

S o m a t i c

G e n e

T h e r a p y i n

I n b o r n

E r r o r s o f M e t a b o l i s m , J . I n h e r i t .

M e t a b .

D i s . 1 3 : 5 9 7 6 1 6 ( 1 9 9 0 ) .

L o W r y ,

RB, t a l .

An U p d a t e

o n t h e

F r e q u e n c y o f

Muco

p o l y s a c c h a r i d e

S y n d r o m e s

i n

B r i t i s h

C o l u m b i a ,

Human

G e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 3 9 0

( 1 9 9 0 ) .

M y e r o W i t z , R . , e t a l . , M a t u r a t i o n o f o t L I d u r o n i d a s e i n

C u l t u r e d Hu m a n F i b r o b l a s t s , J . B i o l . Chem.

2 5 6 ( 6 ) : 3 0 4 4 3 0 4 8

( 1 9 8 1 ) .

M o s k o W i t z , S . M . , e t

a l . ,

C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f cDNA

E n c o d i n g t h e Human L y s o s o m a l E n z y m e , o t L I d u

r o n i d a s e , FASEB

J.6:A77

( 1 9 9 2 ) .

N e l s o n ,

1 . ,

I n c i d e n c e

o f

t h e

M u c o p o l y s a c c h a r i d o s e s i n

N o r t h e r n

I r e l a n d , Human G e n e t i c s 1 0 1 : 3 5 5 3 5 8 ( 1 9 9 7 ) .

S c r i v e r , C . R . , B e a u d e t , A . L . ,

S l y , W . S .

a n d V a l l e ,

D .

E d s .

T h e M e t a b o l i c

B a s i s

o f I n h e r i t e d D i s e a s e p p .

1 5 6 5 1 5 8 7 ,

McGraW i l l , NeW Y o r k ( 1 9 8 9 ) .

S h u l l , R . M . ,

e t

a l . , Enzyme R e p l a c e m e n t i n a

C a n i n e

Model

o f H u r l e r

S y n d r o m e ,

P r o c .

N a t l .

A c a d .

S c i ,

USA

9 1 : 1 2 9 3 7 1 2 9 4 1

( 1 9 9 4 ) .

S t o l t z f u s ,

L . J . ,

e t a l . , C l o n i n g

a n d

C h a r a c t e r i z a t i o n o f

cDNA E n c o d i n g

C a n i n e o t L I d u r o n i d a s e , J .

B i o l .

C h e m . 2 6 7 ( 1 0 ) : 6 5 7 0 6 5 7 5

( 1 9 9 2 ) .

T a y l o r , J , e t a l . , o t L I d u r o n i d a s e i n Normal

and

Muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s T y p e 1 Human S k i n F i b r o b l a s t s , B i o

c h e m

J . 2 7 4 : 2 6 3 2 6 8 ( 1 9 9 1 ) .

T o l s t o s h e v ,

P . , e t

a l . ,

G e n e

E x p r e s s i o n

U s i n g

R e t r o v i r a l

V e c t o r s , C u r r e n t O p i n i o n s

B i o t e c h . 1 : 5 5 6 1

( 1 9 9 0 ) .

T u c k e r , P . W . e t a l . , Mouse IgA Heavy C h a i n

G e n e

S e q u e n c e : I m p l i c a t i o n s f o r

E v o l u t i o n

o f I m m u n o g l o b u l i n

H i n g e

E x o n s ,

P r o c . N a t l .

A c a d . S c i .

U S A 7 8 ( 1 2 ) : 7 6 8 4 7 6 8 8

( 1 9 8 1 ) .

U n g e r ,

E . G . , e t a l . , R e c o m b i n a n t o t L I d u r o n i d a s e : C h a r

a c t e r i z a t i o n

o f

t h e

P u r i ? e d

Enzyme

a n d C o r r e c t i o n o f Muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s

T y p e

I

F i b r o b l a s t s ,

B i o c h e m .

J . 3 0 4 : 4 3 4 9

( 1 9 9 4 ) .

P r i m a r y E x a m i n e r P o n n a t h a p u A c h u t a m u r t h y

A s s i s t a n t

ExaminerManjunath N . Rao

( 7 4 ) A t t o r n e y , A g e n t ,

o r

F i r m A l b e r t P . H a l l u i n ; R o b i n C .

C h i a n g ;

HoWrey

Simon A r n o l d

&

h i t e , LLP

( 5 7 ) ABSTRACT

The p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s

a

recombinant ( X - L

i d u r o n i d a s e a n d b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

f r a g m e n t s a n d m u t a n t s

t h e r e o f ,

m e t h o d s

t o

p r o d u c e a n d

p u r i f y

t h i s enzyme

a s

W e l l

a s methods t o t r e a t c e r t a i n g e n e t i c

d i s o r d e r s

i n c l u d i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e

d e ? c i e n c y a n d m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s

I

( M P S 1 ) .

7 C l a i m s , 1 5 Drawing S h e e t s

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

2/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

3/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

4/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

5/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

6/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

7/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

8/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

9/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

10/36

U.S.

P a t e n t J u l . 3 0 , 2 0 0 2

S h e e t

9

0 f

1 5 U S 6 , 4 2 6 , 2 0 8 B1

L a n e # 5

FIGURE

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

11/36

U.S.

P a t e n t J u l . 3 0 , 2 0 0 2

S h e e t

1 0 0 f

1 5 U S 6 , 4 2 6 , 2 0 8 B1

U r i n a r y

GAG

(64-610)

L e v e l s

r e c l r i n i n e

( J

o

o n0

O

1

. L

M P S - l ( 1 6 ) P r e

R x ( 4 )

P o s i

R x ( 4 ) N o r m a l

( 3 4 )

FIGURE

3

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

12/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

13/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

14/36

U.S.

P a t e n t J u l . 3 0 , 2 0 0 2

S h e e t 1 3

0 f

1 5 U S 6 , 4 2 6 , 2 0 8 B1

U r i n a r y G A G

( ( 3 4 - 0 1 0 )

6 5 4 3 2 1

5 5 5 2 0E \ m i

W eek o f Therapy

FIGURE 6

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

15/36

U.S.

P a t e n t J u l . 3 0 , 2 0 0 2

S h e e t

1 4 0 f

1 5 U S 6 , 4 2 6 , 2 0 8 B1

L i v e r S i z e

on Therapy JM

f : AC

f 5 , 4 +RD

0

g 3.5_ -* SH

% +3w

o

3'

m

{ X 2 . 5 1

$

l

N o r m a l

E 2 1

I

l 0 6

12

W e e k s

FIGURE

7 A

Spleen

S i z e on

Therapy +JM

g ;

AC

a :

a 1.5-

5

SW

'0

o

1*

cu

\ \ : 0 5 _ ?\ 3

0

x

J

Norma

.

0 *

m

0

5

12

W e e k s

FIGURE

7 B

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

16/36

U.S.

P a t e n t J u l . 3 0 , 2 0 0 2

S h e e t 1 5

0 f

1 5 U S 6 , 4 2 6 , 2 0 8 B1

wE D G E

2 2 . ;8 5 53 m ;

w wNwPpFpv

C

o r

o wo n

Q w

w o a u c mu E t m

o o o m5 1

N o o o N c m

5 5 0

o z m p o x w

. 4 0u n t :

uouwxa

o v a

I D H U - l l wewd

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

17/36

US

6 , 4 2 6 , 2 0 8

B1

1

RECOMBINANT

t-L-IDURONIDASE,

METHODS

FOR PRODUCING

AND

PURIFYING THE SAMEAND METHODS

FOR TREATING

ISEASES CAUSED

BY

DEFICIENCIES THEREOF

FIELD OF THE INVENTION

The p r e s e n t i n v e n t i o n

i s i n

t h e ? e l d

o f m o l e c u l a r b i o l o g y ,

e n Z y m o l o g y ,

b i o c h e m i s t r y a n d

c l i n i c a l

m e d i c i n e . I n

p a r t i c u l a r ,

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s a

r e c o m b i n a n t

o t - L - i d u r o n i d a s e , m e t h o d s

t o

p r o d u c e

a n d

p u r i f y

t h i s

enZyme a s W e l l

a s

methods

t o t r e a t

c e r t a i n g e n e t i c d i s o r d e r s

i n c l u d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y

a n d

m u c o p o l y s a c c h a

r i d o s i s

I

(MPS ) .

