summary imun2013@ (01)

0

IMMUNOLOGY TESTS

PPDS PATOLOGI KLINIK FK-UNHAS

EDISI I

FEBRUARI 2013

Mohon koreksi jika ada kesalahan

Discussion Summary

1

1. HBsAg (SD)

Metode : ICT nonkompetitif

Prinsip :

Bila dalam serum pasien terdapat Ag (), Ag () akan bergerak menuju garis konjugat dan

berikatan dengan anti HBs monoklonal dari tikus berlabel coloidal gold membentuk kompleks

ikatan antigen&antibodi ( ). Kompleks ini akan menuju ke garis tes dan akan berikatan

dengan anti HBs monoklonal dari tikus membentuk ikatan ( ), memberi warna pada garis

tes. Sisa anti HBs monoklonal dari tikus berlabel coloidal gold yang tidak berikatan dibantalan

konjugat akan menuju ke garis kontrol dan berikatan dengan antibodi poliklonal membentuk

kompleks ikatan antibodi&antibodi ( ) dan memberi warna pada garis kontrol.

Antibodi monoklonal adalah antibodi monospesifik yang dapat mengikat satu epitop saja.

Antibodi monoklonal ini dapat dihasilkan dengan teknik hibridoma. Sel hibridoma merupakan

fusi sel dan sel

Antibodi poliklonal adalah antibodi yang mengenali suatu antigen melalui ikatan

dengan epitop yang bervariasi karena berasal dari sel B yang berbeda-beda.

Cara Kerja :

100 l serum diteteskan ke sumur sampel baca 20 – 30 menit (merupakan masa inkubasi

untuk mengoptimalkan ikatan antigen & antibodi)

jika tidak sesuai dengan waktu baca, maka hasil invalid. Pemeriksaan dilakukan pada suhu

ruangan 15-30C (untuk mengoptimalkan waktu inkubasi)

Hasil :

T C T C T C T C Positif negatif invalid invalid

Interpretasi : bila timbul warna pada garis tes dan garis kontrol reaktif dan valid Sensitifitas/spesifisitas = 100%/100%

Sumur Garis Garis Garis

Konjugat Tes Kontrol

YY

YY

YY

YY

YY

YY

Keterangan….

(bahan yang ada dalam)

Garis Konjugat = anti HBs monoklonal dari tikus

berlabel coloidal gold

Garis Tes = antiHBs monoklonal dari tikus

Garis kontrol = antibodi poliklonal

Y

Y

Y

Y

Y

IMUNOKROMATOGRAFI

2

2. Anti HCV (SD)


Prinsip :

Bila dalam serum ada Ab ( ), akan berikatan dengan Ag di bantalan konyugat , ikatan ini

akan bergerak ke garis tes dan berikatan dengan Ag . Sisa dari ikatan Ag-Ab yang tidak

terikat dengan Ag pada garis tes akan berikatan dengan Ab poliklonal di garis kontrol

Cara Kerja :

Sampel Plasma, WB dengan antikoagulan Heparin, EDTA, atau Na sitrat, serum 10 l serum

diteteskan ke sumur sampel + 4 tetes buffer baca 5 – 20 menit (merupakan masa inkubasi

untuk mengoptimalkan ikatan antigen & antibodi, tergantung dari produsen). Jika tidak sesuai

dengan waktu baca, maka hasil invalid. Pemeriksaan dilakukan pada suhu ruangan 15-30C

(untuk mengoptimalkan waktu inkubasi)

Hasil :


Interpretasi : bila timbul warna pada garis tes dan garis kontrol reaktif dan valid, berarti sedang terinfeksi atau pernah terinfeksi sebelumnya

Sensitifitas/spesifisitas = 100%/99,4%

Keterangan….


Garis Konjugat = protein A berlabel colloidal gold

(Ag)

Garis Tes = Ag rekombinan protein (inti HCV,

NS3, NS4, NS5)


3

3. Anti HIV (SD)


Prinsip :

1. gp120 : surface glikoprotein

2. gp41

3. gp36

4. p17 : matriks protein

5. p24 : capsid protein

Bila dalam serum ada Ab HIV-1( ), akan berikatan dengan Ag gp41 atau p24 di bantalan

konyugat , ikatan ini akan bergerak ke garis tes 1 atau 2 dan berikatan dengan Ag HIV-1

( ) atau antigen HIV-2 ( . Sisa dari ikatan Ag di bantalan konyugat akan berikatan dengan

Ab poliklonal di garis kontrol Y

Cara Kerja :

Sampel: Plasma,WB, serum

10 l serum/plasma atau 20 µl WB + 4 tetes buffer baca 5 – 20 menit (merupakan masa

inkubasi untuk mengoptimalkan ikatan antigen & antibodi, tergantung dari produsen)

jika tidak sesuai dengan waktu baca, maka hasil invalid. Pemeriksaan dilakukan pada suhu

ruangan 15-30C (untuk mengoptimalkan waktu inkubasi)

Hasil :

1 2 C 1 2 C 1 2 C 1 2 C Positif positif positif negatif

Interpretasi : sesuai dengan strategi HIV (WHO) Sensitifitas/spesifisitas = 100%/99,8%

Keterangan….


Garis Konjugat =Ag rekombinan HIV ( gp 41, gp 36, p24)

Garis Tes = Ag HIV-1 (gp 41, p 24)

Ag HIV-2 (gp 36)


: transmembran glikoprotein


Konjugat 1 2 Kontrol

YY

Y

YY

Y

Y

4

Anti HIV (advanced) Metode : ICT nonkompetitif

Prinsip :


2. gp41

3. gp36







Cara Kerja :

Sampel: Plasma,WB, serum

30 l serum/plasma + 1 tetes buffer baca 15 – 20 menit

Hasil :


Interpretasi : sesuai dengan strategi HIV (WHO) Sensitifitas/spesifisitas = 100%/100%

Keterangan….




