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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Exatas

Departamento de Química

Luiz Philip Lopes Costa

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TÉCNICAS DE PREPARO DE

AMOSTRAS PARA DETERMINAÇÃO DE BIXINA E METFORMINA EM

PLASMA DE RATO POR UHPLC-DAD-MS/MS

Belo Horizonte

2017

UFMG/ICEx/DQ. 1210ª

D. 668ª


AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TÉCNICAS DE PREPARO DE

AMOSTRAS PARA DETERMINAÇÃO DE BIXINA E METFORMINA EM

PLASMA DE RATO POR UHPLC-DAD-MS/MS

Dissertação apresentada ao Departamento

de Química do Instituto de Ciências Exatas

da Universidade Federal de Minas Gerais,

como requisito parcial para a obtenção do

grau de Mestre em Química – Química

Analítica

Belo Horizonte

2017

Costa, Luiz Philip Lopes

Avaliação de diferentes técnicas de preparo de

amostras para determinação de bixina e metformina em

plasma de rato por UHPLC-DAD-MS/MS / Luiz Philip Lopes

Costa. 2017.

[x],75 f. : il.

Orientador: Ricardo Mathias Orlando.

Coorientador: Rubén Dario Sinisterra Millan.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Minas Gerais – Departamento de Química.

Inclui bibliografia.

1. Química analítica - Teses 2. Preparação de

amostra (Química) - Teses 3. Medicamentos - Análise –

Teses 4. Cromatografia líquida – Teses I. Orlando,

Ricardo Mathias, Orientador II. Sinisterra Millán,

Rubén Dario, Coorientador III. Título.

CDU 043

C837a

2017

D

químicapó g'-.d"~,,,.u·""9

"Avaliação de Diferentes Técnicas de Preparo de Amostras para Determinação

de Bixina e Metformina em Plasma de Rato por UHPLC-DAD-MS/MS"


Dissertação aprovada pela banca examinadora constituída pelos Professores:

~lW\~ 'M~\p ~Prof. Ricardo Mathias Orlando - Orientador

UFMG

r, \~~.~~[.e~"o/rot:lfúhh UFMG

~~~~!!'~ UF~téVy

Belo Horizonte, 27 de março de 2017.

i

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a minha família, minha mãe Ecy, meus irmãos João

Paulo e Polianne por sempre estarem ao meu lado nessa jornada;

Ao meu Pai, Orácio, por sempre ter me dado incentivo aos estudos;

Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Orlando pela paciência, pelos

ensinamentos e pelo incentivo ao longo do caminho percorrido;

Ao meu coorientador Prof. Dr. Ruben pela parceria neste trabalho;

À Drª. Cyntia pelos ensinamentos;

Ao técnico de laboratório Zezé que sempre esteve disponível quando precisava

de amostra;

Aos amigos dos laboratórios LAMS e LEMB pelos momentos de alegria

compartilhados neste tempo;

Aos amigos de república e os amigos de viçosa que vivem em BH pelos bons

momentos;

Aos amigos de Sete Lagoas pelo companheirismo;

À Pós-graduação do departamento de química e à UFMG pela oportunidade de

desenvolver este trabalho e pela infraestrutura;

Aos funcionários do departamento de química pelo suporte;

Aos professores pelos ensinamentos;

À CAPES pela concessão da bolsa de estudo;

À todos aqueles que de forma direta e indireta contribuíram para realização deste

trabalho e para formação do conhecimento;

Meu muito obrigado.

ii

Resumo

Neste trabalho foram desenvolvidos e validados dois métodos sendo um para

bixina, por extração líquido-líquido, e outro para metformina, por precipitação proteica,

ambos extraídos de amostras de plasma de rato.

Devido à complexidade da composição do plasma, faz-se necessário o uso de

técnicas de preparo de amostra para eliminação de interferentes e/ou pré-concentração.

A extração líquido–líquido foi utilizada para extração de bixina com posterior análise

por cromatografia líquida de ultra eficiência associada a um sistema de detecção por

absorbância com arranjo de fotodiodos e posterior espectrometria de massa sequencial

(UHPLC-DAD-MS/MS). A precipitação proteica foi empregada na extração da

metformina que foi analisada, por sua vez, por cromatografia líquida de ultra eficiência

acoplada à espectrometria de massas sequencial (UPLC-MS/MS).

Os métodos desenvolvidos para bixina e para metformina foram validados e

foram obtidos valores de exatidão por ensaio de recuperação próximo de 103 e 102%,

respectivamente. A precisão obtida em termos de coeficiente de variação foi de 10%

para ambos os compostos. O limite de quantificação foi de 40 ng mL-1

para a bixina e 1

ng mL-1

para a metformina com coeficiente de variação de 15 e 13%, respectivamente.

A faixa linear de trabalho foi de 200-2200 ng mL-1

para a bixina e 5-500 ng mL-1

para

metformina.

Os resultados obtidos são coerentes com a literatura, permitindo a extração e

posterior análise dos compostos a partir de uma matriz complexa, no caso plasma de

rato. Além disso, os volumes de amostra utilizados na extração líquido-líquido da bixina

foram inferiores aos encontrados na literatura.

Palavras-chave: bixina, metformina, plasma, extração líquido-líquido,

precipitação proteica, cromatografia líquida de ultra eficiência.

iii

Abstract

In this work, two methods, one for bixin, by liquid-liquid extraction, another one

for metformin, by protein precipitation, both extracted from samples of rat plasma, were

developed and validated.

Due to the complexity of the plasma composition, it was necessary to use sample

preparation techniques to eliminate interferents and/or preconcentrate. The liquid-liquid

extraction was used to extract bixin with subsequent analysis by ultra-high performance

liquid chromatography associated to an absorbance with photodiode array detector and

subsequent sequential mass spectrometry (UHPLC-DAD-MS/MS). Protein precipitation

was employed in the extraction of metformin, which was analyzed by ultra-high

performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPLC-

MS/MS).

The methods developed for bixin and for metformin were validated and accuracy

values were obtained per recovery experiment near 103 and 102%, respectively. The

precision obtained, in terms of coefficient of variation, was 10% for both compounds.

The quantification limit was 40 ng mL-1

for bixin and 1 ng mL-1

for metformin with a

coefficient of variation of 15 and 13%, respectively. The linear range of work was 200-

2200 ng mL-1

for bixin and 5-500 ng mL-1

for metformin.

The results obtained are consistent with the literature, allowing the extraction

and subsequent analysis of the compounds from a complex matrix, in the rat blood

plasma. In addition, the sample volumes used in the liquid-liquid extraction of bixin are

lower than those found in the literature.

Key words: bixin, metformin, plasma, liquid-liquid extraction, protein

precipitation, liquid chromatography

iv

Lista de Figuras

Figura 1: Estrutura química da molécula de bixina. ....................................................... 1

Figura 2: Proposta da biossíntese de bixina a partir do licopeno por transformações

enzimáticas [1, 2]. ......................................................................................................... 2

Figura 3: Estrutura química da metformina. .................................................................. 4

Figura 4: Esquema das diferentes etapas envolvidas nos preparo de amostras por

precipitação proteica. .................................................................................................... 8

Figura 5: Esquema das diferentes etapas envolvidas em uma extração líquido-líquido. 10

Figura 6: Esquema da extração em fase sólida. 1) etapa de condicionamento em que um

solvente é percolado pelo cartucho. 2) etapa de aplicação da amostra. 3) etapa de

lavagem ou limpeza em que os interferentes são eliminados do sorvente. 4) etapa de

eluição em que os analitos de interesse são removidos do cartucho. ............................ 15

Figura 7: Sistema cromatográfico composto por fase móvel, bomba de alta pressão,

injetor, coluna cromatográfica, detector e sistema de aquisição de dados. .................... 20

Figura 8: Sistema do espectrômetro de massas composto por entrada da amostra, fonte

de ionização, analisador, detector e sistema de aquisição de dados. ............................. 23

Figura 9: Estrutura da metformina e fragmentos do íons monitorados. ........................ 44

Figura 10: Estrutura da bixina e fragmentos dos íons monitorados. ............................. 45

Figura 11: Cromatograma das injeções de solução padrão de metformina(A) (500 ng

mL-1

)com detecção por espectrometria de massas sequencial (m/z 130→60), solução

padrão de bixina (B) (2500 ng mL-1

)com detecção por absorbância com detector com

arranjo de fotodiodos e solução padrão de bixina (C) (2500 ng mL-1

) com detecção por

espectrometria de massas (m/z 395→363). .................................................................. 46

Figura 12: Cromatograma da injeção de solução padrão de bixina (2200 ng mL-1

) com

destaque para o espectro de absorção no tempo de retenção (4,57 min). ...................... 47

Figura 13: Avaliação do tipo de agente precipitante (ATCA, acetona e acetonitrila) na

porcentagem de extração de metformina em amostras de plasma. ................................ 49

Figura 14: Avaliação do teor de agente precipitante (5, 10 e 15% m/v) na porcentagem

de extração de metformina em amostras de plasma...................................................... 50

Figura 15: Cromatogramas demonstrando a distorção no formato do pico da metformina

após a extração por precipitação proteica empregando o agente precipitante ácido

tricloroacético em diferentes concentrações (5, 10 e 15%, m/v). .................................. 51

Figura 16: Avaliação do tipo de solvente extrator (éter dietílico, diclorometano, hexano

e éter dietílico:acetonitrila/5:2) na porcentagem de extração de bixina por extração

líquido-líquido. ........................................................................................................... 52

Figura 17: Avaliação da diluição do plasma na porcentagem de extração de bixina na

extração líquido-líquido. Sem diluição = sem diluição dos 400 µL de plasma com água

deionizada; diluição 100 = 400 µL de plasma diluído com 100 µL de água deionizada;

diluição 200 = 400 µL de plasma diluído com 200 µL de água deionizada. ................. 53

Figura 18: Avaliação do tempo de agitação na porcentagem de extração de bixina por

extração líquido-líquido. ............................................................................................. 54

v

Figura 19: Avaliação do efeito da adição de NH4Ac (acetato de amônio)(20%, m/v),

NaCl (20%, m/v) e Na2HPO4 (10%, m/v) no plasma na porcentagem de extração de

bixina por extração líquido-líquido. ............................................................................. 55

Figura 20: Avaliação do número de extração na porcentagem de extração de bixina por

extração líquido-líquido. ............................................................................................. 56

Figura 21: Avaliação do efeito do tipo de sorvente empregado na porcentagem de

extração de bixina de amostras de plasma empregando a extração em fase sólida. ....... 57

Figura 22: Avaliação do efeito da massa de sorvente na porcentagem de extração de

bixina de amostras de plasma empregando a extração em fase sólida........................... 58

Figura 23: Avaliação do efeito da adição de sal na etapa de diluição do plasma e clean

up na porcentagem de extração de bixina em amostra de plasma empregando a extração

em fase sólida. SA = sem adição de sal; S01 = adição de sal na diluição do plasma; S02

= Adição de sal da diluição do plasma e na etapa de clean up; S03 = adição de sal na

etapa de clean up......................................................................................................... 59

Figura 24: Avaliação de diferentes sistemas de eluição na extração de bixina em

amostrsa de plasma empregando a extração em fase sólida. E1: 2 x 600µL ACN:éter

dietílico (1:1, v/v); E2: 1 x 400 µL ACN; E3: 1 x 600µL ACN:éter dietílico (1:1, v/v) +

1 x 600 µL éter dietílico; E4: 1 x 400 µL ACN + 1 x 600 µL éter dietílico. ................. 60

Figura 25: Cromatogramas da injeção de bixina (2200 ng mL-1

) adicionado em um

extrato de plasma e um extrato de branco de plasma. O espectro Uv-Vis foi adquirido no

comprimento de onda de 459 nm. ................................................................................ 61

Figura 26: Cromatogramas da metformina (500 ng mL-1

) com detecção por

espectrometria de massas sequencial (m/z 130→60) adicionado em um extrato de

plasma e um extrato de branco de plasma. ................................................................... 61

vi

Lista de tabela

Tabela 1: Sorvente utilizados em extração em fase sólida. ........................................... 15

Tabela 2: Comparação das técnicas, colunas, fases móveis e preparo de amostra

utilizadas na analise de metformina e bixina ................................................................ 22

Tabela 3: Especificações das colunas cromatográficas avaliadas. ................................ 29

Tabela 4: Proporções dos agentes precipitantes avaliados na extração de metformina em

amostras de plasma. .................................................................................................... 29

Tabela 5: Grupos de condições avaliadas no estudo do efeito da adição de sal na

porcentagem de extração da bixina por SPE. ............................................................... 37

Tabela 6: Sistemas de eluição avaliados na etapa de eluição para a extração da bixina de

amostras de plasma por SPE........................................................................................ 39

Tabela 7: Parâmetros cromatográficos de separação obtidos nas diferentes colunas

cromatográficas avaliadas. .......................................................................................... 48

Tabela 8: Parâmetros da validação da bixina e metformina. Curva de calibração, faixa

linear, coeficiente de correlação e limite de quantificação. .......................................... 62

Tabela 9: Valores de precisão para bixina e metformina. ............................................. 62

Tabela 10: Valores de recuperação da exatidão para bixina e metformina. ................... 63

vii

Abreviaturas

APCI Ionização química à pressão atmosférica (Atmospheric pressure chemical

ionization)

APPI Fotoionização à pressão atmosférica (Atmospheric pressure

photoionization)

DAD Detector por arranjo de diodos (Diodo array detector)

DESI Ionização de dessorção por eletronebulização (Desorption electrospray

ionization)

DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva (Dispersive liquid-liquid

microextraction)

EI Impacto de elétrons (Electron impact)

ELL Extração líquido-líquido

ESI Ionização por eletronebulização (Eletronspray ionization)

FAB Ionização por bombardeamento de átomos rápidos (Fast atom bombardment

ionization)

HF-LPME Microextração em fase líquida com fibra oca (Hollow fiber liquid phase

microextraction)

HILIC Cromatografia líquida com interação hidrofílica (Hydrophilic interaction

chromatography)

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid

chromatography)

m/z Relação massa carga

MALDI Ionização/dessorção a laser assistida por matriz (Matrix-assisted laser

desorption/ionization)

MS Espectrometria de massas (Mass espectrometry)

MS/MS Espectrometria de massas sequencial (Mass spectrometry/mass

spectrometry)

MSPD Dispersão da matriz em fase sólida (Matrix solid phase dispersion)

RMN Ressonância magnética nuclear

SDME Microextração em gota única (Single drop microextraction)

SPE Extração em fase sólida (Solid phase extraction)

SPME Microextração em fase sólida (Solid phase microextraction)

UHPLC/UPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência (Ultra high

performance liquid chromatography)

UV-Vis Ultravioleta-Visível

https://en.wikipedia.org/wiki/Matrix-assisted_laser_desorption/ionization

https://en.wikipedia.org/wiki/Matrix-assisted_laser_desorption/ionization

viii

Sumário

Agradecimentos ......................................................................................... i

Resumo ................................................................................................. ii

Abstract ................................................................................................ iii

Lista de Figuras ....................................................................................... iv

Lista de tabela.......................................................................................... vi

Abreviaturas ........................................................................................... vii

1. Introdução .......................................................................................... 1

1.1. Bixina ................................................................................................. 1

1.2. Metformina ......................................................................................... 4

1.3. Sistemas de liberação controlada ...................................................... 5

1.4. Técnicas de preparo de amostra para extração de fármacos em

fluídos biológicos .............................................................................. 6

1.4.1. Precipitação protéica ............................................................................................ 7

1.4.2. Extração líquido-líquido....................................................................................... 9

1.4.3. Extração em fase sólida ...................................................................................... 13

1.5. Técnicas de preparo de amostra empregadas para a determinação

de bixina, metformina e compostos correlatos .............................. 17

1.6. Cromatografia líquida na determinação de fármacos em fluídos

biológicos ......................................................................................... 18

1.7. Espectrometria de massas na determinação de fármacos em fluídos

biológicos ......................................................................................... 23

2. Objetivo Geral .................................................................................. 26

3. Materiais e Métodos ......................................................................... 27

3.1. Reagentes e soluções ......................................................................... 27

3.2. Equipamentos ................................................................................... 27

3.3. Amostras ........................................................................................... 27

3.4. Parâmetros cromatográficos ........................................................... 28

3.5. Parâmetros da espectrometria de massa......................................... 28

