seminaire biogenouest crispr 24 avril tuan angers for diffusion
TRANSCRIPT
Double strand break
Non-‐Homologous End Joining (NHEJ)
Gene disrup+on in ~70 % of NHEJ events by out of frame dele+ons
Targeted Gene Knockout
Homologous Repair
(Template)
Homology-‐directed repair (HDR) Precise repair (user–defined) Targeted Gene Integra+on
Gene Knock-‐out Knock-‐in
Engineered ar+ficial nuclease
-‐late S and G2
-‐all cell cycle -‐canonical NHEJ -‐non-‐canonical NHEJ (error prone)
Tous les 8nt
5’-CAAAACGTCGTGA GACAGTTTG-3’ 3’-GTTTTGCAG CACTCTGTCAAAC-5’
Transcription activator-like nucleases (TALEN) (AJ. Bogdanove Science 2011)
CRISPR/Cas (Jinek, science 2012)
Zinc-finger nucleases (D. Carroll Curr Gene Ther. 2011)
Tous les 1kb (Kim, PNAS 1996)
Presque partout (Boch, science 2009 ; Moscou science 2009)
Meganucleases (G. Silva Curr Gene Ther. 2011)
1987: E. coli K12 , région inhabituelle de cinq répétitions partiellement palindromiques, hautement conservées et espacées par 4séquences différentes de 32 nt à l'extrémité 3' du gène de l’isozyme alkaline phosphatase (Ishino et al, J. Bacteriol, 1987)
2002: « CRISPR » clustered regularly interspaced short palindromic repeats. 4 gènes associés gènes CRISPR-associated «Cas», situés invariablement à proximité des loci CRISPR (Jansen et al, Omics, Mol Microbiol. 2002) 2005: Par bioinformatique, les séquences bactériennes spacers « junk » sont identiques à des séquences génomiques de bactériophages. « Curieusement », la bactérie qui contient ces séquences de phage sont
résistantes à ce même phage. (Mojica et al, Mol Evol 2005) 2007: Elucidation du rôle des loci CRISPR, S. thermophilus (souche DGCC7710,industrie laitière) résistantes aux phages 858 et 2972 (fermentations défectueuses ): 1/ L’acquisition ou la délétion d'un spacer confère la résistance ou la sensibilité aux phages 2/ gène essentiel pour la résistance: Cas5 (nouvelle nomenclature Cas 9), domaine nucléase,
(Barrangou , 2007, Science 315, 1709-1712)
La découverte des Crispr, le système immunitaire adaptatif des bactéries
Adapté de Pennisi E, science 2013
Overview of CRISPR/Cas bacterial immune system
type II CRISPR/Cas I immune system (S. Pyrogenes)
Jinek at al, science 2012
Cas 9: DNA endonuclease guided by two RNA molecules
S. Pyrogenes
Cas 9: two nuclease domains cleaving one strand of DNA
Single guide RNA (sgRNA)
reprogramma+on
« CRISPR CRAZE » -‐ « CRISPR SPEED »
1
82
74
2 7
44 45
2 3 4 7
13 13
25
9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
CRISPR
TALEN
ZFN
publica$ons number
PubMeb : “Edi$ng” + “CRISPR” or ”TALEN” or ”ZFN”
2014 : 2 in France
species references
rat Li D, Nat Biotech 2013; Li W, Nat Biotech 2013; Li W, Cell Stem Cell. 2014; Ma, Plos One 2014
mice Yang cell 2013; Fujii, Nucleic Acids Res. 2013; Yin, Nat Biotechnol. 2014 ; Zhou, FEBS J. 2014
Zebrafish Sung et al., genome research 2013; Chang cell research 2013; Hruscha Development. 2013
Human cells Malik science 2013; Conh science 2013; Zhou Nature. 2014; Yang, Methods Mol Biol. 2014
Cynomolgus Niu et al, cell 2014
Bacteriophage Kiro, RNA Biol. 2014
Bacteria Jiang Nat Biotech 2013; Copeland, Curr Opin Biotechnol. 2014
Drosophilia Beumer, Methods. 2014; Bassee, J Genet Genomics. 2014
yeast DiCarlo, Nucleic Acids Res. 2013
Plant Rice Sweet orange Tobacco Wheat
Miao, Cell Res. 2013; Feng, Cell Res. 2013; Xie, Mol Plan 2013 Jia Plos One 2014 Jiang, Nucleic Acids Res. 2013 Shan, Nat Biotechnol. 2013; Upadhyay, G3 (Bethesda). 2013
Xenopus Guo, Development. 2014
Nematode Chiu, Gene$cs 2013; Ka$c, Gene$cs2013; Zhao, Cell Res. 2014
Examples of CRISPR/Cas-‐engineered organisms
CRISPR/Cas Applica+ons :
Some of our (collabora+ve) works
New Models of human diseases an+-‐viral strategy
Regenerera+ve medicine
T100-‐ 103 T100
T105-‐ 103 T105
T107-‐ 103 T107
T118-‐ 103
T118x2-‐ 103 T118 NT TALENs
300pb
T100-103 46 % T105-103 38 % T107-103 39 % TALENs 50 %
• sgRNA AAVS1 • Transfec$on of 293T : cas9+sgRNA • Day 3: total DAN extrac$on + muta$on detec$on assay T7E1 assay
T100, 105, 107, 118 = Cas9 T103 = gRNA
CRISPR
EditGene editing– Validation of CRISPR/cas system
SCIENCE VOL 325 24 JULY 2009
TRANSGENIC RATS
-‐ Validate the technology in the rat
-‐Generate a SCID rat modeling Crigler-‐Najjar (Liver disease) : KO UGT1A1
new pre-‐clinical model for assessing therapeu+c efficacy of human hepatocytes (iPS)
WT KO WT KO
Genera+on of Ugt1A1-‐deficient rat using CRISPR/Cas technology
New models of cys+c fibrosis by CFTR invalida+on
• Autosomal recessive gene+c disorder
• 1-‐in-‐8000 to 1-‐in-‐10,000 births in Europe
• Caused by muta+ons in the CFTR (Cys+c Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)
• Major cause of mortality =pulmonary defects Persistent infec+on and inflamma+on Respiratory failure