Ag HIV-2 (gp 36)




YY

Y

YY

Y


Y

5

Anti HIV (oncoprobe) Metode : ICT nonkompetitif

Prinsip :


2. gp41

3. gp36







Cara Kerja : Sampel Plasma,WB,

serum 1 tetes serum/plasma (25 µl) + 1 tetes buffer baca 5-20 menit

2 tetes WB (50µl) + 2 tetes buffer baca 5 – 30 menit

Hasil :


Interpretasi : sesuai dengan strategi HIV (WHO)

Sensitifitas / spesifisitas : 100%/100%

Keterangan….




Ag HIV-2 (gp 36)




YY

Y

YY

Y


Y

8

4. Dengue (Panbio) Metode : ICT nonkompetitif

Prinsip :

Bila dalam serum pasien terdapat Ab ( ) akan bergerak menuju garis konjugat dan berikatan

dengan Ag dengue 1-4 rekombinan berlabel coloidal gold membentuk kompleks ikatan

antigen&antibodi . Kompleks ini akan menuju ke garis tes dan akan berikatan dengan anti

human IgG Ab ( ) atau anti human IgM Ab ( ) , memberi warna pada garis tes. Sisa

ikatan Ag-Ab yang tidak berikatan dibantalan konjugat akan menuju ke garis kontrol dan

berikatan dengan antibodi poliklonal membentuk kompleks ikatan antibodi&antibodi dan

memberi warna pada garis kontrol.

Cara Kerja :

10 l serum/plasma/WB + 2 tetes buffer baca 15 menit

Hasil :

IgG IgM C IgG IgM C IgG IgM C IgG IgM C Positif positif positif negatif

Interpretasi : IgM (+) & IgG (-) infeksi primer virus dengue IgM (+) & IgG (+)infeksi sekunder virus dengue IgM (-) & IgG (+)infeksi sekunder virus dengue

Infeksi primer: Akut 0 - 5 hari Konvalesence >5 hari Infeksi sekunder: Akut Konvalesence Sensitifitas/spesifisitas = Infeksi primer 95,3% Infeksi sekunder 100% Infeksi primer/sekunder 95,1%

Keterangan….


Garis Konjugat = Ag dengue 1-4 rekombinan


Garis Tes = IgG anti human IgG Ab

IgM anti human IgM Ab



Konjugat IgG IgM Kontrol

YY

Y

YY

Y

YY

YY

YY

YY

Y

9

5. Narkoba (ABONmultidrug) Metode : ICT kompetitif Prinsip :

Bila dalam urin pasien terdapat Ag (),Ag () akan berkompetisi dengan Ag berlabel colloidal

gold di bantalan konyugat untuk berikatan dengan Ab spesifik. Jika Ag () pada urin berikatan

dengan salah satu Ab spesifik obat pada garis tes ( / / ) tidak akan menimbulkan

warna, sedangkan jika yang berikatan adalah Ag berlabel colloidal gold dengan salah satu Ab

spesifik obat pada garis tes ( ex: ), akan menimbulkan warna. Selanjutnya sisa Ag berlabel

colloidal gold akan bergerak menuju garis kontrol berikatan dengan Ab poliklonal

( ) membentuk warna pada garis kontrol.

Pada ICT yang kompetitif, yang mau dideteksi sama dengan yang ditanam pada bantalan

konyugat.

Cara kerja:

Sampel: urin sewaktu

3 tetes urin (max.100 µl) diteteskan ke sumur sampel dibaca dalam 5-10 menit

Hasil :

T C T C T C T C Negatif Positif invalid invalid

Hasil samar Negatif Interpretasi bila tidak timbul warna pada masing2 garis tes positif pada masing2 obat Sensitifitas/spesifisitas = 100%/100%

Keterangan….


Garis Konjugat = protein obat berlabel colloidal gold

Garis Tes = Ab spesifik THC, Ab spesifik

Cocaine, Ab spesifik amfetamin



Konjugat IgG IgM Kontrol

Y

YY

Y

YY

YY

YY

YY

YY

YY

Y Y Y

Y

Y

10

6. Urin HCG Metode : ICT nonkompetitif

Prinsip :

Bila dalam urine pasien terdapat HCG / Ag (),Ag () akan bergerak menuju garis konjugat dan

berikatan dengan anti HCG monoklonal berlabel coloidal gold membentuk kompleks ikatan

antigen&antibodi ( ). Kompleks ini akan menuju ke garis tes dan akan berikatan dengan anti

HCG monoklonal dari rabit membentuk ikatan ( ), memberi warna pada garis tes. Sisa anti

HCG monoklonal berlabel coloidal gold yang tidak berikatan dibantalan konjugat akan menuju

ke garis kontrol dan berikatan dengan antibodi poliklonal goat membentuk kompleks ikatan

antibodi&antibodi ( ) dan memberi warna pada garis kontrol.

Cara Kerja :

3 tetes urin serum diteteskan ke sumur sampel baca 3 – 10 menit

Pemeriksaan dilakukan pada suhu ruangan 15-30C (untuk mengoptimalkan waktu inkubas)

Hasil :


Interpretasi : positif ada hormon HCG

Sensitifitas/spesifisitas = 100%/100%


Konjugat Tes Kontrol

YY

YY

YY

YY

YY

YY

Keterangan….