ix

3.6. Avaliação das colunas cromatográficas .......................................... 28

3.7. Avaliação dos parâmetros de precipitação proteica para extração

de metformina de amostras de plasma .......................................... 29

3.7.1. Avaliação do tipo de agente precipitante na extração de metformina de amostras

de plasma 29

3.7.2. Avaliação do tipo de agente precipitante na extração de metformina de amostras

de plasma 30

3.8. Otimização da extração líquido-líquido para extração de bixina de

amostras de plasma ........................................................................ 31

3.8.1. Avaliação do tipo de solvente extrator na extração de bixina de amostras de

plasma 31

3.8.2. Avaliação do efeito da diluição da amostra de plasma na extração de bixina ...... 32

3.8.3. Avaliação do tempo de agitação entre a amostra de plasma e o solvente extrator na

extração de bixina .............................................................................................. 32

3.8.4. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma na extração de bixina ............. 33

3.9. Otimização da extração em fase sólida para extração de bixina de


3.9.1. Avaliação do tipo de sorvente na extração de bixina de amostras de plasma ....... 35

3.9.2. Avaliação da massa de sorvente na extração de bixina ....................................... 36

3.9.3. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma e na etapa de limpeza sobre a


3.9.4. Avaliação do solvente de eluição na extração de bixina ...................................... 38

3.10. Determinação dos parâmetros de validação do método ............... 40

3.10.1. Condições cromatográficas para determinação de bixina.................................. 40

3.10.2. Condições cromatográficas para determinação de metfomina........................... 41

3.10.3. Seletividade ..................................................................................................... 41

3.10.4. Lineariadade e faixa linear de trabalho ............................................................. 42

3.10.5. Exatidão ....................................................................................................... 42

3.10.6. Precisão ....................................................................................................... 42

3.10.7. Limite de quantificação ................................................................................... 43

4. Resultados e discussão ..................................................................... 44

x

4.1. Otimização das condições cromatográficas, arranjo de diodo e

espectrometria de massas ............................................................... 44

4.2. Avaliação das colunas cromatográfica ............................................ 47

4.3. Avaliação dos parâmetros para extração de metformina por

precipitação proteica ...................................................................... 48

4.3.1. Avaliação do tipo de agente precipitante na extração de metformina .................. 48

4.3.2. Otimização da concentração do ácido tricloroacético na extração de metformina 50

4.4. Otimização da extração líquido-líquido para extração de bixina nas


4.4.1. Avaliação do tipo de solvente extrator na extração de bixina .............................. 51

4.4.2. Avaliação do efeito da diluição da amostra de plasma na extração da bixina ...... 52

4.4.3. Avaliação do tempo de agitação entre a amostra de plasma e o solvente extrator na

extração da bixina .............................................................................................. 53

4.4.4. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma na extração da bixina ............. 54

4.4.5. Extração líquido-líquido sequencial na determinação de bixina .......................... 55



4.5.1. Avaliação do tipo de sorvente na extração de bixina de amostras de plasma ....... 56

4.5.2. Avaliação da massa de sorvente na extração de bixina de amostras de plasma .... 57

4.5.3. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma e na etapa de limpeza sobre a


4.5.4. Avaliação do solvente de eluição na extração de bixina ...................................... 59

4.1. Determinação das figuras de mérito de validação do método ....... 60

5. Conclusões ........................................................................................ 64

6. Referências ....................................................................................... 65

7. Anexo I .............................................................................................. 75

1

1. Introdução

1.1. Bixina

A bixina (metil hidrogênio 9’-cis-6,6’-diapocaroteno- 6,6’-dioato, C25H30O4,

massa molar 394,5 g mol-1

, Figura 1) é um composto presente na casca da semente do

urucum proveniente do fruto do urucuzeiro (Bixa orellana L). A árvore do urucum é

normalmente encontrada em regiões tropicais como o centro e sul da América, Ásia e

África [3]. Dos corantes naturais utilizados em alimentos, a bixina derivada da semente

do urucum corresponde a 50% dos corantes naturais utilizados no setor alimentício [4].

Esse corante (E160b) é bastante utilizado para colorir diversos alimentos, tais como

óleo, sorvete, manteiga, queijos, pães, embutidos e cereais [5].

CH3

O

CH3

CH3

CH3 CH3

O

OH

O

Figura 1: Estrutura química da molécula de bixina.

O pigmento extraído da semente do urucum é constituído por vários

carotenoides, em que a bixina é o componente majoritário sendo ele um apocarotenoide

predominantemente de estrutura na forma cis [3]. Os primeiros relatos do isolamento da

bixina datam de 1875, apesar da sua estrutura ter sido elucidada somente em 1961 com

auxilio da espectroscopia de ressonância magnética nuclear [6, 7]. A bixina possui em

uma extremidade da sua estrutura uma carboxila e uma metil carboxila (ester) na outra

extremidade. Entre as cabonilas há nove duplas ligações conjugadas e quatro metilas

ligadas a sua cadeia principal. Essa estrutura confere à bixina alta lipossolubilidade,

sendo amplamente solúvel em diversos solventes orgânicos. A cis-bixina é solúvel em

diversos solventes orgânicos, porém não é solúvel em óleo vegetal. Quando aquecido,

ocorre a isomerização para a trans-bixina que é mais estável e solúvel em óleo vegetal

[3]. Apesar de pouco conhecido, a biossíntese da bixina começa de um carotenoide

2

bastante conhecido, o licopeno. O licopeno sofre varias reações enzimáticas oxidativas,

transformando-se em um apocarotenoide (Figura 2)[1, 2, 8].

1.1.1. Propriedades físico-químicas

A bixina possui um hidrogênio ionizável com pka obtido por cálculos teóricos

de 4,79 [9]. Seu ponto de fusão é 198 ºC e o sistema de duplas ligações conjugadas faz

Licopeno

Dioxigenase

Dioxigenase

Aldeido oxidase/desidrogenase

Aldeido oxidase/desidrogenasse

Carboxilmetil transferase

Norbixina

Bixina

Figura 2:Proposta da biossíntese de bixina a partir do licopeno por transformações enzimáticas

[1, 2].

3

com que essa molécula possua absorção apreciável na região do visível do espectro

eletromagnético sendo o máximo de absorbância em clorofórmio observado em 503,

469 e 439 nm. Este composto é fracamente solúvel em água, porém plenamente solúvel

em acetona, clorofórmio e soluções aquosas básicas [10].

1.1.2. Propriedades farmacológicas da bixina

A bixina é um composto natural capaz de combater diversas enfermidades. Silva

e colaboradores[11] verificaram a eficácia da bixina em reduzir o número de aberrações

cromossômicas e inibir o aumento da peroxidação lipídica. Em um estudo em que foram

avaliados corantes alimentícios naturais frente à proliferação celular, foi constatado que

a bixina foi hábil na inibição de células tumorais humanas de câncer de colón, sistema

nervoso central, estomago e células pulmonares. Observou-se também que a bixina

possui ação anti-inflamatória [12]. Tibodeau e colaboradores[13] investigaram a ação da

bixina sobre células de mieloma múltiplo e averiguou-se que a cis-bixina foi eficiente

na atividade anti-mieloma. Em outros estudos Rohers e colaboradores observaram em

2014 que os níveis de glicose em sangue de rato diminuem na presença de bixina tanto

quanto a metformina que é um fármaco de referência e amplamente conhecido com

agente antihiperglicêmico[14]. Em 2015 Somacal e colaboradores verificaram que a

bixina possui a capacidade de combater lesões ateroscleróticas em ratos com dieta

hipercolesterômicas, provavelmente devido a sua capacidade antioxidante e anti-

inflamatória[15]. Também foi averiguado que a bixina foi capaz de reduzir a gordura

visceral e massa corporal [16]. Em um estudo realizado por Anantharaman e

colaboradores em 2016 foi verificado que a bixina possui capacidade inibitória da

atividade da tirosinase em células de melanoma[17]. Recentemente, Pinzón-García e

colaboradores desenvolveram e patentearam uma nanofibra de bixina suportada em um

polímero biodegradável que demonstrou ser um material promissor quando empregado

como curativos, uma vez que a nanofibra foi capaz de acelerar a cicatrização de feridas

de ratos diabéticos [18]. Em 2010 pesquisadores da Universidade Federal de Viçosa

patentearam uma pomada, a base de extrato do urucum, de uso tópico e oral para o

auxilio na cicatrização da epiderme e das mucosas[19].

4

1.2. Metformina

A metformina (1,1-dimetilbiguanida, C4H11N5, MM 129,1 g mol-1

, Figura 3) é

um fármaco da classe das biguanidas que possuem cinco nitrogênios intercalados com

carbonos em uma cadeia curta. A guanidina, precursor das biguanidas, é o composto

ativo presente na Galega officinalis [20]. A metformina assim como as outras

guanidinas são compostos utilizados como agentes no combate da diabetes mellitus tipo

2.

CH3

N

CH3

NH

NH

NH

NH2

Figura 3: Estrutura química da metformina.

1.2.1. Propriedades físico-químicas

A metformina é um composto básico com pKa = 12,4 [21], fazendo com que sua

permeabilidade na célula seja limitada dado seu elevado grau de ionização,

lipofobicidade e sua carga positiva. O cloridrado de metformina é um pó branco,

cristalino, sem cheiro característico, com características amargas, higroscópico e ponto

de ebulição entre 222-226 ºC. Possui alta solubilidade em água, baixa em etanol e

praticamente insolúvel em solvente orgânico como acetona, éter etílico e

clorofórmio[22]. Este composto não possui cromóforos importantes na estrutura da

molécula sendo 233 nm o comprimento de onda de máxima absorção da metformina.

1.2.2. Propriedades farmacológicas da metformina

Apesar de ser bastante utilizado como agente no combate à diabetes é conhecido

o uso da metformina em outras enfermidades como, por exemplo, a síndrome

metabólica, síndrome do ovário policístico, hirsurtismo além de ser empregada como

regulador do ciclo menstrual [22].

5

Esse composto é considerado um agente antihiperglicêmico por reduzir os níveis

de glicose no sangue. Alguns estudos demonstram que a metformina atua na diminuição

da produção de glicose hepática, seja ela pela inibição da glicogênese hepática por

modificação da atividade enzimática ou por diminuição da captação hepática de

substratos glicogênicos [21].

O cloridrato de metformina é a principal forma como o medicamento é

consumido e nessa apresentação ela possui uma absorção lenta e incompleta pela parte

superior do intestino delgado, sendo a biodisponibilidade do comprimido de 50-60%. O

tempo de meia vida é de aproximadamente de 6 horas com pico máximo de

concentração de 1-3 horas. Seu efeito pode durar até duas semanas sendo sua

eliminação realizada majoritariamente por via renal. A interação proteína-metformina é

insignificante, fazendo com que o fármaco esteja na forma livre quando presente na

circulação sanguínea [22].

1.3. Sistemas de liberação controlada

Os sistemas de dosagem de medicamentos convencionais são sistemas que

liberam medicamentos em uma dose única ou múltiplas doses sequenciais. Uma grande

limitação desses sistemas é a baixa capacidade em manter as concentrações plasmáticas

do medicamento dentro da faixa compreendida entre o limiar tóxico e o limiar

subterapêutico. Devido ao risco de intoxicações em doses únicas ou ao inconveniente

em se utilizar múltiplas doses de medicamentos, para manter a concentração plasmática

em níveis adequados, sistema de liberação prolongada são preferidos ou mesmo

necessários, com a intenção de reduzir as intoxicações e diminuir o número de doses.

Com o uso de sistema de liberação controlada há, frequentemente, um menor acúmulo

de medicamento no organismo visto que à medida que o fármaco é liberado ele é

consumido, diminuindo tanto o acúmulo como a excreção de medicamento inalterado e

não utilizado. A diminuição do metabolismo e excreção do princípio ativo pelos órgãos

metabolizadores e excretores também constitui uma das vantagens dos sistemas de

liberação, uma vez que o fármaco não está totalmente em sua forma livre. Para os

sistemas de liberação controlada utilizam-se de preferência polímeros biocompatíveis,

não cancerígenos, não alergênicos e quimicamente inertes [23, 24].

6

Um dos principais sistemas de liberação de fármacos são as nanopartículas

poliméricas. As nanopartículas poliméricas são sistemas em que o principio ativo fica

retido no núcleo da nanoesfera revestida por um polímero ou pode ser incorporada a

matriz polimérica. O fármaco pode ser liberado por meio da difusão, em que ele penetra

na camada polimérica formando uma gradiente de concentração ou pelo rompimento

dessa camada [24]. Os sistemas de liberação baseados em bicamadas lipídicas são os

lipossomas que são vesículas capazes de encapsular fármacos hidrofílicos e

hidrofóbicos devido as suas camadas lipofílica e hidrofílica [25, 26]. Os dendrímeros

são sistemas baseados em estrutura polimérica nanométricas com múltiplas

ramificações [27, 28].

Os sistemas de liberação controlada podem ser utilizados em tratamento de

doenças como câncer [29-33], Parkinson [34], asma [35] e herpes genital [36, 37]. O

sistema criado por Pinzón-García e colaboradores consitiu de uma nanofibra de

policaprolactona incorporada com bixina que foi desenvolvida para aplicação em feridas

de ratos diabéticos [18].

1.4. Técnicas de preparo de amostra para extração de fármacos em

fluídos biológicos

A etapa de preparo de amostra é uma das etapas envolvidas no procedimento

analítico. Essa etapa é de extrema importância porque visa isolar o analito da matriz,

realizar uma limpeza de interferentes e, quando possível, pré-concentrar o composto de

interesse. Devido à importância da analise química, o tempo gasto na etapa de preparo

de amostra em um procedimento analito torna-se cada vez maior [38]. Hoje em dia,

diversas técnicas de preparo de amostras podem ser empregadas em preparo de amostra,

que vão desde as técnicas mais comuns como as tradicionais, extração líquido-líquido

(ELL), extração em fase sólida (SPE) e precipitação proteica (PP). Outras técnicas mais

recentemente desenvolvidas também são amplamente empregadas incluindo a dispersão

da matriz em fase sólida (MSPD), microextração em fase sólida (SPME), microextração

sortiva em barra de agitação (SBSE), microextração em gota única (SDME),

microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), preparo de amostra empregando

meios de acesso restritos, polímeros de impressão molecular, entre outras. Devido à

necessidade de analises cada vez mais rápida e grandes volumes de amostras, técnicas

de preparo de amostra automatizadas vêm sendo desenvolvidas. Com a automação dos

7

processos é possível eliminar o erro proveniente do analista. As técnicas miniaturizadas

recentemente aprimoradas são de especial importância uma vez que, em alguns casos o

volume de amostra é pequeno, como algumas amostras biológicas, impossibilitando o

uso de grandes volumes. A diminuição do volume de solvente empregado nas técnicas

de preparo de amostra também tem sua relevância em virtude da preocupação com o

meio ambiente, visto que a maioria dos solventes orgânicos empregados são prejudiciais

ao meio ambiente.

O plasma assim como outras matrizes biológicas apesar de, em sua maioria

serem compostas por água, possui em sua composição diversos outros componentes

como lipídeos diversos, sais minerais, açúcares, proteínas entre outros. A presença

desses componentes nas soluções a serem injetadas nos sistemas cromatográficos pode

prejudicar o resultado analítico ou mesmo comprometer o equipamento entupindo

colunas e danificando os tanto a parte fluídica quanto os sistemas de detecção.

1.4.1. Precipitação protéica

A precipitação proteica é uma técnica de preparo de amostra bastante utilizada

visto que é uma técnica simples, rápida, de fácil manipulação e de baixo custo [39].

Essa técnica se baseia na desnaturação das proteínas pelos agentes precipitantes que

alteram suas estruturas secundárias e terciárias devido à quebra de interação

intramoleculares fazendo com que a proteína exponha grupos hidrofóbicos e

