propagaciÓn in vitro a partir de meristemos de cinco
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PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel)
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para obtener el título de
BIOLOGA
DIRECTORA CLAUDIA RAMIREZ SANDOVAL Unidad de Biotecnología Vegetal
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA
BOGOTA, DC. Junio de 2005
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
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PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel)
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ
APROBADO
Claudia Ramírez Sandoval, MSc Directora
Iván Cruz Daniel Zapata Ingeniero Agrónomo Ingeniero Industrial Jurado Jurado
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PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel)
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ
Angela Umaña, MPhil Carmen Cecilia Espíndola, MSc Decana Académica Directora de la Carrera de Biología Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
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A mi Familia y Nicolás por todo su amor y comprensión
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AGRADECIMIENTOS
A Germán Mejía por su interés y apoyo y a la empresa Colibrí Flowers por el
suministro del material vegetal para el desarrollo del trabajo.
A Claudia Ramírez, MSc, investigadora de la Unidad de Biotecnología
Vegetal de la Universidad Javeriana por la dirección técnica y científica y el
constante apoyo durante la realización del trabajo.
A Juan Carlos Vaca, PhD, investigador de la Unidad de Biotecnología
Vegetal de la Universidad Javeriana por la asesoría en el área de virología
vegetal.
A Dagoberto Castro, PhD, investigador de la Universidad Católica de Oriente
(Rionegro – Antioquia) por la asesoría durante la ejecución del trabajo.
A Jhon Alexander Zambrano e Iván Cruz por el apoyo durante la fase de
laboratorio.
A Nixon y Jorge por su colaboración durante la fase de laboratorio.
A Jenny Milena Escobar por su asesoría y realización del análisis estadístico.
A mis padres y hermanos por el constante apoyo, ánimo, tiempo y
comprensión durante la realización del trabajo.
A Nico por la total entrega, dedicación, comprensión, apoyo y presencia en
todo momento.
A la familia Fernández por el apoyo y colaboración a lo largo del trabajo.
JUNIO DE 2005
6
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN……………………………………………………………………………...16 ABSTRACT…………………………………………………………………………….17
1. INTRODUCCION ............................................................................................ 18
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA ...................................... 20
2.1 Dianthus caryophyllus l. (Clavel) ............................................................... 20 2.1.1 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA......................................................................... 20 2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA ........................................................................... 20 2.1.3 ORIGEN E HISTORIA .................................................................................. 21 2.1.4 ZONAS DE PRODUCCIÓN ........................................................................... 22 2.1.5 VARIEDADES ............................................................................................ 22 2.1.6 CULTIVO Y PRODUCCIÓN........................................................................... 23
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la producción ................. 24 2.1.6.1.1 Temperatura 24 2.1.6.1.2 Suelo 24 2.1.6.1.3 Riego 24 2.1.6.1.4. Nutrientes 24
2.1.7 PLAGAS Y ENFERMEDADES ....................................................................... 25
2.1.7.1 Plagas.............................................................................................. 25 2.1.7.1.1 Ácaros 25 2.1.7.1.2 Áfidos 26 2.1.7.1.3 Trips 26 2.1.7.1.5 Nemátodos 26
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias ........................... 27
2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular 27 2.1.7.2.2 Botritis 27 2.1.7.2.3 Roya del clavel 27 2.1.7.2.4 Mancha foliar 28
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus .................................................. 28
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM) 28 2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV) 29 2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV) 29
vii
2.1.7.3.4. Virus del moteado necrótico del clavel (CaNFV) 29 2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV) 30
2.1.7.3.5.1 Clasificación....................................................................... 30 2.1.7.3.5.2 Historia y distribución......................................................... 30 2.1.7.3.5.3 Transmisión ....................................................................... 30 2.1.7.3.5.4 Citopatología...................................................................... 30 2.1.7.3.5.5 Sintomatología del clavel................................................... 31 2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos ........................................... 31
2.1.7.4 Técnicas para la detección de virus 31
2.1.7.4.1 Pruebas biológicas ............................................................... 32 2.1.7.4.2 Citopatología......................................................................... 32 2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrónico (ISEM) ...... 32 2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimática (ELISA)....................................... 33 2.1.7.4.5 Hibridación molecular ........................................................... 34 2.1.7.4.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)....................... 34
2.1.7.5 Control de virus ........................................................................... 35 2.1.7.5.1 Quimioterapia ....................................................................... 36 2.1.7.5.2 Termoterapia ........................................................................ 36
2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO................................................................ 37 2.2.2 ZONAS DE CRECIMIENTO – MERISTEMOS –................................................. 38 2.2.3 REGULADORES DE CRECIMIENTO .............................................................. 40
2.2.2.1 Auxinas............................................................................................ 40 2.2.2.2 Citoquininas..................................................................................... 41
2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS ....................................................... 43
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE MERISTEMOS IN VITRO......................................... 46 2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa.............................................................. 46 2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante ............................................. 46 2.3.1.3 Etapa II: Multiplicación y elongación de brotes ............................... 47 2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro............................................................ 47 2.3.1.5 Etapa IV: Aclimatación del material obtenido in vitro ...................... 48
2.3.2 PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO IN VITRO ........................................... 48
2.3.2.1 Contaminación................................................................................. 48 2.3.2.2 Oxidación......................................................................................... 49 2.3.3.2 Vitrificación ó hiperhidratación......................................................... 50
2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratación 51 2.3.3.2.2 Factores que influyen en la hiperhidratación 51 2.3.3.2.3 Signos 52
2.4 MICROPROPAGACIÓN DE CLAVEL ................................................................. 52
viii
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN................................ 56 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA..................................................................... 56 3.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................... 56
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 58 4.1 OBJETIVO GENERAL..................................................................................... 58 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 58
5. MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................... 59
5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN...................................................................... 59 5.1.1 Diseño experimental del Componente I. Atenuación del CarMV........ 60 5.1.2 Diseño Experimental del Componente II. Proceso de Micropropagación del Material Vegetal..................................................................................... 61 5.1.3 Población de estudio y muestra ......................................................... 62 5.1.4 Variables del estudio. ......................................................................... 63
5.4.1.1 Componente I. Atenuación del CarMV 63 5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagación del Material Vegetal 64
5.2 MÉTODOS ................................................................................................... 66
5.2.2 Termoterapia ...................................................................................... 68 5.2.3 Detección de partículas virales........................................................... 69 5.2.3 Micropropagación del Material Vegetal .............................................. 71
5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro 72 5.2.3.1.1 Desinfestación ...................................................................... 72 5.2.3.1.2 Obtención y siembra del explante ........................................ 72 5.2.3.1.3 Medio y condiciones físicas del cultivo ................................. 73
5.2.3.2 Propagación in vitro 73 5.2.3.3 Enraizamiento in vitro 74
5.3 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN............................................................. 74 5.4 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN...................................................................... 75
5.4.1. Componente I. Atenuación del CarMV .............................................. 75 5.4.1.1Prueba no paramétrica de Kruskall Wallis 75 5.4.1.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan 76
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagación ................................. 76 5.4.2.1 Análisis de Varianza (ANOVA) 76 5.4.2.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan 77
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 78
6.1 COMPONENTE I. ATENUACIÓN DEL CARMV .................................................. 78
ix
6.2 COMPONENTE II. PROCESO DE MICROPROPAGACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL83 6.2.1 Establecimiento in vitro de meristemos .............................................. 86 6.2.2 Propagación in vitro............................................................................ 89
6.2.2.1 Ciclo de multiplicación 1 89 6.2.2.2 Ciclo de multiplicación 2 91 6.2.2.3 Efecto de la concentración de agar en la hiperhidratación 95
6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro ........................................................... 97 6.2.4 Comportamiento de las variedades a través del tiempo................... 101 6.2.5 Cálculo del potencial productivo....................................................... 106
7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 109
8. RECOMENDACIONES ................................................................................. 111
9. LITERATURA CITADA ................................................................................. 112
x
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel......................................................25 Tabla 2. Componente I. Métodos empleados para la atenuación del CarMV...........59 Tabla 3. Componente II. Fases del proceso de micropropagación...........................60 Tabla 4. Niveles del Factor 1 (métodos de atenuación del CarMV) del componente I..................................................................................................................................60 Tabla 5. Niveles del Factor 2 (variedades) del componente I...................................61 Tabla 6. Niveles del Factor 1 (variedades) del componente II..................................62 Tabla 7. Población y variables del estudio en cada etapa del proceso de micropropagación......................................................................................................63 Tabla 8. Tratamientos evaluados en la fase de enraizamiento.................................74
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en los invernaderos de la empresa floricultora...............................................................67 Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el método de termoterapia en una Cámara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38ºC. Instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal PUJ........................................68 Figura 3. Metodología empleada para la atenuación del CarMV .............................70 Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento de meristemos, multiplicación y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS). Kinetina (Kin), Acido indolacético (AIA).....................................................................71 Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje...................................................................................................................................73 Figura 6. Resultados de la prueba “DAS – ELISA”, en las cinco variedades y con cada método de atenuación de virus, a partir de los valores promedio de absorbancia (nm). .....................................................................................................79 Figura 7. Efecto de los métodos para la atenuación del virus moteado de clavel (CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel. ...............................................81 Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia.83 Figura 9. Número de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el proceso de micropropagación ...................................................................................85 Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al método de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II. .....................................................86 Figura 11. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus...............................................87 Figura 12. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.....................88 Figura 13. Tasa de multiplicación en el ciclo de propagación 1, para las variedades Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel. .................................90 Figura 14. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de multiplicación 1 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................90
xii
Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de propagación 2 para las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim...................................................92 Figura 16. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de propagación 2 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................95 Figura 17. Efecto de la concentración de agar sobre la hiperhidratación de los explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa de multiplicación. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar. ........................................96 Figura 18. Efecto de la concentración del medio de cultivo y del AIA sobre el desarrollo de raíces (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim...................................................................................................................................99 Figura 19. Comparación del efecto de los tratamientos aplicados para la inducción de raíces in vitro para cada variedad. .....................................................................100 Figura 20. Tasa de pérdida en el tiempo para cada variedad ................................101 Figura 21. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de multiplicación 1 y 2 para cada variedad..................................................................................................103 Figura 22. Número de brotes exitosos en cada variedad a través del tiempo........104 Figura 23. Brotes de Dianthus caryophyllus obtenidos in vitro. A: Brote hiperhidratado de la variedad Mercedes. B: Brote no hiperhidratado de la variedad Picote Vanesa. ........................................................................................................104 Figura 24. Número de brotes hiperhidratados por variedad a través del tiempo....105
xiii
LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Composición del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) (1962) .........127 Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada método de cada variedad........................................................................................128 Anexo 3. Componente I Atenuación del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba ELISA para los 3 métodos.......................................................................................128 Anexo 4. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la prueba ELISA para los 3 métodos...........................................................................129 Anexo 5. Tabla de los tratamientos (método y variedad) para aplicar la prueba Kruskall – Wallis ......................................................................................................129 Anexo 6. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba Kruskall – Wallis para las variables método y variedad ...................................................................................130 Anexo 7. Componente I. Atenuación del CarMV . Prueba Duncan para las variables método y variedad...................................................................................................130 Anexo 8. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha)........................131 Anexo 9. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha). .......................132 Anexo 10. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha). .....................132 Anexo 11. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha). .....................133 Anexo 12. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 1).......................................................................................................133 Anexo 13. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 1).......................................................................................................134 Anexo 14. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1).........134 Anexo 15. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1). .......135
14
Anexo 16. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 2).......................................................................................................135 Anexo 17. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 2).......................................................................................................136 Anexo 18. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2).........136 Anexo 19. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2). .......137
15
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar una metodología para la
micropropagación de cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus
L. (clavel), a partir de meristemos apicales. Adicionalmente se analizaron las
concentraciones del virus moteado del clavel (CarMV) en tejido vegetal de
cinco variedades mediante la utilización de la prueba de ELISA luego de
haber recibido los métodos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos y
la combinación de ambos. Se evaluaron las tasas de pérdida y las de
velocidad de multiplicación para cada variedad con el fin de determinar el
comportamiento de cada una en condiciones in vitro. En la fase de
establecimiento in vitro se confirmó que la variedad se asocia con la tasa de
pérdida; y con la presencia de microorganismos, vitrificación y oxidación de
los explantes. Durante la fase de multiplicación in vitro, la tasa de velocidad
de multiplicación aumento en el segundo 2 ciclo de propagación, dejando de
manifiesto el aumento de la capacidad morfogénetica a través de los
subcultivos. Durante la etapa de inducción de raíces se evidenció la
capacidad rizogénetica de las variedades. El comportamiento de cada
variedad durante las etapas fue diferente por lo que se concluye que la
respuesta es específica para cada genotipo. Se estableció la presencia del
virus en las 5 variedades estudiadas. La concentración del virus se redujo
utilizando el tratamiento combinado de termoterapia y cultivo in vitro de
meristemos.
16
ABSTRACT
The main object of the following project was to develop a methodology for the
micropropagation of five different commercial varieties of Dianthus
caryophyllus L. based on apical meristems. In addition to the above, another
purpose of the investigation was to analyze the different concentrations of the
CarMV virus in every of the five carnation varieties using the ELISA test. All
the varieties were treated before trying the ELISA test with thermotherapy, in
vitro culture or both. After, another analysis was the one based on the lost
rates and the multiplication velocity for each and every variety, looking
forward to determine their behavior under in vitro conditions. During the in
vitro establishment phase, the results allowed to confirm that the variety
influenced the lost rate. The latter was also influenced by the presence of
microorganisms, hiperhydratation and explants oxidation. The in vitro
multiplication phase was also reviewed and the multiplication velocity rate
was higher in the second propagation cycle, permitting to conclude that the
morphogenetic capacity was higher after several subcultures. During the root
induction stage, there was also another factor analyzed which was the
rizogenetic capacity of each variety. Nevertheless, each variety behavior was
different in each treatment. The latter may allow concluding that the specific
answer depends on each genotype. It was established the presence of the
CarMV in the five different varieties. The virus concentration was reduced
after the use of the combination of thermotherapy and meristem in vitro
culture treatments.
17
1. INTRODUCCION
La economía colombiana ha entrado a competir en el mercado mundial
gracias a productos como el petróleo, el café, las frutas y las flores, los
cuales tienen una importancia significativa para el país.
El rubro de la floricultura se ha convertido en una interesante opción
productiva para la agricultura en Colombia. De acuerdo con la Asociación
Colombiana de Exportadores de Flores (Asocolflores), la floricultura ocupa el
primer lugar como generadora de divisas dentro de las exportaciones no
tradicionales de Colombia. El 95% de la producción se destina a la
exportación. En el año 1979 Colombia exportó flores por un valor de 75
millones de dólares y en 1992 la cifra alcanzó ya los 341 millones. En 1994 el
material exportado fue de 430 millones de dólares y en 1996 se totalizaron
509,9 millones de dólares, cifra que supone un crecimiento del 17% con
relación al año anterior. Los principales mercados son Estados Unidos (80%)
y la Unión Europea (14%); dentro de este bloque económico se destacan el
mercado británico y alemán, con participaciones del 6,2% y del 2,0%,
respectivamente, sobre el valor exportado (Asocolflores, 2005).
En Colombia el área sembrada con flores de corte asciende a 6544
hectáreas. El 85% de la producción se desarrolla en la Sabana de Bogotá,
12% en el área de Rionegro y 3% en Valle, Cauca y el Eje Cafetero. La
principal especie exportada es el clavel (estándar y miniatura), con más de
4.000 hectáreas dedicadas a este cultivo. (ASOCOLFLORES, 2005).
Una de las principales zonas productoras de clavel es la Sabana de Bogotá;
en esta región el cultivo de clavel se ha convertido en una alternativa de
producción. Sin embargo, los métodos de propagación vegetativa
18
convencionales presentan limitaciones con respecto al suministro de plantas
madres con condiciones fisiológicas y fitosanitarias adecuadas.