Garis Konjugat = antibodi HCG


Garis Tes = antibodi HCG monoklonal rabit

Garis kontrol = antibodi poliklonal goat

Y

Y

Y

Y

Y

11

A. ASTO (Anti Streptolisin O)

Streptolysin O adalah suatu toksin yang terdiri protein dengan berat molekul 60.000 dalton, aktif dalam suasana aerob yaitu melisiskan sel darah merah juga neutrofil, platelet dan organella subsel. Streptolysin O bersifat meracuni jantung. Streptokokus grup A (Streptokokus beta hemolitik) dapat menghasilkan berbagai produk ekstraseluler yang mampu merangsang pembentukan antibodi.Antibodi itu tidak merusak kuman dan tidak mempunyai dampak perlindungan, tetapi adanya antibody itu dalam serum menunjukkan bahwa didalam tubuh baru saja terdapat streptokokus yang aktif. Antibody yang dibentuk adalah Antistreptolysin O (ASTO), Antihialuronidase (AH), Antistreptokinase (anti SK), antideoksiribonuklease B (AND B), dan anti nikotinamid adenine dinukleotidase (anti-NADase). Tes ASTO paling banyak digunakan, hasil tes ini positif pada 80% faringitis streptokokus, pada glomerulonefritis, demam rematik, endokarditis bacterial, dan scarlet fever. Banyak anak usia sekolah memiliki kadar titer ASTO yang lebih tinggi daripada anak usia pra sekolah dan dewasa. Penetapan ASTO umumnya hanya memberi petunjuk bahwa telah terjadi infeksi oleh streptokokus. Yang lebih penting diperhatikan adanya kenaikan titer. Meskipun semula titer rendah tetapi bila terjadi peningkatan dan tetap tinggi pada pemeriksaan berikutnya, adanya infeksi oleh streptokokus. METODE : aglutinasi lateks PRINSIP :

Jika pada sampel ditemukan Ab ASTO dengan penambahan reagen lateks yang mengandung Ag streptolisin, maka Ab ASTO akan berikatan dengan antigen streptolisin yang menyelubungi partikel lateks. Gabungan ikatan kompleks Ag-Ab ini akan nampak sebagai aglutinasi. Lateks berguna untuk membantu melihat ada aglutinasi yang mikropartikuler.

ALAT & BAHAN A L A T B A H A N 1. Aplikator 1. Serum 2. Pipet (20µl, 100µl) 2. Reagen latex 3. Tes slide, plastik slide 3. Kontrol positif 4. Rotator mekanik 4. Kontrol negatif 5. Tabung reaksi 5. Larutan NaCl 0,9% CARA KERJA (Sampel: serum tidak hemolisis, lipemik, terkontaminasi) 1. Cara kualitatif (aglutinasi)

a. Reagen dan sampel disimpan pada suhu ruangan b. Teteskan 40µl serum di atas slide tes c. Kocok reagen latex dan tambahkan satu tetes di atas serum tadi d. Aduk dengan aplikator e. Homogenkan larutan dengan menggoyang slide tes dengan hati-hati f. Observasi adanya aglutinasi dalam waktu 3 menit

AGLUTINASI

12

campur Homogenkan selama 3 menit

2. Metode semikuantitatif a. Siapkan tabung reaksi 5 buah b. Masukkan kedalam masing-masing tabung reaksi 100µl NaCl c. Tambahkan pada tabung I 100 µl sampel lalu aduk (pengenceran ½) d. Pindahkan dari tabung I ke tabung II 100µl (pengenceran ¼) e. Buat pengenceran sampai 1/32 f. Kemudian masing-masing ditambahkan reagen latex sebanyak 1 tetes, observasi pada

tabung yang ke berapa aglutinasi berakhir

HASIL 1. Kualitatif ada aglutinasi : (+)

tidak ada aglutinasi : (-) 2. Semikuantitatif Kadar ASTO = Tabung terakhir yang ada aglutinasi x 200 IU/ml

INTERPRETASI ada aglutinasi >200 IU/ml

tidak ada aglutinasi <200 IU/ml POSITIF : infeksi akut streptococcus False positive : RA, scarlet fever, tonsilitis SENSITIFITAS/SPESIFISITAS : 98%/97%

Tabung I II III IV V

Pengenceran ½ ¼ 1/8 1/16 1/32

Sampel 100 µl - - - -

NaCl 0,9% 100 µl 100 µl` 100 µl 100 µl 100 µl

Pindahkan sampel 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Lihat ada tidaknya

aglutinasi

Saline 100 µl

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

1/2 1/8 1/16 1/32 1/4

Saline 100 µl Saline 100 µl Saline 100 µl Saline 100 µl

Sampel

100 µl Buang

100 µl

13

B. CRP (C-Reactive Protein) Protein C-reactif (C-reactive protein, CRP) dibuat di hati dan dikeluarkan ke dalam aliran darah. CRP beredar dalam darah selama 6-10 jam setelah proses inflamasi akut dan destruksi jaringan. Kadarnya memuncak dalam 48-72 jam. Seperti halnya uji laju endap darah (erithrocyte sedimentation rate, ESR), CRP merupakan uji non-spesifik tetapi keberadaan CRP mendahului peningkatan LED selama inflamasi dan nekrosis lalu segera kembali ke kadar normalnya. CRP merupakan salah satu dari beberapa protein yang sering disebut sebagai protein fase akut dan digunakan untuk memantau perubahan-perubahan dalam fase inflamasi akut yang dihubungkan dengan banyak penyakit infeksi dan penyakit autoimun. Beberapa keadaan dimana CRP dapat dijumpai meningkat adalah radang sendi (rheumatoid arthritis), demam rematik, kanker payudara, radang usus, penyakit radang panggung (pelvic inflammatory disease, PID), penyakit Hodgkin, SLE, infeksi bakterial. CRP juga meningkat pada kehamilan trimester akhir, pemakaian alat kontrasepsi intrauterus dan pengaruh obat kontrasepsi oral.

Tes CRP seringkali dilakukan berulang-ulang untuk mengevaluasi dan menentukan apakah pengobatan yang dilakukan efektif. CRP juga digunakan untuk memantau penyembuhan luka dan untuk memantau pasien paska bedah, transplantasi organ, atau luka bakar sebagai sistem deteksi dini untuk kemungkinan infeksi.

METODE : aglutinasi lateks PRINSIP :

Bila dalam serum pasien mengandung Ag CRP, maka akan berikatan dengan Ab CRP yang menyelubungi partikel lateks. Gabungan ikatan kompleks Ag-Ab akan nampak sebagai aglutinasi.