BACKGROUND

OF THE INVENTION

C a r b o h y d r a t e s

p l a y a number

o f

i m p o r t a n t r o l e s

i n

t h e

f u n c t i o n i n g o f l i v i n g o r g a n i s m s .

I n

a d d i t i o n

t o

t h e i r m e t a

b o l i c

r o l e s ,

c a r b o h y d r a t e s

a r e s t r u c t u r a l

c o m p o n e n t s o f t h e

human

body

c o v a l e n t l y

a t t a c h e d t o numerous o t h e r e n t i t i e s

s u c h a s

p r o t e i n s a n d

l i p i d s ( c a l l e d

g l y c o c o n j u g a t e s ) . F o r

e x a m p l e , human c o n n e c t i v e t i s s u e s

a n d

c e l l membranes

c o m p r i s e p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s a n d a p r o t e o g l y c a n m a t r i x .

T h e c a r b o h y d r a t e p o r t i o n o f t h i s p r o t e o g l y c a n m a t r i x p r o

v i d e s i m p o r t a n t p r o p e r t i e s t o t h e b o d y s s t r u c t u r e .

A

e n e t i c

d e ? c i e n c y o f t h e c a r b o h y d r a t e - c l e a v i n g ,

l y s o

somal enZyme o t - L - i d u r o n i d a s e

c a u s e s a

lysosomal s t o r a g e

d i s o r d e r knoWn

a s

m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I (MPS I )

( N e u f e l d , E . F . , a n d M u e n Z e r , J . ( 1 9 8 9 ) . T h e m u c o p o l y s a c

c h a r i d o s e s

i n The

M e t a b o l i c B a s i s o f

I n h e r i t e d D i s e a s e

( S c r i v e r , C . R . ,

B e a u d e t , A .

L . , S l y , W .

S . ,

a n d V a l l e ,

D . ,

E d s . ) ,

p p .

1 5 6 5 1 58 7 , M c G r a W - H i l l , NeW

o r k ) .

I n a

s e v e r e

f o r m ,

MPS

i s

commonly

knoWn

a s

H u r l e r

syndrome a n d

i s a s s o c i a t e d W i t h m u l t i p l e p r o b l e m s s u c h a s m e n t a l

r e t a r d a t i o n , c l o u d i n g o f t h e c o r n e a , c o a r s e n e d f a c i a l

f e a t u r e s ,

c a r d i a c d i s e a s e , r e s p i r a t o r y d i s e a s e ,

l i v e r

a n d

s p l e e n e n l a r g e m e n t ,

h e r n i a s ,

a n d j o i n t s t i f f n e s s . P a t i e n t s

s u f f e r i n g , f r o m

H u r l e r

s y n d r o m e

u s u a l l y

d i e

b e f o r e a g e

1 0 .

I n

a n

i n t e r m e d i a t e form k n o W n a s

H u r l e r - S c h e i e

syndrome,

m e n t a l f u n c t i o n i s g e n e r a l l y n o t s e v e r e l y a f f e c t e d , b u t

p h y s i

c a l problems m a y l e a d t o

d e a t h

by t h e t e e n s o r t W e n t i e s .

S c h e i e

syndrome i s t h e

m i l d e s t

form o f

MPS

. I t i s

c o m p a t i b l e W i t h a n o r m a l l i f e s p a n , b u t j o i n t

s t i f f n e s s ,

c o r n e a l c l o u d i n g a n d

h e a r t

v a l v e

d i s e a s e

c a u s e s i g n i ? c a n t

p r o b l e m s .

The f r e q u e n c y o f MPS i s e s t i m a t e d

t o

b e 1 : 1 0 0 , 0 0 0

a c c o r d i n g

t o

a

B r i t i s h

Columbia

s u r v e y o f

a l l

neWborns

( L o W r y e t a l . , Human

G e n e t i c s

8 5 : 3 8 9 3 9 0 ( 1 9 9 0 ) )

a n d

1 1 7 0 , 0 0 0 a c c o r d i n g

t o a n

I r i s h

s t u d y ( N e l s o n , Human G e n e t

i c s

101:355358 ( 1 9 9 0 ) ) .

T h e r e a p p e a r s t o be

no

e t h n i c

p r e d i l e c t i o n f o r

t h i s

d i s e a s e . I t i s l i k e l y

t h a t

W o r l d W i d e t h e

d i s e a s e

i s

u n d e r d i a g n o s e d

e i t h e r

b e c a u s e

t h e p a t i e n t

d i e s o f

a c o m p l i c a t i o n b e f or e

t h e

d i a g n o s i s

i s

made

o r

b e c a u s e

t h e

m i l d e r

f o r m s

o f

t h e syndrome ma y

b e m i s t a k e n

f o r

a r t h r i t i s

o r m i s s e d

e n t i r e l y .

E f f e c t i v e neWborn s c r e e n i n g f o r MPS

W o u l d

l i k e l y

? n d some p r e v i o u s l y u n d e t e c t e d p a t i e n t s .

Except f o r

bone

m ar r o W

t r a n s p l a n t a t i o n , t h e r e

a r e no

s i g n i ? c a n t

t h e r a p i e s a v a i l a b l e

f o r

MPS . Bone

marroW

t r a n s p l a n t s c a n b e e f f e c t i v e i n t r e a t i n g

some o f

t h e

symptoms

o f

t h e

d i s o r d e r b u t h a v e

h i g h m o r b i d i t y

a n d m o r t a l i t y

i n

MPS

and

o f t e n

a r e

n o t

a v a i l a b l e

t o

p a t i e n t s

because

o f

a

l a c k

o f s u i t a b l e

d o n o r s .

An a l t e r n a t i v e t h e r a p y a v a i l a b l e t o

a l l

a f f e c t e d

p a t i e n t s Would

p r o v i d e

a n

i m p o r t a n t b r e a k

t h r o u g h i n t r e a t i n g a n d m a n a g i n g t h i s

d i s e a s e .

EnZyme r e p l a c e m e n t

t h e r a p y h a s l o n g

b e e n

c o n s i d e r e d

a

p o t e n t i a l t h e r a p y

f o r MPS I f o l l o W i n g t h e d i s c o v e r y t h a t

10

1 5

25

35

45

55

6 5

2


c a n c o r r e c t t h e enZymatic d e f e c t i n H u r l e r

c e l l s

i n

c u l t u r e .

I n

t h i s c o r r e c t i v e

p r o c e s s , t h e enZyme

c o n t a i n i n g

a m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e

r e s i d u e

i s

t a k e n

up i n t o

c e l l s

t h r o u g h

r e c e p t o r - m e d i a t e d e n d o c y t o s i s

a n d t r a n s p o r t e d

t o t h e l y s o s o m e s W h e r e

i t c l e a r s

t h e s t o r e d

s u b s t r a t e s ,

h e p a r a n

s u l f a t e

a n d d e r m a t a n

s u l f a t e .

A p p l i c a t i o n o f

t h i s

t h e r a p y

t o

humans

h a s

p r e v i o u s l y

n o t b e e n p o s s i b l e d u e

t o

i n a d e q u a t e

s o u r c e s o f

o t - L - i d u r o n i d a s e i n t i s s u e s . The

enZyme

r e p l a c e m e n t

c o n c e p t

Was r s t e f f e c t i v e l y

a p p l i e d t o

G a u c h e r

p a t i e n t s

i n a

m o d i ? e d p l a c e n t a l g l u c o c e r e b r o s i d a s e .