Las enfermedades causadas por virus afectan el rendimiento y la calidad de
la producción de flores de clavel, en especial el virus moteado de clavel
(CarMV), responsable de pérdidas del 16 % en la producción de flores
exportables en plantas infectadas por este.
La aplicación de técnicas de cultivo in vitro de tejidos en ornamentales es una
alternativa que permite suministrar al floricultor material vegetal revigorizado
(rejuvenecimiento) y con condiciones fitosanitarias adecuadas para
enraizamiento y producción de esquejes para multiplicación masiva
(Hartmann et al., 1997).
Teniendo en cuenta la importancia económica del clavel, la empresa privada
se ha interesado en utilizar ésta herramienta, que ofrece alternativas
respecto a la calidad del material vegetal. Sin embargo, se conoce poco del
comportamiento in vitro de las variedades comerciales cultivadas en
condiciones colombianas, razón por la cual se ha formado un vínculo con la
academia con el fin de investigar, conocer, y ofrecer alternativas que apoyen
los sistemas de propagación convencional.
El presente trabajo tuvo como objetivo adaptar y desarrollar metodologías
para la propagación in vitro de cinco variedades comerciales de clavel y
evaluar el comportamiento de la respuesta en condiciones in vitro. Así
mismo, se aplicaron diferentes métodos dirigidos a analizar el efecto de la
concentración del virus moteado del clavel.
19
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Dianthus caryophyllus L. (clavel)
2.1.1 Clasificación botánica
La clasificación sistemática del clavel según Janes (1988) es:
CLASE: Dicotiledonea
SUBCLASE: Caryophyllidae
ORDEN: Caryophyllales
FAMILIA: Caryophyllaceae
SUBFAMILIA: Silenoideae
GENERO: Dianthus
ESPECIE: Dianthus caryophyllus L. Nombre Científico: Dianthus caryophyllus L. Nombres Comunes: Clavel, Clavel del poeta
2.1.2 Descripción botánica
Es una planta perenne de base leñosa con tallos de hasta 80 cm de altura,
glabros y de día largo.
Hojas: lineares de 0.8-1.5 cm de longitud, planas y blandas, acuminadas y
glaucas, con la base envainadora.
Flores: En grupos de 1-5, muy olorosas. Sin estipulas. Epicáliz con 4-6
brácteas anchas, abruptamente acuminadas, mucho más cortas que el cáliz.
Cáliz de 2.5-3 cm de longitud, con dientes triangulares. Pétalos dentados de
forma irregular, no barbados, de 1-1.5 cm de longitud, de color rosado-
púrpura en las especies silvestres (Heywood & Moore, 1998).
20
2.1.3 Origen e historia
Luego de las rosas y los crisantemos, el clavel es la tercera flor de corte más
popular del mundo, siendo originario de la cuenca mediterránea. Sus
orígenes datan del año 300 A.C., cuando el filósofo griego Theophratus
nombró a esta flor Dianthus, que significa en su lengua, dios (Dios) y anthos
(Flor). Posteriormente, la “Flor divina”, fue descrita por Linneo como Dianthus
caryophyllus (Ball, 1998).
El interés comercial por esta especie data de inicios del siglo XVI, época en
la que se realizaron los primeros mejoramientos. Las variedades de claveles
de floración permanente fueron desarrolladas en Francia en 1840 e
introducidas a América en 1852 (Larson, 1992).
En 1938, William Sim, obtuvo por hibridaciones y selecciones, una serie de
claveles que llevaron su nombre “Clavel Sim o Clavel Americano”. Se
caracterizaron por presentar una mayor longitud y un cáliz más firme. Sin
embargo, presentaba problemas como la susceptibilidad a adquirir
enfermedades y la dificultad de ser cultivadas al aire libre. (Larson, 1992).
López (1989) clasifica el clavel utilizado en floricultura en tres grupos:
1. Claveles europeos
2. Claveles americanos (Sim)
3. Miniclaveles (Spray)
Los europeos son los más fáciles de cultivar, ya que se adaptan al aire libre
sin el uso de tecnología. El Sim es el mejor remunerado, tiene mayor calidad
y es comercializado por el floricultor tecnificado. Durante el invierno es
21
necesario protegerlo en invernaderos. El miniclavel o tipo spray, es muy
apreciado en el norte de Europa (López, 1989).
2.1.4 Zonas de producción Las áreas de mayor producción de clavel son Holanda, Colombia, Israel,
Kenia y España. De igual manera, las áreas cercanas a los 30º de latitud
norte o sur y en el borde oeste de los continentes, presentan condiciones
apropiadas para su cultivo. Dentro de estas áreas se incluye el sur de
California, el área Mediterránea, cerca de Perth en Australia, las cercanías de
Valparaíso en Chile y en Sudáfrica (Ball, 1998; Ojeda, 2004).
2.1.5 Variedades
En la producción comercial para flor cortada se cultivan tres tipos de clavel:
Americano o Sim, Europeo y Miniatura o Spray. Dentro de dichos tipos existe
un gran número de variedades que se diferencian por su color, textura del
pétalo, resistencia o susceptibilidad a enfermedades, adaptabilidad al aire
libre o invernadero y rendimiento. Basándose en estas características, el
floricultor selecciona las variedades de acuerdo con las condiciones
ambientales y demandas del mercado (Larson, 1992).
El mejoramiento de la calidad de las variedades obtenidas de clavel, resulta
de los cruces intraespecíficos entre los diferentes tipos. Debido a las
exigencias del mercado, el número de variedades es elevado, apareciendo
de manera contínua nuevas formas y tipos, producto de mutaciones
inducidas, hibridaciones y selección de características deseadas. (Larson,
1992).
22
Las flores de los claveles Americanos o Sim se caracterizan por ser las más
bellas debido a su diversidad de colores, tallos de gran porte y una
sobresaliente durabilidad. Entre los claveles europeos se destacan los tipos
Chabaud y Flamands, que producen flores de gran tamaño, tallo largo
adecuado para el manejo en el cultivo y uso en floristerías (Ojeda 2004).
Las variedades miniatura se caracterizan por tener tallos muy cortos y
abundante floración. Con ésta característica se pretende que el clavel tenga
el mayor número de botones florales (López, 1989).
Actualmente, la producción de nuevas variedades esta basada en las
siguientes características: resistencia al hongo Fusarium oxysporum,
limpieza de virus, longitud del tallo, precocidad y rapidez de crecimiento,
duración de la flor, ausencia de botones laterales, diversidad de colores y
adaptación a cultivos al aire libre (Ojeda, 2004).
En los últimos años se ha intentado recuperar el olor, una característica que
se había perdido en estas flores a favor de su belleza visual, pero que las
tendencias del mercado están exigiendo (Ojeda, 2004).
2.1.6 Cultivo y producción Se estima que el clavel tiene un ciclo de vida útil de dos años bajo
condiciones como las colombianas. La producción de flores comienza a partir
del sexto mes, aunque depende de la variedad. Se calcula que la
productividad promedio del clavel estándar (Europeo y Sim) se encuentra
entre 180 y 210 flores / m² al año (rendimiento bruto). Mientras que el clavel
miniatura tiene una productividad de 190 flores/m². Sin embargo, estos datos
23
pueden variar por la influencia de factores ambientales y por el manejo de
cada uno de los cultivos (Pizano, 2000).
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la producción 2.1.6.1.1 Temperatura La temperatura óptima diurna es de 20° C a 25ºC que se obtiene fácilmente
bajo invernaderos a la altura de los 2600 metros sobre el nivel del mar;
rasgos predominantes en la zona de la Sabana de Bogotá. Con respecto a la
temperatura nocturna, ésta baja a 6 y 8 °C, razón por la cual se hace
necesario el uso de invernaderos en ésta región (Pizano, 2000).
2.1.6.1.2 Suelo El clavel se adapta a un amplio rango de suelos, desde arenosos a franco-
arcillosos, pero requiere de una profundidad efectiva es de 30 a 40 cm. El
rango de pH debe estar entre 6,5 - 7. Es importante destacar que a mayor
restricción de las características antes mencionadas, se pierde más calidad
que producción (Ojeda, 2004).
2.1.6.1.3 Riego El sistema de riego más indicado para la producción de clavel es el goteo, ya
que dosifica de manera precisa la cantidad de agua aplicada y evita la
dispersión de algunas enfermedades y plagas del follaje y de las flores por
salpicadura (Pizano, 2000).
2.1.6.1.4. Nutrientes A continuación se presenta una tabla con las necesidades básicas de
nutrientes.
24
Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel
Elemento Gramos / cama - semana
Potasio 135
Nitrógeno 98
Calcio 52
Magnesio 20
Fósforo 20
Azufre 20
Zinc 0.44
Boro 0.35
Cobre 0.25
Nota: Los requerimientos nutricionales han sido calculados para camas de 30 m² y una densidad de siembra promedio de 1000 plantas por cama. Tomado de Pizano, 2000.
2.1.7 Plagas y Enfermedades
2.1.7.1 Plagas
Las plagas más comunes que afectan al cultivo del clavel son algunos
insectos, ácaros y nemátodos.
2.1.7.1.1 Ácaros
El ácaro más común que afecta el cultivo de clavel es la arañita roja
(Tetranychus cinnabarinus). Es un artrópodo de ocho patas en su estado
adulto, sin alas y con un aparato bucal que posee una articulación prensil que
le permite perforar las hojas para succionar el contenido de sus células
(Gómez, 1992).
25
Los primeros signos manifestados en el haz del follaje son puntos blancos
que luego se tornan en manchas rojizas oscuras. En casos de grandes
poblaciones puede llegar a secar la planta por completo. Los daños más
importantes se producen en los primeros estados vegetativos de la planta,
produciendo retraso en el crecimiento (Gómez, 1992).
2.1.7.1.2 Áfidos
Los áfidos son una plaga muy frecuente en el clavel. Se alimentan de hojas y
flores, en donde succionan los azúcares que se transportan por el floema.
(López, 1989).
2.1.7.1.3 Trips Las especies más importantes que atacan al cultivo del clavel son Haplothrips
sp y Thrip tabaco. Estos insectos se alimentan de flores y centros de
crecimiento provocando decoloraciones y deformaciones en los tejidos
afectados. Para el control se prefieren los insecticidas sistémicos (López, 1989).
2.1.7.1.5 Nemátodos
Los géneros Meloidogyne y Heterodera, son endoparásitos que se alimentan
de la parte aérea y radicular del clavel, produciendo decoloración,
debilitamiento y enanismo. Adicionalmente, los nemátodos pueden actuar
como vectores de algunos virus. Igualmente pueden ser la causa de la
invasión por bacterias y hongos sobre las plantas. Para su control se debe
identificar los géneros y poblaciones presentes en el suelo, para determinar
una posible aplicación de nematicidas granulares o esterilizantes de suelo,
previo a la siembra (Marroquín & Arbeláez, 1992).
26
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias 2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular
Enfermedad originada por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Afecta
al sistema vascular pudiendo llevar a la desecación y muerte de la planta
(Carver et al., 1996). Inicialmente los signos se manifiestan en las hojas
inferiores hasta llegar a las hojas superiores. En los estados finales el tallo
muestra agrietamiento por la parte exterior y toma el aspecto de leña seca
(Ochoa, 1996; Arbeláez, 1999).
Como medidas de manejo preventivo esta la desinfección del suelo previo a
la siembra y control de la humedad (Mirkova, 1998).
2.1.7.2.2 Botritis
Botrytis cinerea es un hongo que infecta inicialmente a las flores, luego se
transmite hacia las hojas, pecíolos y tallos. Los signos en las flores se
manifiestan como necrosis del tejido; en las hojas se desarrollan lesiones
necróticas con forma de V que se cubren con moho gris y posteriormente se
marchita y muere la hoja. Su desarrollo se favorece por la alta humedad,
poca ventilación y exceso de nitrógeno (Latorre et al., 1998).
2.1.7.2.3 Roya del clavel
Causada por el hongo Uromyces caryophyllinus, ataca las hojas y los tallos,
produciendo manchas amarillas, estas producen agrietamiento de la cutícula,
posteriormente aparecen manchas de color café en forma de ampollas que al
reventar liberan las esporas cuyo polvo cubre las hojas, flores y tallos. Las
épocas de mayor incidencia de ésta enfermedad son las de lluvias o cuando
27
los cultivos permanecen con su follaje mojado por causa del riego mal
realizado (Arbeláez, 1987)
2.1.7.2.4 Mancha foliar
Producida por Pseudomonas andropogonis (Smith) Stapp bacteria gram-
negativa con forma de bastoncillo. Los signos se manifiestan a nivel del
follaje al formarse lesiones circulares e irregulares con centros marrones y
bordes de color pardo rojizo (Ochoa, 1996).
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus
Las enfermedades causadas por virus juegan un papel muy importante en la
productividad de las plantas. En el clavel, el rendimiento en la producción
puede descender entre un 30 y un 50% con la mayoría de las virosis (Oliger
et al., 1994). Actualmente se conocen doce virus distintos capaces de
infectar el clavel, de los cuales cinco se encuentran en todas las regiones del
mundo. Aun cuando se ha identificado su presencia en los cultivos no es
motivo de preocupación para los floricultores, ya que la expresión de los
signos es leve e incluso imperceptible. Sin embargo, la productividad y
calidad del material vegetal libre de virus es significativamente mejor que la
de las plantas infectadas (Gonzáles et al., 1990; Pizano, 2000).
A continuación se describirán cinco de los virus más frecuentes del clavel:
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM)
Pertenece al grupo de los potyvirus. Se manifiesta sobre el tejido foliar cerca
de las nerviaciones con un jaspeado difuso localizado principalmente sobre
las hojas. Durante el invierno estos signos quedan enmascarados (Oliger et
al., 1994).
28
2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV)
Corresponde al género de los Caulimovirus e infecta solamente a las plantas
de la familia Caryophyllaceae. Se expresa por pequeñas manchas necróticas
en líneas o anillos sobre los bordes. Algunas veces, las necrosis se
distribuyen en placas bordeadas de color pardo o púrpura, situadas en la
punta de las hojas, provocando deformaciones en el borde. (Oliger et al.,
1994; Büchen – Osmond, 2002).
2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV)
Es un pequeño virus de ARN isométrico que infecta principalmente a
Dianthus caryophyllus, Dianthus barbatus. Se ha logrado inocular
artificialmente en plantas de varias familias. Se transmite mecánicamente y
por contacto entre plantas o por injertación. Sobre las hojas infectadas se
desarrollan anillos concéntricos y moteados (Arbeláez 1999; Pizano, 2000;
Büchen – Osmond, 2002).
2.1.7.3.4. Virus del moteado necrótico del clavel (CaNFV) Pertenece al grupo de los closterovirus. Infecta principalmente a D.
caryophyllus, D. barbatus y D. chinensis. Se ha reportado como vectores los
insectos de la familia Aphididae (áfidos). Sus signos son moteados y rayados
sobre las hojas de color gris o rojo (Brunt et al., 1996).
29
2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV)
2.1.7.3.5.1 Clasificación De acuerdo con el comité internacional en taxonomía de virus (ICTV), el virus
moteado del clavel pertenece al grupo de los Tombovirus, genero Carmovirus
y familia Tombusviridae. Presenta una morfología isosaédrica y posee un
genoma monopartito de ARN linear de cadena simple y polaridad positiva
(Carrington & Morris, 1985; Rodriguez et al., 2000; Büchen – Osmond, 2002).
2.1.7.3.5.2 Historia y distribución
Fue descrito por primera vez en Inglaterra en 1955 por Kassanis. Diez años
después se encontraron variedades de clavel infectadas con el CarMV
(Hollings & Stone, 1964).
La distribución de éste virus inicio en Estados Unidos en la costa oeste,
especialmente en California. En la actualidad se encuentra en todo el mundo.