ALAT & BAHAN

1. Pengaduk 4. Kontrol positif 2. Plat/slide 5. Kontrol negatif 3. Reagen latex CRP

CARA KERJA (Sampel: serum tidak hemolisis, lipemik, terkontaminasi)

1. Cara kualitatif (aglutinasi) a. Reagen dan sampel disimpan pada suhu ruangan b. Teteskan 40µl serum di atas slide tes c. Kocok reagen latex dan tambahkan satu tetes di atas serum tadi d. Aduk dengan aplikator e. Homogenkan larutan dengan menggoyang slide tes dengan hati-hati f. Observasi adanya aglutinasi dalam waktu 3 menit

14


2. Metode semikuantitatif a. Siapkan tabung reaksi 5 buah b. Masukkan kedalam masing-masing tabung reaksi 100µl NaCl c. Tambahkan pada tabung I 100 µl sampel lalu aduk (pengenceran ½) d. Pindahkan dari tabung I ke tabung II 100µl (pengenceran ¼) e. Buat pengenceran sampai 1/32 f. Kemudian masing-masing ditambahkan reagen latex sebanyak 1 tetes, observasi

pada tabung yang ke berapa aglutinasi berakhir.

Dilution ½ ¼ 1/8 1/16 1/32

Sampel serum 100 µl - - - -

NaCl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Volume sample 50 µl 50µl 50µl 50µl 50µl

6 x N of dilution 6x2 6x4 6x8 6x16 6x32

Mg/I.U/ml 12 24 48 96 192

HASIL 1. Kualitatif ada aglutinasi : (+) tidak ada aglutinasi : (-) 2. Semikuantitatif Kadar CRP = Tabung terakhir yang ada aglutinasi x 6 mg/l

INTERPRETASI ada aglutinasi >6 mg/l tidak ada aglutinasi <6 mg/l

POSITIF : pada penyakit inflamasi SENSITIFITAS/SPESIFISITAS : 95%/96%

Lihat ada tidaknya

aglutinasi

Saline 100 µl

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

1/2 1/8 1/16 1/32 1/4


Sampel

100 µl Buang

100 µl

15

C. RF (Rheumatoid Factor) Faktor reumatoid (rheumatoid factor, RF) adalah immunoglobulin yang bereaksi dengan molekul IgG. Karena penderita juga mengandung IgG dalam serum, maka RF termasuk autoantibodi. Faktor penyebab timbulnya RF ini belum diketahui pasti, walaupun aktivasi komplemen akibat adanya interaksi RF dengan IgG memegang peranan yang penting pada rematik artritis (rheumatoid arthritis, RA) dan penyakit-penyakit lain dengan RF positif. Sebagian besar RF adalah IgM, tetapi dapat juga berupa IgG atau IgA. RF positif ditemukan pada 80% penderita rematik artritis. Kadar RF yang sangat tinggi menandakan prognosis yang buruk dengan kelainan sendi yang berat dan kemungkinan komplikasi sistemik. RF sering dijumpai pada penyakit autoimun lain, seperti LE, scleroderma, dermatomiositis, tetapi kadarnya biasanya lebih rendah dibanding kadar RF pada rematik arthritis. Kadar RF yang rendah juga dijumpai pada penyakit non-imunologis dan orang tua (di atas 65 tahun). Uji RF tidak digunakan untuk pemantauan pengobatan karena hasil tes sering dijumpai tetap positif, walaupun telah terjadi pemulihan klinis. Selain itu, diperlukan waktu sekitar 6 bulan untuk peningkatan titer yang signifikan. METODE : aglutinasi lateks PRINSIP :

Bila dalam serum pasien mengandung Ab RF, maka Ab akan berikatan dengan Ag (Human γ-globulin) yang menyelubungi partikel lateks. Gabungan ikatan kompleks Ag-Ab akan nampak sebagai aglutinasi

ALAT & BAHAN A L A T B A H A N 1. Aplikator 1. Serum 2. Pipet (20µl, 100µl) 2. Reagen latex 3. Tes slide, plastik slide 3. Kontrol positif 4. Rotator mekanik 4. Kontrol negatif 5. Tabung reaksi 5. Larutan NaCl 0,9% CARA KERJA (Sampel: serum tidak hemolisis, lipemik, terkontaminasi) 1. Cara kualitatif (aglutinasi)

a. Reagen dan sampel disimpan pada suhu ruangan b. Teteskan 40µl serum di atas slide tes c. Kocok reagen latex dan tambahkan satu tetes di atas serum tadi d. Aduk dengan aplikator e. Homogenkan larutan dengan menggoyang slide tes dengan hati-hati f. Observasi adanya aglutinasi dalam waktu 3 menit

http://www.masriswanto.com/2009/09/penyakit-rematik.html

http://www.masriswanto.com/2009/09/penyakit-rematik.html

16


3. Metode semikuantitatif a. Siapkan tabung reaksi 5 buah b. Masukkan kedalam masing-masing tabung reaksi 100µl NaCl c. Tambahkan pada tabung I 100 µl sampel lalu aduk (pengenceran ½) d. Pindahkan dari tabung I ke tabung II 100µl (pengenceran ¼) e. Buat pengenceran sampai 1/32 f. Kemudian masing-masing ditambahkan reagen latex sebanyak 1 tetes, observasi

pada tabung yang ke berapa aglutinasi berakhir.