T h e d e l i v e r y

a n d e f f e c t i v e

u p t a k e o f g l u c o c e r e b r o s i d as e

i n

Gaucher

p a t i e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t a n enZyme c o u l d

b e

t a k e n

u p i n v i v o i n s u f ? c i e n t q u a n t i t i e s

t o

p r o v i d e e f f e c t i v e

t h e r a p y .

For o t - L - i d u r o n i d a s e

enZyme

t h e r a p y i n

MPS

, a

recom

b i n a n t

s o u r c e

o f enZyme

h a s

been needed i n o r d e r t o o b t a i n

t h e r a p e u t i c a l l y

s u f f i c i e n t s u p p l i e s o f

t h e e n Z y m e . The mam

m a l i a n enZyme Was c l o n e d i n

1990

( S t o l t Z f u s e t a l . ,

J . B i o l .

Chem. 267:65706575 ( 1 9 9 2 ) ,

and t h e human enZyme Was

c l o n e d

i n

1 9 9 1 ( M o s k o W i t Z

e t

a l . ,

FASEB

J

6 1 A 7 7

( 1 9 9 2 ) ) .

DESCRIPTION OF

THE

FIGURES

F I G .

1 (SEQ I D NO:1 & SEQ I D N O : 2 ) r e p r e s e n t s t h e

n u c l e o t i d e and deduced amino a c i d s e q u e n c e s

o f

cDNA

e n c o d i n g ( X - L - i d u r o n i d a s e . N u c l e o t i d e s 1 t h r o u g h

6200 a r e

p r o v i d e d . Amino a c i d s a r e p r o v i d e d s t a r t i n g W i t h t h e ? r s t

m e t h i o n i n e

i n t h e o p e n

r e a d i n g

f r a m e .

FIG.

2

r e p r e s e n t s

t h e

r e s u l t s from

a n

SDS-PAGE

u n o f

e l u a t e

o b t a i n e d

a c c o r d i n g

t o

t h e

p r o c e d u r e s e t

f o r t h

i n

Example

1 . Lane 1 i s

b l a n k .

Lane 2 c o n t a i n ed h i g h molecu

l a r W e i g h t s t a n d a r d s .

Lane

3 i s a

b l a n k . Lane

4 c o n t a i n e d

bovine serum albumin

i n

a c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 p g . Lanes 5

t h r o u g h

1 0

r e p r e s e n t

e l u a t e

c o n t a i n i n g

r e c o m b i n a n t l y

p r o

duced

human

o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts o f 1 p g , 2 p g , 5

p g ,

5 p g , 5 p g a n d 5 p g ,

r e s p e c t i v e l y .

F I G . 3 r e v e a l s t h e u r i n a r y GAG e v e l s i n 1 6

MPS

p a t i e n t s

i n

r e l a t i o n

t o

normal e x c r e t i o n v a l u e s .

There i s

a

Wide r a n g e o f u r i n e GAG a l u e s i n u n t r e a t e d

MPS

p a t i e n t s .

A r e a t e r t h a n 50%

r e d u c t i o n

i n e x c r e t i o n o f

u n d e g r a d e d

G A G s f o l l o W i n g t h e r a p y W i t h r e c o m b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e

i s

a valid

means

t o m e as u r e a n individuals

response

t o

t h e r a p y .

F I G . 4 d e m o n s t r a t e s l e u k o c y t e i d u r o ni d a s e

a c t i v i t y

b e f o r e

a n d a f t e r enZyme t h e r a p y

i n

MPS p a t i e n t s .

F I G .

5 d e m o n s t r a t e s t h e b u c c a l i d u r o n i d a s e

a c t i v i t y

b e f o r e a n d a f t e r

enZyme t h e r a p y .

F I G .

6

d e m o n s t r a t e s i n t h r e e p a t i e n t s t h a t a s u b s t a n t i a l

s h r i n k a g e o f

l i v e r

a n d s p l e e n

t o g e t h e r

W i t h

s i g n i ? c a n t

c l i n i

c a l

improvement i n

j o i n t

a n d

s o f t t i s s u e s t o r a g e

Was a s s o

c i a t e d W i t h a g r e a t e r t h a n 65%

r e d u c t i o n

i n u n d e g r a d e d

GAG f t e r o n l y

8 Weeks o f

t r e a t m e n t W i t h

r e c o m b i n a n t

enZyme.

F I G .

7 d e m o n s t r a t e s t h a t t h e r e

i s

s u b s t a n t i a l

n o r m a l i Z a

t i o n o f l i v e r s a n d s p l e e n s i n

p a t i e n t s t r e a t e d

W i t h r e c o m b i

n a n t

enZyme a f t e r

o n l y 1 2 Weeks o f

t h e r a p y .

F I G . 8

d e m o n s t r a t e s

a p r e c i p i t o u s d r o p i n u r i n a r y GAG

e x c r e t i o n o v e r 22 Weeks

o f

t h e r a p y W i t h r e c o m b i n a n t

enZyme i n

6 p a t i e n t s .

BRIEF SUMMARY

OF

THE

INVENTION

I n one a s p e c t , t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n f e a t u r e s a method

t o

p r o d u c e

o t - L - i d u r o n i d a s e i n a m o u n t s W h i c h e n a b l e u s i n g t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y . I n a b r o a d embodiment, t h e method

c o m p r i s e s

t h e

s t e p o f t r a n s f e c t i n g

a

cDNA n c o d i n g

f o r a l l

o r

a

p a r t of an o t - L - i d u r o n i d a s e i n t o

a

c e l l

s u i t a b l e f o r

t h e

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

18/36

US

6 , 4 2 6 , 2 0 8

B1

3

e x p r e s s i o n

t h e r e o f . I n some

e m b o d i m e n t s ,

a cDNAencoding

f o r a c o m p l e t e o t - L - i d u r o n i d a s e i s u s e d , p r e f e r a b l y a

human

o t - L - i d u r o n i d a s e .

HoWever,

i n

o t h e r

e m b o d i m e n t s , a cDNA

e n c o d i n g f o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e f r a g m e n t o r m u t a n t

t h e r e o f

may

be u s e d . S p e c i ? c a l l y ,

one o r

more amino a c i d

s u b s t i t u t i o n s

m a y

b e

made

W h i l e

p r e s e r v i n g

o r

e n h a n c i n g

t h e

b i o l o g i c a l

a c t i v i t y o f t h e e n Z y m e . I n o t h e r p r e f e r r e d

embodiments,

a n e x p r e s s i o n

v e c t o r

i s u s e d

t o

t r a n s f e r

t h e

cDNA n t o a s u i t a b l e

c e l l

o r c e l l l i n e f o r e x p r e s s i o n t h e r e o f .

I n

o n e

p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , t h e cDNA s

t r a n s f e c t e d i n t o a Chinese hamster ovar y c e l l t o

c r e a t e

c e l l

l i n e 2 . 1 3 1 .

I n y e t

o t h e r

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,

t h e p r o d u c

t i o n p r o c e d u r e f e a t u r e s one

o r

more o f t h e f o l l o W i n g

c h a r

a c t e r i s t i c s W h i c h h a v e

d e m o n s t r a t e d

p a r t i c u l a r l y h i g h p r o

d u c t i o n l e v e l s :

( a ) t h e

p H o f

t h e

c e l l

g r o W t h

c u l t u r e

may

b e

l o W e r e d t o a b o u t 6 . 5 t o 7 . 0 , p r e f e r a b l y t o

a b o u t 6 . 7 6 . 8

d u r i n g

t h e

p r o d u c t i o n

p r o c e s s ,

( b ) a b o u t Z / 3 t o 3 A 1 o f

t h e

medium may b e

c h a n g e d

a p p r o x i m a t e l y e v e ry 1 2 h o u r s ,

( c )

oxygen s a t u r a t i o n

ma y b e o p t i m i Z e d

a t

a b o u t

80% u s i n g

i n t e r m i t t e n t

p u r e

o x y g e n

s p a r g i n g ,

( d )

m i c r o c a r r i e r s

W i t h

a b o u t

1 0%

serum

n i t i a l l y m a y be u s e d

t o

p r o d u c e c e l l mass

f o l l o W e d by

a

r a p i d

W a s h o u t

s h i f t t o p r o t e i n - f r e e

medium f o r

p r o d u c t i o n ,

( e )

a

p r o t e i n - f r e e o r loW p r o t e i n medium s u c h a s

a JRH B i o s c i e n c e s PF-CHO

p r o d u c t

m a y b e c o n s i s t i n g o f

g l u t a m a t e , a s p a r t a t e , g l y c i n e , r i b o n u c l e o s i d e s a n d

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ,

a p e r f u s i o n W a n d such a s a

B e l l c o

p e r f u s i o n Wand ma y

b e u s e d

i n a f r e q u e n t b a t c h - f e e d

p r o c e s s

r a t h e r

t h a n a

s t a n d a r d

i n t e n d e d p e r f u s i o n

p r o c e s s ,

a n d ( g ) a

m i l d

s o d i u m - b u t y r a t e

i n d u c t i o n p r o c e s s ma y

b e

u s e d

t o i n d u c e

i n c r e a s e d

o t - L - i d u r o n i d a s e e x p r e s s i o n .