Colombia es uno de los países más afectados. Rodriguez et al. 2000,
reportaron la alta incidencia del CarMV en la Sabana de Bogotá, encontrando
una proporción del 82% de muestras positivas.
2.1.7.3.5.3 Transmisión
El CarMV es transmitido mecánicamente y se propaga fácilmente de una
planta a otra por las heridas o injertación (Pizano, 2000; Büchen – Osmond,
2002). Generalmente sucede por la siembra de esquejes de plantas madres
contaminadas o infectadas(Cano & Sánchez, 1994).
2.1.7.3.5.4 Citopatología
El virus moteado del clavel infecta todas las estructuras de la planta,
causando alteraciones citopatológicas en las células. Las más comunes son
30
formación de vesículas periféricas en el citoplasma, múltiples membranas,
variaciones del núcleo y desarrollo de burbujas en las vacuolas por
acumulación de virus (Castr, 1973).
2.1.7.3.5.5 Sintomatología del clavel Los claveles infectados por el CarMV se caracterizan por presentar tenues
moteados cloróticos, manchas y punteados en las hojas nuevas. Las hojas
viejas pueden presentar el virus enmascarado. También se presenta
deformación de hojas y falta de vigor, comparado con plantas sanas (Cano &
Sanchez, 1994; Pizano, 2000; Ojeda 2004).
Según esto es de suma importancia establecer cultivos de clavel libres del
CarMV, ya que la calidad y cantidad de las flores se ve aumentada en
comparación del material infectado con el virus (Calderón & Arbeláez, 1999).
2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos El CarMV se puede encontrar en las siguientes especies: Dianthus
caryophyllus, D. barbatus, D. chinensis, D. superbus, Saponaria officinalis, S.
Vaccaria, Daphne odora, Begonia eliator. Sin embargo, se ha logrado
inocular artificialmente en una gran cantidad de especies (Pizano, 2000).
2.1.7.4 Técnicas para la detección de virus
Para la elección de la técnica utilizada en el diagnóstico de la enfermedad y
la detección del virus responsable, se debe tener en cuenta la finalidad del
trabajo a realizar, la experiencia del investigador y la disponibilidad de
equipos y reactivos del laboratorio (Conti et al., 2001).
31
2.1.7.4.1 Pruebas biológicas
Consiste en la utilización de plantas indicadoras (herbáceas) que se inoculan
con virus fitopatógenos; posteriormente las plantas manifiestan signos típicos
de la infección. Para el aislamiento de la mayoría de los virus de las plantas
hortícolas se utilizan como huéspedes, herbáceas de las siguientes familias:
Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Solanaceae (Conti et al., 2001). Estas
pruebas se utilizan cuando no se dispone de reactivos para el diagnóstico en
el laboratorio.
2.1.7.4.2 Citopatología Se basa en el reconocimiento de un conjunto de modificaciones de las
células de los tejidos vegetales que son el resultado de un metabolismo
alterado por la infección viral, dando como resultado el desarrollo de cuerpos
de inclusión (proteínas estructurales, no estructurales, y funcionales,
utilizadas en la replicación viral). Estas estructuras son detectadas por el
microscopio óptico. Si se requiere una observación detallada se puede usar
el microscopio electrónico. Sin embargo, su identificación no es rápida ni
fácil y requiere de personal capacitado (Mattews, 1991).
2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrónico (ISEM) Se utiliza para detectar virus en pequeñas concentraciones o en mezclas con
otros virus. La muestra infectada se coloca sobre un retículo de microscopía
electrónica previamente sensibilizado con un anticuerpo; el anticuerpo
captura de forma específica a las partículas virales de la muestra y lo
concentra en el retículo, facilitando la búsqueda con el microscopio
electrónico (Conti et al., 2001). La sensibilidad del ensayo es similar a la
obtenida con la prueba inmunoenzimática que se menciona a continuación.
Sin embargo, la metodología es costosa en términos de instrumentos y
personal, dificultando diagnósticos a gran escala.
32
2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimática (ELISA)
La prueba ELISA (Enzyme-Linked-Inmunosorbent Assay) es el método
serológico más usado actualmente, dada su alta sensibilidad, rapidez y
evaluación cuantitativa y cualitativa del virus (Conti et al., 2001).
Esta técnica se basa en el reconocimiento de un antígeno (partículas de
virus) por anticuerpos y la posterior unión de este complejo con una enzima.
Este conjugado retiene simultáneamente la actividad inmunológica y
enzimática de los componentes. Si existe una unión entre los anticuerpos
específicos y su respectivo antígeno, se produce un cambio de color de la
solución y esto permite determinar los resultados visualmente o cuantificarlos
por medio de un espectofotómetro. Existen varias modificaciones de la
prueba ELISA, que se usan de acuerdo con el objetivo del análisis, dentro de
las más conocidas se encuentra el método de doble anticuerpo o "Sandwich"
y el método indirecto (Clark & Adams, 1977; Mattews, 1991; Coll, 1993).
El test ELISA incluye varios pasos: el primero consiste en la adsorción del
anticuerpo en un pozo plástico tratado. Se utiliza este material porque tiene
gran afinidad por las proteínas. El segundo paso es la unión del antígeno con
el anticuerpo. El tercer paso se basa en la conjugación del anticuerpo con
una enzima (ej. Fosfatasa alcalina) capaz de producir un cambio de color en
un sustrato adecuado (ej. Fosfato disódico de p-nitrofenilo), cuyo producto
absorbe luz a una determinada longitud de onda, que es proporcional a la
concentración de antígeno (Clark & Adams, 1977; Castaño – Zapata, 1998).
En esta técnica se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales que se
diferencian en el número de sitios de unión al virus (Schumann, 1998).
Con el fin de hacer la prueba ELISA más versátil y aplicada a diagnósticos a
gran escala, se han desarrollado diferentes técnicas: Western Blot, Dot Blot,
Dipstisck Tissue Blot, que difieren del ELISA por la utilización de otros
33
soportes (membranas de nitrocelulosa, nylon, polivinildiflurida) (Conti et al.,
2001).
2.1.7.4.5 Hibridación molecular Las técnicas moleculares han contribuido a aumentar el conocimiento en el
campo de la virología vegetal. Su ventaja radica en la posibilidad de
diagnosticar y/o identificar el genoma viral completo. Especialmente es útil en
casos como la detección de virus inestables, con bajo poder inmunógeno,
escasa presencia en el huésped natural, viroides y cepas de virus
serológicamente próximos o indistinguibles. Sin embargo, la metodología es
muy costosa en términos de reactivos y equipos y necesita personal
capacitado en técnicas moleculares; por este motivo, no se emplea en
investigaciones básicas y de diagnóstico a gran escala (Hammond & Rosner,
1994; Matthews, 1991; Conti et al., 2001)
La hibridación molecular se basa en la preparación de construcciones
genéticas que contienen secuencias de nucleótidos homólogas al genoma
viral, ya que a partir de estas construcciones se sintetizan las sondas que se
utilizan para señalar la presencia o ausencia de virus en muestras de plantas.
La detección de virus por hibridación molecular ha sido ampliamente
utilizada, en particular la hibridación sobre extractos de ácidos nucleicos
totales de plantas aplicados sobre membranas de nitrocelulosa o nylon.
Recientemente se han utilizado técnicas de hibridación molecular sobre
improntas de secciones de tejidos de plantas cuya obtención es más sencilla
que los extractos de ácidos nucleicos (Foster & Taylor, 1998).
2.1.7.4.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la
amplificación de un segmento de DNA utilizando la enzima DNA polimerasa y
34
cebadores (oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria a la
secuencia a amplificar). Se utiliza para la detección de secuencias
nucleotídicas virales (Hames et al., 1995). La reacción se produce en tres
fases:
1. El DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas.
2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla.
3. Síntesis de la cadena complementaria del DNA producida por la DNA
polimerasa (Taq polimerasa)
Cada etapa o ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo se puede
repetir llevando a cabo otra vez todos los pasos. El resultado obtenido es un
producto amplificado de DNA que puede ser detectado por una electroforesis
(Foster & Taylor 1998; Klug & Cummings, 1999).
Para que esta técnica sea aplicada a virus con cadena RNA, es necesario
sintetizar una cadena de DNA complementario mediante transcripción
inversa (RT-PCR) (Foster & Taylor, 1998).
La mayor ventaja derivada de la PCR es la identificación de secuencias
nucleotídicas virales que no pueden ser detectadas por pruebas serológicas.
Sin embargo, requiere de más tiempo por lo que su aplicación se dificulta
para diagnósticos en masa (Conti et al., 2001).
2.1.7.5 Control de virus La mejor forma de mantener los cultivos de plantas libres de virus es el
establecimiento de material certificado y su continua inspección respecto a
determinados virus. Si el virus ya está presente dentro del cultivo se pueden
realizar diferentes tratamientos; el éxito de estos dependerá de las
propiedades del virus y de la especie vegetal (Razdan, 2003).
35
2.1.7.5.1 Quimioterapia
En la actualidad no se ha desarrollado ninguna sustancia química capaz de
erradicar los virus de plantas infectadas. Hasta el momento se han realizado
trabajos con el fin de suprimir virus de tejidos vegetales y protoplastos con la
adición de sustancias químicas (antimetabólicos) en el medio. Sin embargo,
no se han obtenido resultados exitosos, ya que en algunos casos el virus se
suprime y en otros se estimula su producción. Se ha reportado que el uso de
ribavirin (análogos nucleosídicos) tiene efectos positivos en la eliminación del
virus PVX en plantas de papa (Razdan, 2003). No obstante, la quimioterapia
presenta ciertos problemas de orden técnico, ya que las sustancias con
propiedades viricidas han producido toxicidad en los tejidos vegetales
tratados (Media & Díaz, 1981).
2.1.7.5.2 Termoterapia Consiste en colocar plantas completas o estructuras de éstas, en cámaras de
crecimiento a temperatura de 35 a 40ºC. El tiempo de exposición al calor es
variable y depende de la especie. Con esto se pretende reducir la
concentración de virus en la planta (Razdan, 2003).
Experimentos llevados a cabo por Kassanis en 1965, muestran que la
habilidad del virus para infectar o multiplicarse en plantas a 36ºC no está
correlacionada con su punto de inactivación térmica. La eliminación de los
virus puede ser atribuida a algún sistema metabólico, el cual causa un
desbalance entre la síntesis y la degradación de los virus o a una dificultad
para la multiplicación a esa temperatura (Razdan, 2003).
Por otro lado, Quak (1977), reportó que la reducción en la concentración del
virus, se puede dar por la competencia entre las células del huésped que se
36
encuentran en proceso de rápida división y las partículas del virus, por
lugares de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas lo cual puede llevar a un
cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las partículas del
virus.
Se ha encontrado que no todos los virus reaccionan de la misma manera a la
termoterapia. Para la eliminación de algunos virus isométricos, 4 a 6
semanas podrían ser suficientes. Mientras que virus como el del
enrollamiento de la hoja (PLRV) en papa necesitan de un período más
prolongado (varios meses), probablemente más largo del que la planta pueda
resistir. Trabajos realizados por Hearon y Lawson (1980) en Saponaria
vaccaria y Baker y Kinnaman (1973) en clavel, obtuvieron una reducción en
la concentración de los virus presentes en cada especie. A pesar de esto el
porcentaje de plantas que sobrevive es bajo porque no toleran las altas
temperaturas. Adicionalmente, muchos virus no pueden ser inactivados por
tratamientos de calor, se sugiere utilizar el cultivo in vitro de meristemos
(Razdan, 2003)
2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO
El conjunto de eventos que contribuyen a la progresiva formación del cuerpo
de la planta y que le permiten obtener alimento, reproducirse y adaptarse a
su ambiente se define como desarrollo (o morfogénesis). Este involucra dos
procesos: crecimiento (se manifiesta por cambios cuantitativos) y
diferenciación (se refiere a los cambios cualitativos) (Azcón – Bieto & Talón,
2000)
El crecimiento se explica como un incremento irreversible en tamaño y
volumen, que esta dado por la combinación de expansión y división celular.
La expansión celular ocurre por una mayor extensibilidad de la pared, con
intervención de expansinas (proteínas que promueven la pérdida de rigidez),
37
endoglucanasas, y un aumento en la presión de turgencia. Esta extensión se
convierte en irreversible una vez que la pared recupera su rigidez (Raven et
al., 1999). El control de la división celular radica en el ciclo celular, que se
define como la secuencia de eventos bioquímicos y morfológicos que llevan a
la generación de células nuevas a partir de una célula madre (Azcón – Bieto
& Talón, 2000).
Para que el cuerpo de la planta se desarrolle es necesario un proceso de
diferenciación celular, en el que las células se especializan para ser
estructural y funcionalmente diferentes unas de otras. Este proceso depende
básicamente de la expresión diferencial del material genético. Estas células
tendrán toda la información necesaria para formar una nueva planta. Este
fenómeno se conoce como totipotencia celular (Azcón – Bieto & Talón,
2000). Las zonas de crecimiento (meristemos) que se mantienen en
constante división presentan la mayor proporción de células totipotentes
(Taiz & Zeiger, 1998)
2.2.2 Zonas de crecimiento – meristemos –
El meristemo, es una estructura dinámica en la que continuamente se está
produciendo crecimiento y división celular (Azcon – Bieto & Talón, 2000).
Los meristemos se pueden clasificar por su origen, posición y la estructura
que originan. Los meristemos apicales (o primarios) del tallo y de la raíz
conducen al desarrollo del cuerpo primario (raíces, tallos y hojas) de la planta
y se forman durante la embriogénesis (Randall & Hake 1997). Los
meristemos secundarios como los axilares son similares a los primarios en
estructura y desarrollo, aunque dan origen a raíces o tallos secundarios
(Margara, 1988; Kerstetter & Hake 1997; Randall & Hake 1997).
38
Adicional al desarrollo del cuerpo primario está el desarrollo del cuerpo
secundario que se diferencia porque no da lugar a una planta completa ya
que sólo está formado por un número limitado de tejidos y la ausencia de
ciertos órganos. Tal crecimiento deriva de los meristemos laterales (Taiz &
Zeiger, 1998; Azcon – Bieto & Talón, 2000).
En los meristemos suceden eventos morfogenéticos que conducen a la
formación de la planta; el origen de un nuevo primordio foliar está
determinado por un cambio en el plano de división. Generalmente una
división periclinal en el corpus (capa interna) o en la túnica (capa externa)
sugiere que se está desarrollando un nuevo primordio (Kerstetter & Hake
1997).
El meristemo apical se divide en tres regiones o zonas:
Zona central (ZC): ubicada en el extremo distal, presenta células vacuoladas
y núcleos prominentes, ocurren menos divisiones celulares que en el resto.
Zona periférica (ZP): Rodea a la zona central, presenta índices más
elevados de división celular, su función principal es la formación de órganos
laterales.
Zona medular (ZM): Situada en la base del meristemo, las células que
origina son la parte central del tallo y los tejidos vasculares.
Durante el desarrollo vegetativo se conserva la organización del meristemo,
pero la posición y el destino de las células derivadas del mismo cambian con
el tiempo. Este proceso está regulado por la información de la posición y por
la regulación génica (Azcon – Bieto & Talón, 2000).
39
2.2.3 Reguladores de crecimiento
El desarrollo de las plantas está influenciado por la interacción de factores
externos e internos. Dentro de los factores internos se incluyen las
hormonas (o fitohormonas), las cuales se definen como señales químicas
que facilitan la comunicación entre las células y coordinan sus actividades. El
control hormonal lo realizan cinco grupos principales: auxinas, giberelinas,
citoquininas, etileno y ácido abscísico. Sin embargo, en los últimos años se
han aislado una serie de sustancias que también pueden clasificarse como
hormonas vegetales. En este nuevo grupo de hormonas se incluyen:
jasmonatos, poliaminas, salicatos y brasinosteroides (Azcon – Bieto & Talón,
2000).
