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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Reacciones enzimáticas en sistemas heterogéneos
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Reacciones enzimáticas en sistemas heterogéneos
Involucrando sustratos insolubles� Enzimas en solución actuando
sobre sustratos insolubles
Involucrando enzimas inmovilizadas� Enzimas inmovilizadas sobre una
superficie actuando sobre sustratos en solución
Quitina insoluble
Quitinasas
ss
ss
ss
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Reacciones enzimáticas involucrando sustratos insolubles
La enzima se adsorbe ahora en el sustrato. Si A es un sitio vacante sobre la superficie del sustrato, podemos asumir el siguiente equilibrio:
[ ] [ ] [ ]EAAEdes
ads
k
k
←→
+
Si a0 es el número total de sitios de adsorción sobre la superficie del sustrato por unidad de volumen de la mezcla de reacción, tenemos
aeaa +=0
( )eK
eaea
A += 0
ads
desA k
kK =
Combinando con la relación de equilibrio para la adsorción de una enzima da
con
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El desarrollo se completa asumiendo que la hidrólisis se completa por descomposición irreversible del complejo [EA], consecuentemente
( )eK
eakeakv
A +== 03
3
Donde e es la concentración de enzima libre y está relacionada a la concentración total e0 al inicio del experimento por
( )eaee +=0
Si la concentración inicial de enzima es mucho mayor que la del sustrato (e0>>a0), podemos asumir con un excelente grado de aproximación que
ee ≈00
003
eK
eakv
A +=
La situación e0>>a0 no es poco común para reacciones involucrando sustratos sólidos. La tasa de reacción de la ecuación anterior revela que una gráfica doble recíproca, análoga a la ecuación de Lineweaver-Burk, (1/v versus 1/e0) podría ser lineal.
así
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Catálisis enzimática heterogénea
Para combinar las ventajas de la catálisis homogénea y heterogénea, se desarrolló la heterogenización de la catálisis homogénea
Las enzimas inmovilizadas son enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida de espacio con la retención de sus actividades catalíticas, que pueden ser usadasrepetidamente y continuamente
Los métodos más comunesde inmovilización de enzimasHeterogenización de enzimas solubles a través del acoplamientode un soporte insoluble mediante: adsorción o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en microcápsulas
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Método de inmovilizaciónRendimiento (%)
Enzima Soporte
Propiedades bioquímicas Características químicas
Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas
Efectos de transferencia de masaEficiencia (η)
ComportamientoConsumo de enzima (U/kg producto)
Productividad (kg producto/U)
Estabilidad operacional# de ciclos
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas están gobernadas por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material del soporte
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Inmovilización de enzimas
• Costo de la enzima
• Grado de purificación requerido de la enzima
• Costo del proceso de inmovilización
• Estabilidad de la enzima
• Efectos de inhibición y envenenamiento
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Pros y contras de la Inmovilización
PROS
Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo cortante y a la contaminación
Fácil de desarrollar procesoscontinuos
Rápidas tasas de reacción
Fácil separación de los productos
Uso repetitivo del catalizador
CONTRAS
Existencia de la resistencia a la transferencia de masa
Necesidad del proceso de inmovilización
Costos adicionales de reactivos para la inmovilización
Pérdida de actividad durante la etapa de inmovilización
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Inmovilización de enzimasLa inmovilización es la restricción espacial de la movilidad de la enzima
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Métodos de inmovilización
A: Métodos de enlace a soportesa) Enlace covalente; b) Adsorpción física; c) Fuerzas electrostáticas
B: Entrecruzamiento
C: Atrapamiento
Enzyme in Industry: Production and Applications, pg66.