I n

a s e c o n d

a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s a

t r a n s f e c t e d c e l l l i n e W h i c h f e a t u r e s t h e

a b i l i t y

t o p r o d u c e


i n amounts Which e n a b l e

u s i n g

t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y . I n

p r e f e r r e d


t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n f e a t u r e s a recombinant Chinese hamster ovary

c e l l

l i n e s u c h a s t h e 2 . 1 3 1 c e l l l i n e t h a t s t a b l y a n d

r e l i a b l y

p r o d u c e s a m o u n t s o f


W h i c h e n a b l e u s i n g

t h e enZyme h e r a p e u t i c a l l y . I n some p r e f e r r e d


t h e c e l l l i n e

m a y c o n t a i n a t

l e a s t a b o u t

1 0

c o p i e s o f

a a n

e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t . I n even

more

p r e f e r r e d embodiments,

t h e c e l l l i n e e x p r e s s e s r e c o m b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e i n

amounts o f

a t l e a s t

a b o u t

2040

micrograms p e r 1 0 7 c e l l s

p e r d a y .

I n a t h i r d

a s p e c t , t h e


p r o v i d e s n o v e l

v e c t o r s

s u i t a b l e t o produce


i n

amounts

W h i c h e n a b l e

u s i n g

t h e

e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y . I n p r e f e r r e d


t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s

a n e x p r e s s i o n

v e c t o r

c o m p r i s i n g

a

c y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h a n c e r

e l e m e n t , a 5

i n t r o n

c o n s i s t i n g o f a murine Ca i n t r o n , a

cDNA ncoding a l l

o r

a fragment

o r

mutant of

an o t - L

i d u r o n i d a s e ,

a n d

a 3 b o v i n e g r o W t h hormone p o l y a d e n y l a

t i o n

s i t e .

A l s o , p r e f e r a b l y

t h e

cDNA n c o d i n g

a l l

o r a

fragment o r

mutant

o f an o t - L - i d u r o n i d a s e i s

a b o u t

2 . 2 kb i n

l e n g t h .

T h i s

e x p r e s s i o n

v e c t o r

m a y

b e

t r a n s f e c t e d a t , f o r

e x a m p l e , a

50 t o 1

r a t i o W i t h any a p p r o p r i a t e common

s e l e c t i o n v e c t o r s u c h a s ,

f o r e x a m p l e ,

pSV2NEO, t o

e n h a n c e m u l t i p l e

c o p y

i n s e r t i o n s . A l t e r n a t i v e l y ,

g e n e

a m p l i

? c a t i o n m a y

b e u s e d t o i n d u c e m u l t i p l e

copy i n s e r t i o n s .

I n a f o u r t h

a s p e c t ,

t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n

p r o v i d e s

n o v e l

o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n

a c c o r d a n c e

W i t h

t h e m e t h o d s

o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

a n d t h e r e b y

p r e s e n t i n a m o u n t s

W h i c h

e n a b l e u s i n g

t h e

e n Z y m e

t h e r a p e u t i c a l l y .

T h e

s p e c i ? c

a c t i v i t y

o f

t h e

o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

i s i n e x c e s s

o f

2 0 0 , 0 0 0

u n i t s

p e r m i l l i g r a m p r o t e i n .

P r e f e r a b l y , i t

i s i n e x c e s s o f a b o u t 2 4 0 , 0 0 0

u n i t s

p e r

m i l l i

gram p r o t e i n . T h e m o l e c u l a r

W e i g h t o f

t h e


o f

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n i s a b o u t

8 2 , 0 0 0

d a l t o n s ,

a b o u t

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

4

7 0 , 0 0 0 d a l t o n s b e i n g

a m i n o

a c i d a n d a b o u t

1 2 , 0 0 0

d a l t o n s

b e i n g c a r b o h y d r a t e s .

I n

a

? f t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

f e a t u r e s a

n o v e l

method

t o p u r i f y o t - L - i d u r o n i d a s e . According t o a ? r s t

embodiment,

a c e l l mass may

e

g r o W n i n about 10% erum

c o n t a i n i n g

medium

f o l l o W e d

by

a

s W i t c h

t o

a

modi?ed

p r o t e i n - f r e e

p r o d u c t i o n

medium

W i t h o u t

a n y s i g n i ? c a n t

a d a p t a t i o n

t o

p r o d u c e a

h i g h s p e c i ? c a c t i v i t y

s t a r t i n g m a t e

r i a l f o r p u r i ? c a t i o n . P r e f er a b l y , a c o n c e n t r a t i o n / d i a ? l t r a t i o n

scheme i s employed t h a t a l l o W s

f o r t h e

r e m o v a l o f

e x o g

enous

m a t e r i a l s

t h a t m a y b e r e q u i r e d f o r r e c o m b i n a n t p r o

d u c t i o n o f t h e same s u c h

a s ,

f o r e x a m p l e , P l u r o n i c s F - 6 8 , a

commonly u s e d s u r f a c t a n t f o r

p r o t e c t i n g

c e l l s f r o m

s p a r g i n g

d a m a g e .

S u c h

e x o g e n o u s

m a t e r i a l s s h o u l d n o r m a l l y b e

s e p a r a t e d f r o m

t h e

c r u d e b u l k t o p r e v e n t f o u l i n g o f t h e

c o l u m n s .

I n

a n o t h e r

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , a

? r s t column

l o a d

i s

a c i d i ? e d t o

m i n i m i Z e t h e

c o m p e t i t i v e

i n h i b i t i o n

e f f e c t o f u r o n i c a c i d s f o u n d

i n

p r o t e i n - f r e e medium formu

l a t i o n s . I n o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , a h e p a r i n , p h e n y l

a n d

s i Z i n g

c o l u m n

p u r i ? c a t i o n

s c h e m e

i s u s e d

t o

p r o d u c e

p u r e enZyme u s i n g a u t o m a t a b l e s t e p s a n d v a l i d a t a b l e m e d i a .

I n o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e

h e p a r i n a n d p h e n y l

column s t e p s a r e

used

t o e l i m i n a t e l e s s d e s i r a b l e o t - L

i d u r o n i d a s e

t h a t i s

n i c k e d o r d e g r a d e d . I n y e t o t h e r

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s , a t h r e e s t e p

column

c h r o m a t o g r a p h y may b e

u s e d t o p u r i f y t h e

enZyme.

Such

a

t h r e e s t e p column

c h r o m a t o g r a p h y

m a y i n c l u d e u s i n g a b l u e s e p h a r o s e

F F ,

a

Cu++ c h e l a t i n g s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y a n d

a

p h e n y l

s e p h a r o s e HP

c h r o m a t o g r a p h y .

I n

a n o t h e r p r e f e r r e d

embodiment, a n a c i d p H t r e a t m e n t s t e p i s u s e d t o i n a c t i v a t e

p o t e n t i a l v i r u s e s

W i t h o u t

h a r m i n g t h e e n Z y m e .