consequentemente se enovele e precipite[39-43]. As etapas envolvidas na precipitação

são: adição de solvente, agitação, centrifugação e remoção do sobrenadante (Figura 4).

Proteínas são biomoléculas formadas por uma sequência de aminoácidos,

ligados por ligações peptídicas. As proteínas determinadas por três ou quatros

estruturas: a estrutura primária é formada por ligações covalentes conhecidas por

ligação peptídicas em que os aminoácidos são ligados uns aos outros pelo grupo amino

e carboxílico formando a cadeia polipeptídica; a estrutura secundária é a conformação

espacial formada por ligações estáveis em que ligações de hidrogênio ocorrem entre o

grupo NH e C=O; a estrutura terciária é a estrutura tridimensional que a proteína

adquire devido algumas ligações com enxofre (ponte dissulfeto) ou ligação com metais;

a estrutura quaternária acontece quando a proteína possui mais de uma cadeia

polipeptídica no qual os peptídeos possuem uma organização definida [44].

8

Diversos fatores podem promover a precipitação de proteínas, dentre eles a

mudança de pH do meio em que a proteína se encontra, o aumento da temperatura,

adição de solvente orgânico miscível com a amostra, presença de sal e de íons

metálicos.

A mudança de pH do meio (e.g. adição de ácido tricloroacético, ácido perclórico

ou ácido túngstico) atua na mudança de carga e da conformação da proteína, fazendo

com que a repulsão eletrostática rompa as ligações de hidrogênio danificando as

estruturas secundárias da proteína. Por um mecanismo semelhante o aumento da

temperatura pode danificar as interações fracas da proteína, causando o rompimento de

ligações de hidrogênio. Alguns solventes orgânicos miscíveis em água como

acetonitrila, metanol, etanol e acetona também são empregados como agentes

precipitantes. Esses solventes diminuem a constante dielétrica do meio causando o

aumento das interações entre as proteínas devido ao deslocamento das moléculas de

água da solução [39, 40, 44].

Já a adição de alguns sais pode reduzir a disponibilidade de água no meio

provocando maior interação e aglomeração das proteínas e consequentemente a sua

precipitação. Alguns íons metálicos (zinco, cobre, chumbo, mercúrio) possuem a

capacidade de complexar com algumas proteínas formando sais insolúveis [40, 44].

1)Amostra com todos os

componentes

2)Adição do

agente precipitante e

agitação

3) Centrifugação

A= analito de interesse

P = proteína

O = outros

componentes da

matriz

4) Remoção do

sobrenadante

Figura 4: Esquema das diferentes etapas envolvidas nos preparo de amostras por precipitação

proteica.

9

A precipitação proteica já foi utilizada na determinação de diversos fármacos em

plasma como ibersatana [45], epinefrina e norepinefrina[46] staglipitina [47],

cobimetinibe [48], triptorrelina [49], granisetrona [50].

Algumas vezes a precipitação proteica antecede ou sucede uma segunda técnica

de preparo de amostras aumentando assim a capacidade de eliminação de interferentes

do método. Em um trabalho de Li e colaboradores publicado em 2012 a técnica de

precipitação de proteínas foi empregada em um dispositivo de multipoços previamente

à extração em fase sólida na extração de cefnidir em plasma de cachorro da raça Beagle.

A finalidade desse método foi a sua aplicação para estudos farmacocinéticos in vivo do

cefdinir encapsulado [51].

1.4.2. Extração líquido-líquido

A extração líquido-líquido (ELL) é uma das técnicas de preparo de amostras

mais utilizadas para análise de fármacos em fluídos biológicos [40]. Essa técnica se

baseia na partição de um analito (A) entre duas fases imiscíveis.

𝐴(𝑎𝑞) ⇄ 𝐴(𝑜𝑟𝑔)

Nessa técnica, em geral, uma das fases possui caráter aquoso (amostra de fluído

biológico) e a outra fase caráter orgânico e imiscível (solvente orgânico). Os compostos

que estão na fase aquosa quando em contato com a fase orgânica irão se distribuir, entre

as fases, segundo seus coeficientes de partição e, após a agitação, migrar para a fase

extratora (Figura 5). Para que ocorra a extração é importante que a fase orgânica seja

imiscível na amostra e ainda solubilize bem os analitos de interesse, tornando assim a

fase orgânica um melhor aceptor [39, 40].

A extração ocorre quando os dois líquidos são postos em contato em um

recipiente seguido de agitação para acelerar o processo de transferência de massas.

Devido à possível formação de emulsão, pode-se empregar, após a agitação, a

centrifugação, adição de sal ou ainda o resfriamento para auxiliar a separação de fases.

10

É possível associar a partição do composto entre as duas fases imiscíveis com a

constante de distribuição de Nerst Kd (Equação 01), onde são correlacionadas a

concentração do composto particionado na fase orgânica (Corg) e sua concentração na

fase aquosa (Caq) em equilíbrio termodinâmico.

𝐾𝑑 = 𝐶𝑜𝑟𝑔

𝐶𝑎𝑞 Equação 01

Já a fração extraída da quantidade total de matéria presente na amostra também

chamada de eficiência (E) dependerá dos volumes e concentrações das respectivas fases

(volume das fases orgânica (Vorg) e aquosa (Vaq)) como descrito na Equação 02.

𝐸 = 𝐶𝑜𝑟𝑔 .𝑉𝑜𝑟𝑔

𝐶𝑜𝑟𝑔.𝑉𝑜𝑟𝑔+𝐶𝑎𝑞.𝑉𝑎𝑞 Equação 02

Rearranjando a Equação 01 e 02 podemos observar que a fração extraída

dependente da relação dos volumes das fases imiscíveis e da constante de distribuição

(Equação 03).

𝐸 = 𝐾𝑑 .

𝑉𝑜𝑟𝑔

𝑉𝑎𝑞

1+𝐾𝑑 .𝑉𝑜𝑟𝑔

𝑉𝑎𝑞

Equação 03

Para obter eficiência de extração apreciável de composto com baixa constante de

distribuição é aconselhável empregar volumes de solvente extrator mais elevados o que

1) Amostra 2) Adição da fase

extratora e agitação

seguida de

centrifugação

3) Separação da

fase extratora

A = analito de

interesse

O = outros

componentes

da amostra

Figura 5: Esquema das diferentes etapas envolvidas em uma extração líquido-líquido.

11

torna o procedimento inviável além de ambientalmente pouco amigável. Outra

estratégia nesse caso é realizar mais de uma extração (extração sequencial) para uma

mesma amostra a fim de aumentar a fração extraída. Empregando a Equação 04 é

possível prever a porcentagem de extração obtida (E) com “n” extrações sequenciais ou

ainda calcular o número de extrações sequenciais (n) necessárias para se obter uma

fração extraída desejada:

𝐸 = 1 − [1

1+𝐾𝑑 .𝑉𝑜𝑟𝑔

𝑉𝑎𝑞

]

𝑛

Equação 04

Em que n é o número de extrações realizadas[39, 40].

Outro fator importante e que deve ser observado na extração líquido-líquido é o

pH da fase aquosa especialmente quando pretende-se extrair eletrólitos fracos.

Frequentemente analitos na forma não ionizada apresentam maior solubilidade na fase

orgânica. Quando o composto apresenta caráter básico, haverá uma maior eficiência de

extração quando a fase aquosa estiver em pH preferencialmente duas unidades acima do

pKa do analito mais básico. Por outro lado quando o composto possuir caráter ácido, a

extração será maior quando a fase aquosa apresentar pH duas unidades abaixo do pKa.

Para extrair compostos ionizáveis altamente hidrofílicos pode se utiliza agentes

complexantes ou formadores de par iônico como estratégia para aumentar a fração de

extração [52]. O agente de par iônico, representado por um contra-íon com uma porção

lipossolúvel se associa ao analito de interesse neutralizando a carga do analito e

elevando a sua afinidade pela fase orgânica.

A adição de sal à amostra (salting out) também é uma estratégia amplamente

empregada em ELL para auxiliar no aumento da constante de distribuição [53, 54].

Quando se adiciona sal na fase aquosa, as moléculas de água, em geral, apresentam uma

tendência maior em solvatar os cátions e ânions do sal do que do próprio analito, o que

reduz sua solubilidade na amostra e aumenta assim sua afinidade e distribuição para a

fase orgânica [39, 55].

A extração líquido-líquido já foi utilizada para extração de diversos compostos

em diversas matrizes como, por exemplo, na extração de clindamicina [56], bixina,

12

norbixina[57] e odanacatib [58] em plasma. Um sistema de 96 reservatórios foi

utilizado para extração de suvorexanto de plasma humano[59].

Recentemente houve um grande avanço em relação às técnicas de preparo de

amostras em especial em relação à miniaturização de técnicas clássicas como a extração

líquido-líquido.

Em 1995 foi desenvolvido o precursor da microextração em gota única

(SDME)[60] em que uma gota suspensa foi utilizada mantida em contato com uma fase

gasosa para analise de gás atmosférico. No ano seguinte foi publicado o primeiro

trabalho demonstrando o potencial da SDME. Neste trabalho uma gota de octano foi

suspensa por uma agulha em uma solução aquosa sobre agitação para manter a

transferência de analito da fase aquosa para a fase orgânica [61]. Essa é uma técnica

com alta capacidade de concentração visto que o volume final da amostra é de apenas

alguns microlitros (1-3 µL) [62]. Diversos são os fatores que influenciam a SDME entre

eles: a constante de distribuição do analito entre as fases; tipo de seringa utilizado;

volume da gota; volume de amostra; velocidade de agitação; tempo de extração;

temperatura, entre outros [63]. A variação do volume da gota pode afetar a precisão do

método desenvolvido e a estabilidade da gota, sendo a instabilidade da gota devido à

agitação da amostra a principal desvantagem desta técnica. A SDME já foi utilizada na

extração de alcaloides [64] e anti-histamínicos [65] em urina e outros fármacos em

plasma [66, 67].

Outra técnica de extração líquido-líquido desenvolvida nos últimos anos foi a

microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME). Em 2006, a técnica foi

desenvolvida baseada na dispersibilidade de solvente empregando um sistema ternário

de solventes [68]. A técnica consiste na injeção rápida de uma mistura de um solvente

dispersor juntamente com um solvente extrator dentro da amostra contendo os analitos.

O solvente dispersor deve ser solúvel na fase aquosa e fase orgânica. Após a injeção

rápida a mistura solvente dispersor-solvente extrator se dispersa em diminutas gotículas

na fase aquosa, promovendo assim maior área de contato do solvente extrator com os

analitos. A etapa de centrifugação é necessária para separação da fase aquosa com o

solvente dispersor da fase orgânica. A impossibilidade de automação devido à etapa de

centrifugação é a principal desvantagem da DLLME. Aos principais fatores que

influenciam esta técnica são os tipos de solventes utilizados e o volume do solvente

13

extrator e dispersor[40] sendo esta técnica rápida, de baixo custo e de alto poder de

enriquecimento[69]. A DLLME foi utilizada para análise de drogas de abuso em plasma

[70], na determinação de antipirina em saliva [71] além da determinação de alcaloide

em plasma humano[72].

A microextração em fase líquida com fibra oca (HF-LPME) é uma alternativa a

microextração em gota única. A HF-LPME é uma técnica que foi desenvolvida em 1999

em que se utiliza uma membrana porosa embebida em um solvente que separa a fase

doadora (amostra) da fase receptora. A fase receptora fica retida dentro da fibra e

mantém contato com a fase aquosa por meio de uma fina camada líquida suportada

dentro dos poros da fibra. A vantagem da fibra oca sobre a SDME é que a extração em

fibra oca não corre o risco da dispersão da gota devido agitação da fase aquosa e

também a possibilidade de haver material particulado na amostra [73, 74], entretanto

devido ao pequeno volume de fase extratora utilizada, a precisão pode ser prejudicada.

Essa técnica já foi utilizada para determinação de muscimol em urina humana [75] e

para análise de aminas aromáticas policíclicas em sangue humano [76].

1.4.3. Extração em fase sólida

A extração em fase sólida (SPE) é a segunda técnica de preparo de amostra mais

difundida para a extração e purificação de fármacos em fluídos biológicos [40]. As

principais finalidades dessa técnica são a remoção de interferentes, pré concentração dos

analitos, dessalinização de amostras, derivatização in situ, estocagem e transporte de

amostras além da mudança de fase. Essa técnica possui diversas vantagens, dentre elas:

alta capacidade de recuperação, altas taxas de pré-concentração devido ao fato do

volume final poder ser menor que o volume inicial da amostra, facilidade de recolher a

fração desejada, capacidade de eliminar materiais particulados uma vez que o sorvente

age como um filtro, menor consumo de solvente orgânico quando comparado a ELL,

facilidade de manusear os cartuchos, disponibilidade de aparelhos automatizados e a

não formação de emulsões [40, 77].

Os princípios e mecanismos envolvidos na SPE podem ser classificados como:

partição, adsorção, troca iônica e exclusão. Neste caso, a fase estacionária muitas vezes

é um líquido suportado quimicamente em um sólido, representado geralmente pela

sílica gel ou sílica quimicamente modificada. O analito ao passar pela extração se

distribui entre a fase móvel líquida e a fase estacionária. Quando a fase estacionária é

14

um líquido trata-se da partição já a adsorção ocorre quando a fase estacionária é um

sólido. A troca iônica por outro lado se baseia na retenção por interação eletrostática. O

material sorvente possui um grupo ionizável ou iônico, carregado positivamente ou

negativamente. Para ocorrer a retenção o sorvente possui uma carga oposta a carga do

composto de interesse, ocorrendo assim a retenção do analito. O princípio da exclusão

se fundamenta na separação por tamanho de partícula. O sorvente é formado por um

material com poros que retém compostos de tamanhos menores devida a maior

facilidade de penetração desses compostos. Os compostos maiores, por outro lado,

possuem maior dificuldade de penetração nos poros e por isso passam com maior

facilidade pelo sorvente. Outros sorventes também são utilizados na extração em fase

sólida como: sorventes magnéticos, polímeros de impressão molecular, nanotubos de

carbono[40, 77, 78].

A técnica de SPE é realizada mais amplamente empregando cartuchos do tipo

seringa (Figura 6) em que o material sorvente é contido entre dois filtros de porosidade

de 20 µm. O volume dos cartuchos mais comuns varia de 0,5 a 10 mL, com uma massa

que pode variar de 35 mg a 2 g.

Basicamente a SPE é realizada em quatro etapas principais. A primeira é a etapa

de condicionamento do sorvente. Nessa fase, o material sorvente é preparado para

receber a amostra. Na segunda etapa a amostra é aplicada na fase estacionária para que

os compostos de interesse sejam sorvidos. A terceira etapa é a remoção de interferentes

(limpeza ou lavagem) onde se busca a eliminação seletiva dos interferentes que não são

interessantes para a análise. A última etapa é a etapa de eluição em que o analito é

eluido em um volume adequado de solvente a fim de ter uma pré-concentração.

O material sorvente mais empregado na SPE ainda são aqueles baseados em

sílica e sílica modificada com grupos C18, porém existem outros para aplicações mais

específicas. A escolha depende das características do analito e também dos interferentes

presentes na matriz. Na tabela 1 podemos verificar os diversos tipos de sorventes e os

respectivos mecanismos sortivos.

15

Tabela 1: Sorvente utilizados em extração em fase sólida.

Fase normal

(adsorção)

Sílica (SiOH)

Alumina (Al2O3)

Florisil (Mg2SiO3)

Fase normal

(fase quimicamente ligada à

sílica)

Ciano (CN)

Amino (NH2)

Diol (-CH(OH)-CH(OH)-)

Fase reversa

(absorção, alta

hidrofobicidade)

Octadecil (C18)

Octil (C8)

Fase reversa

(hidrofobicidade

intermediaria)

Phenyl

Ciclohexil

Diphenyl

Fase reversa

(baixa hidrofobicidade)

Butil (C4)

Etil (C2)

Metil (C1)

Troca iônica Amina secundária ligada à sílica

Amina quaternária ligada à sílica

Ácido sulfônico ligado à sílica

Ácido carboxílico ligado à sílica

1) Condicionamento

2) Aplicação

da amostra

3) Lavagem

4) Eluição

A = analito de interesse

O = outros componentes da

amostra

Figura 6: Esquema da extração em fase sólida. 1) etapa de condicionamento em que um solvente

é percolado pelo cartucho. 2) etapa de aplicação da amostra. 3) etapa de lavagem ou limpeza em que os interferentes são eliminados do sorvente. 4) etapa de eluição em que os analitos de

interesse são removidos do cartucho.

16

Uma das variantes dos dispositivos de SPE são as placas com 96 reservatórios

ou poços. Cada reservatório funciona como um cartucho de extração em fase sólida

onde o sorvente encontra-se imobilizado entre dois filtros. Os sistemas 96 poços são

especialmente interessantes quando uma frequência analítica maior é requerida. A SPE

possui também uma ampla gama de sistemas automatizados nos quais as etapas de

extração, limpeza (clean up), eluição e analise cromatográfica são realizados

automaticamente pelo equipamento. Apesar do custo inicial elevado, esses sistemas

apresentam vantagens como redução do tempo de análise e diminuição dos erros

provenientes de manipulação [40, 77].

Devido suas vantagens a SPE já foi utilizada em diversos trabalhos como na

extração de fluoroquinolonas em ovos com aplicação de campo elétrico [79]. Rossmann

e colaboradore desenvolveram em 2014 um método para análise de muitos antibióticos