Las células vegetales responden a las señales hormonales mediante un
mecanismo de acoplamiento estímulo – respuesta que requiere la percepción
de la señal (primer mensajero) por un receptor, seguido de la generación y
transmisión de la señal que activará la respuesta. Estos procesos constituyen
la cadena de transducción de la señal hormonal (Azcon – Bieto & Talón,
2000).
2.2.2.1 Auxinas
El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de
sustancias que estimulan la elongación. El ácido indolacético (IAA) es la
forma predominante, sin embargo, se aceptan como auxinas naturales el
ácido fenilacético, ciertos cloro-indoles y el ácido indolbutírico. A su vez
existen varias sustancias que causan un efecto fisiológico similar y que se
han producido sintéticamente; entre las cuales se encuentra el ácido
naftalenacético (NAA), El ácido 2,4 – diclorofenoxiacético (2,4 – D) y el ácido
2 – metil – 4 – clorofenoxiacético (MCPA) (Taiz & Zeiger, 1998).
40
Una de las principales características de las auxinas es la fuerte polaridad
exhibida en su transporte a través de la planta. Las hormonas son
transportadas por medio de un mecanismo dependiente de energía,
alejándose en forma basipétala, es decir, desde el punto apical de la planta
hacia su base. Este flujo de auxinas reprime el desarrollo de brotes axilares
laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical.
El movimiento de las auxinas fuera de la lámina foliar hacia la base del
pecíolo parece también prevenir la abscisión de las hojas (Raven et. al.,
1999).
Las auxinas participan en diferentes procesos del desarrollo vegetal:
alargamiento o elongación celular, formación de raíces adventicias,
partenocarpia, tropismos, promoción de biosíntesis del etileno, entre otros.
Por ello, se han desarrollado auxinas sintéticas que son utilizadas en el área
agronómica y biotecnológica (Azcon – Bieto & Talón, 2000).
En el cultivo in vitro de tejidos se utiliza principalmente para estimular el
crecimiento y favorecer la formación de raíces. Sin embargo, la respuesta
que se produce tras la aplicación al explante depende de la edad fisiológica
del material vegetal, la naturaleza de las auxinas, concentración y tiempo de
aplicación (Hartmann et al., 1997).
2.2.2.2 Citoquininas
En 1956 Skoog y colaboradores aislaron la quinetina (6 – furfurilaminopurina)
a partir del DNA del esperma del arenque sometido al autoclave. El término
41
hace referencia a su capacidad para promover la división celular en tejidos
vegetales. A pesar de su gran actividad biológica, no es sintetizada por las
plantas. Se puede obtener a partir de mezclas de adenina y furfuril alcohol.
La primera citoquinina natural identificada fue la zeatina, a parir del
endospermo del maíz. A partir de esto se han descubierto varias sustancias
naturales y sintéticas, que tienen efectos análogos a la quinetina. (Roca &
Mroginski 1991; Taiz & Zeiger, 1998).
Las citoquininas se pueden derivar de la base púrica adenina (6 –
aminopurina) y de la fenilúrea. Las derivadas de la adenina poseen un
sustituyente de naturaleza isoprenoide o aromática, en el nitrógeno amínico
de la posición 6 del anillo de purina, en este grupo se encuentran citoquininas
naturales como la zeatina, benciladenina y citoquininas sintéticas como la
kinetina (6 – furanosil aminopurina). A pesar de tener similitudes en la
estructura pueden presentar analogías respecto a la síntesis, actividad y
metabolismo (Van Staden & Crouch, 1996).
Las citoquininas procedentes de la fenilúrea, son compuestos sintéticos
divididos en dos grupos, las piridylureas y las thidiazolureas. En el grupo de
las thidiazolureas se encuentra el thidiazuron, un compuesto con actividad de
citoqunina, el cual es más efectivo que las citoquininas naturales en la
promoción del desarrollo de yemas axilares, o la diferenciación de yemas
adventicias en cultivos in vitro (Huetteman et al., 1993).
Las citoquininas regulan varios procesos del desarrollo de las plantas,
incluyendo división celular, proliferación de yemas axilares, senescencia
foliar y floración, entre otros. Gran parte de estos procesos están afectados
por otros estímulos, especialmente ambientales y hormonales. Como caso
típico esta la interacción de las citoquininas con las auxinas que se utiliza
para regular la neoformación de órganos in vitro y controlar la dominancia
42
apical fundamental en la industria de la micropropagación (Ascón – Bieto &
Talón, 2000).
2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS
El cultivo de tejidos in vitro comprende una serie de técnicas mediante las
cuales un explante (porción de tejido o de un órgano que se retira del resto
de la planta) se cultiva en un medio de composición química definida en
condiciones ambientales controladas (Razdan, 2003).
Los factores que se deben tener en cuenta para obtener una respuesta
adecuada del explante incluyen: la posición en la planta donadora, edad
ontogenética y estado fisiológico de la misma. Adicionalmente se debe
considerar la especie con la que se esté trabajando y los objetivos que se
buscan. Uno de estos, es el uso de meristemos apicales para la producción
de plantas libres de virus (Razdan, 2003).
En los años 50 en estudios realizados sobre dalias dirigidos por Morel y
Martin se descubrió que las plantas obtenidas a partir de meristemos estaban
libres de virus. Después de este trabajo y ante la evidencia de las
aplicaciones de este método, se iniciaron estudios en busca de las razones
por las cuales esto sucedía. Una primera hipótesis explica la ausencia del
virus en el meristemo por la inexistencia de tejido vascular (tejido a través del
cual se movilizan los virus) en directa relación con el meristemo. Incluso si el
virus fuera capaz de invadir o moverse de célula a célula, la velocidad de
avance de los virus sería inferior a la de crecimiento del meristemo, lo cual
impediría su invasión. Otras hipótesis proponen una inhibición de la
replicación de los virus en la zona meristemática debido a la alta tasa
metabólica del meristemo y a la elevada concentración de reguladores
(auxinas) en esa zona. Aunque el motivo de la ausencia de virus en el
43
meristemo no está totalmente esclarecido, estas hipótesis o una conjunción
de las mismas parece ser bastante acertada (Azcón – Bieto, 2000; Peña,
2000).
Sin embargo, existen argumentos que contradicen la absoluta ausencia de
meristemos libres de virus, ya que es un proceso probabilístico, que no
ocurre en el 100% de los casos, sino sólo en una alta proporción (Gonzáles
et al., 1990).
Una vez obtenidos los meristemos se proceden a la siembra en un medio de
cultivo, con el cual se busca el crecimiento y regeneración de estos mediante
el aporte de nutrientes. La composición general de los medios de cultivo no
varía mucho de especie a especie y sus elementos esenciales son
macronutrientes (nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, magnesio y azufre),
micronutrientes (boro, cobalto, manganeso, hierro, zinc, molibdeno y cobre),
compuestos orgánicos (vitaminas como tiamina, piridoxina y acido nicotínico),
fuente de carbono (generalmente sacarosa), reguladores de crecimiento y
materiales de soporte. El medio más usado para micropropagación es el de
Murashige & Skoog (1962) cuya composición puede variar de acuerdo con
los requerimientos de cada especie (Razdan, 2003).
Dentro de los materiales de soporte el más utilizado es el agar, cuyo
componente es la agarosa, proveniente de ciertas algas. Otros son el
Phytagel® y Gel Rite® que se componen de ácido glucorónico, ramanos y
glucosa. Al tener elementos sustitutos del agar su potencial mátrico es más
bajo, lo que permite mayor disponibilidad de agua para el explante cultivado
in vitro; no obstante se pueden presentar problemas de hiperhidratación
(Passqualetto, 1990; George, 1996). Existen otros materiales de soporte
como el medio líquido en agitación ó puentes de papel filtro.
44
Con respecto al pH del medio, el rango entre el cual se debe ajustar previo a
autoclavar es de 5.6 a 5.8. En general la respuesta de las plantas no es muy
sensible a los cambios de pH en rangos pequeños. Es importante recalcar
que el crecimiento del material vegetal en un período de tiempo puede
generar cambios en el pH, haciéndose necesaria la transferencia a medios
frescos (Smith, 1992).
Dentro de los factores físicos a tener en cuenta se incluyen la luz, la
temperatura y la humedad relativa. Se ha reportado que cambios de
irradiancia (cantidad y calidad de luz), fotoperíodo (duración de la luz) y
longitud de onda afectan el tamaño de las hojas y brotes al igual que la
morfogénesis (Jeong et al., 1995). De igual manera, la temperatura influye
sobre el desarrollo del explante in vitro. El promedio para la mayoría de
especies es de 25ºC (Razdan, 2003). Temperaturas tan bajas como los 6ºC
pueden reducir significativamente la tasa de crecimiento, mientras que otras
tan altas como 30ºC pueden inhibir la multiplicación de brotes (Hartmann et
al., 1997). Se debe considerar que utilizar una misma temperatura durante
los períodos de luz (generalmente, 16 horas) y oscuridad (8 horas) favorece
la organogénesis.
El tercer factor físico a tener en cuenta es la humedad relativa del recipiente
que puede ser cercana al 100% en condiciones in vitro. El potencial hídrico
del aire y el sustrato es menos negativo o cercano a cero. Por lo tanto, no se
presenta un gradiente de potencial hídrico suficiente para dirigir un proceso
de transpiración, lo cual contribuye a la hiperhidratación de los tejidos
cultivados in vitro (Ziv, 1991; Jeong et al., 1995).
Un último aspecto a tener en cuenta es la composición de gases dentro del
recipiente. Los principales son etileno, oxígeno, dióxido de carbono, y
45
acetaldehído. Los efectos producidos por estos gases afectan la
morfogénesis, promoviendo crecimientos celulares anormales. Sin embargo,
aún se desconoce del todo la interacción de estos gases entre sí y su efecto
en el comportamiento de las plantas (Razdan, 2003).
2.3.1 Etapas del cultivo de meristemos in vitro
El cultivo in vitro de meristemos, comprende las siguientes etapas:
2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa
Consiste en clasificar el material que se encuentra en condiciones fisiológicas
y fitosanitarias adecuadas. Usualmente las plantas que donan el explante se
someten a termoterapia con el fin de eliminar partículas virales (Hartmann et
al., 1997).
2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante
Las plantas donadoras de explantes deben someterse a una desinfestación
superficial, con productos químicos que sean tóxicos para los
microorganismos, puesto que si no se eliminan podrían competir con el
crecimiento y desarrollo del explante en condiciones in vitro (Debergh &
Zimmerman 1991).
Dentro de los productos químicos más utilizados se encuentran el etanol (50
%), que posee una baja tensión superficial y puede fácilmente humedecer el
tejido; hipoclorito de sodio (NaClO) y el hipoclorito de calcio (CaClO). El
hipoclorito de sodio se utiliza con mayor frecuencia; para su aplicación se
manejan diluciones a concentraciones de 2 a 3.5 % y tiempos de
desinfestación que no afecten el tejido. Además, se recomienda realizar
46
lavados (3 a 5 veces) con agua destilada estéril, con el fin de eliminar
residuos de desinfectantes que pueden inhibir el crecimiento del explante.
Estos procedimientos se deben realizar dentro de una cámara de flujo
laminar que garantice la asepsia del procedimiento (Hartmann et al., 1997).
Durante la etapa de establecimiento, el explante pasa por un periodo inicial,
donde se estabiliza después del estrés producido por el aislamiento de la
planta donadora y por los tratamientos de desinfestación. De esta manera, se
espera que ocurra un crecimiento resultado de la división y elongación celular
(Smith, 1992).
2.3.1.3 Etapa II: Multiplicación y elongación de brotes
Tiene como objetivo la multiplicación de los brotes obtenidos a partir del
meristemo. Por lo general, el medio de cultivo es similar al de la fase de
establecimiento y es común utilizar citoquininas con el propósito de estimular
la división celular e inhibir la dominancia apical para lograr el crecimiento de
brotes (Razdan, 2003).
El número de subcultivos y la composición del medio de cultivo pueden
afectar la estabilidad genética y la tasa de multiplicación de las plantas
obtenidas (Hartmann et al., 1997).
2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro
Los brotes obtenidos son sometidos a condiciones de enraizamiento y
preparación para ser transplantados ex vitro. Para este procedimiento se
deben transferir por unos días a un medio de cultivo sin reguladores de
crecimiento y posteriormente se subcultivan en medio para la inducción de
47
raíces in vitro. Se recomienda que se disminuyan los niveles de citoquininas
exógenas y se aumenten los de auxinas exógenas. Adicionalmente, se debe
disminuir la concentración de las sales y de la fuente de carbono (Razdan,
2003).
El tiempo de duración de esta etapa depende de la especie o variedad y el
tipo y concentración del regulador de crecimiento (Luttge et al., 1993;
Debergh & Zimmermann 1991).
2.3.1.5 Etapa IV: Aclimatación del material obtenido in vitro
Es la etapa conocida como endurecimiento, proceso mediante el cual las
plantas obtenidas en condiciones in vitro se transfieren gradualmente a un
ambiente ex vitro. Para obtener éxito en los resultados se debe reducir
gradualmente la humedad relativa que rodea a la planta, con el objetivo de
lograr que la planta controle la transpiración y pueda adaptarse a un sustrato
en condiciones de campo (Hartmann et al., 1997).
2.3.2 Problemas asociados al cultivo in vitro
2.3.2.1 Contaminación
La presencia de microorganismos en los cultivos in vitro reduce el éxito de
los resultados, especialmente durante las primeras etapas. Esta situación se
genera por las condiciones físicas del cultivo que conforman un ambiente
propicio para su desarrollo (Debergh & Zimmerman, 1991).
La mayor fuente de contaminación en el cultivo de tejidos vegetales se
produce por la presencia de microorganismos superficiales y sistémicos de la
planta donadora. Para controlar la contaminación superficial se deben
descartar los individuos que estén en mal estado fitosanitario, realizar
48
procedimientos de desinfestación adecuados, utilizando desinfectantes
superficiales y fungicidas. A pesar de esto, el material puede no quedar
completamente estéril, ya que es probable que se presenten
microorganismos sistémicos como virus, bacterias y hongos. Algunos de
estos contaminantes se pueden tratar con el uso de antibióticos o de
tratamientos de quimioterapia y termoterapia (Casells, 1991).
Adicional al uso de sustancias químicas de desinfección, es necesario
trabajar en ambientes adecuados, esterilizar los medios de cultivo, y realizar
los cultivos siguiendo ciertas normas de asepsia (Roca & Mroginski, 1991).
2.3.2.2 Oxidación
Durante el cultivo in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor medida
situaciones de estrés, ocasionadas por daños mecánicos o por las
condiciones del cultivo in vitro (como la composición del medio). Estas
situaciones estimulan el metabolismo de los compuestos fenólicos. La
síntesis de fenoles va a producir una serie de reacciones de
hipersensibilidad, tales como la exudación al medio del contenido de las
células deterioradas. De igual forma, las células vecinas de las que
inicialmente fueron lesionadas se ven afectadas, incluso aunque esas células
no parezcan estarlo, llevando finalmente a una muerte prematura (Debergh
& Read, 1991).
En general, los fenoles son sustancias lábiles y fáciles de oxidar. Los
productos generados por la oxidación tienen carácter fitotóxico, por lo que
son capaces de alterar eventos morfogenéticos y/o de crecimiento y
desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidación,
puesto que se convierten en potentes oxidantes (Dixon & Paiva, 1995).
Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar el
efecto de la oxidación. Una forma mediante la cual se puede realizar esto es
49
evitando el estrés que estimula la biosíntesis de compuestos fenólicos, con el
fin de impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan
efectos tóxicos e inhiban el crecimiento (Debergh & Read, 1991).