I n

a

s i x t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e l

m e t h o d s o f t r e a t i n g

d i s e a s e s

c a u s e d a l l

o r

i n p a r t

by

a

d e ? c i e n c y i n o t - L - i d u r o n i d a s e . I n o n e e m b o d i m e n t , t h i s

method f e a t u r e s a d m i n i s t e r i n g a recombinant o t - L

i d u r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o r mutant

t h e r e o f

a l o n e

o r i n

combination With a

p h a r m a c e u t i c a l l y

s u i t a b l e

c a r r i e r . I n o t h e r


t h i s method

f e a t u r e s

t r a n s f e r r i n g

a

n u c l e i c

a c i d encoding

a l l

o r a p a r t o f

a n

o t - L - i d u r o n i d a s e i n t o

one

o r more

h o s t

c e l l s i n v i v o . Pre

f e r r e d

e m b o d i m e n t s i n c l u d e o p t i m i Z i n g t h e d o s a g e t o

t h e

n e e d s o f t h e o r g a n i s m

t o b e

t r e a t e d , p r e f e r a b l y mammals

o r

h u m a n s , t o e f f e c t i v e l y a m e l i o r a t e

t h e

d i s e a s e s y m p t o m s .

I n

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e d i s e a s e i s

m u c o p o l y s a c c h a r i d o

s i s I

(MPS ) ,

H u r l e r

s y n d r o m e ,

H u r l e r - S c h e i e s y n d r o m e o r

S c h e i e

s y n d r o m e .

I n

a

s e v e n t h

a s p e c t , t h e


f e a t u r e s

n o v e l

p h a r m a c e u t i c a l c o m p o s i t i o n s c o m p r i s i n g


u s e f u l

f o r t r e a t i n g a

d i s e a s e

c a u s e d a l l o r i n

p a r t

by a

d e ? c i e n c y

i n o t - L - i d u r o n i d a s e . S u c h

c o m p o s i t i o n s

may

b e

s u i t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n

i n a

number o f

W a y s such

a s

p a r e n t e r a l ,

t o p i c a l ,

i n t r a n a s a l , i n h a l a t i o n o r o r a l a d m i n i s t r a

t i o n . Within t h e s c o p e o f t h i s

a s p e c t

a r e

embodiments

f e a t u r i n g n u c l e i c a c i d s e q u e n c e s encoding

a l l

o r a p a r t o f a n

o t - L - i d u r o n i d a s e Which m a y b e

a d m i n i s t e r e d

i n v i v o i n t o

c e l l s a f f e c t e d

W i t h a n


d e ? c i e n c y .

DETAILED

DESCRIPTION

OF THE

INVENTION

I n

one a s p e c t , t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a method

t o

p r o d u c e


i n

a m o u n t s W h i c h


t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y . I n

g e n e r a l ,

t h e

m e t h o d f e a t u r e s

t r a n s f o r m i n g a

s u i t a b l e

c e l l

l i n e W i t h t h e cDNA n c o d i n g

f o r

a l l

o f o t - L - i d u r o n i d a s e

o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment

o r

mutant

t h e r e o f .

Those o f s k i l l

i n

t h e a r t m a y

p r e p a r e

e x p r e s

s i o n c o n s t r u c t s o t h e r

t h a n

t h o s e

e x p r e s s l y

d e s c r i b e d h e r e i n

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

19/36

US

6 , 4 2 6 , 2 0 8

B1

5

f o r

o p t i m a l p r o d u c t i o n

o f

o t - L - i d u r o n i d a s e i n

s u i t a b l e

c e l l

l i n e s t r a n s f e c t e d t h e r e w i t h .

M o r e o v e r ,

s k i l l e d a r t i s a n s ma y

e a s i l y

d e s i g n f r a g m e n t s o f cDNA e n c o d i n g

b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

f r a g m e n t s

a n d m u t a n t s o f t h e n a t u r a l l y o c c u r r i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e Which p o s s e s s t h e same

o r

s i m i l a r

b i o l o g i

c a l

a c t i v i t y

t o

t h e n a t u r a l l y

o c c u r r i n g

f u l l - l e n g t h

e n Z y m e .

To

c r e a t e a

recombinant source

f o r o t - L - i d u r o n i d a s e , a

l a r g e

s e r i e s

o f e x p r e s s i o n v e c t o r s ma y b e c o n s t r u c t e d

a n d

t e s t e d f o r

e x p r e s s i o n

o f a o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA.

Based

on

t r a n si e n t t r a n s f e c t i o n experiments a s Well a s s t a b l e

t r a n s f e c t i o n s , a n

e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t m a y b e i d e n t i ? e d t h a t

p r o v i d e s

p a r t i c u l a r l y

h i g h

l e v e l e x p r e s s i o n .

I n o n e e m b o d i

ment

o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n ,

a C h i n e s e h a m s t e r

c e l l l i n e

2 . 1 3 1 d e v e l o p e d b y t r a n s f e c t i o n o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e

e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t a n d s e l e c t i o n

f o r a

h i g h e x p r e s s i o n

c l o n e p r o v i d e s p a r t i c u l a r l y h i g h

l e v e l

e x p r e s s i o n . S u c h

a

C h i n e s e h a m s t e r c e l l l i n e a c c o r d i n g t o t h i s embodiment o f

t h e


m a y s e c r e t e

a b o u t 5 , 0 0 0 t o 7 , 0 0 0 f o l d

more o t - L - i d u r o n i d a s e

t h a n

n o r m a l . The o t - L - i d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

t h e r e b y

may b e

p r o p e r l y p r o c e s s e d , t a k e n

u p

i n t o

c e l l s

W i t h h i g h

a f ? n i t y

a n d i s

c o r r e c t i v e

f o r


d e ? c i e n t c e l l s s u c h

a s

t h o s e

f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m

H u r l e r s S y n d r o m e .

The method f o r p r o d u c i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e i n

amounts

t h a t


t h e enZyme t h e r a p e u t i c a l l y f e a t u r e s a

p r o d u c t i o n p r o c e s s

s p e c i ? c a l l y

d e s i g n e d t o p r o d u c e t h e

e n Z y m e i n h i g h

q u a n t i t i e s . A c c o r d i n g

t o p r e f e r r e d e m b o d i

ments of such a

process, microcarriers

a r e used a s a l o W c o s t

s c a l a b l e s u r f a c e on

Which

t o

g r o W

a d h e r e n t c e l l s . I n

e s p e

c i a l l y p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , s u c h m i c r o c a r r i e r s a r e

m i c r o p o r o u s .

A c c o r d i n g t o

o t h e r

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s

o f

t h e

method

f o r

p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ,

a c u l t u r e system i s o p t i m i Z e d . I n a ? r s t

e m b o d i m e n t ,

t h e c u l t u r e

p H

i s l o W e r e d

t o

a b o u t

6 . 5

t o 7 . 0 ,

p r e f e r a b l y

t o

a b o u t 6 . 7 6 . 8

d u r i n g

t h e p r o d u c t i o n

p r o c e s s .

One

a d v a n t a g e o f

s u c h a pH s t o e n h a n c e

a c c u m u l a t i o n

o f

lysosomal enZymes t h a t

a r e

more

s t a b l e a t a c i d i c pH. I n a

s e c o n d e m b o d i m e n t , a b o u t

/ 3

t o 3 A 1 o f t h e medium s

c h a n g e d

a p p r o x i m a t e l y

e v e r y 1 2 h o u r s . One

a d v a n t a g e

o f

t h i s

p r o

c e d u r e i s t o enhance t h e s e c r e t i o n r a t e o f recombinant

o t - L - i d u r o n i d a s e and c a p t u r e more a c t i v e

enZyme.