em águas residuais [80]. Diversos trabalhos foram descritos empregando a SPE para

extração de medicamentos em fluídos biológico como a doxiciclina em gordura de

galinha [81], a etoricoxibe em plasma humano empregando um sistema de SPE online

[82], o alendronato por SPE magnética [83] e drogas ilícitas por microSPE em plasma e

urina humana [84].

Com o avanço do desenvolvimento das técnicas de preparo de amostra, outras

variações da técnica de SPE foram surgindo ao longo dos anos.

Uma das variações foi a dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) que é uma

modificação mais recente da extração em fase sólida. A dispersão da matriz em fase

sólida consiste na homogeneização mecânica da amostra com um suporte sólido que

pode ser um sorvente de SPE. Durante a homogeneização, os analitos serão adsorvidos

no suporte para posterior eluição. Após a mistura, o conjunto formado é colocado em

um tubo semelhante aos utilizados na extração em fase sólida convencional. O material

contendo a amostra e a matriz ficam acondicionados entre dois filtros e em seguida é

realizada a eluição seletiva dos analitos com um solvente adequado. Diversos fatores

devem ser levados em conta na dispersão da matriz em fase sólida como: suporte sólido

dispersante; proporção amostra/suporte; tempo de mistura; solvente de eluição [85]. A

MSPD já foi utilizada para analise de resíduos de pesticidas em alimentos e amostras

ambientais [86] além de antitireoidianos em amostras de leite e urina [87].

17

Outra técnica bastante empregada na extração e purificação de analitos em

fluídos biológicos é a microextração em fase sólida (SPME). A SPME é uma técnica

miniaturizada em que a extração ocorre em uma fibra fina (espessura 0,11-0,16 mm) de

cerca de 1 cm recoberta por filme polimérico extrator (espessura 0,1 mm)[40]. Devido

ao tamanho da fibra, essa técnica permite que a injeção dos analito ocorra diretamente

em um cromatógrafo gasoso após o aquecimento da fibra contendo os analitos

sorvidos/absorvidos [88]. A extração acontece quando a fibra é exposta diretamente na

amostra sobre agitação ou quando a fibra fica em contato com o vapor da amostra em

um recipiente fechado. Neste último caso a extração é chamada de espaço confinado

(headspace). Na extração por headspace os analitos devem ser voláteis para que eles

sejam transferidos (evaporem) da amostra e entrem em contato com a fibra exposta.

Dentre os fatores que influenciam a microextração em fase sólida podemos citar: o tipo

de fibra, temperatura de extração, tempo de extração, pH, velocidade de agitação, força

iônica e tempo de dessorção. Exemplos da aplicação da SPME em fluídos biológicos é a

extração de clorexidina em saliva [89] e drogas recreativas em suor [90].

1.5. Técnicas de preparo de amostra empregadas para a determinação de

bixina, metformina e compostos correlatos

Dentre os diversos métodos de preparo de amostra mencionados, vários deles já

foram empregados na determinação bixina,metformina e compostos correlatos em

fluídos biológicos.

Levy e colaboradores descreveram em 1997 um método empregando a extração

líquido-líquido para avaliar a extração de bixina em plasma humano. Neste trabalho foi

utilizado um volume de amostra, 3 mL, com extrações múltiplas (3x). Como solvente

extrator foi empregado uma mistura composta por etanol:clorofórmio (6:3, 9 mL). Com

esta estratégia os pesquisadores conseguiram quantificar a bixina até a concentração de

2,8 ng bixina por mL de amostra de plasma devido a pré concentração obtida (3x).

Contudo, neste trabalho não foram apresentados dados de validação para o método

proposto [57].

A ELL também foi utilizada para avaliação de carotenoides como a luteína,

licopeno e 𝛽-carotene em amostras plasma. Outra técnica baseada na ELL, a extração

por solvente acelerado, também foi utilizada para determinação de carotenoides,

18

incluindo a bixina, em amostras de alimentos e elevados valores de recuperação foram

obtidos [91].

Diversos métodos de extração foram relatados em métodos para determinação de

metformina em fluídos biológicos sendo a precipitação proteica empregando acetonitrila

a mais abundantemente utilizada [92-101]. Para esse mesmo fármaco também já foram

reportados na literatura o uso de ácido tricloroacético [102] e ácido perclórico [103]

como agentes precipitantes. Nestes trabalhos, os agentes precipitantes foram

adicionados ao plasma seguido de agitação, centrifugação, separação do sobrenadante e

finalmente injeção no sistema cromatográfico.

A extração em fase sólida também foi utilizada para a extração de metformina

em amostras biológicas como plasma [104], água residual [105], suplementos dietéticos

e ervas medicinais [106]. A grande dificuldade de extração da metformina nos métodos

descritos é frequentemente associada à baixa afinidade desse medicamento pelos

solventes orgânicos e sorventes apolares baseados em sílica de fase reversa o que pode

ser comprovado pelas baixas recuperações observadas. Em alguns casos o problema da

baixa recuperação da metformina por SPE não foi contornado mesmo utilizando

sorventes híbridos [105]. A extração de fase sólida utilizando laurel sulfato de sódio

como agente de par iônico foi reportado na análise de metformina e sitagliptina em

plasma [107]. Um sorvente de troca catiônica fui empregado na extração de metformina

em plasma [108]. A microextração em fase líquida empregando fibra oca também foi

descrita para extração de metformina e rosiglitazona em amostras de plasma e urina

[109].

Devido à falta de afinidade da metformina com grande parte dos solventes

orgânicos mais comuns, a derivatização com cloreto de p-nitrobenzoil foi empregada

como recurso para auxiliar na extração líquido-líquido, uma vez que a metformina é um

composto altamente polar [110].

1.6. Cromatografia líquida na determinação de fármacos em fluídos

biológicos

A cromatográfia líquida de alto e ultra desempenho associada à diversos

sistemas de detecção é uma técnica amplamente empregada para a determinação de

fármacos em fluídos biológicos, devido a sua elevada capacidade de separar compostos

19

orgânicos, inorgânicos ou biológicos provenientes de diversas matrizes seja na indústria

farmacêutica, de alimentos, petroquímica como em laboratórios forense e de análises

clínicas.

A cromatografia é uma técnica de separação de compostos que se baseia nas

diferentes interações dos analitos entre duas fases, sendo uma fase móvel e uma fase

estacionária. Em 1906 o botânico russo Mikhail Tswett publicou, em uma revista de

botânica, um trabalho em que ele percolou um extrato de planta por uma coluna de

vidro recheada com carbonato de cálcio. Após passar um solvente apolar pela coluna,

Tswett percebeu que os diferentes pigmentos foram separados em bandas de cores

diferentes [111]. Diferentemente de outros trabalhos que antecederam este Tswett

propôs que essa separação ocorreu pelas diferenças de interação dos componentes com a

fase móvel e a fase estacionária.

A cromatografia pode ser classificada por dois tipos a planar e em coluna. Na

cromatografia planar a fase estacionária é suportada em um material plano ou um papel.

A fase móvel é um liquido que se move por ação da capilaridade. Na cromatografia em

coluna a fase estacionaria se encontra empacotada dentro de um tubo. A fase móvel

passa pela fase estacionária por meio da ação da gravidade (cromatografia líquida

clássica), por capilaridade (cromatografia em camada delgada ou papel) ou por ação de

uma pressão externa (cromatografia líquida, gasosa ou por fluido supercrítico).

Podemos também classificar a cromatografia de acordo com a fase móvel em que se

diferem de acordo com o fluido que carreia a amostra, podendo ser a fase móvel um

líquido, um gás ou um fluido supercrítico [112].

Na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) o sistema cromatográfico é

constituído basicamente por um reservatório de fase móvel, o sistema de bomba de alta

pressão, o injetor, uma coluna cromatográfica e um detector com sistema de aquisição

de dados (Figura 7). A eluição pode ocorrer no modo isocrático em que a composição

da fase móvel não altera ao longo da análise ou no modo gradiente em que a

composiçãodo solvente de eluição muda ao longo da corrida cromatográfica.

20

Figura 7: Sistema cromatográfico composto por fase móvel, bomba de alta pressão, injetor,

coluna cromatográfica, detector e sistema de aquisição de dados.

A separação dos compostos de interesse ocorre na coluna que é recheada com a

fase estacionária apropriada. A separação ocorre por diferentes mecanismos, sendo estes

mecanismos basicamente os mesmos dos envolvidos na extração em fase sólida em que

o tipo de interação com a fase estacionária é levado em conta. São eles: partição,

adsorção, troca iônica, bioafinidade, quiral e exclusão[112]. Diversos são os tipos de

fase estacionárias que se pode utilizar em cromatografia sendo as mais comuns as

partículadas totalmente porosas, esféricas e de tamanho regular de até 3,5 m. Já

materiais mais recentemente utilizados são aqueles baseados em monólitos de corpo

continuo, particulados totalmente porosos de diâmetro inferior a 2 m ou ainda

particulado superficialmente porosas e núcleo não poroso [113].

As colunas cromatográficas podem variar de tamanho de acordo com o interesse,

podendo variar de 1-25 cm de comprimento nas colunas analíticas e acima de 20 cm as

preparativas. O diâmetro interno também varia de acordo com a finalidade da separação,

sendo as analíticas entre 1-4,6 mm e as preparativas maiores que 10 mm. Da mesma

forma o tamanho de partícula da fase estacionária pode variar entre 1,5 a 10 µm [112,

114].

Em cromatografia os sistemas de detecção estão conectados em série e após a

coluna cromatográfica. Ao sair da coluna o analito entra no detector e gera um sinal que

é visualizado na forma de um pico cromatográfico O sinal é proporcional à

concentração do analito na amostra. Os detectores podem ser universais, que geram um

sinal para todos os componentes presentes na amostra ou seletivos, que geram sinais

21

somente para compostos que apresentem propriedades específicas. Dentre as

características de um detector, é importante que ele seja: sensível, estável a diversos

tipos de solvente, reprodutível, o sinal de ser proporcional a concentração em uma

ampla faixa linear, não deve ser sensível à variação de temperatura nem de vazão, ser

capaz de obter resposta rápida e ser de fácil manuseio. Muitos são os tipos de detectores

empregados em cromatografia líquida, sendo os principais os de absorvância,

fluorescência, eletroquímicos, índice de refração e espectrometria de massas [112, 115].

Com o advento da tecnologia foi possível o desenvolvimento de sistemas

cromatográficos mais eficientes, que possibilitou a melhor separação e menor tempo de

analise. Esse avanço foi possível devido a diminuição do tamanho de partícula, com

colunas cromatográficas empacotadas com partículas menores que 2 µm e o diâmetro

interno das colunas entre 1-2,1 mm. Devido à diminuição do tamanho das partículas foi

necessário um sistema que suportasse maiores pressões (100 MPa). Foi necessária a

diminuição dos volumes internos, redução da cela de detecção e maior velocidade de

aquisição de dados. Esse sistema moderno foi denominado de cromatografia líquida de

ultra eficiência (UHPLC)[114, 116-118].

Por ser uma técnica extremamente relevante o UHPLC é bastante utilizado na

análise de diversos tipos de compostos presentes em diversas matrizes [45-47, 76, 79,

80, 86, 119-122].

Como método de análise a cromatografia líquida é amplamente empregada como

ferramenta para determinação de metformina e bixina em amostras biológicas. Podemos

observar na Tabela 2 diversos métodos em que diversos tipos de colunas, fases móveis,

técnicas de preparo de amostra foram utilizadas para análise de metformina e bixina.

22

Tabela 2: Comparação das técnicas, colunas, fases móveis e preparo de amostra

utilizadas na analise de metformina e bixina

Autores/Ano Técnica/Coluna Fase móvel Amostra Preparo de

amostra

Attimarad et al,

2015 [97] HPLC/C18 NH4Ac/MeOH Plasma PP

Polagani et al, 2013

[94], Chen et al,

2011 [100]

HPLC/C18 NH4Ac/ACN Plasma PP

Shah et al, 2016

[107] HPLC/CN NH4HCO2/MeOH Plasma SPE

Koseki et al, 2005

[108]

HPLC/Troca

iônica NH4Ac/ACN Plasma SPE

Scherf-Clavel e

Hogger, 2015 [123] HPLC/HILIC

NH4HCO2/ACN/C

H2O2

Mancha de

sangue seco

SPE

modificada

Discenza et al, 2010

[92] UHPLC/HILIC NH4HCO3/MeOH Plasma PP

Sherif et al, 2015

[99] UHPLC/C18 ACN/CH2O2 Plasma PP

Pontorolo et al, 2014

[95] HPLC/HILIC

NH4HCO2/ACN/C

H2O2 Plasma PP

Porta et al, 2008 [93] HPLC/Fenil Tampão

fosfato/ACN Plasma PP

Chhetri et al, 2014

[103] HPLC/C18

ACN/KH2PO4/

lauril sulfato de

sódio

Plasma PP

Yardimci et al, 2007

[98] HPLC/Fenil

Tampão acetato

/ácido acético/ACN Plasma PP

Bem-Hander et al,

2015 [109] HPLC/C18

Tampão

fosfato/ACN

Plasma e

urina HF-LPME

Porwal e Talele,

2016 [102] HPLC/Fenil H3PO4/ACN Plasma PP

Levy et al, 1997 [57] HPLC/C18 ácido acético/ACN Plasma ELL

23

1.7. Espectrometria de massas na determinação de fármacos em fluídos

biológicos

O espectrômetro de massas é um instrumento extremamente versátil e poderoso

na identificação e quantificação de diversos composto orgânicos e inorgânicos

especialmente quando associado à cromatografia líquida de alta e ultra eficiência. Suas

aplicações abrangem todas as áreas da química analítica e os mais diversos ramos do

conhecimento. O princípio fundamental da espectrometria de massas se baseia na

determinação de diferentes espécies químicas ionizadas em função das suas respectivas

relações massa carga (m/z) [115, 124].

O espectrômetro de massas é na verdade um equipamento complexo formado

por componentes com funções distintas. O primeiro componente na sequência por onde

passam os analitos é o chamado sistema de entrada ou infusão da amostra, responsável

pela injeção no espectrômetro a uma vazão controlada. Esse sistema pode ser

representado por uma bomba de seringa ou um cromatógrafo (a líquido ou a gás). Na

entrada do espectrômetro a amostra passa por uma fonte de ionização onde os analitos

são ionizados e íons livres, em fase gasosa, adentram ao espectrômetro. O modulo

seguinte é o analisador de íons que irá separar os íons que adentraram de acordo com

suas relações massa/carga. Os íons separados pelo analisador colidem então com um

detector de íons que faz a contagem desses íons gerando um sinal elétrico que é

convertido em um espectro de massas e/ou em um cromatograma de íons dependendo

do caso (Figura 8).

Figura 8: Sistema do espectrômetro de massas composto por entrada da amostra, fonte de ionização, analisador, detector e sistema de aquisição de dados.

As fontes de ionização são muito importantes no processo uma vez que para que

os diferentes analitos sejam diferenciados eles precisam ser estar ionizados para que

24

campos eletromagnéticos atuem sobre eles. Existem diversos métodos de ionização

dentre eles pode-se destacar o impacto de elétrons (EI), a ionização química (CI),

ionização por eletronebulização (ESI), o bombardeamento rápido de átomos (FAB),

ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI), dessorção por

eletronebulização (DESI), ionização química a pressão atmosférica (APCI) e a

fotoionização a pressão atmosférica (APPI) [115, 124]. Quando a cromatografia gasosa

é acomplada a espectrometria de massas as principais fontes de ionização utilizadas são

a EI e a CI, pois essas fontes encontram-se sob alto vácuo, já para cromatografia líquida

as fontes mais utilizadas são ESI, APCI e APPI.

Os analisadores são os responsáveis pela seleção dos íons de acordo com a m/z

de interesse do analista. Os analisadores mais comuns são o quadrupolo (Q), a

armadilha de íons de Paul (ion-trap), armadilha de íons de Kindon (orbitrap) e tempo

de voo (TOF). O analisador pode ser de alta ou baixa resolução. A resolução do

analisador está associada à capacidade do espectrômetro diferenciar compostos com

massa nominal iguais [115].

Alguns métodos de ionização são capazes não só de ionizar as moléculas de

interesse, mas também são capazes de fragmentar os íons, gerando fragmentos

carregados eletricamente característicos de íons filhos. Essa fragmentação é importante

porque ajuda na elucidação da estrutura química dos compostos. Quando a fonte de

ionização não é energética o suficiente para formar íons é possível utilizar a

espectrometria sequencial em que dois analisadores são colocados em sequência. No

primeiro analisador ocorre a seleção do íon do analito de interesse. Em seguida o íon

selecionado entra em uma cela de colisão onde o íon sofre uma fragmentação induzida

por um gás inerte gerando fragmentos específicos que são transferidos para o segundo

analisador onde ocorre a seleção dos fragmentos gerados na colisão[124].

Diversos métodos empregando a fonte de ionização ESI associada com