Tabung I II III IV V

Pengenceran 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

Sampel 100 µl - - - -

NaCl 0,9% 100 µl 100 µl` 100 µl 100 µl 100 µl

Pindahkan sampel 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

HASIL 1. Kualitatif ada aglutinasi : (+)

tidak ada aglutinasi : (-) 2. Semikuantitatif Kadar RF = Tabung terakhir yang ada aglutinasi x 8 IU/ml

INTERPRETASI ada aglutinasi 8 IU/ml tidak ada aglutinasi <8 IU/ml

POSITIF : pada RA SENSITIFITAS/SPESIFISITAS : 100%/98,9%

Lihat ada tidaknya

aglutinasi

Saline 100 µl

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

1/2 1/8 1/16 1/32 1/4


Sampel

100 µl Buang

100 µl

17

D. TES WIDAL Salmonella typhi dan Salmonella paratyphi A, B dan C menyebabkan demam enterik pada manusia. Sebagai respon terhadap stimulus antigen Salmonella (O dan H), tubuh memproduksi antibodi terhadap antigen O dan H. Titer antibodi-antibodi ini meningkat pelan-pelan dalam fase awal/dini penyakit, mencapai maksimumnya, kemudian pelan-pelan menurun sampai tidak lagi terdeteksi. Pada pasien typhoid, antibodi terhadap Salmonella dapat dideteksi dalam serum pada minggu kedua setelah infeksi. Tes Widal dapat dilakukan dengan metode slide atau metode tabung. Metode slide merupakan cara yang cepat tetapi kurang tepat untuk menunjukkan titer antibodi. Maka untuk menentukan titer antibodi dianjurkan melakukan metode tabung karena lebih teliti menunjukkan besaran titer. METODE : Aglutinasi PRINSIP :

Reaksi aglutinasi yang timbul bila terjadi ikatan antara antibodi yg terdapat dalam serum penderita dengan antigen S.Typhii pada reagen. Antigen yang digunakan pada tes widal ini berasal dari suspense salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum.

ALAT & BAHAN :

Kit Plasmatec berisi:

Suspensi antigen Salmonela Typhi H

Suspensi antigen Salmonella H paratyphi A Suspensi antigen Salmonella H paratyphi B Suspensi antigen Salmonella H paratyphi C

Suspensi antigen Salmonella Typhi O Suspensi antigen Salmonella O paratyphi A Suspensi antigen Salmonella O paratyphi B Suspensi antigen Salmonella O paratyphi C

Lempeng pereaksi (tile / slide)

Tabung reaksi & Rak tabung

Pipet 0,08 ml; 0,04 ml; 0,02 ml; 0,01 ml; 0,005 ml 1,0 ml dan 1,9 ml

Larutan NaCl fisiologis (0.85 %)

Sentrifus Inkubator

CARA KERJA

Metode Slide: a. Siapkan serum yang akan dites, jika menggunakan serum-simpan, biarkan serum

beberapa saat untuk menyesuaikan suhu ruangan (18-30C).

b. Siapkan lempeng-reaksi, buatkan lima buah lingkaran dengan 3 cm. Pipetkan serum sesuai pola di bawah ini:

Lingkaran Serum Pengenceran

1 80 L 1/20

2 40 L 1/40

3 20 L 1/80

4 10 L 1/160

5 5 L 1/320

6 2,5 L 1/640

18

c. Kocok dengan baik isi botol suspensi antigen kemudian pipet 1 tetes pada setiap lingkaran.

d. Serum dan antigen dalam setiap lingkaran dicampur baik kemudian goyang memutar lempeng pereaksi agar campuran reaksi merata.

e. Setelah satu menit baca hasil reaksi (agglutinasi). Metode tabung a. Siapkan 8 tabung reaksi kecil, beri nomor ,,,,,, dan . b. Pipetkan NaCl 0,85% sebanyak 1.9 mL ke tabung , dan 1 ml masing-masing ke tabung

s/d c. Tambahkankan 0,1 ml serum ke tabung dan campur baik isi tabung d. Pindahkan 1,0 ml isi tabung ke tabung dan campur baik isi tabung dan seterus

nya ke tabung sampai tabung . Dari tabung , buang 1,0 ml.. Tabung hanya akan berisi NaCl 0,85% dan akan dipakai sebagai control.

e. Botol reagen dikocok baik kemudian pipetkan 1,0 ml ke setiap tabung. Campur baik isi setiap tabung.

f. Inkubasikan pada suhu 50C selama 4 jam atau pada 37C semalam. g. Baca hasil reaksi dan laporkan tabung terakhir yang masih menunjukkan agglutinasi.

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8

Pengenceran 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 kontrol

Diinkubasi selama 24 jam baca, dilihat aglutinasi padaa tabung terakhir

Interpretasi: 1/320 (+) typhoid

1/20 1/40 1/80 1/160

0

1/320 1/640 1/1280

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl NaCl

+ 2 tetes

reagen

100 µl

serum

Buang

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

100 µl NaCl

19

E. Tubex TF Tes Tubex TF adalah suatu tes diagnostik semikuantitatif yang selama 10 menit mendeteksi demam tifoid akut yang disebabkan oleh Salmonella typhi, melalui deteksi spesifik adanya antibodi IgM dalam serum penderita terhadap antigen S.typhi O9 lipopolisakarida dengan cara mengukur kemampuan serum antibodi Ig M tersebut dalam menghambat reaksi antara antigen berlabel partikel lateks magnetik dan monoklonal antibodi berlabel lateks warna, selanjutnya ikatan inhibisi tersebut diseparasikan oleh suatu daya magnetik. Tingkat inhibisi yang dihasilkan adalah setara dengan konsentrasi antibodi IgM S.typhi dalam sampel. METODE : Inhibisi Magnetic Binding (IMB) assay PRINSIP :

Terjadi reaksi antara Ag berlabel partikel lateks magnetik (reagen warna coklat) dengan monoklonal Ab berlabel lateks warna (reagen biru) ikatan reaksi tersebut diseparasikan oleh suatu daya magnetik hasil dibaca secara visual. Ag O lipopolisakarida (LPS) Ag H flagella Jika dalam serum penderita terdapat antibodi, maka akan terjadi ikatan Ag-Ab antara serum dan reagen coklat ikatan kompleks tersebut akan tertarik oleh magnet ke bawah. Pada saat ditambahkan reagen biru maka antibodi lateks warna yang ada dalam reagen biru tidak akan berikatan dengan antibodi dalam serum karena berkompetisi dengan antibodi dalam reagen coklat antibodi pada reagen biru melayang dalam larutan.