Otros métodos que han dado buen resultado cuando la síntesis de fenoles no
puede evitarse son: la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como
el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del
potencial redox (disminuyendo los agentes redox), o la disponibilidad de
oxígeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros
sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH,
incubación a temperaturas más bajas, entre otros. En general lo que se
busca al proporcionar éstas condiciones es reducir la actividad fenolasa y la
disponibilidad de sustratos para esta enzima (Debergh & Zimmerman, 1991;
Thomas & Ravindra, 1997).
La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen
aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que se pueden
convertir en oxidantes muy potentes, invirtiéndose su efecto positivo en el
control de los fenoles (Debergh & Read, 1991).
2.3.3.2 Vitrificación ó hiperhidratación
La vitrificación ó hiperhidratación, es un desorden fisiológico que se presenta
en los tejidos cultivados in vitro, especialmente en las hojas, que incide sobre
dos de los procesos más importantes que realizan estas estructuras: la
fotosíntesis y el intercambio gaseoso. En menor medida los tallos y raíces
también resultan afectados por estas anomalías anatómicas, que en ciertos
50
casos van a impedir el establecimiento de plantas micropropagadas en
condiciones ex vitro (Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004) .
2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratación Los estudios realizados sobre la hiperhidratación, señalan que los defectos
anatómicos y fisiológicos observados, son el resultado de varias alteraciones
en determinadas rutas metabólicas. Así los cambios en la síntesis de
proteínas, inciden en varias enzimas implicadas en la fotosíntesis (Rubisco),
en la síntesis de celulosa y lignina (fenilalanina amonioliasa, glúcano
sintetasa), y en procesos asociados con la producción de etileno
(peroxidasas) (Saher et al., 2004). Los niveles de proteínas de hojas
hiperhidratadas son inferiores a los de hojas normales y se ha detectado una
proteina de 30 kD exclusiva de hojas vitrificadas y otras proteínas de 30-32
kD de tipo peroxidasa asociadas con la síntesis de lignina (Kevers et al.,
1.984).
2.3.3.2.2 Factores que influyen en la hiperhidratación Los factores que intervienen en la hiperhidratación están ligados a las
diferentes condiciones del cultivo in vitro, tales como: concentración de sales,
el agente gelificante, elevadas dosis de reguladores de crecimiento
(citoquininas, auxinas, etileno, entre otras); una baja intensidad lumínica
durante la incubación; y la humedad relativa y un potencial hídrico, que
según Debergh, (1987) son el factor clave para explicar estas complejas
anormalidades producidas in vitro (Majada et al., 2002; Yadav et al., 2003).
51
2.3.3.2.3 Signos Los primeros signos de hiperhidratación en los explantes se manifiestan
durante las primeras semanas, y se van incrementando con el tiempo de
cultivo. Inicialmente parte del explante ó de una o dos hojas, generalmente
las que están en contacto con el medio. El crecimiento de los brotes es más
rápido de lo normal y puede mostrar tamaños anormales en la formación de
brotes axilares. Las hojas presentan una apariencia frágil y translúcida y su
longitud es menor comparada con la de las hojas normales (Ziv et al., 1987;
Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004).
Las características morfológicas y anatómicas de las hojas hiperhidratadas
incluyen cambios estructurales y químicos. La capa cuticular y la epidermis
se vuelven más delgadas, los estomas son anormales, aumenta la cantidad
de tejido parenquimatoso, y se presentan células del mesófilo con pocos
cloroplastos mal desarrollados y con cantidades bajas de clorofila y
proteínas. Todas estas anormalidades interfieren en la aclimatación y el
transplante, causando supervivencias bajas e incluso la muerte (Debergh et
al., 1992; Olmos & Hallin, 1998; Majada et al 2002).
2.4 Micropropagación de clavel
La micropropagación, constituye uno de los métodos biotecnológicos que
mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. El número de
especies hortícolas, frutícolas, ornamentales y forestales que se multiplican
por alguna de las técnicas del cultivo in vitro, es cada vez mayor, y así son
más numerosas las empresas comerciales que se dedican a la producción de
plantas por medio de estas técnicas (Razdan, 2003).
52
Dentro de la amplia gama de especies ornamentales que se propagan por
técnicas de cultivo in vitro se destaca el clavel. En las últimas décadas, el
rápido crecimiento del mercado de las flores ha hecho que sea necesario el
uso de cultivo in vitro de clavel por las ventajas que éste ofrece a nivel de
calidad (plantas libres de virus) y economía (mayor producción de plantas)
(Hartmann et al., 1997).
A nivel mundial algunas empresas de biotecnología vegetal dedicadas a la
producción de plantas in vitro trabajan con diferentes productos, el clavel es
uno de éstos. En España, la empresa Barberet & Blanc se dedica a la
producción de plantas de clavel por medio del cultivo in vitro de meristemos
y certificación de éstas (Barberet & Blanc, 2002).
Uno de los objetivos de la implementación de la micropropagación en clavel
es la producción de plantas libres de virus, siendo ésta una de las
características principales con la cual dichas empresas han entrado al
mercado. Con base en éste fundamento los esfuerzos se han enfocado en
realizar trabajos que confirmen la efectividad del cultivo de tejidos in vitro
sobre la eliminación de virus.
Ejemplos de dichos estudios son: Baker & Kinnaman (1973) quienes
utilizaron tratamientos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos para
obtener plantas de clavel libres del virus moteado del clavel (CarMV). Pov et
al., en 1994 realizaron un trabajo similar al anterior. Jelaska & Sutina (1977)
desarrollaron un protocolo para la micropropagación del
clavel con el objetivo de obtener plantas libres del CarMV.
Sin embargo, una de las principales limitaciones de la micropropagación es
la hiperhidratación de los brotes de clavel que afecta el proceso de
aclimatación en condiciones ex vitro. Por ésta razón se han realizado una
cantidad significativa de estudios en busca de solucionar éste problema. Los
53
principales temas investigados han sido la anatomía, bioquímica y fisiología
de las hojas hiperhidratadas.
Autores como Leshem en 1983, Ziv et al en 1983, Paek en 1991, Majada en
el 2002, han estudiado los efectos de diferentes factores y sus
manifestaciones anatómicas sobre las hojas.
Por otro lado, investigadores como Kevers & Gaspar en 1986 estudiaron la
fisiología de la vitrificación encontrando una anormalidad en la regulación y
distribución de agua en los diferentes compartimentos con una mayor
proporción de agua en el espacio extracelular combinada con aire,
produciendo espacios intracelulares en el parénquima. Las conclusiones
principales fueron que éste fenómeno es debido a un estrés osmótico.
En cuanto a la bioquímica se han estudiado diferentes alteraciones, como el
estrés oxidativo causado por superóxidos, radicales libres y peróxido de
hidrógeno. (Saher, 2004)
Se han planteado numerosas hipótesis dirigidas a explicar la causa de las
alteraciones generadas por la hiperhidratación de brotes. Una de éstas es la
presencia de altas concentraciones de reguladores de crecimiento como BA,
ABA (Kim et al., 1988), AIA (Li et al., 1997). En otras hipótesis se indican
cambios en los niveles de cloruro de calcio, nitrato de amonio y nitrato de
potasio. (Choudhary & Prakash, 1993; Tsay, 1998).
Otras evidencias indican que la acumulación de gases en el recipiente como
CO2 y etileno y las bajas concentraciones de agar se relacionan con la
hiperhidratación (Fal & Sánchez – Tames, 2002; Kevers & Gasper, 1986;
Tsay, 1998; Yadav et al., 2003).
Aunque el cultivo in vitro de clavel presenta limitantes, los estudios han
permitido estandarizar protocolos útiles en la producción masiva de clavel.
Dichas variables incluyen el medio de Murashige & Skoog (1962), una
temperatura constante de 25 + 2 ºC, fotoperíodo de 16/8 h (luz/oscuridad) y
54
la humedad relativa (70-100%) (Correll & Weathers, 2001; Hayashi et al.,
2002; Fal y Sanchéz, 2002; Yadav et al., 2003). Sin embargo, se debe tener
en cuenta las diferencias atribuidas a la variedad.
55
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
El establecimiento y mantenimiento de bancos de plantas madres de clavel
requiere de material vigoroso y con condiciones fitosanitarias adecuadas.
Una de las limitantes que presenta la propagación convencional es el
suministro de material vegetal con dichas condiciones básicas para el
enraizamiento y producción de esquejes utilizados para la multiplicación
masiva.
Dentro de los problemas fitosanitarios que se han identificado, se encuentran
las enfermedades causadas por virus, en especial por el virus moteado del
clavel (CarMV) el impacto más importante de este virus se presenta en la
calidad comercial de las flores (tallos de escasa longitud y de reducido
tamaño) (Calderón & Arbeláez, 1999).
Considerando que el cultivo in vitro es una sistema de multiplicación masiva
que puede contribuir a la revigorización (“rejuvenecimiento”) y a la reducción
de agentes fitopatógenos, se pretende implementar esta estrategia que
permitirá el suministro de material vegetal con condiciones fisiológicas y
fitosanitarias adecuadas que podrá ser utilizado en el establecimiento de
bancos de plantas madres.
3.2 Justificación de la investigación
Las exportaciones totales de flores de corte de Colombia durante el año
2003, sumaron 679.4 millones de dólares, de los cuales aproximadamente el
30 % corresponden al clavel (Legicomex, 2004).
56
Debido a la importancia de esta especie como flor de corte, es importante
contar en los cultivos con sistemas de bloques de plantas madres. El uso de
material vegetal con condiciones fisiológicas y fitosanitarias adecuadas para
el establecimiento de plantas madres, será decisivo para el éxito de la
propagación. Para tal fin se requiere desarrollar estrategias que dentro de las
cuales se incluyen: la esterilización con vapor del sustrato de cultivo y el
medio de enraizamiento, técnicas de propagación por nebulización
intermitente, riego automatizado, fertilización líquida constante,
almacenamiento refrigerado de esquejes tanto enraizado como sin raíz, entre
otros (Pizano, 2000).
Complementario ha esto se ha implementado el uso del cultivo in vitro de
tejidos como una estrategia de multiplicación masiva que puede contribuir al
suministro de materiales de propagación (plantas madres) más adecuados
desde el punto de vista fisiológico y fitosanitario.
El presente trabajo estableció un protocolo de micropropagación para la
producción de materiales de propagación de 5 variedades comerciales de
clavel. Los resultados obtenidos constituyen una valiosa herramienta para la
realización de nuevos proyectos enfocados a la propagación in vitro y
limpieza del virus moteado del clavel en variedades comerciales.
57
4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general
Adaptar y desarrollar una metodología para la propagación in vitro de cinco
variedades comerciales de Dianthus caryophyllus a partir de meristemos.
4.2 Objetivos específicos
• Evaluar las condiciones para el establecimiento, multiplicación y
enraizamiento in vitro a partir de meristemos de Dianthus caryophyllus.
• Evaluar el comportamiento in vitro de cinco variedades de Dianthus
caryophyllus.
• Analizar la concentración del virus moteado del clavel utilizando métodos
de termoterapia, cultivo in vitro de meristemos solos y en combinación.
58
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Diseño de la investigación
El presente trabajo de investigación comprendió dos componentes. El
primero corresponde a la evaluación de 2 métodos para la atenuación del
virus moteado del clavel (CarMV). En el segundo componente se evalúa la
respuesta al cultivo in vitro de cinco variedades de clavel.
En la tabla 2, se presentan los métodos para la evaluación de la atenuación
del CarMV.
Tabla 2. Componente I. Métodos empleados para la atenuación del CarMV.
Método
Termoterapia
Cultivo in vitro de meristemos
Termoterapia + Cultivo in vitro de meristemos
El proceso de micropropagación comprendió 3 fases. La primera fue el
establecimiento in vitro de meristemos. La segunda, propagación in vitro, se
dividió en 2 sub – fases llamadas ciclos de multiplicación 1 y 2. La tercera
comprendió el enraizamiento in vitro. A partir de los resultados obtenidos en
cada fase se realizó la evaluación del comportamiento in vitro de las 5
variedades de clavel (Tabla 3).
59
Tabla 3. Componente II. Fases del proceso de micropropagación No. Fase Fase
Fase 1 Establecimiento in vitro de meristemos
Fase 2 Propagación in vitro
Sub – fase 1 Ciclo de Multiplicación 1
Sub - fase 2 Ciclo de Multiplicación 2
Fase 3 Enraizamiento in vitro
5.1.1 Diseño experimental del Componente I. Atenuación del CarMV
Para este componente se realizó un diseño factorial con dos factores. El
primer factor (métodos de atenuación del CarMV) presentó 3 niveles que
incluyen métodos de termoterapia, cultivo in vitro de meristemos solos y en
combinación. El segundo factor tiene 7 niveles (Variedades) que corresponden a las
variedades Marfil, Mercedes, Picote Vanesa, Orange Bri, White Sim y a los
controles positivo (presente el CarMV) y negativo (ausencia del CarMV). Para
cada combinación de los factores mencionados anteriormente se obtuvieron
3 replicas (Tabla 4).
Tabla 4. Niveles del Factor 1 (métodos de atenuación del CarMV) del
componente I
Nivel Factor 1 (Método)
Nivel 1 Termoterapia
Nivel 2 Cultivo in vitro de meristemos
Nivel 3 Termoterapia + Cultivo in vitro de
meristemos
60
Tabla 5. Niveles del Factor 2 (variedades) del componente I
Nivel Factor 2 (Variedad)
Nivel 1 Marfil
Nivel 2 Mercedes
Nivel 3 Orange Bri
Nivel 4 Picote Vanesa
Nivel 5 White Sim
Nivel 6 Control Positivo
Nivel 7 Control Negativo
5.1.2 Diseño Experimental del Componente II. Proceso de Micropropagación del Material Vegetal Para el componente II, en las fases de establecimiento, multiplicación y
enraizamiento, se realizó un diseño aleatorio simple de un factor (variedades)
con 5 niveles que corresponden a las variedades Marfil, Mercedes, Picote
Vanesa, Orange Bri y White Sim (Tabla 6). Para cada nivel se formaron
aleatoriamente 5 grupos (réplicas) cada uno con 10 esquejes. Cada esqueje
presentaba entre 2 y 3 meristemos, que constituyeron la unidad de
observación.
61
Tabla 6. Niveles del Factor 1 (variedades) del componente II
Nivel Factor 1 (Variedad)
Nivel 1 Marfil
Nivel 2 Mercedes
Nivel 3 Orange Bri
Nivel 4 Picote Vanesa
Nivel 5 White Sim
5.1.3 Población de estudio y muestra
El estudio comprendió una fase de laboratorio que se realizó en las
instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia
Universidad Javeriana, ubicadas en la ciudad de Bogotá. Allí se
micropropagó el material obtenido de esquejes de clavel seleccionados por
una empresa Floricultora, localizada en Facatativa, Departamento de
Cundinamarca, Colombia.
La población de estudio y las variables dependientes estudiadas en cada
etapa del proceso de propagación in vitro de 5 variedades comerciales de D.
caryophyllus se describen en la Tabla 7.
62
Tabla 7. Población y variables del estudio en cada etapa del proceso de micropropagación.
Etapa Población Variables del estudio
Termoterapia Esquejes % de Supervivencia
Prueba ELISA Hojas Absorbancia (nm)
Establecimiento in vitro Meristemos Tasa de pérdida (TP)
Multiplicación in vitro Brotes Tasa de velocidad de
multiplicación (TVM) y (TP).
Brotes hiperhidratados y
brotes no hiperhidtrados.
Enraizamiento in vitro Brotes Presencia/ Ausencia de
raíces
5.1.4 Variables del estudio.
5.4.1.1 Componente I. Atenuación del CarMV
• Porcentaje de supervivencia de esquejes
Esquejes que sobrevivieron (turgentes y no contaminados) luego de ser
sometidos al método de termoterapia en cada variedad.
• Valores promedio de Absorbancia (nm) Se define como la proporción de luz incidente que es absorbida por una
sustancia (sustrato Prueba ELISA). Se expresa por un cambio de color.