I n a t h i r d

e m b o d i m e n t ,

oxygen s a t u r a t i o n

i s o p t i m i Z e d a t a b o u t

80%

u s i n g

i n t e r m i t t e n t

p u r e

o x y g e n s p a r g i n g r a t h e r

t h a n c o n t i n u

o u s s p a r g i n g . I n a f o u r t h embodiment,

c y t o d e x

2 m i c r o c a r

r i e r s

With a b o u t 10% serum i n i t i a l l y a r e

used

t o

produce

a

c e l l

mass

f o l l o W e d by

a r a p i d Washout

h i f t t o

a p r o t e i n - f r e e

medium f o r

p r o d u c t i o n . I n

a

? f t h embodiment,

a g r o W t h

medium

such

a s a

JRH i o s c i e n c e s PF-CHO r o d u c t

m a y

be o p t i m i Z e d t o i n c l u d e s u p p l e m e n t a l amounts o f one o r

more i n g r e d i e n t s s e l e c t e d

f r o m t h e g r o u p

c o n s i s t i n g o f

g l u t a m a t e , a s p a r t a t e , g l y c i n e , r i b o n u c l e o s i d e s a n d d e o x y r i

b o n u c l e o s i d e s . I n

a s i x t h embodiment, a

p e r f u s i o n W a nd

such

a s a B e l l c o p e r f u s i o n

W a n d

m a y be used i n a f r e q u e n t

b a t c h - f e e d p r o c e s s

r a t h e r

t h a n a s t a n d a r d i n t e n d e d p e r f u s i o n

p r o c e s s . I n a s e v e n t h embodiment, a m i l d sodium b u t y r a t e

i n d u c t i o n

p r o c e s s m a y b e used t o i n d u c e

i n c r e a s e d

o t - L

i d u r o n i d a s e e x p r e s s i o n W i t h o u t

a

s u b s t a n t i a l e f f e c t on t h e

c a r b o h y d r a t e p r o c e s s i n g

a n d c e l l u l a r u p t a k e

o f

t h e e n Z y m e .

Such

a n

i n d u c t i o n

p r o c e s s

m a y

p r o v i d e a b o u t

a

t W o - f o l d

i n c r e a s e i n

p r o d u c t i o n

W i t h o u t s i g n i ? c a n t l y a l t e r i n g p o s t

t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g .

P a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d


o f

t h e

m e t h o d

f o r

p r o d u c i n g


a c c o r d i n g t o

t h e p r e s e n t i n v e n

t i o n f e a t u r e o n e ,

more

t h a n one o r a l l of t h e o p t i m i Z a t i o n s

d e s c r i b e d

h e r e i n . The p r o d u c t i o n

method o f

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ma y t h e r e f o r e

p r o v i d e

a

p r o d u c t i o n

c u l t u r e

p r o

c e s s h a v i n g t h e f o l l o W i n g f e a t u r e s :

10

1 5

20

25

30

35

40

45

55

60

6 5

6

1 . A i c r o c a r r i e r b a s e d

c u l t u r e

u s i n g Cytodex 2 b e a d s o r

a n

e q u i v a l e n t

t h e r e o f

i s

p r e f e r a b l y

u s e d i n

l a r g e

s c a l e

c u l t u r e ? a s k s W i t h o v e r h e a d Wand

s t i r r i n g

u s i n g a

B e l l c o

p e r f u s i o n W a nd o r

a n

e q u i v a l e n t

t h e r e o f .

A t t a c h

ment

t o

t h e s e

beads m a y be a c h i e v e d by c u l t u r e i n

a

10%

f e t a l

b o v i n e

serum

i n

DME/F 2

1 : 1

medium

m o d i ? e d

W i t h i n g r e d i e n t s i n c l u d i n g r i b o n u c l e o s i d e s ,

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s , p y r u v a t e , n o n - e s s e n t i a l a m i n o

a c i d s , a n d HEPES-and a t

a pH

f a b o u t

6 . 7 6 . 9 .

A f t e r

a b o u t 3

d a y s

i n t h i s medium, a W a s h o u t

p r o c e d u r e

i s

b e g u n

i n

W h i c h

p r o t e i n - f r e e m e d i u m

r e p l a c e s a p p r o x i

m a t e l y Z / 3

o f

t h e medium a p p r o x i m a t e l y

e v e r y

1 2

h o u r s

f o r a t o t a l

o f a b o u t

34 W a s h e s . S u b s e q u e n t l y a n d

t h r o u g h o u t t h e e n t i r e r e m a i n i n g c u l t u r e p e r i o d , t h e

c e l l s

a r e c u l t i v a t e d

i n

p r o t e i n - f r e e medium.

.

The c u l t u r e conditions a r e preferably

maintained a t

a

d i s s o l v e d oxygen o f 80% f

a i r

s a t u r a t i o n a t a pH f

a b o u t

6 . 7

and t a t e m p e r a t u r e o f a b o u t 3 7 C . T h i s m a y

b e a c h i e v e d u s i n g a c o n t r o l t o W e r ,

s e r v i c e u n i t

a n d

a p p r o p r i a t e

p r o b e s s u c h

a s

t h o s e

p r o d u c e d

b y

W h e a t o n .

H o W e v e r , s k i l l e d a r t i s a n s W i l l r e a d i l y

a p p r e c i a t e

t h a t

t h i s

c a n e a s i l y

b e a c h i e v e d

by

e q u i v a l e n t

c o n t r o l s y s

t e m s p r o d u c e d

by

o t h e r m a n u f a c t u r e r s . An a i r s a t u r a

t i o n o f a b o u t 80% r e s u l t s i n i m p r o v e d o t - L - i d u r o n i d a s e

s e c r e t i o n

o v e r 40%

and

60%

i r s a t u r a t i o n . H o W e v e r

90%

a i r

s a t u r a t i o n d o e s n o t p r o v i d e s i g n i ? c a n t l y

enhanced

s e c r e t i o n o v e r

80%

i r s a t u r a t i o n . The d i s

s o l v e d o x y g e n m a y

b e s u p p l i e d by

i n t e r m i t t e n t p u r e

oxygen

s p a r g i n g

u s i n g a

5 m i c r o n

s t a i n l e s s

s t e e l

s p a r g e r

o r

e q u i v a l e n t t h e r e o f . A H o f a b o u t

6 . 7

i s

o p t i m a l f o r t h e a c c u m u l a t i o n

o f

t h e o t - L - i d u r o n i d a s e

e n Z y m e .

The enZyme i s


u n s t a b l e

a t

pHs

a b o v e a b o u t

7 . 0 .

BeloW a p H o f a b o u t

6 . 7 ,

t h e

s e c r e t i o n

r a t e

m a y

d e c r e a s e , p a r t i c u l a r l y

beloW

a

p H

o f

a b o u t

6 . 5 .

The c u l t u r e i s t h e r e f o r e

m a i n t a i n e d o p t i m a l l y b e t W e e n

a

pH f a b o u t 6 . 6 t o 6 . 8 .

. The production c u l t u r e medium may

be a

modi?ed

f o r m o f t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p r o p r i e t a r y

medium

from

JR H

B i o s c i e n c e s c a l l e d E x c e l l PF

CHO.

T h i s medium s u p p o r t s l e v e l s o f s e c r e t i o n e q u i v a l e n t t o

t h a t o f serum u s i n g a c e l l

l i n e

such

a s t h e

2 . 1 3 1

c e l l

l i n e . I t

m a y

b e

p r e f e r a b l y

modi?ed o

i n c l u d e

a n

a c i d i c

p H

o f a b o u t

6 . 7

( + / 0 . 1 ) , a n d

i t

may b e

b u f f e r e d

W i t h

HEPES t

7 . 5

mM. The medium m a y c o n t a i n

0 . 0 5 t o

0.1% o f

P l u r o n i c s

F - 6 8

(BASF),

a

n o n - i o n i c

s u r f a c t a n t

o r a n e q u i v a l e n t t h e r e o f Which f e a t u r e s t h e a d v a n t a g e

o f

p r o t e c t i n g

c e l l s

f r o m

s h e a r

f o r c e s a s s o c i a t e d

W i t h

s p a r g i n g .