Semakin banyak Ab serum terikat pada reagen coklat, reagen biru yang terikat akan bebas dan nampak sebagai warna biru (+)

Jika tidak ada Ab dalam serum, maka reagen coklat akan terikat dengan reagen biru sehingga nampak sebagai warna coklat (-)

ALAT & BAHAN ALAT : BAHAN :

a. V – Shape Wells a. Sampel serum b. Magnetic Color Scale b. Reagen A ( Brown Reagent ) c. Sealing Tape c. Reagen B ( Blue Reagent ) d. Pipet d. Kontrol Negatif e. Stopwatch e. Kontrol Positif

20

Cara kerja : Sampel: serum Reagen coklat (Brown reagent) Ag LPS O9 S.typhii Reagen biru (Blue reagent) Ab 45 µl brown reagent + 45 µl serum inkubasi 2 menit + 90 µl blue reagent tutup homogenkan 2 menit, letakkan di skala magnetik untuk reaksi separasi

INTERPRETASI :

SKOR INTERPRETASI

< 2 3

4 – 5 > 6

NEGATIF Tidak menunjukkan infeksi Demam Tifoid aktif BORDERLINE Pengukuran tidak dapat disimpulkan. Ulangi pengujian, apabila masih meragukan, lakukan sampling ulang beberapa hari kemudian. POSITIF Menunjukkan infeksi Demam Tifoid POSITIF Indikasi kuat infeksi Demam Tifoid

INDETERMINATE Ketidak jelasan pengukuran disebabkan oleh : 1. Protokol pengujian tidak diikuti dengan baik. Ulangi pengujian. 2. Kualitas sampel kurang baik. Lakukan sampling dan pengujian

ulang.

21

Electro Cemiluminesence Immunoassay dengan prinsip menggunakan reaksi kimiawi untuk

pembangkit energi. Cemiluminesence ditimbulkan oleh reaksi kimia sederhana dan melibatkan suatu

aksi dari oksigen atau peroksida pada suatu substrat organik oksidatif. Setelah eksitasi dari substrat

luminesens, beberapa molekul memancarkan energi dalam bentuk cahaya, sedangkan beberapa

molekul yg lain melepaskan energi dalam bentuk panas. Proporsi relatif dari cahaya yang

dipancarkan (photon efficiency) merupakan ukuran yang berguna dari efisiensi reaksi.

Cobas e411 (ECLIA)

Electro Cemiluminesence Immunoassay (ECLIA)

22

Metode : Electro Cemiluminesence Immunoassay (ECLIA) nonkompetitif

Bahan : serum (antigen)

Reagen R1 (antibodi monoklonal )

Reagen R2 (antibodi monoklonal berlabel ruthenium)

M (streptavidin yang diselubungi mikropartikel)

Jenis antibodi monoklonal yg digunakan tergantung dari parameter yang akan diperiksa

Jika dalam sampel mengandung antigenantigen akan berikatan dengan R1 (Ab monoklonal

biotinylated) dan R2 (Ab monoklonal berlabel ruthenium) membentuk ikatan kompleks sandwich

setelah diinkubasi selama 9 menit pada suhu 37C tambahkan reagen M (streptavidin yg

diselubungi mikropartikel) inkubasi 9 menit streptavidin akan melekat pada ikatan kompleks

sandwich bagian ab biotinylated Selanjutnya kompleks yang terikat dengan streptavidin akan

tertarik ke medan magnet pencucian dengan procell tambahkan TPA (akan mengubah rumus

kimia ruthenium 3+ menjadi 2+) molekul akan memancarkan energi dalam bentuk cahaya yg

berpendar dan terbaca oleh alat.

jumlah pendaran cahaya yg terbaca oleh alat sebanding dengan kadar antigen dalam serum.

23

Metode : Electro Cemiluminesence Immunoassay (ECLIA) nonkompetitif

Bahan : serum (antibodi)

Reagen R1 (antigen biotinylated)

Reagen R2 (antigen berlabel ruthenium)


Jenis antigen yg digunakan tergantung dari parameter yang akan diperiksa

Jika dalam sampel mengandung antibodi (IgG/IgM) antibodi (IgG/IgM) akan berikatan dengan R1

(antigen biotinylated) dan R2 (antigen berlabel ruthenium) membentuk ikatan kompleks

antigen&antibodi setelah diinkubasi selama 9 menit pada suhu 37C tambahkan reagen M

(streptavidin yg diselubungi mikropartikel) inkubasi 9 menit streptavidin akan melekat pada

ikatan kompleks antigen&antibodi bagian antigen biotinylated Selanjutnya kompleks yang terikat

dengan streptavidin akan tertarik ke medan magnet pencucian dengan procell tambahkan TPA

(akan mengubah rumus kimia ruthenium 3+ menjadi 2+) molekul akan memancarkan energi dalam

bentuk cahaya yg berpendar dan terbaca oleh alat.

jumlah pendaran cahaya yg terbaca oleh alat sebanding dengan kadar antibodi dalam serum.

24

Metode : Electro Cemiluminesence Immunoassay (ECLIA) kompetitif

Bahan : serum (antigen)

Reagen R1 (antigen biotinylated)

Reagen R2 (antibodi monoklonal berlabel ruthenium)


Jenis antibodi monoklonal dan antigen yang digunakan tergantung dari parameter yang akan

diperiksa

Jika dalam sampel mengandung antigenantigen akan berikatan dengan R2 (Ab monoklonal berlabel

ruthenium) membentuk ikatan kompleks antigen&antibodi setelah diinkubasi selama 9 menit pada

suhu 37C, namun ada beberapa antibodi dalam R2 yang tidak terikat dengan antigen dalam serum

antibodi yang tidak terikat tersebut akan berikatan dengan antigen biotinylated (R1) dan streptavidin

(M) setelah inkubasi kedua selama 9 menit pada suhu 37C Selanjutnya kompleks yang terikat

dengan streptavidin akan tertarik ke medan magnet pencucian dengan procell tambahkan TPA

(akan mengubah rumus kimia ruthenium 3+ menjadi 2+) molekul akan memancarkan energi dalam

bentuk cahaya yg berpendar dan terbaca oleh alat.

jumlah pendaran cahaya yg terbaca oleh alat berbanding terbalik dengan kadar antigen dalam serum.