B C
A
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Atributos ideales de un soporte
• Alta área superficial
• Permeable
• Insoluble
• Alta rigidez
• Regenerable
• Resistente a ataque microbiano y químico
• Estable mecánicamente y térmicamente
• Hidrofobicidad controlada
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Métodos de inmovilización claves
• Unión Covalente– Glutaraldehido– CNBr-activación– Ácidos cíclicos (glicoproteinas)– Carbodimidas
• Adsorción– Intercambio iónico– Hidrofobicidad
• Entrecruzamiento• Encapsulación
– Geles poliméricos– Liposomas y otras bicapas
Más común para enzimas
Más común para células
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Métodos de inmovilización: Soportes
Tipos de Soporte
• Inorgánicos: p.ej. Sílica, Vidrio poroso
• Orgánicos: p.ej. Poliamida, Poliacrilamida
• Biológicos: p.ej. Celulosa, Quitosano
Tipos de enlace
• Enlace covalente
• Adsorción física
• Enlace iónico
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Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
El soporte en este caso es amino alkoxy silano
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Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
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Adsorción Física
• Los biocatalizadores enlazan a los soportes porinteracciones físicas tales como interaccioneshidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc.
• Frecuentemente se usan soportes inorgánicos. Actualmente, están disponibles varios materialesnaturales que tienen fuertes capacidades de adsorción.
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Unión a un soporte por adsorción física
El método se basa en la adorción física de lasmoléculas de enzima en la superficie de unamatriz sólida, poniendo en contacto una soluciónacuosa de enzima con el soporte.
Procedimiento estáticoElectrodeposiciónProceso de reactorBaño con agitación
Métodos deadsorción física
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Métodos de inmovilización: Atrapamiento
El método de atrapamiento de inmovilización está basado en la localización de una enzima dentro de un enrejado de una matrizpolimérica o membrana de tal forma que previene la liberación de proteina mientras permite la penetración de substrato.
-La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz del gel o a la membrana.
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Métodos de inmovilización: EntrecruzamientoDefinición: Formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formandoagregados entrecruzados tridimensionales.
Métodos: Adición de una cantidad apropiada de agente entrecruzantea una solución de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formación de enlaces covalentes múltiples.
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Métodos de inmovilización: Entrecruzamiento (cont…)
Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585
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Efecto de la inmovilización sobre la estabilidad
(a) activity of free underivatised chymotrypsin. (b)activity of chymotrypsin derivatised with acryloylchloride. (c) activity of acryloyl chymotrypsin copolymerised within a polymethacrylate gel. Up to 12 residues are covalently bound per enzyme molecule. Lower derivatisation leads to lower stabilisation. (d) activity of chymotrypsin non-covalently entrapped within a polymethacrylate gel. The degree of stabilisation is determined by strength of the gel, and hence the number of non-covalent interactions. All reactions were performed at 60 °C using low molecular weight artificial substrates. The immobilisedchymotrypsin preparations showed stabilisation of up to 100,000 fold, most of which is due to their multipoint nature although the consequent prevention of autolytic loss of enzyme activity must be a significant contributory factor.
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Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas inmovilizadas
( )
maximum rate of reaction
maximum rate of diffusion
m ss L b s
m s
mDa
L b
V SJ k S S
K S
VN
k S
= − =+
= =
NDa<<1 Limitado por reacción
NDa≈1 Reacción y difusión -resistencias comparables
NDa>>1 Limitado por difusión
NDa = Número de Damhköler
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Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la tasa de reacción aparente es frecuentemente expresada en términos de un factor de efectividad, η
reaction with diffusional limitations
intrinsic reaction rateη =
Para una reacción enzimática que sigue la cinética de Michaelis-Menten
m ssurface
m s
V Sr
K Sη=
+
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Limitaciones difusionales para enzimasinmovilizadas en pelletsporosos
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Perfil de concentraciónen estado estacionarioen pelletsporosos
Consideraciones:Cinética de Michaelis-Menten
Enzima uniformemente distribuida a través del pellet
No hay partición de substrato entre el interior y el exterior del pellet