The

medium

m a y

f u r t h e r

c o n t a i n

a p r o p r i

e t a r y s u p p l e m e n t t h a t p r o v e s

t o b e i m p o r t a n t i n

i n c r e a s

i n g

t h e p r o d u c t i v i t y o f t h e

medium o v e r

o t h e r p r o t e i n

f r e e mediums t h a t a r e p r e s e n t l y a v a i l a b l e . Those s k i l l e d

i n

t h e a r t W i l l r e a d i l y

u n d e r s t a n d

t h a t t h e

c h o i c e o f

c u l t u r e medium

may

b e

o p t i m i Z e d

c o n t i n u a l l y a c c o r d

i n g t o p a r t i c u l a r c o m m e r c i a l embodiments a v a i l a b l e

a t

p a r t i c u l a r p o i n t s i n t i m e . S u c h

c h a n g e s

e n c o m p a s s

n o

more

t h a n

r o u t i n e e x p e r i m e n t a t i o n

and a r e i n t e n d e d t o

b e

W i t h i n

t h e

s c o p e

o f

t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n .

.

The

p r o d u c t i o n medium m a y be a n a l y Z e d u s i n g a n

a m i n o

a c i d

a n a l y Z e r c o m p a r i n g s p e n t medium W i t h

s t a r t i n g

m e d i u m . S u c h a n a l y s e s h a v e d e m o n s t r a t e d

t h a t

t h e

2 . 1 3 1 c e l l l i n e

d e p l e t e s

a s t a n d a r d PF CHO edium

o f

g l y c i n e ,

g l u t a m a t e

a n d

a s p a r t a t e

t o

a l e v e l

o f

a r o u n d

10%

o f

t h e s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o n o f

t h e s e amino a c i d s t o h i g h e r l e v e l s m a y r e s u l t i n

e n h a n c e d c u l t u r e d e n s i t y a n d p r o d u c t i v i t y t h a t

may

l e a d t o a

23 f o l d

h i g h e r p r o d u c t i o n t h a n a t b a s e l i n e .

S k i l l e d

a r t i s a n s

W i l l a p p r e c i a t e t h a t o t h e r c e l l l i n e s

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

20/36

US

6 , 4 2 6 , 2 0 8

B1

7

W i t h i n t h e

s c o p e o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

ma y b e

e q u a l l y

u s e f u l f o r p r o d u c i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d

i n g t o

t h e

p r e s e n t m e t h o d . H e n c e , more o r l e s s s u p p l e

m e n t a l n u t r i e n t s may b e r e q u i r e d t o o p t i m i z e t h e

medium. Such o p t i m i z a t i o n s

a r e i n t e n d e d t o be W i t h i n

t h e

s c o p e

o f

t h e


a n d

ma y

b e

p r a c t i c e d

W i t h o u t

u n d u e

e x p e r i m e n t a t i o n .

. The

me d i um

may be supplemented With r i b o n u c l e o

s i d e s a n d

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s

t o

s u p p o r t

t h e

d i h y d r o

f o l a t e r e d u c t a s e d e ? c i e n t c e l l

l i n e 2 . 1 3 1 . S k i l l e d

a r t i

s a n s

W i l l a p p r e c i a t e t h a t o t h e r c e l l

l i n e s W i t h i n

t h e

s c o p e

o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y b e e q u a l l y u s e f u l

f o r p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t

method. Hence, more o r l e s s r i b o n u c l e o s i d e s and deox

y r i b o n u c l e o s i d e s may

b e

r e q u i r e d

t o

o p t i m i Z e

t h e

medium.

Such o p t i m i Z a t i o n s a r e

i n t e n d e d W i t h i n

t h e

s c o p e

o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a n d m a y b e p r a c t i c e d

W i t h o u t

u n d u e

e x p e r i m e n t a t i o n .

6 . A f t e r

r e a c h i n g

c o n ? u e n c e a t a b o u t

3 4

d a y s

o f

c u l t u r e ,

a p p r o x i m a t e l y Z / 3 o f

t h e

medium

may

b e c h a n g e d o u t

a p p r o x i m a t e l y e v e r y

1 2

h o u r s .

The

c h a n g e

o u t

o f

medium

may

b e a c c o m p l i s h e d

u s i n g , f o r i n s t a n c e , a

B e l l c o p e r f u s io n Wand

Which i s a

s t i r r i n g d e v i c e W i t h

a holloW c e n t e r a n d s c r e e n ? l t e r a t

i t s

t i p . By pumping

o u t

medium t h r o u g h t h e h o l l o W

i n t e r i o r o f

t h e Wand

t h r o u g h t h e 40 micron s c r e e n . The

m i c r o c a r r i e r s

W i t h

t h e 2 . 1 3 1 c e l l

mass

a r e

s e p a r a t e d

from

s u p e r n a t a n t

c o n t a i n i n g

t h e e n Z y m e .

.

The r a p i d and

f r e q u e n t

t u r n o v e r o f t h e

medium h a s

b e e n

shoWn

by p r o d u c t i v i t y s t u d i e s t o r e s u l t

i n

i m p r o v e d o v e r a l l c o l l e c t i o n o f enZyme f r o m t h e c e l l

c u l t u r e .

L e s s f r e q u e n t

c h a n g e s

r e s u l t i n l e s s t o t a l

a c c u

m u l a t i o n

o f enZyme. S t u d i e s

o f

t h e s e c r e t i o n

r a t e

o f t h e

enZyme

d u r i n g a

1 2 h o u r c u l t u r e

c y c l e

d e m o n s t r a t e t h a t

t h e

c e l l s

a r e

a c t i v e l y

s e c r e t i n g

enZyme

o r

t h e

m a j o r i t y

o f

t h e

c u l t u r e p e r i o d . More f r e q u e n t c h a n g e s a r e

u n l i k e l y t o

y i e l d

s u b s t a n t i a l l y more

e n Z y m e . The

method

o f t h i s embodiment h a s p r o v e n t o b e s u p e r i o r

t o

p e r f u s i o n

c u l t u r e a n d

f a r s u p e r i o r

t o

s t r i c t

b a t c h

c u l t u r e o r d a i l y

o r

e v e r y

o t h e r

d a y

b a t c h / f e e d s t r a t e g i e s .

U s i n g

t h e

e v e r y a p p r o x i m a t e l y

1 2

h o u r c h a n g e , t h e

c e l l s m a y b e m a i n t a i n e d

i n e x c e l l e n t

c o n d i t i o n W i t h

h i g h d e g r e e s o f

v i a b i l i t y

a n d

a

h i g h l e v e l o f p r o d u c

t i v i t y .

.

P r o d u c t i o n

o f o t - L - i d u r o n i d a s e may e enhanced by t h e

u s e

o f sodium

b u t y r a t e i n d u c t i o n o f

g e n e

e x p r e s s i o n .

S y s t e m a t i c s t u d i e s o f a 2 . 1 3 1

c e l l

l i n e d e m o n s t r a t e d

t h a t a b o u t 2 mM u t y r a t e c a n b e a p p l i e d a n d r e s u l t i n

about

a

t W o - f o l d

o r

g r e a t e r

i n d u c t i o n o f

enZyme

p r o

d u c t i o n W i t h minimal e f f e c t s

on

c a r b o h y d r a t e p r o c e s s

i n g . LoWer

l e v e l s

o f

b u t y r a t e

h a v e

n o t

b e e n shoWn t o

i n d u c e a s W e l l ,

a n d

s u b s t a n t i a l l y

h i g h e r

l e v e l s may

r e s u l t

i n h i g h e r i n d u c t i o n b u t d e c l i n i n g a f f i n i t y o f

t h e

p r o d u c e d e n Z y m e

f o r c e l l s f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m

o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .

The

r e s u l t s

s u g g e s t

t h a t

t W o - f o l d o r g r e a t e r

i n d u c t i o n

r e s u l t s i n l e s s p r o c e s s i n g

o f t h e c a r b o h y d r a t e s a n d l e s s

p h o s p h a t e a d d i t i o n

t o t h e

enZyme

a s

W e l l

a s

i n c r e a s i n g t o x i c i t y . One


p r e f e r r e d

method

u s e s 2 mM u t y r a t e a d d i t i o n e v e r y 4 8

h o u r s t o t h e c u l t u r e s y s t e m . T h i s

embodiment

r e s u l t s i n

a b o u t a

t W o - f o l d

i n d u c t i o n o f enZyme p r o d u c t i o n u s i n g

t h i s

method

W i t h o u t s i g n i ? c a n t

e f f e c t

o n

t h e

u p t a k e

a f ? n i t y

o f

t h e

e n Z y m e ,

( K - u p t a k e o f

l e s s

t h a n

3 0

U/ml

o r 2 . 0 mM). U s i n g e m b o d i m e n t s

o f

t h e p r e s e n t method

f e a t u r i n g a l l

o f

t h e

a b o v e m o d i ? c a t i o n s a n d

i n d u c t i o n ,

a

1 5

l i t e r

c u l t u r e

s y s t e m

m a y

p r o d u c e

a p p r o x i m a t e l y

2 5

mg

e r

l i t e r

o f

c u l t u r e p e r d a y , o r

more

t peak

u l t u r i n g

d e n s i t y .

10

1 5

25

35

45

55

6 5

8

I n

a s e c o n d

a s p e c t , t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a

t r a n s f e c t e d

c e l l l i n e Which p o s s e s s e s t h e u n i q u e a b i l i t y t o

p r o d u c e

o t - L - i d u r o n i d a s e i n a m o u n t s W h i c h e n a b l e u s i n g t h e

e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y .

I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a recombinant C h i n e s e h a m s t e r

o v a r y

c e l l l i n e

s u c h

a s t h e

2 . 1 3 1

c e l l l i n e

t h a t

s t a b l y

a n d

r e l i a b l y p r o d u c e s a m o u n t s

o f o t - L - i d u r o n i d a s e . I n p r e f e r r e d

embodiments, t h e c e l l l i n e m a y c o n t a i n

a t

l e a s t a b o u t 1 0

c o p i e s

o f a n e x p r e s s i o n c o n s t r u c t c o m p r i s i n g a CMV

p r o m o t e r , a Ca i n t r o n , a human

o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA,

a n d

a

b o v i n e g r o W t h hormone p o l y a d e n y l a ti o n s e q u e nc e .

I n

even

more

p r e f e r r e d

embodiments,

t h e c e l l l i n e

e x p r e s s e s

o t - L - i d u r o n i d a s e a t

amounts

o f a t l e a s t a b o u t 2040

micro

g r a m s

p e r 1 0 7 c e l l s p e r d a y i n a p r o p e r l y p r o c e s s e d , . h i g h

u p t a k e f o r m a p p r o p r i a t e f o r e n Z y m e r e p l a c e m e n t

t h e r a p y .

A c c o r d i n g , t o

p r e f e r r e d


o f

t h i s

a s p e c t

o f

t h e

i n v e n t i o n , t h e t r a n s f e c t e d c e l l l i n e a d a p t e d t o

p r o d u c e

o t - L

i d u r o n i d a s e

i n amounts

Which


t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y

p o s s e s s e s

one

o r

more

o f

t h e

f o l l o W i n g

f e a t u r e s :

1 . The c e l l l i n e o f

p r e f e r r e d

embodiments

s

d e r i v e d

f r o m

a

p a r e n t

c e l l l i n e Wherein t h e c e l l s a r e p a s s a g e d i n

c u l t u r e

u n t i l t h e y

h a v e

a c q u i r e d a s m a l l e r s i Z e and

more

r a p i d

g r o W t h r a t e a n d u n t i l

t h e y r e a d i l y

a t t a c h

t o

s u b s t r a t e s .

2 .

The

c e l l l i n e

o f p r e f e r r e d

embodiments i s t r a n s f e c t e d

W i t h a n e x p r e s s i o n v e c t o r c o n t a i n i n g

t h e c y t o m e g a l o v i

r u s p r o m o t e r / e n h a n c e r e l e m e n t , a 5 i n t r o n c o n s i s t i n g o f

t h e murine

Ca

i n t r o n betWeen exons

2 and

3 , a h uma n

cDNA f

a b o u t

2 . 2 kb i n l e n g t h , a n d a 3 b o v i n e g r o W t h

h o r m o n e

p o l y a d e n y l a t i o n s i t e . T h i s e x p r e s si o n v e c t o r

m a y b e t r a n s f e c t e d a t , f o r e x a m p l e , a 50 t o

1

r a t i o

W i t h

any

a p p r o p r i a t e

common s e l e c t i o n v e c t o r such a s

pSV2NEO.

The

s e l e c t i o n v e c t o r p S V 2 NEO i n t u r n

c o n f e r s

G 418

r e s i s t a n c e on s u c c e s s f u l l y t r a n s f e c t e d

c e l l s . I n p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d


a r a t i o o f

a b o u t

50

t o

1

i s

u s e d s i n c e t h i s r a t i o

e n h a n c e s

t h e

a c q u i s i t i o n

o f m u l t i p l e c o p y n u m b e r i n s e r t s . A c c o r d i n g

t o one embodiment

Wherein t h e

Chinese hamster ovary

c e l l

l i n e 2 . 1 3 1 i s p r o v i d e d , t h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y 1 0

c o p i e s o f t h e e x p r e s s i o n v e c t o r f o r o t - L - i d u r o n i d a s e .

Such a

c e l l l i n e

h a s d e m o n s t r a t e d t h e

a b i l i t y t o

p r o d u c e

l a r g e

q u a n t i t i e s

o f h u m a n o t - L - i d u r o n i d a s e

( m i n i m u m

2 0 m i c r o g r a m s p e r

1 0

m i l l i o n c e l l s p e r d a y ) . P a r t i c u

l a r l y

p r e f e r r e d

embodiments s u c h

a s

t h e

2 . 1 3 1

c e l l

l i n e

p o s s e s s

t h e

a b i l i t y

t o p r o d u c e

p r o p e r l y p r o c e s s e d

enZyme t h a t c o n t a i n s N - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s con

t a i n i n g h i g h

m a n n o s e c h a i n s

modi?ed

W i t h p h o s p h a t e

a t

t h e 6 p o s i t i o n i n s u f ? c i e n t q u a n t i t y t o

p r o d u c e

a n

e n Z y m e

W i t h

h i g h a f ? n i t y

( K - u p t a k e

o f

l e s s t h a n 3 n M ) .

3 . The

enZyme p r o d u c e d f r o m t h e

c e l l

l i n e s o f t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

such

a s a

Chinese hamster ovary c e l l l i n e

2 . 1 3 1

i s r a p i d l y

a s s i m i l a t e d i n t o

c e l l s , e l i m i n a t e s g l y

c o s a m i n o g l y c a n

s t o r a g e a n d h a s a h a l f - l i f e

o f

a b o u t 5

d a y s

i n c e l l s

f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m

o t - L

i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .

4 . The c e l l l i n e o f p r e f e r r e d embodiments

such

a s

a

2 . 1 3 1

c e l l

l i n e

a d a p t s t o l a r g e s c a l e c u l t u r e

a n d

s t a b l y

p r o

d u c e s

human o t - L - i d u r o n i d a s e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .

The

c e l l s

o f

p r e f e r r e d

embodiments

a r e

a b l e

t o

groW

a n d

s e c r e t e


a t

t h e

a c i d

pH

f a b o u t

6 . 6

t o

6 . 8

a t Which enhanced accumulation

of o t - L

iduronidase can occur.

5 . P a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d


o f

t h e

c e l l l i n e

a c c o r d i n g

t o t h e i n v e n t i o n , such

a s

a

2 . 1 3 1

c e l l

l i n e

a r e

a b l e

t o s e c r e t e h u m a n o t - L - i d u r o n i d a s e a t l e v e l s

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

21/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

22/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

23/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

24/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

25/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

26/36

8/10/2019 US 6,426,208-Nov 19

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