25

Perkembangan teknologi mutakhir telah

memungkinkan identifikasi sel dengan

menggunakan instrumen automatis yang

disebut flowcytometer dan cell sorter.

Flowcytometri memerlukan instrumentasi

yang canggih, tetapi mempunyai kelebihan

kemampuan kuantitasi yang sangat baik dan

waktu analisis yang cepat. Prinsip

flowcytometri dan cell sorting (fluorescence

activated cell sorter,FACS) adalah menggabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi

karakteristik permukaan setiap sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam suatu

suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis melalui suatu celah yang ditembus

oleh seberkas sinar laser.

APLIKASI FACS diantaranya adalah :

1. Analisis dan pemisahan subpopulasi limfosit dengan menggunakan antibodi monoklonal

terhadap antigen permukaan (CD) yang dilabel dengan zat warna flourokrom;

2. Memisahkan sel hidup dari sel mati;

3. Analisis fungsi atau aktivasi sel.

TUJUAN tes CD4 adalah mendeteksi jumlah sel CD4 dengan menggunakan metode FACS. Salah satu

kegunaannya untuk memantau status imunitas pada pasien HIV-AIDS.

SAMPEL

a. Whole blood dengan antikoagulan K3 EDTA

b. disimpan tidak lebih dari 48 jam pada temperatur ruangan (200C hingga 250C).

c. Sampel pasien normal untuk kontrol

BD FACSCountTM System

26

ALAT & BAHAN 1. Alat

a. Mesin FACSCount b. Work station c. Coring station d. Vortex

2. Bahan: a. Kit Reagen : Reagen CD4/CD8

Fixative solution 1 x 5 ml vial : 5% formaldehyda dalam PBS (berfungsi sebagai buffer untuk mempertahankan pH)

b. Kit Kontrol : 4 konsentrasi : zero, low, medium, high

zero

Low – red top ( ~50 beads / 50 L )

Medium – blue top ( ~250 beads / 50 L )

High – purple top (~1000 beads / 50 L)

a

b

e

d

c

e. Pipet 50 µ f. Tutup tabung g. Tip h. Tabung vakum K3EDTA

27

PRINSIP KERJA

Tabung reagen mengandung antibodi berlabel flourokrom.Jika ditambahkan sampel, antibodi

tersebut akan terikat dengan antigen spesifik pada permukaan limfosit dan akan berflouresensi bila

terkena sinar laser. Flouresensi yang terjadi sebanding dengan jumlah sel yang ada.

Prinsip reaksi imunologi menggunakan dua zat pewarna flourokrom pada metode FACS.

(Sumber : CD 4 Testing using the BD FACSCount System in BD FASCount Training Resouce, Module 1 BD)

Dengan sistem FACS setiap subset limfosit dibedakan satu dari yang lain berdasarkan ekspresi

antigen permukaan yang direaksikan dengan antibodi monoklonal berlabel flourokrom. Setiap sel

yang melewati berkas sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai

karakteristik sel yang bersangkutan. Alat dapat mengidentifikasi setiap jenis dan aktivitas sel dan

menghitung jumlah masing-masing dalam suatu populasi campuran. Zat flourokrom yang digunakan

adalah Phycoerythrin atau Allophycocyanin.

Prinsip flowcytometri terdiri dari fluidics system, pendeteksian optik, proses sinyal dan pemisahan

sel elektrostatik.

sel

28

Gambar 5. Prinsip deteksi sel pada metode FACS.

(Sumber: http://www.bio.davidson.edu.2001.Diakses Februari 2012) CARA KERJA

1. FACSCount Reagen dikeluarkan dari lemari es dan dibiarkan mencapai suhu ruang (60 menit).

2. Tabung reagen diberi label sesuai nomor identitas pasien, dan tabung reagen untuk kontrol L, M,

H (pasien normal).

3. Tabung reagen di vortex dengan sisi bawah tegak lurus 5 detik.

4. Tabung reagen di vortex dengan sisi atas tegak lurus 5 detik.

5. Tabung reagen dilubangi dengan Coring Station, lalu ditempatkan pada Work station.

6. Tabung sampel whole blood dibolak balik agar tercampur rata

7. Pipet 50 l whole blood ke dalam masing-masing tabung reagen untuk sampel dan kontrol.

http://www.bio.davidson.edu.2001.diakses/

29

8. Tabung ditutup dan divortex selama 5 detik.

9. Tabung reagen untuk sampel dan kontrol diletakkan kembali kemudian ditutup untuk

menghindari cahaya / ditempatkan pada ruang gelap.

10. Diinkubasi selama 60 – 120 menit pada suhu ruang.

11. Tabung dibuka kembali dan pipet 50 l larutan fiksatif ke dalam masing-masing tabung reagen

sampel dan kontrol. Ganti tip untuk masing-masing tabung.

12. Pipet 50 l FACSCount Control ke masing-masing tabung L, M, H.

13. Tutup tabung reagen dengan penutup yang baru, dan vortex selama 5 detik.

14. Siap baca pada mesin FACSCount, dimulai dengan control L, M, H, kemudian pembacaan

sampel.

15. Hasil pemeriksaan akan dibaca oleh alat dan dikeluarkan melalui print out hasil pemeriksaan

CD4 dan CD8.

