Terapia genética no controlo daTerapia genética no controlo dador crónicador crónica

Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Orientadoras Dra. Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares

Francisca Santos

Nilza Pinto

Maio 2005 Porto

«An unpleasant sensory and «An unpleasant sensory and emotional experience which we emotional experience which we primarily associate with tissue primarily associate with tissue damage or describe in terms of tissue damage or describe in terms of tissue damage, or both»damage, or both» (IASP)(IASP)

Sistema endógeno de controlo da dorSistema endógeno de controlo da dor

Um dos tratamentos mais utilizados no Um dos tratamentos mais utilizados no alívio da dor crónica são alívio da dor crónica são opiáceosopiáceos

como a morfina e compostos similares.como a morfina e compostos similares.

• efeitos efeitos colaterais colaterais • habituaçãohabituação

Terapia genéticaTerapia genética

tratamento tratamento alternativoalternativo

Tecnologia cujo objectivo é Tecnologia cujo objectivo é corrigir a corrigir a expressão de genes alvoexpressão de genes alvo implicados no implicados no desenvolvimento de doenças:desenvolvimento de doenças:

- Sobre-expressar esse gene alvo- Sobre-expressar esse gene alvo

- Ou diminuir a sua expressão- Ou diminuir a sua expressão

Através do uso de vectores que transportam Através do uso de vectores que transportam o gene terapêutico até às células-alvo.o gene terapêutico até às células-alvo.

Tipos de vectores: víricos e não víricos

Os mais utilizados são os víricos

Os vectores víricos são derivados de vírus por substituição da componente patogénica

por genes terapêuticos.

Penetram naturalmente nas células

Terapia genética da dorTerapia genética da dor

Fink et al., apresentado ao NIH

Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal

Pohl et al., 2003Pohl et al., 2003

Fink et al., apresentado ao NIH

Terapia genética da dorTerapia genética da dor

Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal

Outros alvos:Outros alvos:

Regiões do encéfalo que controlam a Regiões do encéfalo que controlam a transmissão da dor na medula a partir transmissão da dor na medula a partir de determinadas estruturas do bolbo de determinadas estruturas do bolbo

raquidianoraquidiano

VLM

Bolbo Bolbo raquidiano raquidiano

ventrolateral ventrolateral antinociceptiantinocicepti

vovo

Injecção do HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1)

VLM

activar os neurónios

antinociceptivos do VLM

ICP4 ICP4

hCMV-P PAlacZ

TK UL US

• Delecção do gene ICP4

• Inserção da cassete (promotor de citomegalovírus e transgene) no gene da timidine kinase

• Transgene lacZ: beta galactosidase detectada por imunocitoquímica

Construção do vector

Não replicati

vo

-- Os estudos de marcação retrógrada com Os estudos de marcação retrógrada com traçadores neuroanatómicos mostraram que os traçadores neuroanatómicos mostraram que os corpos celulares dos neurónios aferentes ao VLM corpos celulares dos neurónios aferentes ao VLM ocorriam no encéfalo e na medula espinhalocorriam no encéfalo e na medula espinhal

Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que exprimiam a beta-galactosidase em celulares que exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na medula espinhalcorpos celulares na medula espinhal

Com base em estudos prévios:

SELECTIVIDADE DE MIGRAÇÃO?

- - O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra retrogradamente do terminal axonal até ao retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celularcorpo celular

Objectivo doObjectivo do trabalhotrabalho

Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migraçãomigração

Tentou-se encontrar o genoma vírico na Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula espinhal por PCRmedula espinhal por PCR

MetodologiaMetodologia

• Injecção estereotáxica do vector no VLM Injecção estereotáxica do vector no VLM

• Sacrifício por decapitação (10 dias após Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção)injecção)• Dissecção:Dissecção: 1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica)1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica) 2) Medulas (DNA)2) Medulas (DNA)

Medulas:Medulas: Bolbos:Bolbos:

Extracção de DNA Cortes de Extracção de DNA Cortes de congelaçãocongelação

PCR ImunocitoquímicaPCR Imunocitoquímica ElectroforeseElectroforese

Injecção estereotáxica do vectorInjecção estereotáxica do vector

- Com a suspensão vírica n=4

- Com soro fisiológico n=1

Dissecção do bolbo e medulaDissecção do bolbo e medula

Decapitação 10 dias após injecçãoDecapitação 10 dias após injecção

DissecçãoDissecção Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºCRato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC Restantes:Restantes:

– bolbo fixador (paraformaldeído 4% - 4h-bolbo fixador (paraformaldeído 4% - 4h-sacarose 30%)sacarose 30%)

– medula espinhal (alargamentos cervical e medula espinhal (alargamentos cervical e torácico) congeladas a -80ºCtorácico) congeladas a -80ºC

Reacção imunocitoquímica de Reacção imunocitoquímica de detecção da beta-galactosidasedetecção da beta-galactosidase