analisadores do tipo quadrupolo ou triplo quadrupolo já foram utilizados na

determinação de metformina em plasma de rato [92], plasma humano [95, 97, 99, 101,

107, 108], sangue seco [123]. O ESI associado com analisadores seqüenciais do tipo

quadrupolo-armadilha de íons (Qtrap) também já foi empregado em estudos envolvendo

metformina em plasma humano [100]. Uma fonte de dessorção por laser com fonte de

ionização APCI com analisador do tipo triplo quadrupolo foi utilizado para

25

determinação de metformina em sangue seco de humanos e ratos [125] e em plasma de

rato[126].

26

2. Objetivo Geral

Avaliar diferentes técnicas de preparo de amostras visando desenvolver e validar um

método para determinação de metformina e bixina em plasma de rato empregando a

cromatografia de ultra eficiência associado a detector por absorbância com arranjo de

fotodiodos e espectrometria de massas sequencial.

Os objetivos específicos são:

1. Avaliar diferentes colunas cromatográficas buscando a melhor retenção, tempo

de análise e seletividade para os compostos alvos;

2. Avaliar os parâmetros da técnica de precipitação de proteínas para obter melhor

extração de metformina do plasma;

3. Avaliar os parâmetros de extração em fase sólida para obter a melhor extração

de bixina do plasma;

4. Avaliar os parâmetros de extração líquido-líquido para obter a melhor extração

de bixina do plasma;

5. Validar o método da precipitação protéica e da extração líquido-líquido

desenvolvido;

6. Empregar o método validado em amostras de ratos tratados com sistemas de

liberação controlada contendo bixina e metformina.

27

3. Materiais e Métodos

3.1. Reagentes e soluções

Os padrões analíticos dos fármacos utilizados no trabalho foram bixina (96,6%,

ChromaDex) e metformina (99,8%, Sigma-Alcrich). A água empregada para o preparo

das soluções e fase móvel foi do Tipo I (água deionizada) obtida de um sistema de

deionização Milli-Q (Milipore). Acetonitrila (ACN) e metanol (MeOH), foram ambos

grau HPLC (J.T.Baker); etér dietílico (Vetec; Neon); ácido tricloroacético (ATCA,

Synth); acetona (Sigma-Aldrich); acetato de amônio (NH4Ac, Merck), cloreto de sódio

(NaCl, Synth); ácido fórmico (Merck) grau analítico ou superior. Os sorventes para

extração em fase sólida avaliados foram à base de sílica com fase quimicamente ligada

com grupos octadecil (C18) Strata C18T (55 µm, 140A, Phenomenex); com grupos octil

(C8) Strata C8 (55 µm, 140A, Phenomenex) e HFC8 (Agilent); com grupo fenil –Strata

Phenyl (50 µm, 65A, Phenomenex) e fases poliméricas StrataX (33 µm, Phenomenex) e

Oasis HLB (30 µm, 80A,Waters).

3.2. Equipamentos

As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo líquido de

ultra desempenho UPLC® Aquity H-Class (Waters). O sistema de detecção foi efetuado

por um detector por absorbância com arranjo de fotodiodo (PDA, Waters) e um

espectrômetro de massas Xevo TQD (Waters) do tipo triplo quadrupolo com ionização

por eletronebulização.

Para a agitação das amostras foi utilizado um agitador tipo Vortex Classic (Velp)

e para centrifugação foi utilizado uma centrífuga de tudo de polipropileno 5415D

(Eppendorf). Para dissolução de amostras e degaseficação da fase móvel foi empregado

um aparelho de ultrassonicação (Ney Ultrasonic).

3.3. Amostras

As amostras de plasma de ratos sem a presença de bixina e metformina foram

obtidas do Laboratório de Hipertenção do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

(ICB-UFMG), estocados a -20 ºC e ao abrigo da luz por no máximo 3 meses. Os

28

estudos desenvolvidos nesse trabalho receberam aprovação pelo comitê de ética

responsável que se encontra no Anexo I.

3.4. Parâmetros cromatográficos

A corrida cromatográfica foi realizada em uma coluna Acquity UHPLC® HSS

C18 (100 x 2,1mm; 1,8 µm) com uma coluna de guarda de 0,5 cm de mesma fase

estacionária e um filtro de linha de 0,2 µm. A eluição foi realizada com (A) NH4Ac 20

mmol L-1

em água deionizada e (B) 0,5% ácido fórmico em ACN no modo gradiente. O

gradiente utilizado foi: 0-1min, 99% (A); 1,00-1,01 min, 99-10% (A); 1,01-3,50 min,

10-0% (A); 3,50-5,00 min, 0% (A); 5,00-5,01 min, 0-99% (A); 5,01-7,00 min, 99% (A)

. A vazão da fase móvel foi mantido em 0,300 mL min-1

e tanto a temperatura da coluna

como do amostrador foram mantidos a 30 ºC. O volume de injeção foi de 10,0 µL.

3.5. Parâmetros da espectrometria de massa

A fonte de ionização empregada foi a de eletronebulização no modo positivo. A

temperatura de dessolvatação foi de 450 ºC com uma vazão de 650 L min-1

de N2. A

temperatura de bloco foi mantida em 150 ºC, a vazão de N2 do cone de 10 L min-1

e a

voltagem do capilar de 2,5 kV. O modo de aquisição dos dados foi o de monitoramento

de reações múltiplas (MRM). A análise dos dados foi realizada utilizando o software

MassLynx 4.1 (Waters).

3.6. Avaliação das colunas cromatográficas

Nesta avaliação foram empregadas cinco diferentes colunas de fase reversa e

com exceção da coluna com grupos fenil (Agilent) todas as outras colunas foram da

marca Waters. Algumas características das colunas são descritas na Tabela 3.

Para esta avaliação foram utilizadas solução padrão de metformina na

concentração 500 ng mL-1

preparada em água e solução padrão de bixina na

concentração de 1000 ng mL-1

preparada em metanol.

29

Tabela 3: Especificações das colunas cromatográficas avaliadas.

Colunas Dimensões

(mm)

Tamanho

de

partícula(

µm)

Densidade

de ligante

(µmol/m²)

%

carbono

Área

superficial

(m²/g)

Poroshell 120 Phenyl Hexyl 3,0x 50

2,7

Acquity UPLC® BEH C18 2,1x 50 1,7 3,1 18 185

Acquity UPLC® HSS T3 2,1x 50 1,8 1,6 11 230

Acquity UPLC® HSS C18 2,1 x 100 1,8 3,2 15 230

Acquity UPLC® HSS C18 SB 2,1x 50 1,7 1,6 8 230

3.7. Avaliação dos parâmetros de precipitação proteica para extração de

metformina de amostras de plasma

3.7.1. Avaliação do tipo de agente precipitante na extração de


Foram avaliados três tipos diferentes de agentes precipitantes e suas

combinações para a extração da metformina das amostras de plasma. Os três agentes

precipitantes avaliados foram: solução 10% (m/v) de ácido tricloroacético preparado em

água deionizada, acetonitrila e acetona.

As amostras foram preparadas em tubos de polipropileno de 2 mL fortificando

200 µL de plasma com 10 µL de solução de metformina (10 µg mL-1

). Ás amostras de

plasma fortificadas foram adicionados os agentes precipitantes em suas devidas

proporções como apresentado na Tabela 4.

Tabela 4: Proporções dos agentes precipitantes avaliados na extração de metformina em amostras de plasma.

Experimento Solução de precipitação avaliada

1 100 µL de ATCA 10% (m/v) + 200 µL de água deionizada

2 500 µL de acetona

3 500 µL de ACN

4 100 µL de ATCA 10% (m/v) + 500 µL de acetona

5 250 µL de ACN + 250 µL de acetona

6 100 µL de ATCA 10% (m/v) + 500 µL de ACN

7 100 µL de ATCA 10% (m/v) + 250 µL de acetona + 250 µL de ACN

ATCA = ácido tricloroacético, ACN = acetonitrila.

30

Em seguida as amostras de plasma adicionadas dos agentes precipitantes foram

agitadas por 30 segundos em vortex e levadas para centrifugação por 10 minutos a

13000 rpm. Duzentos microlitros (200 µL) do sobrenadante foram recolhidos em vials,

diluídos com 400 µL de água deionizada e 5 µL injetados no cromatógrafo. As

condições utilizadas nos testes acima foram obtidas a partir de testes prévios.

Os resultados de porcentagem de extração foram calculados comparando

amostras de plasma fortificadas antes da etapa de precipitação e o extrato livre de

metformina (branco) fortificado após a precipitação. A recuperação de extração foi

calculada empregando a Equação 5:

𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑎 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎çã𝑜

á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑎𝑝ó𝑠 𝑎 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑥 100 Equação 05

Para cada condição avaliada foram realizadas duas extrações (n = 2) e os valores

de porcentagem de extração são apresentados como a média desses valores.



Para a avaliação da concentração do agente precipitante (ATCA em água

deionizada) foram utilizadas soluções nas concentrações de 5, 10 e 15% (m/v).

As amostras foram preparadas em tubo de polipropileno de 2 mL fortificando

200 µL de plasma com 10 µL de solução de metformina (10 µg mL-1

) e 12 µL de bixina

(48,5 µg mL-1

). Ás amostras fortificadas foram adicionados 200 µL de ATCA em

diferentes concentrações (5, 10 e 15%, m/v).

Em seguida as amostras de plasma adicionadas dos agentes precipitantes foram


13000 rpm. Cem microlitros (100 µL) do sobrenadante foram recolhidos em vials,

diluídos com 500 µL de água deionizada e 5 µL injetados no cromatógrafo. Os

resultados de porcentagem de extração foram calculados comparando amostras de

plasma fortificadas antes da etapa de precipitação e o extrato livre de metformina

(branco) fortificado após a precipitação.

31

O cálculo para os valores de porcentagem de extração foram realizados

empregando a Equação 05 descrita no item 3.7.1.



3.8. Otimização da extração líquido-líquido para extração de bixina de

amostras de plasma

3.8.1. Avaliação do tipo de solvente extrator na extração de bixina de

amostras de plasma

Foram avaliados quatro tipos diferentes de solventes extratores éter dietílico,

diclorometano e hexano e a mistura de acetonitrila/éterdietílico (2/5:v/v).

As amostras de plasma foram preparadas em tubo de polipropileno de 2 mL

fortificando 400 µL de plasma com 12 µL de solução de bixina (97 µg mL-1

) e 20 µL

de solução de metformina (10 µg mL-1

).

Às amostras fortificadas foi adicionado1 mL do solvente orgânico extrator, em

seguida agitadas por 30 segundos em vortex e levadas para centrifugação por 10

minutos a 13000 rpm.

Após a centrifugação, 800 µL da fase orgânica foram recolhidos e levados para

completa evaporação do solvente em banho Maria ( 40 C) seguida da redissolução do

resíduo com 400 µL de acetonitrila. Finalmente as amostras foram filtradas em filtro de

poro de 0,22 µm e 10 µL injetados no cromatógrafo.




amostras de plasma fortificadas antes da etapa de extração e o extrato livre de

metformina (branco) fortificado após a extração.



32

3.8.2. Avaliação do efeito da diluição da amostra de plasma na extração

de bixina

Neste estudo as amostras de plasma fortificadas com bixina foram previamente

diluídas com água deionizada em diferentes proporções (plasma/água - 400/100 µL e

400/200µL) para avaliar seu efeito na porcentagem de extração.

As amostras de plasma foram preparadas em tubos de polipropileno de 2 mL


) e 20 µL


). Essas amostras fortificadas foram divididas em

dois grupos. Em um grupo foi avaliado a adição de 100 e no outro 200 µL de água ao

plasma fortificado para verificar o efeito da diluição.

Às amostras fortificadas foi adicionado 1 mL de éter dietílico, em seguida


13000 rpm.

Após a centrifugação, 800 µL da fase orgânica foram recolhidos e levados para

completa evaporação do solvente em banho Maria ( 40 C) seguida da redissolução do

resíduo com 400 µL de acetonitrila.

Finalmente as amostras foram filtradas em filtro de poro de 0,22 µm e 10 µL

injetados no cromatógrafo.








3.8.3. Avaliação do tempo de agitação entre a amostra de plasma e o

solvente extrator na extração de bixina

Neste estudo foram avaliados diferentes tempos de agitação entre a solução de

extração e a amostra de plasma.

33



) e 20 µL


).

Às amostras fortificadas foi adicionado 1 mL do solvente orgânico extrator (éter

dietílico) e separadas em dois grupos. Um grupo foi agitado por 30 segundos enquanto

que o outro foi agitado por 60 segundos, ambos em vortex. Em seguida ambos os

grupos foram levados para centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm. Após a

centrifugação, 800 µL da fase orgânica foram recolhidos e levados para completa

evaporação do solvente em banho Maria ( 40 C) seguida da redissolução do resíduo

com 400 µL de acetonitrila. Finalmente as amostras foram filtradas em filtro de poro de

0,22 µm e 10 µL injetados no cromatógrafo.








3.8.4. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma na extração de

bixina

Neste estudo foi avaliado o efeito da adição de sal (salting out) na porcentagem

de extração de bixina em amostras de plasma.



) e 20 µL


). As amostras fortificadas foram separadas em

dois grupos. Um deles recebeu a adição de 100 µL de uma solução de acetato de amônio

(20%, m/v), 100 µL de uma solução de cloreto de sódio (20%, m/v), 200 µL de uma

solução de hidrogenofosfato dissódico (10%, m/v) enquanto que o outro grupo não

recebeu a adição dessa solução.

Aos dois grupos de amostras fortificadas foi adicionado 1 mL de éter dietílico,

em seguida agitadas por 30 segundos em vortex e levadas para centrifugação por 10

minutos a 13000 rpm. Após a centrifugação, 800 µL da fase orgânica foram recolhidos

34

e levados para completa evaporação do solvente em banho Maria ( 40 C) seguida da

redissolução do resíduo com 400 µL de acetonitrila. Finalmente as amostras foram

filtradas em filtro de poro de 0,22 µm e 10 µL injetados no cromatógrafo.








3.8.5. Avaliação da extração líquido-líquido sequencial na extração de

bixina das amostras de plasma

Para esta avaliação foi utilizado o éter dietílico como solvente extrator e

comparado os valores de recuperação empregando duas e três extrações sequenciais.



) e 20 µL


).

As extrações empregando éter dietílico foram realizadas empregando duas e três

extrações com 1,2 mL de éter dietílico.

No modo de duas extrações sequenciais foi adicionado às amostras uma primeira

alíquota de 1,2 mL de éter dietílico. A mistura foi então agitada por 30 segundos em

vortex e levada para centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm. Após a centrifugação

1000 µL da fase orgânica (denominado extrato 1) foram recolhidos e armazenados . À

fase aquosa residual foram adicionados mais 1,2 mL de éter dietílico. Em seguida o

tubo foi mais uma vez agitado por 30 segundo em vortex e levado para centrifugação

por 10 min a 13000 rpm. Uma segunda alíquota de 1000 µL da fase orgânica foi

recolhida (denominada extrato 2) e adicionada ao primeiro extrato (extrato 1). A

solução combinada dos extratos 1 e 2, ambos no mesmo recipiente de polipropileno de

2 mL, foi então levado para completa evaporação do solvente em banho Maria ( 40

C). No teste com três extrações foi adicionado a fase aquosa mais uma alíquota de 1,2

mL de éter dietílico, seguido de agitação por 30 segundos em vortex e centrifugação por

35

10 min. Uma terceira alíquota foi recolhida (denominada extrato 3) e adicionado ao

mesmo frasco da solução do extrato 1 e 2. Essa ultima fração de éter foi evaporado em

banho Maria, seguida da redissolução do resíduo com 400 µL de acetonitrila.

Finalmente as amostras foram filtradas em filtro de poro de 0,22 µm e 10 µL injetados

no cromatógrafo.









amostras de plasma

Para a otimização da extração de bixina por extração em fase sólida (SPE) foram

empregados cartuchos montados com seringas de polipropileno de 1 mL contendo um

filtro (frit) superior e outro inferior de politetrafluor etileno (Teflon®) ambos com poros

de 0,22 µm de diâmetro médio. Para a otimização dos parâmetros de SPE foi utilizado

uma bomba peristáltica Ismatec e tubulações de Viton® de 1 mm de diâmetro em numa

vazão aproximada de 1 mL min-1

( 0,1 mL min-1

). Com essas condições foram

avaliados os parâmetros de SPE descritos a seguir.

3.9.1. Avaliação do tipo de sorvente na extração de bixina de amostras

de plasma

Neste estudo foram avaliados seis tipos diferentes de fase estacionária: Strata

C18T (55 µm, 140A, Phenomenex); Strata C8 (55 µm, 140A, Phenomenex); HFC8

(Agilent); StrataX (33 µm, Phenomenex); Oasis HLB (30 µm, 80A, Waters). Strata

Phenyl (50 µm, 65A Phenomenex) .Os cartuchos foram montados empregando 80 mg

dos sorventes descritos.

As amostras de plasma foram preparadas em tubos de polipropileno de 2 mL


) e 20 µL

36


) seguido de diluição com 400 µL de água

deionizada.

O procedimento de SPE foi realizado em quatro etapas descritas a seguir:

Condicionamento do cartucho: uma alíquota de 400 µL de MeOH seguida de

duas alíquotas de 500 µL de água deionizada;

Amostragem: 800 µL da amostra de plasma diluída com água deionizada

(1:1/v:v);

Limpeza (clean up): uma única alíquota de 800 µL de água;

Eluição: duas alíquotas de 600 µL de uma solução ACN:éter dietílico (1:1/ v:v).

Após a etapa de eluição o solvente do eluato recolhido foi reduzido a 600 µL em

banho Maria ( 40 C). Finalmente as amostras foram filtradas em filtro de poro de 0,22

µm e 10 µL injetados no cromatógrafo.








3.9.2. Avaliação da massa de sorvente na extração de bixina

Nesta avaliação foram montados cartuchos de SPE com 40, 80 e 120 mg de

sorvente Strata C18T a base de sílica, com partículas de 55 m, tamanho médio de poro

de 140 Å. As amostras de plasma foram preparadas em tubo de polipropileno de 2 mL


) e 20 µL



deionizada.


Condicionamento do cartucho: 200, 300 e 400 µL de MeOH foram percolados

para os cartuchos contendo 40, 80 e 120 mg sorvente, respectivamente, seguido