NILAI RUJUKAN Jumlah Normal sel CD4, CD8 dan dalam tiap mm3 darah :

CD4 : 447 – 1750 sel/mm3 CD8 : 413 – 1260 sel/mm3

INTERPRETASI Bila jumlah CD4 < 200 sel/mm3 : AIDS. WHO immunological classification for estabilished HIV infection

HIV Asscociated Immunodeficiency CD4 values

None or not significant >500

Mild 300-499

Advanced 200-349

Severe <200 or 15%

30

FACSCount Reagen

Dilabel ( L, M, H dan Identitas Pasien

Vortex sisi bawah ( 5 detik)

Tabung reagen dilubangi dengan Coring Station Kemudian ditempatkan pada work station

Vortex sisi atas ( 5 detik)

Vortex ( 5 detik)

Tambah 50 l whole blood (sampel)

Tutup tabung dan vortex 5 detik

Tambah 50 l larutan fiksatif

Inkubasi 60 – 120 menit

Vortex 5 detik

Tambah 50 l FACSCount control

untuk tabung L, M, H

Baca pada mesin FACSCount setelah

pembacaan kontrol

Tambah 50 l whole blood (sampel

normal sebagai control)

Tutup tabung dan vortex 5 detik

Inkubasi 60 – 120 menit

Tambah 50 l larutan fiksatif

Vortex 5 detik

Baca pada mesin FACSCount mulai

control L, M, H

HASIL KELUAR MELALUI PRINT OUT

31

Metode Sandwich Enzyme Immunoassay dengan Final Fluorescent Detection (Enzyme Linked Fluorescent Assay

= ELFA) menggunakan alat otomatis Mini Vidas. Untuk mendeteksi IgM/IgG CMV yang dapat membantu

mendiagnosa adanya infeksi primer, laten dan sekunder.

Prinsip dari metode Sandwich adalah reaksi antigen antibodi pada benda padat yang dilabel enzim. Kompleks

antigen antibodi berlabel diinkubasikan dengan substrat kromogenik yang semula tidak berwarna kemudiaan

kembali berwarna karena dihidrolisis oleh enzim dalam waktu tertentu. Intensitas warna diukur dan sebanding

dengan kadar antigen yang diukur. Metode ELFA merupakan modifikasi EIA dengan menggunakan enzim

alkaline phosphatase sebagai label pada antibodi atau hapten dan substratnya dengan menggunakan methly

umbelliferyl phosphat. Substrat ini akan dipecah oleh enzim dan menghasilkan fluoresens yang dapat diukur

intensitasnya dengan fluorometer. Intensitasnya sebanding dengan kadar yang diuji.

Alat dan Bahan:

A. Alat yang digunakan: 1. Pipet disposable 100 µl 2. Sarung tangan disposable 3. Strip untuk IgM dan untuk IgG 4. Vortex 5. Mini Vidas

Enzyme Linked Fluorescent

Assay (ELFA)

32

B. Bahan yang digunakan: 1. Sampel: serum (Well 1) 2. Reagen:

a) Serum diluent: Phosphate buffer (100 mmol/l) pH 7,2 – Tween + protein dan chemical stabilizers + 1 g/l sodium azide (300µl) (W 2)

b) Pre wash solution: (10 mmol/l) pH 7,2 – Tween + protein dan chemical stabilizer + 1 g/l sodium azide (600µl) (W 3)

c) Wash solution: TRIS (50 mmol/l) pH 7,4 + 0,9 g/l sodium azide (600µl) (W 4,5,7,8) d) Conjugated:

Tes IgM: Alkaline phosphatase-labeled monoclonal anti human IgM antibodies (mouse) + 1 g/l sodium azide (400µl) (W6)

Tes Ig G: Alkaline phosphatase-labeled monoclonal anti human IgG antibodies (mouse) + 1 g/l sodium azide (400µl) (W6)

e) Cuvette dengan substrat: 4-methyl-umbelliferyl phosphate (0,6 mmol/l) + diethanolamine /DEA (0,62 mol/l atau 6,6%,pH 9,2) + 1 g/l sodium azide (300µl) (W 10)

Cara kerja:

1. Gunakan 1 CMVM/CMVG strip dan 1 CMVM/CMVG SPR untuk setiap sampel, kontrol atau kalibrator untuk tes.

2. Pilih CMVM/CMVG untuk dimasukkan ke tes code. Kalibrator harus diidentifikasi sebagai S1 dan dites ganda. Jika kontrol positif akan dites maka diberi tanda C1. Jika kontrol negatif akan dites maka diberi tanda C2.

3. Gabungkan kalibrator, kontrol dan sampel dengan menggunakan vortex.. 4. Masukkan sampel atau kontrol 100 µl ke dalam sampel well. 5. Masukkan SPR dan strip ke dalam alat pada section yang dikehendaki (misalnya section A). Pastikan label

warna dengan kode tes yang cocok pada SPR dan reagen strip. 6. Hasil pemeriksaan akan tampil pada monitor dan keluar dalam bentuk print out..

Keterbatasan metode:

1. Gangguan bisa terjadi pada sampel serum yang berisi antibodi yang bereaksi dengan komponen reagen sehingga hasil tes harus mempertimbangkan riwayat penderita dan hasil tes yang lain.

2. Hasil tes pada penderita immunocompromised sulit diinterpretasikan karena respon imun berkurang.

Interpretasi:

a. Infeksi primer akut: serokonversi negatif menjadi positif antibodi spesifik total, IgG atau IgM. b. Infeksi laten atau masa lampau: IgG positif, IgM negatif c. Infeksi sekunder atau reaktivasi: IgG sangat tinggi dengan peningkatan 2-4 kali, dengan atau tanpa IgM d. Infeksi kongenital: IgM positif, IgG positif

33

Editor : Raesa Chandra, Una Thamrin, Lince Wijoyo.

Tim Diskusi :

Erviani Zuhriah, Wawan WJ, Raesa Chandra, Vivi ZN, AmyRaehan, Suriyanti, Ariani S. Culla, Una Thamrin, Lince Wijoyo, IrnaReza, NheeyaWarz, Milka, Bahar Razak,

Glent Nurtanio, Hera, Cupi’X.

Mohon Koreksi dan Masukan Jika Ada Kesalahan…………….

summary imun2013@ (01)

Documents

ns5 garis kontrol

p24 garis tes

ag hiv

garis kontrol cara kerja

garis kontrol y cara

ag rekombinan hiv gp

sisa dari ikatan ag

anti hiv sdmetode