• MetodologiaMetodologia

– A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos bolbos fixados bolbos fixados

– B) Reacção imunocitoquímicaB) Reacção imunocitoquímica

• Objectivo: Objectivo: verificar local de injecçãoverificar local de injecção

Beta-galactosidase

Anticorpo secundário

Anticorpo primário

Extracção de DNAExtracção de DNA

• ObjectivoObjectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCRPCR

• MaterialMaterial

• Bolbos dos C+ e C- Bolbos dos C+ e C- • Medulas dos animais com injecção no VLMMedulas dos animais com injecção no VLM

• MetodologiaMetodologia

--Digestão com proteinase KDigestão com proteinase K

- Precipitação das proteínas- Precipitação das proteínas- Precipitação do DNA com isopropanol- Precipitação do DNA com isopropanol- Ressuspensão do DNA em 20- Ressuspensão do DNA em 20µlµl de água bi-destilada de água bi-destilada- Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a - Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a

260nm 260nm

PCRPCR

• Princípio da técnica : Princípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : “primers”cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : “primers”

• Vários protocolosVários protocolos– Primers para amplificar o transgene Primers para amplificar o transgene laclacZ da construção Z da construção

víricavírica• 95ºC- 45 sec95ºC- 45 sec• 60ºC- 30 sec60ºC- 30 sec• 72ºC -45 sec72ºC -45 sec• 30 ciclos30 ciclos

– Primers para amplificar o gene da Primers para amplificar o gene da timidina kinasetimidina kinase do do HSV-1HSV-1

• Optimizar o protocoloOptimizar o protocolo

ElectroforeseElectroforese

• Gel de agarose a 2% Gel de agarose a 2%

• Visualização das bandas de DNA depois à adição de Visualização das bandas de DNA depois à adição de brometo de etídiobrometo de etídio

ResultadosResultados

- Reacção imunocitoquímica : local de injecção

Os ratos cujo local de injecção estava no VLM foram utilizados para amplificação do DNA vírico na medula

ICP4 TK

UL US

hCMV-P PAlacZ

ICP4

L R

Amplificação do gene lacZ no alargamento torácico da medula espinhal

Bra

nco

Con

trol

o-

Con

trol

o+

Rat

o1

Rat

o2

Rat

o3

200pb

Amplificação do gene da TK nos segmentos torácicos da medula espinhal

hCMV-P PAlacZ

TK TK

L R

300pb

A

Optimização do protocolo

DNA do controlo+

1) Temperatura de annealing a 60 e 62ºC

2) Concentração de MgCl2 (cofactor da Taq Polimerase) a A:2,5mM e B:4mM

3) Betaina optimiza condições de PCR estabilizando o DNA

4) Condições escolhidas Temperatura de annealing 60ºC -2,5mM de MgCl2

95ºC-45sec

60ºC-30sec 72ºC-45sec 30 ciclos

B BA

60ºC 62ºC

300pb

Bra

nco

Con

trol

o-

Con

trol

o+

Rat

o1

Rat

o2

Rat

o3

300pb

Amplificação do gene da TK nos segmentos cervicais e torácicos da medula espinhal

Alargamento cervical

Alargamento torácico

• Mesma quantidade de DNA total por amostra:5000ng/microg

•Diferenças de quantidade de DNA vírico no alargamento cervical e torácico

Perspectivas futuras:

1- Questão técnica: quantificação de DNA por real time PCR ou DNA standard

2- Alargar o estudo a áreas encefálicas para aprofundar a selectividade da expressão beta-galactosidase

3- Esclarecer os mecanismos que impedem a detecção da beta-galactosidase

BibliografiaBibliografia

• Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of cronic pain. gene transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Experimental NeurologyNeurology. 2003 Jun; 184(2003)S25-S29. 2003 Jun; 184(2003)S25-S29

• Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain. Pain. Current Gene Therapy. Current Gene Therapy. 2003 Mar; 3(3):223-382003 Mar; 3(3):223-38

• Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalin-enconding herpes virus. preproenkephalin-enconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.Sci. USA. 1999 Mar; 96(1999) 1999 Mar; 96(1999)

• Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management. Management. Current Review of PainCurrent Review of Pain. 2000; 4:445-450. 2000; 4:445-450

• Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da DorBiblioteca da Dor. . Permanyer Portugal Permanyer Portugal

• http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genetherapy.shtmlmedicine/genetherapy.shtml

• http://www.dor.med.br/cronica2.htmlhttp://www.dor.med.br/cronica2.html• http://http://www.pain-workshop.comwww.pain-workshop.com//painpain/pain1//pain1/contentcontent//htmlhtml//ptpt

/pain1_1.html/pain1_1.html

AgradecimentosAgradecimentos

• Dr.ª Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares pela orientação facultada ao longo da realização do nosso trabalho;

• Laboratório de Biologia Celular e Molecular e Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado;

• Dr.ª Sandra Rebelo pela amizade;

• E, ainda, a todos os nossos amigos!