de duas alíquotas de 500 µL de água deionizada;

37

Amostragem: um volume de 800 µL da amostra de plasma diluído com água

deionizada (1:1/v:v) foi introduzida no cartucho;

Limpeza (clean up): uma única alíquota de 800 µL de água deionizada foi

percolada nos cartuchos;

Eluição: duas alíquotas de 600 µL de uma solução ACN:éter dietílico (1:1, v/v)

foram percolados nos cartuchos.











3.9.3. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma e na etapa de

limpeza sobre a extração de bixina

Para este estudo foi empregada uma solução de cloreto de sódio (20 % m/v)

adicionada na amostra de plasma e também durante a etapa de limpeza. As amostras de

plasma foram fortificadas foram separadas em quatro grupos distintos como descrito na

Tabela 5.

Tabela 5: Grupos de condições avaliadas no estudo do efeito da adição de sal na

porcentagem de extração da bixina por SPE.

Experimento Descrição

1 Amostra diluída com água e limpeza com água (SA)

2 Amostra diluída com NaCl e limpeza com NaCl (SO1)

3 Amostra diluída com água e limpeza com NaCl (SO2)

4 Amostra diluída com NaCl e limpeza com água (SO3)

SA = sem adição de sal; SO = grupo salting out.

38

Nesta avaliação os cartuchos foram montados com 80 mg de sorvente Strata

C18T a base de sílica C18.



) e 20 µL



deionizada.


Condicionamento do cartucho: uma alíquota de 400 µL de MeOH foi percolada

seguida de duas alíquotas de 500 µL de água deionizada;

Amostragem: 800 µL de amostra de plasma diluída (diluição com solução de

cloreto de sódio ou água deionizada);

Limpeza (clean up): uma única alíquota de 800 µL de água deionizada ou

solução de cloreto de sódio;

Eluição: duas alíquotas de 600 µL de uma solução ACN:éter dietílico (1:1, v/v).










de porcentagem de extração são apresentados como a média desses valores

3.9.4. Avaliação do solvente de eluição na extração de bixina

Neste estudo foram avaliadas diferentes composições do solvente de eluição.

Foram avaliados quatro diferentes sistemas de eluição descrito na Tabela 6.

39

Tabela 6: Sistemas de eluição avaliados na etapa de eluição para a extração da bixina

de amostras de plasma por SPE.

Experimento Descrição

1 Duas alíquotas de 600 µL de uma solução ACN:éter dietílico (1:1/v:v)

2 Única alíquota de 400 µL de ACN

3 Uma primeira alíquota de 600 µL de uma solução ACN:éter dietílico

(1:1/ v:v) seguida de uma segunda alíquota de 600 µL de éter dietílico

4 Uma primeira alíquota de 400 µL de ACN seguida de uma segunda

alíquota de 600 µL de éter dietílico

ACN = acetonitrila.

Nesta avaliação os cartuchos foram montados com 80 mg de sorvente Strata C18T a

base de sílica C18.



) e 20 µL



deionizada.


Condicionamento do cartucho: uma alíquota de 400 µL de MeOH foi percolada

seguida de duas alíquotas de 500 µL de água deionizada;

Amostragem: 800 µL de amostra de plasma diluído;

Limpeza (clean up): uma única alíquota de 800 µL de água deionizada ou

solução de acetato de amônio;

Eluição: conforme descrito na Tabela 5.

Após a etapa de eluição o solvente do eluato recolhido foi reduzido ao volume total

de ACN na amostra de eluição em banho Maria ( 40 C). Finalmente as amostras

foram filtradas em filtro de poro de 0,22 µm e 10 µL injetados no cromatógrafo.







de porcentagem de extração são apresentados como a média desses valores

40

3.10. Determinação dos parâmetros de validação do método

A validação de um método desenvolvido é de fundamental importância para

demonstrar a sua confiabilidade, uma vez que os resultados obtidos de uma análise

podem ter consequências graves. Para validar um método deve-se seguir alguns

procedimentos que envolvem a avaliação de determinados parâmetros descritos em

diversos protocolos oficiais e artigos da área.

Neste trabalho dado as grandes diferenças físico-químicas dos analitos de

interesse foram validados dois métodos distintos de análise, um para a bixina e outro

para a metformina. O método de determinação de bixina em plasma de rato empregou

extração líquido-líquido e UHPLC-PDA como técnica instrumental de análise e o

segundo método para determinação de metformina em plasma de rato empregou a

precipitação proteica e UHPLC-MS/MS como sistema instrumental de análise. Foram

avaliados os parâmetros: seletividade, linearidade, faixa linear de trabalho, precisão,

exatidão e limite de quantificação. As principais figuras de mérito de validação foram

avaliadas tomando como referência o guia de validação do FDA – Food and Drug

Administration [127].

Devido ao fato dos analitos terem apresentado comportamentos cromatográficos

praticamente antagônicos, foi necessário fazer ajustes nas condições no método

cromatográfico que serão descritos nos itens a seguir.

3.10.1. Condições cromatográficas para determinação de bixina

A corrida cromatográfica foi realizada em uma coluna analítica Acquity

UHPLC® BEH C18 (50 x 2,1mm; 1,7 µm) acoplada a uma coluna de guarda de 0,5 cm

de mesma fase estacionária e um filtro de coluna de 0,2 µm. A eluição foi realizada com

(A) ácido fórmico 0,1% (v/v) em água deionizada e (B) ACN no modo gradiente de

eluição. O gradiente utilizado foi: 0-4,00min, 98-2% (A); 4,00-5,00 min, 2% (A); 5,00-

5,10 min, 2-98% (A); 5,10-6,50 min, 98% (A). A vazão da fase móvel foi mantida em

0,4 mL min-1

. As temperaturas da coluna e do amostrador formam de 40 e 20 ºC,

respectivamente. O volume de injeção foi de 10,0 µL.

41

O detector de arranjo de fotodiodos foi empregado no modo varredura do

espectro na faixa de 200 a 650 nm com resolução de 4,8 nm. O modo de ionização

empregado foi o de eletronebulização no modo positivo. A temperatura de

dessolvatação foi de 400 ºC com uma vazão de 600 L min-1

de N2. A temperatura de

bloco foi mantida em 150 ºC, a vazão de N2 do cone foi de 25 L min-1

e a voltagem do

capilar de 5,0 kV. A análise dos dados foi realizada utilizando o software MassLynx 4.1

(Waters).

3.10.2. Condições cromatográficas para determinação de metfomina

A corrida cromatográfica foi realizada em uma coluna analítica Acquity

UHPLC® HSS C18 (100 x 2,1 mm; 1,8 µm) com uma coluna de guarda de mesma fase

estacionária e um filtro de coluna. A eluição foi realizada com (A) NH4Ac 20 mmol L-1

em água deionizada e (B) 0,5% ácido fórmico em ACN no modo gradiente de eluição.

O gradiente utilizado foi: 0-1 min, 99% (A); 1,00-1,01 min, 99-0% (A); 1,01-1,50 min,

0% (A); 1,50-1,51 min, 0-99% (A); 1,51-3,00 min, 99% (A). A vazão da fase móvel foi

mantida em 0,300 ml min-1

e a temperatura da coluna e do amostrador foram mantidos a

30 ºC. O volume de injeção foi de 5,0 µL.

O ESI foi utilizado para análise no modo positivo. A temperatura de

dessolvatação foi de 450 ºC com uma vazão de 650 L min-1

de N2. A temperatura de

bloco foi mantida em 150 ºC, a vazão de N2 do cone foi de 10 L min-1

, a voltagem do

capilar de 2,5 kV. A análise dos dados foi realizada utilizando o software MassLynx 4.1

(Waters).

3.10.3. Seletividade

A seletividade é a capacidade do método de determinar exatamente o composto

de interesse na presença de interferentes da matriz. Para avaliação da seletividade, deve-

se comparar o extrato da matriz branco com o extrato da matriz fortificado. Assim

verifica-se a existência ou não de algum interferente da matriz no mesmo tempo de

retenção do composto de interesse [128]. Para essa avaliação o branco deve ser

avalidado em replicata (n=6).

42

3.10.4. Lineariadade e faixa linear de trabalho

A linearidade e a faixa linear de trabalho foram avaliadas construindo uma curva

analítica adicionando concentrações conhecidas de metformina e bixina ao plasma

seguido da extração. Foi utilizado oito níveis de concentração para cada composto com

um mínimo de três extrações (triplicata) para cada concentração. Para a bixina o plasma

foi fortificado nas concentrações de 200; 400; 600; 800; 1200; 1500; 1800 e 2200 ng

mL-1

. Para a metformina foi o plasma fortificado nas concentrações de 10; 25; 50; 100;

200; 300; 400 e 500 ng mL-1

. Após a extração, as áreas correspondentes ao sinal dos

compostos de interesse foram inseridos em um gráfico de área vs concentração. Através

de um modelo de regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados ordinários, foi

obtida uma equação que descreve uma relação linear do tipo y = ax + b em que a é o

coeficiente angular, b o coeficiente linear, y é o sinal analito (área) e x a concentração

do analito. O coeficiente de correlação é um bom indicativo ajuste do modelo em uma

determinada faixa de concentração.

3.10.5. Exatidão

A exatidão de um método está relacionada com a proximidade do teor do

composto de interesse encontrado na amostra com a concentração teórica esperada. Esse

ensaio foi realizado por meio do teste de recuperação em que se compara o resultado

obtido da Equação 06 com o valor teórico.

𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑜

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 𝑥 100 Equação 06

O branco de plasma foi fortificado em três níveis de concentração diferentes em

quintuplicata (n=5) para cada nível. Para a bixina foi avaliada as concentração de 300,

1000 e 2000 ng mL-1

. Para a metformina foi avaliada as concentrações 10, 150 e 450 ng

mL-1

. Após fortificar o plasma nestas concentrações, realizou se a extração e os sinais

de área obtidos foram aplicados na equação da regressão linear para obter o valor de

concentração.

3.10.6. Precisão

A precisão do método verifica se há proximidade dos resultados da análise de

amostra homogêneas analisadas em replicara em um determinado nível de

concentração. Neste ensaio verificasse a variação das medidas feitas em um dia

43

(precisão) e em dias diferentes (precisão intermediária) sendo avaliados três níveis de

concentrações em quintuplicata (n=5). O resultado da precisão é dado em função do

coeficiente de variação (CV) (Equação 07).

𝐶𝑉 (%) = 𝑆

𝐶𝑚 𝑥 100 Equação 07

Em que S é o desvio padrão dos valores obtidos e Cm a concentração média

obtida. Para a precisão intermediária foi feita a análise em três dias diferentes pelo

mesmo analista e o mesmo equipamento. Para a bixina foram avaliados os níveis de

concentração de 400, 1200 e 2200 ng mL-1

. Para a metformina foram avaliados os níveis

de concentração de 25, 200 e 500 ng mL-1

.

3.10.7. Limite de quantificação

O limite de quantificação é definido como a menor quantidade de composto de

interesse que pode ser determinado pelo método proposto com precisão e exatidão

aceitáveis. Esse parâmetro de determinado pela Equação 08 que leva em consideração

parâmetros obtido pela curva de calibração.

𝐿𝑄 = 10 ×𝑠

𝑆 Equação 08

Em que s é o desvio padrão do branco medido em seis replicas (n=6) e S é o

valor da inclinação da curva de calibração.

44

4. Resultados e discussão

4.1. Otimização das condições cromatográficas, arranjo de diodo e

espectrometria de massas

A otimização da cromatografia líquida acoplada ao detector de absorvância com

arranjo de fotodiodos e espectrometria de massas foi de extrema importância para

aumentar a detectabilidade do método. A quantificação da metformina foi realizada

utilizando se o fragmento de maior intensidade. Para a metformina usou-se o íon

molecular protonado [M+H]+ de m/z 130 como íon precursor e para a fragmentação a

transição de quantificação foi feita pela transição 130→60 com energia do cone de 28 V

e colisão de 10 V. A confirmação foi realizada pela transição 130→71 com energia do

cone de 28 V e colisão de 18 V. Na Figura 9 é apresentado o local de quebra da

metformina, sendo esses fragmentos já descritos na literatura [92, 95, 100, 101, 106,

108, 126]. Foi utilizado o modo de janela de detecção em que a metformina foi

monitorada entre 0 e 2,50 min. O tempo de retenção da metfomina foi de 1,06 min

(Figura 11).

Figura 9: Estrutura da metformina e fragmentos do íons monitorados.

Para a bixina foi utilizado o comprimento de onda de máximo de absorvância no

visível (459 nm). No espectrômetro de massas foi utilizada o íon precursor protonado

[M+H]+ de m/z 395 e a transição de quantificação da bixina foi a de 395→363 com a

voltagem do cone de 24 V e colisão de 8 V. A transição de confirmação foi a 395→335

com voltagem do cone de 24 V e colisão de 8 V. Essas transições utilizadas no

espectrômetro de massas (Figura 10) e o comprimento de onda me máximo de absorção

foram baseados em trabalhos descritos na literatura [57, 129-132]. O tempo de retenção

45

da bixina foi de 4,57 min (Figura 11). Na Figura 12 podemos observar o espectro de

absorção do pico cromatográfico correspondente à bixina.

Figura 10: Estrutura da bixina e fragmentos dos íons monitorados.

46

Figura 11: Cromatograma das injeções de solução padrão de metformina(A) (500 ng mL-1

)com detecção por espectrometria de massas sequencial (m/z 130→60), solução padrão de bixina (B)

(2500 ng mL-1

)com detecção por absorbância com detector com arranjo de fotodiodos e solução

padrão de bixina (C) (2500 ng mL-1

) com detecção por espectrometria de massas (m/z 395→363).

Tempo / min

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

A

B

C

47

Figura 12: Cromatograma da injeção de solução padrão de bixina (2200 ng mL-1

) com destaque

para o espectro de absorção no tempo de retenção (4,57 min).

4.2. Avaliação das colunas cromatográfica

O resultado da avaliação das diferentes colunas cromatográficas de fase reversa

estão apresentados na Tabela 7. Nesta tabela podemos observar que a coluna a base de

sílica modificada com grupos fenil foi a que apresentou o resultado mais satisfatório,

pois esta teve os maiores valores de fator de retenção e números de pratos teóricos para

metformina. Pode-se atribuir a alta retenção as interações com silanóis livres uma vez

que o comprimento do grupo fenil quimicamente ligado possui um comprimento menor

em relação ao C18, tornando o acesso aos grupos silanóis livres mais fácil. Outra coluna

que apresentou bons resultados foi à coluna HSS C18 SB. Nesta coluna a maior

retenção da metformina também poderia ser atribuída à forte interação com grupos

silanois resíduas devido à falta de capeamento do grupo ligado quimicamente a sílica.

Em geral o capeamento de colunas de fase reversa é empregado para diminuir a

interação de analitos básicos com silanóis livres por impedimento estérico, que no caso

de compostos muito hidrossolúveis e pouco retidos o efeito é uma perda de retenção

significativa [113, 133]. A coluna HSS C18 SB apresentou uma alta dispersão da

bixina, fazendo com que não obtivéssemos um sinal mensurável. A coluna HSS T3

possui características semelhantes à HSS C18, entretanto ela possui menor densidade de

48

ligante e menor porcentagem de carbono, fazendo com que o acesso a silanóis livres

seja maior. A coluna da família BEH (ethylene bridged hybrid) C18 é uma coluna que

possui ponte de pontes de etileno entre os silícios no suporte da coluna. A presença

desses grupos etilenos diminui a presença de grupos silanóis tornando-a menos retentiva

para compostos básicos e ainda mais estáveis ao ataque de álcalis. A principal diferença

entre as colunas HSS e a BEH é que o suporte da coluna HSS é basicamento óxido de

silício, enquanto que o suporte da coluna BEH é composta pelas chamadas sílicas

híbridas. Para o caso particular da metformina que possui baixa afinidade pelos grupos

apolares a maior presença de grupos silanóis auxilia na sua retenção [134].

Tabela 7: Parâmetros cromatográficos de separação obtidos nas diferentes colunas

cromatográficas avaliadas.

Coluna Metformina Bixina

k N tR k N tR

BEH C18 0,2 115 0,88 5,9 38109 5,21

Phenyl 2,6 205 1,34 14,5 46276 5,74

HSS T3 2,0 115 1,12 13,7 33284 5,42

HSS C18 1,3 416 1,73 6,8 47292 5,80

HSS C18 SB 10,9 5741 4,39 * * *

k = fator de retenção; N = número de pratos; tR = tempo de retenção.

4.3. Avaliação dos parâmetros para extração de metformina por

precipitação proteica


metformina

Três diferentes agentes precipitantes foram avaliados na precipitação das

proteínas de plasma para determinação de metformina (Figura 13). Apesar de a

acetonitrila ser amplamente utilizada como agente precipitante, o ácido tricloroacético

(ATCA) foi o que o obteve maior porcentagem de extração da metformina (Figura 13).

Um dos possíveis motivos do melhor rendimento empregando o ATCA pode ser

atribuída à ionização das proteínas que se tornaram catiônicas e consequentemente

arrastaram menos metformina para o precipitado.

49

0

22

44

66

88

110

% d

e ex

traçã

o m

etfo

rm

ina

Figura 13: Avaliação do tipo de agente precipitante (ATCA, acetona e acetonitrila) na

porcentagem de extração de metformina em amostras de plasma.

50

0

22

44

66

88

110

5 10 15

% d

e ex

traçã

o d

e m

etfo

rm

ina

% ATCA (m/v)

4.3.2. Otimização da concentração do ácido tricloroacético na extração

de metformina

Outro parâmetro avaliado foi a concentração de ATCA empregado para a

precipitação das proteínas do plasma. Foram avaliados três concentrações de ATCA na

solução de precipitação (5, 10 e 15% m/v). Nos resultados da Figura 14 podemos