Este cambio de color depende de la concentración del virus. La unidad de
medida para ésta variable es el nanómetro (nm) y se mide mediante un
lector ELISA.
63
5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagación del Material Vegetal
• Tasa de pérdida (TP) (%) Se refiere a la relación entre el No. de explantes totales perdidos de cada
variedad en una fase y el No. de explantes introducidos a esa misma fase
(CONIF, 2005).
TP en cada variedad = No. Explantes perdidos
No. Explantes introducidos X 100
Explantes perdidos se refiere a aquellos que presentaron los siguientes
parámetros
Sin respuesta
Aquellos explantes que no desarrollaron brotes.
Número de explantes contaminados
La contaminación se determinó por la presencia de hongos, levaduras y/o
bacterias.
Número de explantes oxidados
Se definió como oxidación, a aquellos explantes que presentaban
oscurecimiento (coloración amarillo – café) de los tejidos foliares.
64
• Tasa de Velocidad de la Multiplicación (TVM) Expresa la relación entre el No. de explantes obtenidos al final del ciclo,
menos el No. de explantes introducidos al ciclo de la fase de
multplicación, sobre el tiempo (t) de duración del ciclo (CONIF, 2005).
TVM en cada variedad =
No. de explantes finales del ciclo – No. De explantes introducidos al ciclo
t
• Número de explantes hiperhidratados
Para la evaluación de esta variable se tomaron en cuenta los brotes que
presentaban una apariencia vidriosa acompañada de una malformación y
coloración verde brillante de los tejidos foliares. Se determinará el
promedio de explantes hiperhidratados por cada tratamiento.
• Número de explantes no hiperhidratados (exitosos) Para esta variable se contabilizó el número de brotes desarrollados por
explante que no presentaron malformaciones morfológicas en los tejidos
foliares.
• Brotes que desarrollaron raíces
Para esta variable se tomaron en cuenta los brotes que desarrollaron
raíces y se determinó el promedio de brotes que desarrollaron raíces en
cada variedad y en cada tratamiento.
65
5.2 Métodos 5.2.1 Enraizamiento
El material vegetal fue obtenido de esquejes de cinco variedades comerciales
de clavel: Marfil, Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim. Los
esquejes fueron seleccionados de plantas madres, por la empresa
floricultora, de acuerdo con los siguientes criterios:
• Entrenudos cortos
• Pares de hojas juntos (imperceptible)
• Carácter vegetativo
• Estabilidad genética (Sin mutaciones ni regresiones)
Para el desarrollo de la metodología se sembraron 72 esquejes / bandeja de
cada variedad, se colocaron en escoria y cascarilla quemada con una
proporción de 9:1 respectivamente y a cada esqueje se le aplicó
enraizadores comerciales. El sustrato fue esterilizado con vapor durante 3
horas a 90° C. El ensayo de enraizamiento fue ubicado en el invernadero de
las instalaciones de la empresa floricultora (Figura 1) en condiciones de
temperatura (18 - 20 ºC) y humedad relativa (HR) de 30 -40 % en el día y del
100 % en la noche (Figura 3). Este proceso tuvo una duración de 21 días
después de siembra (DDS). A los dos meses se repitió este procedimiento
con las mismas condiciones, constituyéndose 2 grupos.
66
Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en los invernaderos de la empresa floricultora.
67
5.2.2 Termoterapia
Para este método, los esquejes enraizados de cada variedad fueron
mantenidos en una cámara de crecimiento o fitotron marca LAB LINE®
Biotronette, a temperatura constante de 38 + 2 ºC, fotoperíodo de 12/12 h
(luz/ oscuridad), durante 25 días (Figura 2) (Castro, 2005).
Durante la primera semana, el riego fue suministrado por aspersión foliar. En
las siguientes semanas se colocó agua destilada en la base de las bandejas.
Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el método de termoterapia en una Cámara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38ºC. Instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal PUJ.
68
5.2.3 Detección de partículas virales
La prueba serológica “DAS - ELISA” (inmunoensayo de enzima ligando en
“sandwich” de doble anticuerpo), con anticuerpos policlonales para la
detección del virus moteado del clavel fue aplicada al material vegetal
sometido al método de termoterapia. Posteriormente se repitió la prueba
luego de que éste material fuera cultivado en condiciones in vitro. Por otro
lado se realizó la prueba ELISA a material proveniente únicamente de cultivo
in vitro de meristemos.
Se utilizó el Pathoscreen Kit (DAS ELISA, alkaline phosphatase label) marca
Agdia®. Para su desarrollo se siguió cada uno de los pasos explicados en el
manual correspondiente sin modificaciones.
Se seleccionó tejido foliar de 3 muestras de cada variedad luego de haber
sido aplicado cada método. Cada muestra fue macerada con nitrógeno
líquido hasta ser pulverizada; simultáneamente se agregó buffer de
extracción. Posteriormente, se dispensaron 100 µl de cada muestra dentro
de los pozos. Luego se adicionó 100 µl de control positivo en el respectivo
pozo. Igualmente con el control negativo. La placa con los pozos se colocó
en una cámara húmeda, durante toda la noche en nevera (4ºC).
Terminada la incubación se lavó 6 veces la placa con 1X PBST - Tween.
Luego se agregó 100 µl de la enzima – conjugado. Durante 2 horas se
incubó la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente, seguido por 6
lavados con la misma solución. A continuación, se adicionó 100 µl de
solución PNP por pozo, seguido por una incubación de 45 minutos en
cámara húmeda. La reacción fue detenida al agregar 50 µl de 3M de
hidróxido de sodio a cada pozo.
69
Para la interpretación de los resultados se realizó una lectura de la
absorbancia mediante un lector ELISA (MULTISKAN MCC/340 P. Version
2.33) utilizando un filtro a 405 nm.
TERMOTERAPIA
72 esquejes/ bandeja por variedad
Cámara de crecimiento 38 + 2 º C
12/12 h luz/oscuridad 25 días
ENRAIZAMIENTO 72 esquejes/ bandeja
por variedad 21 días
Prueba serológica ELISA
Pathoscreen Kit (DAS ELISA, alkaline phosphatase label)
Virus moteado del clavel
CULTIVO in vitro DE
MERISTEMOS Figura 3. Metodología empleada para la atenuación del CarMV
70
5.2.3 Micropropagación del Material Vegetal
ESTABLECIMIENTO DE MERISTEMOS in vitro
Desinfectación Etanol (50 %) 30 s
Hipoclorito de sodio (0.5 %) 3 min 4 Lavados de agua destilada
Obtención y siembra del explante Meristemo apical con 1 – 2 primordios
foliares
Medio y condiciones físicas del cultivo MS – 7% agar 0.1 ppm de Kin
T 22 + 2º C 16/8 h luz/oscuridad
HR 61 + 2 % 30 días
MULTIPLICACIÓN in vitro Brotes con 2 nudos
Ciclo 1 y Ciclo 2
MS – 7 y 8% agar 25 días
Control: MS T1: MS/2 Sacarosa 1.5 % T2: MS/2 Sacarosa 1.5 % 1 ppm de AIA.
ENRAIZAMIENTO in vitro Brotes
Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento de meristemos, multiplicación y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS). Kinetina (Kin), Acido indolacético (AIA).
71
5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro
En esta fase, se utilizaron los esquejes de cada variedad que sobrevivieron a
la termoterapia. Los criterios de selección fueron las condiciones fisiológicas
(turgencia del esqueje) y fitosanitarias (ausencia de hongos y/o bacterias)
(Figura 4).
5.2.3.1.1 Desinfestación
Los esquejes se colocaron en recipientes estériles, manteniéndose en
constante agitación con diferentes sustancias de acuerdo con el siguiente
protocolo de desinfestación (Castro, 2005):
1. Etanol al 50 % durante 30 segundos.
2. Solución de Hipoclorito de sodio (Clorox®) al 0.5 % durante 3 minutos.
3. Cuatro lavados con agua destilada, desionizada estéril, en cámara de
flujo laminar.
5.2.3.1.2 Obtención y siembra del explante
Los meristemos fueron extraídos de los esquejes previamente desinfestados.
Cada uno fue colocado sobre una caja de Petri estéril bajo el estereoscopio.
A cada esqueje se le retiró el mayor número de hojas utilizando pinzas y
cuchilla No. 11 completamente estériles, hasta obtener el meristemo apical
del tallo con 2 primordios foliares (Figura 5.A). Cada meristemo se retiró con
agujas y se sembró en el medio de cultivo (Figura 5.B).
El medio de cultivo utilizado fue el de MS (1962) cuya composición se
describe en el Anexo 1. El pH del medio se ajusto a 5.7, se esterilizó
autoclavado durante 25 minutos a 120ºC y a 15 libras de presión por pulgada
72
cuadrada. Posterior a la siembra los tubos de ensayo se taparon con
VINIPEL®. Los cuales fueron mantenidos en cuartos de incubación con
temperatura de 22 + 2 ºC, con fotoperíodo de 16 horas luz/ 8 horas
oscuridad y humedad relativa de 61 + 2 %.
A B
Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje.
5.2.3.1.3 Medio y condiciones físicas del cultivo
Durante la fase de establecimiento, el medio de cultivo fue suplementado con
3% de sacarosa y 0.1 ppm de Kinetina. El agente gelificante usado fue Agar
OXOID® al 7 %. Estos explantes fueron mantenidos durante 30 días en este
medio. Posteriormente, fueron transferidos a medio MS sin reguladores de
crecimiento y 7 % de agar por 30 días.
5.2.3.2 Propagación in vitro El material proveniente de la fase de establecimiento se utilizó para iniciarla.
Los brotes diferenciados que presentaban 2 nudos fueron cortados y
transferidos a medio MS, con densidad de 2 ó 3 explantes por recipiente. Los
recipientes fueron cubiertos con tapas Magenta® para permitir el intercambio
gaseoso con el ambiente exterior. En esta fase se calculó la TP y TVM para
cada variedad.
73
Dentro de esta fase se definieron 2 ciclos de multiplicación a realizarse.
Estos se generaron por la respuesta de los explantes en las condiciones in
vitro. Cada ciclo tuvo una duración de 25 días.
Adicionalmente se evaluó la consistencia del medio con respecto a la
hiperhidratación de los explantes. Se utilizaron 2 concentraciones de agar
OXOID ® 7 % (Control) y 8% (T1).
5.2.3.3 Enraizamiento in vitro
En esta fase se subcultivaron los brotes desarrollados in vitro en medio MS,
con macronutrientes diluídos a la mitad (MS/2), sacarosa al 1.5%,
correspondiente al tratamiento 1. El tratamiento 2 correspondió al MS/2 y 1
ppm de ácido indolacético (AIA), para inducir la formación de raíces. El
control perteneció a MS básico sin reguladores de crecimiento (Tabla 8).
Tabla 8. Tratamientos evaluados en la fase de enraizamiento
Control MS
Tratamiento 1 MS / 2
Tratamiento 2 MS / 2 – 1ppm AIA
5.3 Recolección de la información Los valores promedio de absorbancia obtenidos correspondieron a los tejidos
foliares de las 5 variedades sometidos a diferentes métodos de atenuación
del CarMV. Estos datos registrados con el lector ELISA (Anexo 2).
74
Para el proceso de micropropagación se observó e identificó cada una de las
fases. Se tomaron los datos para cada variable dependiente (% de
supervivencia, Tasa de pérdida, Tasa de Velocidad de Multiplicación, % de
brotes hiperhidratados y % de brotes que se desarrollo raíces), teniendo en
cuenta el tipo de muestra, durante cada una de las fases. Las lecturas se
iniciaron a los 20 de establecido el cultivo y se continuaron realizando con la
misma frecuencia (20 días). La información fue registrada en Excel y
organizada en tablas para ser analizada estadísticamente. Para esto se
utilizó el programa estadístico Statistical Análisis System (S.A.S versión
8.11). 5.4 Análisis de la información
5.4.1. Componente I. Atenuación del CarMV
5.4.1.1 Prueba no paramétrica de Kruskall Wallis Inicialmente se realizó un ANOVA para explicar las variaciones de la
respuesta del factor método de atenuación de virus y variedad. Al aplicar las
pruebas de normalidad de Shapiro – Wilk y Kolmogorov – Smirnov y las
pruebas de homocedasticidad de Levene. Se encontró que no se cumplió el
supuesto de normalidad, por lo que se determinó que un análisis de varianza
paramétrico no es el adecuado. Teniendo en cuenta estos resultados se
realizó un análisis no-paramétrico. El nivel de significancia utilizado fue del
5% (Anexo 3 y 4).
Este análisis se realizó utilizando la prueba de Kruskall-Wallis, la cual permite
un factor de análisis por lo que se generó una variable llamada “tratamiento”
la cual presentó 21 niveles por la combinación de los 3 métodos
75
(termoterapia, cultivo in vitro de meristemos y la combinación de los dos), las
5 variedades, el control positivo y negativo (Anexo 5 y 6).
El modelo estadístico utilizado para explicar las variaciones de la respuesta
del factor 1 y 2 y su interacción, se describe a continuación:
ijkijjiijky ετββτµ ++++= )( con 3,2,1=i y . 7....,2,1=j
Donde γ es la variable respuesta (absorbancia); µ es el efecto de la media
general; τ es el efecto del método de atenuación del CarMV; β es el efecto
de la variedad; (τ β) es la interacción de los 2 factores (método de
atenuación del CarMV y variedad); y ε es el efecto debido al error
experimental.
5.4.1.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan
Para determinar diferencias entre los 21 tratamientos (combinación de los 3
métodos de atenuación del CarMV, las 5 variedades, el control positivo y
negativo), se utilizó la prueba de comparación de medias (Prueba de Rango
Múltiple Duncan), a partir de los valores de absorbancia calculados para cada
muestra sometida a los método de atenuación del CarMV (Anexo 7).
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagación
5.4.2.1 Análisis de Varianza (ANOVA)
Para cada variedad se calculó un ANOVA (Modelo aleatorio simple MAS) y
una prueba de rango múltiple Duncan para encontrar diferencias
76
estadísticas entre las diferentes variedades en cada fase de la
micropropagación (Anexos 8,10,12,14,16,18) .
En este caso se tiene un solo factor de interés por lo cual el modelo a ajustar
esta dado por la siguiente ecuación:
ijiijy ετµ ++= con 5,...,2,1=i
Donde γ es la variable respuesta (Tasa de pérdida, Tasa de Velocidad de
multiplicación); µ es el efecto de la media general; τ es el efecto de la
variedad; y ε es el efecto debido al error experimental.
Para utilizar este análisis, fue necesario probar los supuestos de normalidad
y homocedasticidad. En este caso, al probar estas hipótesis se encontró que
los datos no son normales, por lo que se aplicaron diferentes
transformaciones de las cuales, al sacar la raíz cuadrada, estos dos
supuestos se cumplían.
5.4.2.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan
Para comprobar las diferencias entre las variedades se utilizó la prueba de
comparación de medias (Prueba de Rango Múltiple Duncan), a partir de los
valores promedio de Tasa de Pérdida calculados para cada variedad (Anexos
9, 11,13, 15, 17, 19).
77
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Componente I. Atenuación del CarMV
La prueba inmunoenzinmática ELISA detectó la presencia del virus moteado
del clavel en los tejidos foliares de las 5 variedades analizadas en este
trabajo. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de la presencia de otros
virus en las mismas. Pizano & Salazar (1992), reportan que adicional a la
incidencia del CarMV, el virus de la mancha anillada del clavel se encuentra
en las variedades sembradas en la Sabana de Bogotá.
La presencia del CarMV encontrado en las 5 variedades mediante la prueba
ELISA, coincide con los resultados obtenidos en otros trabajos (Calderón &
Arbeláez, 1999; Rodríguez et al., 2000), que establecen la alta incidencia del
virus moteado del clavel en los cultivos de la Sabana de Bogotá,
encontrándose una proporción del 82 % de muestras positivas. Martínez et
al., 1974 concluye que este virus presenta características endémicas en los
cultivos de esta región.