Ecuaciones gobernantes:2
2
0
2
( )
0
me
m
s
r
V Sd S dSD
dr r dr K S
S R S
dS
dr =
+ = +
=
=
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Adimensionalización
, , m
s s
KS rS r
S R Sβ= = =Definir variables adimensionales:
22
2
0
2
1
(1) 1, 0, m m
er
d S dS S
r dr Sdr
V Kd SS R
Ddr
φ
β
φ=
+ =+
= = =
Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera
A menos que la reacción sea de 1er orden, el sistema no tiene soluciónanalítica con la cinética de Michaelis-Menten
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Gráfica η η η η versusφφφφ en el sistemaMichaelis-Menten
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• Minimizar el radio de partículadentro las limitacionesmecánicas
• Optimizar la carga de la enzima– Alto contenido de enzima
incrementa la tasa intrínseca de la reacción pero disminuye el factor de efectividad
– Bajo contenido de enzimaincrementa el factor de efectividad pero disminuye la tasa intrínseca de la reacción
Diseño de pellets inmovilizados
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Reactores enzimáticos
Tipos dereactores
Discontínuos(Enzimas libres e inmovilizadas)
Contínuos (Enzimas inmovilizadas)
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Reactores discontinuos
Tipo tanque agitado con paletasque incluyen enzimas inmobilizadas
Tipo tanque agitado con mamparasque incluyen enzimas inmobilizadas
Reactor de lecho empacadocon reciclado total
Reactor de lecho fluidizadocon reciclado total
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Reactores continuos
Tipo tanque agitado con recuperación por ultrafiltración
Reactor de lechoempacado
Reactor de lechofluidizado
Reactor de fibrahueca
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http://www.bccresearch.com/report/enzymes-industrial-applications-bio030f.html
The global market for industrial enzymes is estimated at $3.3 billion in 2010. Thismarket is expected to reach $4.4 billion by 2015, a compound annual growth rate
(CAGR) of 6% over the 5-year forecast period.
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Tecnologíade enzimas comerciales
Technical enzymes are valued at just over $1 billion in 2010. This
sector will increase at a 6.6% compound annual growth rate (CAGR)
to reach $1.5 billion in 2015.
The highest sales of technical enzymes occurred in the leather
market, followed by the bioethanol market.
The food and beverage enzymes segment is expected to reach
about $1.3 billion by 2015, from a value of $975 million in 2010,
rising at a compound annual growth rate (CAGR) of 5.1%.
Within the food and beverage enzymes segment, the milk and dairy
market had the highest sales, with $401.8 million in 2009.
http://www.bccresearch.com/report/enzymes-industrial-applications-bio030f.html
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• GI es un tetrámero de 4 unidades idénticas de cerca de 45,000 kDa
• Compuesto como un dímero de dímeros
• Cada monómero está compuesto de aproximadamente 16 hélices alfa y 15 láminas beta
• La interface monómero-monómero es 3 veces más grande y fuerte que la interface dímero-dímero
• 2 Mn2+ son necesarios para la actividad xilosa y 2 Co2+ para la actividad glucosa isomerasa
Información estructural
From Bacillus Coagulans, Isolated by Novozyme, Inc.
Aplicaciones industrialesGlucosa isomerasa inmovilizada
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Aplicaciones industrialesGlucosa isomerasa inmovilizada
La isomerización de glucosa a jarabes de maíz de alta fructosa(HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para soluciones de sacarosa y azúcar invertida
•Background:Altas temperaturas de reacción para altos rendimientos de fructosapH ≥ 7 para la actividad y estabilidad de la enzimaPERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fácilmente se descomponen a ácidos orgánicos y subproductos coloreadosEl tiempo de reacción debe ser minimizado
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Aplicaciones industrialesGlucosa isomerasa inmovilizada
• Condiciones del proceso:
En reactores de lecho fijo contínuos
Temperatura: 55-60 oC
pH: óptimo pH de la enzima
Los gránulos de la enzima deben sersuficientemente rígidos para prevenir la compactación durante la operación
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Aplicaciones industrialesGlucosa isomerasa inmovilizada
Método de InmovilizaciónRendimiento
(kg producto seco/ kg enzima)
1. La enzima, después del aislamiento y purificación, es covalentemente inmovilizada sobre un soporte inerte
20,000
2. Entrecruzamiento de células que contienen las enzimas deseadas
2,000-4,000
3. La enzima parcialmente purificada es inmovilizada sobre resinas de intercambio iónico
7,000- 10,000
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Conclusiones
• La inmovilización permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costos
• La selección de los métodos de inmovilizacióndeberán estar basados en los requerimientos técnicosespecíficos y en el marco global de su aplicacióncomercial