observar na faixa de concentração avaliada não houve mudança aparente na

porcentagem de extração da metfomina. Em todos os casos a porcentagem de extração

média foi superior a 90%.

Apesar dos resultados de porcentagem de extração indicarem que não houve

diferença aparente entre os teores de ATCA quando observarmos os cromatogramas

referentes a estas análises (Figura 15) é possível notar que o formato do pico da

metformina se altera com o aumento da concentração do agente precipitante. Dessa

forma optou-se por empregar a concentração de 5% do agente precipitante ATCA.

Figura 14: Avaliação do teor de agente precipitante (5, 10 e 15% m/v) na porcentagem de extração de metformina em amostras de plasma.

51

4.4. Otimização da extração líquido-líquido para extração de bixina nas

amostras de plasma

4.4.1. Avaliação do tipo de solvente extrator na extração de bixina

A escolha do tipo de solvente é extremamente importante em procedimentos de

extração líquido-líquido, pois o analito de interesse deve ter elevada solubilidade no

solvente orgânico escolhido para que haja uma extração eficiente. Podemos perceber

que o éter dietílico foi o que obteve maior porcentagem de extração de bixina (Figura

16). Podemos atribuir a maior porcentagem de extração do éter a possível ligação de

hidrogênio em que o oxigênio do éter faz com o hidrogênio da bixina, visto que o éter

possui um caráter mais básico em relação os outros solventes. O diclorometano possui

um caráter anfótero quando avaliado em termos de acidez, por isso possui valor de

extração maior que o do hexano [135]. Comparando a solubilidade do éter (69 g L-1

), do

diclorometano (13 g L-1

) e do hexano (insolúvel), podemos verificar que a solubilidade

do éter em água é maior. Essa maior solubilidade ajuda na transferência de bixina para a

fase orgânica, fazendo assim o éter um melhor solvente para extração de bixina. A

Figura 15: Cromatogramas demonstrando a distorção no formato do pico da metformina após a

extração por precipitação proteica empregando o agente precipitante ácido tricloroacético em

diferentes concentrações (5, 10 e 15%, m/v).

52

adição de acetonitrila ao éter praticamente não resultou em melhora na extração da

bixina. Podemos atribuir isso ao fato da acetonitrila ser prontamente solúvel em água,

logo ao entrar em contato com a fase aquosa ela se distribui preferencialmente na

amostra aquosa e não auxilia na extração. Então o solvente escolhido para os próximos

teste foi o éter dietílico.

Figura 16: Avaliação do tipo de solvente extrator (éter dietílico, diclorometano, hexano e éter dietílico:acetonitrila/5:2) na porcentagem de extração de bixina por extração líquido-líquido.

4.4.2. Avaliação do efeito da diluição da amostra de plasma na extração

da bixina

Outro parâmetro avaliado na extração líquido-líquido foi o efeito da diluição da

amostra na porcentagem de extração de bixina em plasma de rato (Figura 17). Como

podemos verificar que a adição de água ao plasma ajudou discretamente a extração da

bixina. Esse auxílio pode ser atribuído a uma redução da interação bixina-proteína ou

bixina-endógeos tornando a bixina mais amplamente disponível para extração. Esse tipo

de efeito já foi amplamente descrito e avaliado em outros procedimentos de equilíbrio

como a SPME[136]. Então não foi utilizada a diluição do plasma na extração de bixina.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Éter dietílico Diclorometano Hexano Éter dietílico com

ACN

% e

xtr

açã

o d

e b

ixin

a

Tipo de solvente extrator

53

Figura 17: Avaliação da diluição do plasma na porcentagem de extração de bixina na extração

líquido-líquido. Sem diluição = sem diluição dos 400 µL de plasma com água deionizada; diluição 100 = 400 µL de plasma diluído com 100 µL de água deionizada; diluição 200 = 400

µL de plasma diluído com 200 µL de água deionizada.

4.4.3. Avaliação do tempo de agitação entre a amostra de plasma e o

solvente extrator na extração da bixina

O tempo de agitação também é importante na extração líquido-líquido, em

função da preferência por realizar o procedimento em regime de equilíbrio do analito

entre as duas fases onde se obtém o maior rendimento de extração. Quanto maior o

tempo de agitação espera-se haver maior extração até que se atinja um máximo,

assinalando que o equilíbrio de partição foi atingido. Na Figura 18 observa-se que com

maior tempo de agitação houve uma maior porcentagem de extração. Essa maior

porcentagem de extração certamente pode ser atribuída ao maior tempo de contato entre

a bixina e a fase orgânica, resultando em uma maior transferência de massa do analito

da amostra para o solvente extrator. Logo o tempo utilizado para extração foi de 60

segundos.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sem diluição Diluição 100 Diluição 200

% e

xtr

açã

o d

e b

ixin

a

54

Figura 18: Avaliação do tempo de agitação na porcentagem de extração de bixina por extração

líquido-líquido.

4.4.4. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma na extração da

bixina

A adição de sal na fase aquosa pode auxiliar na extração líquido-líquido. Com a

adição de sal ocorre o aumento da quantidade de íons solvatados pela água da amostra

(salting out), em que a água presente no meio solvata o sal diminuindo a solubilidade do

analito na fase aquosa. Entretanto, podemos observar, na Figura 19, que a adição de sal

em alguns casos fez o efeito contrário, pois houve uma diminuição da porcentagem de

extração. Uma possível explicação para essa observação seria o aumento da solubilidade

do analito em fase aquosa devido a possível formação de um par iônico do sal

adicionado com a bixina, tornando a bixina mais solúvel em água, sendo esse o efeito

salting in, em que o aumento da força iônica gera o aumento da solubilidade de analito

no meio.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

30 60

% e

xtr

açã

o d

e b

ixin

a

Tempo de agitação / seg

55

Figura 19: Avaliação do efeito da adição de NH4Ac (acetato de amônio)(20%, m/v), NaCl

(20%, m/v) e Na2HPO4 (10%, m/v) no plasma na porcentagem de extração de bixina por

extração líquido-líquido.

4.4.5. Extração líquido-líquido sequencial na determinação de bixina

Ao empregar a estratégia das extrações sequenciais espera-se um aumento na

porcentagem de extração do analito de interesse como foi apresentado no item 1.4.2.

Podemos observar na Figura 20, que com três extrações sucessivas obtivemos uma

porcentagem de extração acima de 80%, valor desejado para o desenvolvimento do

método.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sem adição NH4Ac NaCl Na2HPO4

% e

xtr

açã

o b

ixin

a

Tipo de sal

56

Figura 20: Avaliação do número de extração na porcentagem de extração de bixina por

extração líquido-líquido.

Com base nos resultados apresentados de otimização dos parâmetros de extração

líquido-líquido avaliados para bixina, as condições finais ótimas consistiram em utilizar

1,2 mL de éter dietílico, empregando 60 segundos de agitação e extração tripla sem

adição de sal ou diluição da amostra.


amostras de plasma

4.5.1. Avaliação do tipo de sorvente na extração de bixina de amostras

de plasma

No estudo do tipo de sorvente foram avaliadas seis fases diferentes. Podemos

verificar nos resultados apresentados na Figura 21 que o sorvente Strata C18T foi o

material que obteve maior valor de extração de bixina. A bixina é um composto que

possui cadeia carbônica extensa e essa estrutura faz com que as interações hidrofóbicas

fracas, do tipo dipolo induzido, com o grupo apolar C18 ligado quimicamente com a

base de sílica seja maior comparativamente com as outras fases. A fase Strata X possui

três tipos de interação em que o analito pode ficar retido, iônica com o grupo amino da

ponta da cadeia, interação π-π como grupo benzil, e interação hidrofóbica. Já a elevada

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2x 3x

% e

xtr

açã

o b

ixin

a

Número de extrações

57

taxa de extração no cartucho de Strata X pode ser devido à interação da carboxila da

bixina com os grupos amino da ponta da cadeia do polímero.

Figura 21: Avaliação do efeito do tipo de sorvente empregado na porcentagem de extração de

bixina de amostras de plasma empregando a extração em fase sólida.

4.5.2. Avaliação da massa de sorvente na extração de bixina de

amostras de plasma

Para este parâmetro foram avaliadas três diferentes massas (40, 80 e 120 mg de

fase estacionária Strata C18T) para a extração de bixina em plasma. Na Figura 22

podemos perceber que quanto maior a massa de sorvente maior a porcentagem de

extração. Esse comportamento, como esperado, obedece aos princípios da

cromatografia, pois quanto maior a massa menor a possibilidade de eluição do analito

de interesse nas etapas de aplicação da amostra e lavagem.

0

20

40

60

80

100

Strata C18T Phenyl StrataX

Polimérica

Oasis HLB Strata C8 HF C8

% d

e ex

traçã

o d

e b

ixn

a

Tipo de sorvente

58

Figura 22: Avaliação do efeito da massa de sorvente na porcentagem de extração de bixina de

amostras de plasma empregando a extração em fase sólida.

4.5.3. Avaliação da adição de sal na amostra de plasma e na etapa de

limpeza sobre a extração de bixina

No estudo da adição de sal, podemos perceber nos resultados da Figura 23, que a

adição de sal diminuiu a porcentagem de extração. Esse efeito pode ser explicado por

dois fatores. Um deles pode ser o efeito inverso ao salting out, o efeito salting in, em

que o aumento da força iônica aumenta a solubilidade do analito em fase aquosa

fazendo com que o analito não fique retido no sorvete na aplicação da amostra. Outro

fator pode estar relacionado ao forte efeito do salting out, em que a interação da bixina

com o sorvete foi extremamente forte e, consequentemente, na etapa de eluição não foi

possível eluir completamente o analito do cartucho.

0

20

40

60

80

100

40 mg 80 mg 120 mg

% d

e ex

traçã

o d

e b

ixin

a

Massa de sorvente

59

Figura 23: Avaliação do efeito da adição de sal na etapa de diluição do plasma e clean up na porcentagem de extração de bixina em amostra de plasma empregando a extração em fase

sólida. SA = sem adição de sal; S01 = adição de sal na diluição do plasma; S02 = Adição de sal

da diluição do plasma e na etapa de clean up; S03 = adição de sal na etapa de clean up.

4.5.4. Avaliação do solvente de eluição na extração de bixina

Na otimização da eluição (Figura 24) foi verificado que o teste de eluição E1 e

E3 foram os que resultaram na maior porcentagem de extração. Pode-se associar essa

maior porcentagem de extração ao maior teor de éter dietílico na fase extratora, uma vez

que a bixina é um composto lipofílico. A mistura acetonitrila:éter (1:1) (E3) foi mais

eficiente possivelmente devido a capacidade de interação da acetonitrila com a água

residual proveniente da etapa anterior de clean up (lavagem).

0

20

40

60

80

100

_SA S01 S02 S03

% e

xtr

açã

o d

e b

ixin

a

60

Figura 24: Avaliação de diferentes sistemas de eluição na extração de bixina em amostrsa de

plasma empregando a extração em fase sólida. E1: 2 x 600µL ACN:éter dietílico (1:1, v/v); E2:

1 x 400 µL ACN; E3: 1 x 600µL ACN:éter dietílico (1:1, v/v) + 1 x 600 µL éter dietílico; E4: 1 x 400 µL ACN + 1 x 600 µL éter dietílico.

4.1. Determinação das figuras de mérito de validação do método

A validação é uma etapa de extrema importância para dar credibilidade ao

método desenvolvido. Nesta validação foram avaliados a seletividade, linearidade, faixa

linear de trabalho, precisão, exatidão e limite de quantificação. A seletividade é

importante para verificar se há a presença de interferentes no mesmo tempo de retenção

dos compostos de interesse. Podemos verificar que no tempo de retenção da bixina

(4,57 min) e da metformina (1,06 min) não há nenhum composto endógeno coelulente

(Figuras 25 e 26).

0

20

40

60

80

100

E1 E2 E3 E4

% d

e ex

traçã

o b

ixin

a

Diferentes estratégias de eluição

61

Figura 25: Cromatogramas da injeção de bixina (2200 ng mL-1

) adicionado em um extrato de

plasma e um extrato de branco de plasma. O espectro Uv-Vis foi adquirido no comprimento de onda de 459 nm.

Figura 26: Cromatogramas da metformina (500 ng mL-1

) com detecção por espectrometria de

massas sequencial (m/z 130→60) adicionado em um extrato de plasma e um extrato de branco

de plasma.

A linearidade do método foi demonstrada para a faixa de concentração 5-500 ng

mL-1

para metformina e 200-2200 ng mL-1

para bixina ambos com coeficientes de

correlação superiores a 0,99 o que comprova a capacidade preditiva do método. Os

coeficientes angular (inclinação), coeficiente linear (intercepto) e o coeficiente de

correlação (r) obtidos pela regressão pelo método dos mínimos quadrados ordinários são

0 1 2 3 4 5 6 7

Inte

nsi

dad

e do

sin

al

Tempo / min

Extrato do branco

Extrato de plasma

fortificado

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Inte

sidad

e do

sin

al

Tempo / min

Extrato do branco

Extrato de branco

fortificado

62

apresentados na Tabela 8. O limite de quantificação calculado pela Equação 08

apresentou coeficiente de variação de 15% para bixina e 13% para metformina, de

acordo com o guia da FDA[127].

Tabela 8: Parâmetros da validação da bixina e metformina. Curva de calibração, faixa

linear, coeficiente de correlação e limite de quantificação.

Bixina Metformina

Inclinação 0,040 70,22

Intercepto 0,501 -455,53

Faixa linear de trabalho (ng mL-1

) 200-2200 5-500

Coeficiente de correlação (r) 0,997 0,998

Limite de quantificação (ng mL-1

) 40 1

A precisão do método visa avaliar a dispersão dos resultados de uma

determinada concentração. No ensaio da precisão foram avaliados três níveis de

concentração em cinco leituras e o resultado é dado em termos de coeficiente de

variação (CV) pela Equação 07. A precisão foi verificada em ensaio intra-dia (precisão)

e inter-dia (precisão intermediaria) em que as medidas são realizadas em três dias

diferentes (Tabela 9).

Tabela 9: Valores de precisão para bixina e metformina.

Analito Concentração (ng mL-1

) Intra-dia (CV%) Inter-dia (CV%)

Bixina

400 8 8

1200 4 10

2200 5 10

Metformina

25 6 8

200 2 10

500 3 8

A exatidão foi avaliada pelo teste de recuperação para verificar se os valores

obtidos foram próximos aos valores teóricos de concentração. No ensaio de exatidão

foram avaliados três níveis de concentração em cinco leituras e três dias diferentes,

sendo os resultados expressos em termos de porcentagem de recuperação (Equação

07)(Tabela 10). Podemos observar que os valores de recuperação obtidos foram

próximos de 100% de acordo com o guia de validação da FDA, visto que a faixa

aceitável é entre 80 e 120% [127].

63

Tabela 10: Valores de recuperação da exatidão para bixina e metformina.

Analito Concentração (ng mL-1

) Recuperação (%)

Bixina

300 103

1000 100

2000 105

Metformina

10 115

150 101

450 89

64

5. Conclusões

Um novo método para determinação de bixina por extração líquido-líquido com

análise por UHPLC-DAD e metformina por precipitação proteica com análise por

UHPLC-MS/MS foi desenvolvido e validado.

Foram avaliadas cinco colunas cromatográficas diferentes. A que obteve melhor

resultado para a metformina foi à coluna de fase reversa a base de sílica C18, HSS C18

SB, entretanto devido a sua falta de capeamento, acredita-se que a retenção nessa coluna

deveu-se exclusivamente por interações com os silanóis livres. A coluna de fase reversa

a base de sílica fenil apresentou um resultado intermediário também provavelmente as

interações com silanóis livres visto que o grupo ligado à sílica é menos volumoso

comparativamente aos grupos C18, facilitando o acesso aos grupos silanóis.

Devidos às grandes diferenças físico-químicas entre a bixina e metformina, neste

trabalho não foi possível desenvolver um método único para determinação destes

compostos em plasma de rato. Por isso a SPE e ELL foram avaliadas para extração de

bixina e precipitação proteica para extração de metformina.

No desenvolvimento do método para extração de bixina por ELL foram

avaliadas à presença de sal no plasma, a diluição do plasma, o tempo de agitação, e o

número de agitação. Os fatores presença de sal e diluição do plasma não demonstraram

auxiliar de forma expressiva à extração de bixina nas faixas avaliadas.

No desenvolvimento do método para extração de metformina foi possível

verificar que o ácido tricloroacético foi o que obteve melhor extração de metformina.

Na avaliação da concentração, a menor concentração de àcido tricloroacético

demonstrou ser melhor em termos de dispersão do pico cromatográfico.

Os métodos de ELL e precipitação proteica demonstraram ser adequados de

acordo com os parâmetros de linearidade, precisão e exatidão previsto pelo guia de

validação do FDA.

65

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universidade federal de minas gerais instituto de ciências ...€¦ · figura 15: cromatogramas...

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