Los resultados de las pruebas ELISA para detectar la presencia del CarMV
indican que las diferencias de los métodos de termoterapia, el cultivo de
meristemos, solos y en combinación, en cada variedad, mostraron
diferencias estadísticas entre sí. Estas diferencias pueden estar relacionadas
con características genéticas de cada variedad y su resistencia al virus.
Estos resultados son similares a los reportados por Calderón & Arbeláez
(1999).
En la Figura 6 se observa el comportamiento de las muestras de cada
variedad sometidas a cada método de atenuación del virus. En general, las
cinco variedades actúan de manera similar respecto a cada método. La
variedad Marfil en la combinación de ambos métodos presenta valores de
78
0,1580 nm siendo estadísticamente iguales a los presentados por el control
negativo (0,1303 nm). Las demás variedades muestran diferencias
estadísticas con el control negativo respecto con los valores promedio de
absorbancia.
0,0000,2000,4000,6000,8001,0001,2001,4001,600
C.Negativo
C. Positivo Marfil Mercedes Oranbri PicoteVanesa
White Sim
Valo
res
prom
edio
de
abso
rban
cia
(nm
)
COMBINADO Cultivo in vitro de meristemos TERMOTERAPIA
Figura 6. Resultados de la prueba “DAS – ELISA”, en las cinco variedades y con cada método de atenuación de virus, a partir de los valores promedio de absorbancia (nm).
Los resultados obtenidos en la prueba ELISA con material vegetal sometidos
únicamente a termoterapia o a cultivo in vitro de meristemos presentaron
valores promedio de absorbancia de 1,279 y 0,987 nm respectivamente,
siendo estadísticamente iguales a los del control positivo (1,114) (Figura 7).
Mientras que a las muestras en las que se aplicaron la combinación de los
dos métodos, los valores presentados fueron (0,459 nm) próximos al control
negativo (0,130 nm).
Los esquejes que fueron sometidos al método de termoterapia presentaron
valores desde 1,373 hasta 1,166 nm de absorbancia en las variedades.
Estos resultados fueron comparados con el control positivo (1,164 nm) y no
se mostraron diferencias estadísticas entre sí. Lo que significa que la
concentración del CarMV no se disminuyó en ninguna de las muestras.
79
Estos resultados sugieren que se podría requerir un, mayor tiempo de
exposición, ya que de acuerdo con Baker & Kinnaman (1973), la exposición
de plantas de clavel por 2 meses a 38°C, disminuye significativamente la
concentración del CarMV. Sin embargo, la prolongación del tiempo debe
decidirse con precaución porque el exceso puede afectar los tejidos de las
plantas (Razdan, 2003).
No obstante, el rango del tiempo de exposición adecuado para erradicar el
CarMV no es el único factor que influye puesto que se han descrito
resultados opuestos como el que obtuvo Paludan (1985) con el virus del
enanismo de crisantemo (CSV). Este virus solo fue inactivado en un 2.9 % de
las plantas sometidas a termoterapia a 37°C durante 210 días.
Por otro parte, el efecto de la temperatura induce variaciones en la expresión
del virus, la virulencia y modificaciones en las células como acumulación de
viriones a nivel ultraestructural (Hearon & Lawson, 1980).
Resultados obtenidos con temperaturas de 32°C en plantas de Saponaria
vaccaria (Familia Caryophyllaceae) con respecto al virus de la mancha
anular, evidencian que las inclusiones en el citoplasma no contienen viriones
o muy pocas partículas de éstos junto con la reducción de la virulencia. Sin
embargo, se observa como efecto adverso el aumento en la tasa de viriones
en los poros del núcleo y en éste. Esto sugiere que la síntesis de viriones
nucleares e inclusiones citoplasmáticas son dos procesos separados que
incluyen diferentes enzimas o pasos con diferentes sensibilidades de
temperatura (Hearon & Lawson, 1980).
De acuerdo con estos resultados, la incubación a una temperatura constante
de 38°C pudo llegar a inhibir la formación de inclusiones en el citoplasma
aunque pudo estimular la síntesis de partículas virales en el núcleo. Se
80
sugiere que para determinar la temperatura necesaria para inactivar el virus
del CarMV sin producir efectos adversos en las plantas, puede ser útil
realizar estudios en las variaciones ultraestructurales de las células
infectadas a diferentes temperaturas.
Las muestras sometidas únicamente a el método de cultivo in vitro de
meristemos y la combinación de este con termoterapia presentaron
diferencias significativas con el control positivo, ya que los valores obtenidos
por las muestras sometidas al método de cultivo in vitro de meristemos
fueron de 0,9878 nm, las de los métodos combinados mostraron valores de
0,459 nm y las del control positivo fueron 1,114 nm Sin embargo los dos
métodos fueron diferentes significativamente entre sí y con respecto al
control negativo (0,130 nm) (Figura 7).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
ControlNegativo
Combinado Cultivo in vitrode meristemos
Termoterapia Control Positivo
Valo
res
prom
edio
de
abso
rban
cia
(nm
)
Figura 7. Efecto de los métodos para la atenuación del virus moteado de clavel (CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel.
Los resultados obtenidos en la prueba ELISA con meristemos provenientes
del método de cultivo in vitro presentan valores promedio de 0,987 nm
siendo menores que las muestras sometidas al método de termoterapia
81
(1,279 nm) pero mayores que el que combina ambos métodos (0,459 nm).
Adicionalmente la diferencia con el control negativo es significativa (0,130
nm). Esto indica que el material sometido únicamente a cultivo in vitro
también presenta el CarMV.
De acuerdo con Helliot (2001), la ventaja del cultivo in vitro de meristemos
depende del estado sanitario inicial del material vegetal (esquejes). En este
caso, el material utilizado en este proceso provino directamente del cultivo, lo
que podría sugerir una elevada concentración del virus. Esto indica que el
estado fisiológico y la condición fitosanitaria de los esquejes que se van a
someter a cultivo in vitro son aspectos relevantes para el éxito de los
procedimientos dirigidos a la “limpieza y/o eliminación del virus”.
Adicionalmente se podría trabajar en sistemas de pre – acondicionamiento in
vivo de los esquejes mediante prácticas culturales adecuadas (Horst, 1988).
Las muestras que se sometieron a la combinación de los 2 métodos
(termoterapia y cultivo in vitro de meristemos) presentaron los valores
promedio más bajos de absorbancia (0,459 nm), dato significativamente
menor a los valores del material vegetal proveniente de los métodos de
termoterapia y cultivo in vitro de meristemos por separado (1,279 y 0,987 nm
respectivamente). Sin embargo, también presenta diferencias con el control
negativo (0,130 nm). Este resultado demuestra que la utilización de los dos
métodos parece incrementar la posibilidad de reducir la concentración del
virus en las plantas sin ser erradicado completamente.
Hollings et al., (1972) reportan que el CarMV es el virus del clavel que
presenta mayor dificultad de ser eliminado por termoterapia y cultivo in vitro
de meristemos, razón por la cual es un excelente indicador de la calidad
sanitaria de las plantas madres de clavel.
82
Adicionalmente los efectos del CarMV pueden ser más severos con el
tiempo, lo cual implicaría un riesgo para mantener cultivos por períodos muy
prolongados, ya que las pérdidas serian mayores y los daños tendrían
efectos más severos. El impacto más importante del virus se presenta en la
calidad de las flores (Calderón & Arbeláez, 1999).
Ante las limitantes atribuidas a la presencia del CarMV se propone la
realización de controles desde el inicio del cultivo del clavel (Gonzalez et al.,
1990). En la selección de las plantas madres se debe realizar un control
activo de los virus, definido por Hammond & Rosner (1994) como la
detección, identificación y eliminación de las plantas infectadas por virus.
6.2 Componente II. Proceso de micropropagación del material vegetal El primer material vegetal sometido a termoterapia presentó una respuesta
de supervivencia muy baja, especialmente en las variedades Picote Vanesa y
Jun con un porcentaje del 41,7 y 11,1 % respectivamente. En las variedades
White Sim y Marfil el 70 % de los esquejes sobrevivieron (Figura 8).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Jun Marfil Orange Bri Picote Vanesa White Sim
(%) S
uper
vive
ncia
Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia
83
Los esquejes de estas variedades se caracterizaron por presentar láminas
foliares cloróticas, deshidratación y pérdida de turgencia de la parte aérea
(Figura 10 A). Parece ser que estos fenómenos estuvieron asociados con el
bajo desarrollo del sistema radical. Sánchez – Díaz & Aguirreola (2000)
describen que la absorción de agua a través de las raíces es
significativamente mayor a la absorción foliar.
La pérdida de agua de los esquejes pudo influir en el metabolismo de la
planta, principalmente en la reducción del potencial hídrico y disminución de
la presión de turgencia. Se han realizado estudios que demuestran que la
perdida de turgencia puede reducir la expansión celular y afectar el
transporte de iones a través de las membranas (Taiz & Zeiger, 1998).
Adicionalmente, el retraso en la absorción de agua a través de las raíces y de
la lámina foliar se reflejó en el marchitamiento de los esquejes. Esto también
se favoreció por las condiciones del método (Temperatura de 38 Cº y
Humedad relativa de 90 %). Azcón – Bieto & Talón (2000) describen que
temperaturas elevadas y la capacidad de absorción del sistema radical son
elementos que afectan la calidad fisiológica de la planta.
La reducción en el número de esquejes también pudo estar relacionada con
la presencia de hongos en las láminas foliares. Esta respuesta se atribuye a
la condensación de vapor generado por la transpiración de las plantas, que
sumado a una temperatura alta (38ºC) generaron el ambiente adecuado para
el desarrollo de microorganismos.
84
Esta reducción en el número de esquejes para cada variedad incidió en el
proceso de micropropagación ya que el número de meristemos obtenidos fue
bajo y sus condiciones fisiológicas no fueron las adecuadas, reflejándose en
niveles altos de pérdida de material y respuestas deficientes en el número de
brotes. Razdan (2003) sugiere que el éxito de la micropropagación depende
en gran parte de la calidad fisiológica de la planta donadora de explantes
(esquejes de plantas madres).
En la Figura 9, se observa que las variedades Orange Bri y Marfil perdieron
el total de meristemos sembrados (74 y 109 respectivamente), razón por la
cual no hubo una respuesta respecto al desarrollo de brotes. Por otro lado,
la variedad White Sim obtuvo los valores más altos para el número de brotes
perdidos (168) y desarrollados (34) respecto a las demás variedades.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Jun Marfil Orange bri PicoteVanesa
White Sim
Núm
ero
PerdidosBrotes
Figura 9. Número de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el proceso de micropropagación Con base en estos resultados no se logró realizar ningún análisis estadístico
puesto que los datos obtenidos fueron poco representativos.
85
Del segundo material sometido a termoterapia se seleccionaron 50 esquejes
de cada variedad que se caracterizaron por presentar un buen desarrollo del
sistema radical que se vió reflejado en la turgencia del esqueje y en la
pigmentación de las láminas foliares (Figura 10 B). Estos esquejes fueron
utilizados para el proceso de micropropagación
A B
Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al método de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II.
6.2.1 Establecimiento in vitro de meristemos
Para esta fase de establecimiento in vitro se calculó la tasa de pérdida a
partir de los meristemos que no presentaron ningún tipo de respuesta y los
que se contaminaron.
De acuerdo con el análisis de varianza se determinó que existen diferencias
estadísticamente significativas entre las variedades con respecto a la tasa de
pérdida. Las variedades Marfil y Mercedes presentaron una tasa de pérdida
similar 49,2 % y 49,3 % respectivamente, al igual que las variedades Orange
Bri (68,4 %) y Picote Vanesa (63,2 %), sin embargo entre estos dos grupos si
se presentaron diferencias.
86
En la figura 11 se observa el porcentaje de la tasa de pérdida para cada
variedad. Las variedades que presentan la misma letra no difieren entre sí.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%
Marfil Mercedes Orange Bri PicoteVanesa
White Sim
Valo
res
tota
les
TP A
A AB
B B
Figura 11. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.
A los 20 días se volvió a calcular la tasa de pérdida para cada una de las
variedades y se encontraron diferencias estadísticas entre éstas. Las
variedades Mercedes (17.6 %), Orange Bri (17.2 %), Picote Vanesa (10 %) y
White Sim (9.8 %) fueron agrupadas por la prueba Duncan, presentando una
tasa de pérdida similar mientras que la variedad Marfil presentó la mayor tasa
de pérdida con un valor de 66.2 % significativamente superior respecto a las
demás variedades (Figura 12).
87
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
Marfil Mercedes Orange Bri PicoteVanesa
White Sim
Valo
res
tota
les
TP
A
BB B B
Figura 12. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.
Estos resultados indican que las tasas de pérdida difieren dependiendo de la
variedad del clavel, siendo algunas más susceptibles que otras. De acuerdo
con Fal et al., (2002) los factores genéticos determinan la sensibilidad del
material vegetal a las condiciones ambientales, que se refleja en las
respuestas de crecimiento y morfogénesis in vitro.
Estudios realizados en clavel revelan que cada variedad se comporta de
forma diferente. Como ejemplos se pueden citar el de Yadav et al., (2003)
que reporta que las variedades White Sim, Exquisite y Scania requirieron de
diferentes niveles de reguladores de crecimiento, concluyendo que la
respuesta es específica para cada genotipo. Adicionalmente, Saher et al.,
(2004) encontró diferencias en la producción de etileno en las diferentes
variedades. Fal et al., 1999 reportan que entre los diferentes genotipos de las
plantas de clavel se presentan diferencias. Densco (1987) sugiere que la
respuesta del explante puede estar afectada por el genotipo de la variedad.
88
Se podría sugerir que cada variedad tiene una respuesta a las condiciones in
vitro, razón por la cual el establecimiento del material no solo debe estar
basado en las condiciones in vitro sino en el genotipo de la variedad.
Adicional a el efecto de la variedad, la tasa de pérdida también estuvo
asociada con la presencia de hongos en el cultivo in vitro. Debergh &
Zimmerman (1991) reportan que en las primeras etapas se alcanza el mayor
porcentaje de contaminación. Esta situación se atribuye a las condiciones
físicas del cultivo que conforman un ambiente propicio para su desarrollo.
6.2.2 Propagación in vitro
En la fase de propagación in vitro se calculó la tasa de velocidad de
multiplicación y la tasa de pérdida para cada variedad. A la variedad Marfil no
se le cuantificó la tasa de velocidad de multiplicación, porque los brotes no
pudieron ser multiplicados ya que el tamaño no era adecuado. 6.2.2.1 Ciclo de multiplicación 1 En el ciclo de multiplicación 1, el análisis estadístico (p-valor=0.3803) indicó
no existen diferencias estadísticas entre las variedades (Anexo 7).
En la Figura 13 se observa el comportamiento de cada variedad respecto a
la tasa total de velocidad de la multiplicación, donde se aprecia una mayor
tasa de multiplicación en la variedad White Sim, cercana a 0.66
explantes/día. La variedad que presentó la menor tasa de multiplicación fue
Orange Bri (0.22 explantes/ día). Sin embargo las diferencias no son
estadísticamente significativas entre las variedades.
89
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White SimValo
res
tota
les
TVM
(exp
lant
es /
día)
Figura 13. Tasa de multiplicación en el ciclo de propagación 1, para las variedades Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel.
Durante este ciclo, la menor tasa de pérdida correspondió a la variedad Marfil
(0), significativamente diferente a los valores presentados por las demás
variedades. Mientras que la variedad Orange Bri presentó la mayor tasa de
pérdida con un porcentaje del 35% (Figura 14).
0%5%
10%15%20%25%30%35%40%
Marfil Mercedes Orange Bri PicoteVanesa
White Sim
Val
ores
tota
les
TP
C
AB
A
AB
BC
Figura 14. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de multiplicación 1 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.
90
La tasa de pérdida estuvo asociada con la oxidación de los explantes. Este
fenómeno se presentó como consecuencia de la hiperhidratación severa de
los brotes.
Saher et al., (2004) plantean que en los tejidos hiperhidratados se observa un
aumento de las concentraciones de hierro. Estos cambios en los contenidos
de hierro pueden generar estrés oxidativo al convertir radicales superóxido y
H2O2 no reactivos, en radicales hidroxilo muy tóxicos. De igual forma el hierro
catalítico (niveles elevados de hierro) promueve la descomposición de lípidos
hidroperóxidos a radicales alkoxy (LO) y peroxilo (LOO), lo que contribuye al
aumento de la peroxidación de lípidos. Dicho estrés puede conducir a la
muerte tisular.
Adicionalmente el exceso de agua en los tejidos puede causar niveles de
saturación, causando hipoxia. Bajo estas condiciones de estrés anaeróbico
se pueden producir niveles tóxicos de H2O2 generando así estrés oxidativo.
Es probable que por estas razones, los tejidos que presentan
hiperhidratación severa se oxiden lo cual puede conducir a la muerte celular.
Desde otra perspectiva la tasa de pérdida pudo estar condicionada por las
características de las plantas donadoras, ya que éstas se encontraban bajo
condiciones que afectaban su fisiología; dicho factor se refiere al cambio de
temperatura durante la termoterapia. Read & Economou (1987) afirman que
el desempeño del explante en condiciones in vitro puede estar influenciado
por las características fisiológicas de la planta donadora.
6.2.2.2 Ciclo de multiplicación 2
En el segundo ciclo de multiplicación, la variedad White Sim sigue
presentando la mayor tasa de velocidad de multiplicación (1.49 explantes /
91
día). La respuesta más baja la obtuvo Mercedes con un valor de 0.68
explantes/ día (Figura 15).
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
Mercedes Picote Vanesa White SimVal
ores
tota
les
TVM
(exp
lant
es /
día)
Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de propagación 2 para las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.
Estas diferencias pueden estar relacionadas con características del material
donante (planta madre) como son: edad, posición del esqueje y el número de
podas (“flush”, se refiere al número de cosechas de esquejes). Trabajos
realizados en Corylus avellana L reportan que la multiplicación de esta
especie utilizando explantes provenientes de plantas intactas (no
revigorizadas in vivo) o de plantas con podas leves o distanciadas entre sí,
fue mas difícil que aquellas que habían recibido tratamientos revigorizantes
más intensos. Se concluyó por lo tanto que la utilización de material vegetal
ontogénica y fisiológicamente juvenil, permite mejores tasas de multiplicación
durante el cultivo in vitro (Sánchez-Olate et al., 2002; 2004).
Durante este ciclo para las 3 variedades aumentaron los valores de la tasa
de multiplicación con relación al resultado anterior (ciclo de multiplicación 1).
92
Este resultado puede estar asociado con la revigorización
(“rejuvenecimiento”) de los tejidos que se expresa con el aumento de la
capacidad morfogenética. Al respecto Sánchez- Olate et al., (2004) afirman
que la revigorización (“rejuvenecimiento”) en el cultivo in vitro se traduce en
un aumento de la tasa de multiplicación a través del tiempo.
Reafirmando lo anterior Díaz – Sala et al., (1995) reportan que brotes de
Corylus avellana L. introducidos in vitro, incrementaban su revigorización
(“rejuvenecimiento”) parcial a medida que aumentaba el número de
subcultivos en presencia de BAP (Bencil amino purina).
La reversión hacia un estado juvenil puede traducirse en una morfología
diferente, modificaciones de las características fisiológicas, y una mayor
aptitud para el enraizamiento. Estudios realizados en Sequioa sempervirens
reportan mayores tasas fotosintéticas, incrementos en los contenidos de
nitrógeno y en las tasas respiratorias en tejidos revigorizados. Esto se
expresa en crecimientos más rápidos y vigorosos de las plantas, relacionado
con el aumento de la síntesis de proteínas favorecido por los altos contenidos
de nitrógeno y por la energía liberada por la respiración (Huang et al., 2003).
La revigorización (“rejuvenecimiento”) de las plantas in vitro parece estar
favorecida por la ruptura de las interacciones entre el ápice y los diferentes
órganos de la planta madre, ya que se ha visto que en una misma planta se
encuentran, yemas en diferentes estados de crecimiento (por ejemplo
crecimiento activo, reposo vegetativo y letargo inducido). De igual, forma se
ha descrito que la revigorización (“rejuvenecimiento”) es favorecida por el
pequeño tamaño del explante, el reducido número de células que lo
componen y las constantes podas (Margara, 1988).
93
Adicionalmente el aumento en la tasa de multiplicación pudo estar asociado
con el tipo de explante utilizado, es decir, el meristemo. Hartmann et al., 1997
reportan que al usar tejido meristemático proveniente de zonas de intensa
división celular como son las yemas apicales o axilares, se produce una
organogénesis directa, manifestada en la formación de un nuevo brote y
raíces a partir de la yema explantada. Estas yemas con una adecuada
composición del medio de cultivo pueden ser inducidas a la brotación
múltiple, aumentando así la tasa de multiplicación de la especie.
Corroborando lo anterior Smith (1992) expone que los tejidos meristemáticos
jóvenes demuestran tener mayor capacidad regenerativa. Por otro lado el
tamaño del explante también influye, ya que los explantes grandes poseen
un potencial regenerador considerablemente mayor con respecto a los de
menor tamaño, los cuales por su parte presentan una viabilidad y capacidad
regenerativa más baja.
En el ciclo de multiplicación 2 se presentaron diferencias estadísticas para la
tasa de pérdida entre las variedades. Las variedades Marfil y Orange Bri
obtuvieron valores de 86.4 y 88 % respectivamente siendo significativamente
diferentes a las variedades Mercedes (27.3 %), White Sim (13.7 %) y Picote
Vanesa (13.5 %) a su vez esta variedad presentó la tasa mas baja pero esta
no difiere estadísticamente de White Sim. En la figura 16, se describe el
comportamiento de cada una de las variedades con relación a la tasa de
pérdida.
94
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Marfil Mercedes Orange Bri PicoteVanesa
White Sim
Valo
res
tota
les
TP
AA
BCBC
Figura 16. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de propagación 2 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.
6.2.2.3 Efecto de la concentración de agar en la hiperhidratación Los datos presentados en la Figura 17 indican el porcentaje de brotes
hiperhidratados y no hiperhidratados de cada variedad respecto al
tratamiento utilizado. El porcentaje de brotes hiperhidratados disminuyó con
el aumento de la concentración de agar. Las variedades Mercedes y White
Sim presentaron un comportamiento similar entre sí, en las 2 variedades los
porcentajes más altos de brotes hiperhidratados se obtuvieron en el control
(7 % de agar) (89.2 y 83.3 % respectivamente) mientras que los porcentajes
más altos de brotes no hiperhidratados ocurrieron en el tratamiento 1(8 % de
agar). Sin embargo, el porcentaje de brotes hiperhidratados y no
hiperhidratados de la variedad Picote Vanesa fue similar en el control y en el
tratamiento 1.
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T1 Control T1 Control T1 Control
Mercedes Picote Vanesa White Sim
Bro
tes
(%)
Hiperhidratados No Hiperhidratados
Figura 17. Efecto de la concentración de agar sobre la hiperhidratación de los explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa de multiplicación. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar.
Estos resultados indican que el aumento en la concentración de agar
disminuye el porcentaje de brotes hiperhidratados en las variedades
estudiadas. Al respecto Leshem (1983), afirma que la concentración de agar
en el medio influye en la morfogénesis de los brotes por la reducción del
potencial hídrico del medio, causándoles hiperhidratación. Este autor
concluye que el aumento en la concentración de agar en el medio produce un
leve estrés hídrico dando como resultado un mayor número de plantas no
hiperhidratadas.
Complementando este planteamiento, Kevers & Gaspar (1986), explican que
las condiciones de hiperhidratación en medios líquidos o en medios sólidos
con altos contenidos de agua inducen a un exceso en la toma de agua de las
plantas de clavel. Esta abundancia en la cantidad de agua se localiza en el
espacio extracelular, especialmente en el periplasma, como consecuencia la
96
cantidad de agua intracelular disminuye. A medida que se pierde el agua de
la célula, la vacuola se contrae progresivamente, con una caída concomitante
en la turgencia celular, lo que lleva a una plasmólisis entre el protopasto y la
pared celular. Por lo tanto, las plantas hiperhidratadas bajo condiciones de
exceso de agua se encuentran en un estrés osmótico.
Igualmente, otros estudios concluyen que el incremento en la concentración
de agar en el medio reduce la hiperhidratación, aunque este efecto implica un
descenso de la tasa de multiplicación (Choudhary & Prakash 1993; Tsay,
1998). Por esta razón se sugiere que para mejorar los resultados, se debe
limitar la síntesis foliar con retardantes de crecimiento y no intentar controlar
la hiperhidratación en la fase de multiplicación. El desarrollo foliar se debe
permitir luego de esta etapa (Ziv, 1991). Esto se apoya en la conclusión de
Leshem (1983) que afirma que el estado hiperhídrico de las plantas puede
ser reversible.
6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro
En la fase de enraizamiento in vitro se calculó la presencia o ausencia de
raíces en los brotes. Los resultados obtenidos muestran que con los 3
tratamientos evaluados se presentaron brotes con desarrollo de raíces en las
cinco de variedades. La capacidad que tienen las plantas en condiciones in
vitro para la producción de raíces adventicias parece estar relacionada con la
revigorización (“rejuvenecimiento”) del material vegetal. Hartmann et al.,
(1997) señalan que el incremento en la inducción de raíces in vitro esta
relacionado con la reversión a un estado juvenil logrado por el aumento en el
número de subcultivos.
97
Complementando este planteamiento Sánchez – Olate et al., (2004) afirman
que el aumento del potencial de enraizamiento puede persistir luego de la
micropropagación. Dichas plantas producidas en condiciones in vitro pueden
ser muy útiles como plantas madres para la producción de esquejes por
métodos convencionales.
En el caso concreto del clavel, el establecimiento de plantas madres se debe
realizar solamente con esquejes enraizados y vigorosos (Pizano, 2000).
Basándose en este planteamiento la revigorización (“rejuvenecimiento”) de
los tejidos in vitro relacionado con un incremento en el potencial de
enraizamiento de los tejidos cultivados, puede ser conveniente en el
momento de sembrar las plantas madres.
En el control (MS – sin reguladores de crecimiento) la variedad White Sim
presentó el mayor porcentaje de brotes que desarrollaron raíces (64.3%), al
igual que con el tratamiento 1 (MS/2 – sin reguladores de crecimiento) (61.5
%). Mientras que con el tratamiento 2 (MS/2 – 1 ppm de AIA) el mayor
porcentaje de brotes que desarrollaron raíces lo obtuvo la variedad Picote
Vanesa con un valor de 81.8 %. Este fue el valor más alto de todos los
tratamientos y variedades (Figura 18).
98
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente
Control T1 T2
% B
rote
s
Mercedes Picote Vanesa White Sim
Figura 18. Efecto de la concentración del medio de cultivo y del AIA sobre el desarrollo de raíces (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim. Estos resultados muestran que la respuesta al tratamiento depende de la
variedad. El porcentaje más alto en el desarrollo de raíces por variedad difirió
en los tratamientos evaluados. Las variedades Mercedes y Picote Vanesa
presentaron los porcentajes más altos en el desarrollo de raíces en el
tratamiento de MS/2 con 1 ppm de ácido indolacético (AIA) (54.5 y 81.8 %,
respectivamente) (Figura 19). Oliver – Ortega et al., (2000) reportan que en el
enraizamiento in vitro, se ha observado que la iniciación de raíz y la
posibilidad de enraizamiento pueden aumentar de manera significativa al
disminuir los niveles de sales minerales en el medio nutritivo, lo cual mejora
el enraizamiento y la aclimatación en invernadero. La concentración de AIA
también influyó en los resultados, Toro (2004) reporta un 70,8 % en la
formación de raíces en Prunus avium; sin embargo el desarrollo de la
relación raíz – parte área, fue muy bajo repercutiendo en la aclimatación del
material.
99
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
Mercedes Picote Vanesa White Sim
% B
rote
s
Control T1 T2
Figura 19. Comparación del efecto de los tratamientos aplicados para la inducción de raíces in vitro para cada variedad.
Contrario a estos resultados la variedad White Sim no mostró diferencias con
respecto a la formación de raíces con ninguno de los tratamientos evaluados,
lo que sugiere que esta variedad no requiere auxinas exógenas para la
producción de raíces. Esto coincide con el estudio realizado por Cuzzuol et
al., (1996) que concluyen que el enraizamiento de clavel puede ser obtenido
sin la necesidad de suplementar el medio con auxinas. Este resultado puede
ser atribuido aparentemente por la producción de auxinas endógenas en la
planta. De acuerdo con Col et al., (1988) las partes aéreas, principalmente
las hojas fuentes, tienen una producción intensa de auxinas que pueden ser
translocadas a la base para estimular la rizogénesis.
Adicionalmente, estos autores describen que el enraizamiento ex vitro puede
presentar mejores resultados con relación al enraizamiento in vitro. El
desarrollo de raíces en condiciones ex vitro puede producir un sistema
radical más completo y funcional con mayor número de raíces secundarias.
Además se sugiere que el enraizamiento en condiciones in vitro puede
presentar desventajas tales como: un sistema radical no funcional, mayores
probabilidades de contraer enfermedades durante el transplante y
conexiones limitadas del sistema vascular entre el tallo y la raíz. (Debergh &
100
Read, 1991). Todo esto se ve reflejado en la supervivencia y desarrollo de
las plantas durante la aclimatización.
6.2.4 Comportamiento de las variedades a través del tiempo Al analizar el comportamiento entre variedades durante las fases se observa
que la tasa de pérdida para Mercedes, Picote Vanesa y White Sim es
similar. Durante la primera fase del establecimiento (T1), se encuentran los
mayores valores en un rango de 49.3 a 68.4 %. En el segundo registro del
establecimiento (T2) decrecen los valores drásticamente con relación al
tiempo 1 (9.8 a 17.6 %). Exceptuando la variedad Marfil ya que en esta se
observa un aumento del 17 % respecto al tiempo 1. En la siguiente fase que
incluye el ciclo de multiplicación 1 (T3) y el ciclo de multiplicación 2 (T4), los
valores tienden a aumentar entre un 4 y 10 % respecto al tiempo 2. Sin
embargo la variedad Orange Bri tiene un incremento de 53.8 % del tiempo 3
al tiempo 4 (Figura 20).
.
0%20%40%60%80%
100%
T1 T2 T3 T4
Tiempo
Valo
res
tota
les
TP
Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim
Figura 20. Tasa de pérdida en el tiempo para cada variedad
101
Los resultados altos en la tasa de pérdida en las variedades Marfil y Orange
Bri sugieren que estas variedades presentan características recalcitrantes al
cultivo in vitro. Al respecto Benson (2000) definen a una especie recalcitrante
como aquellas que no responden o presentan una pobre reacción al cultivo in
vitro. Esto puede ocurrir en cualquier etapa del cultivo; aunque no existe
alguna razón obvia para pensar que algún proceso del cultivo ocasione esta
reacción.
Cuando se subcultivaron los explantes de estas variedades, la coloración del
tejido se tornó amarilla y se observó un crecimiento muy bajo, lo que no
permitió la multiplicación de éstos explantes. Anthony et al., (1999) sugieren
que la oxidación de los tejidos es una causa frecuente de la recalcitración
que ocurre por sus altos contenidos fenólicos
Al evaluar el comportamiento de las variedades, exceptuando la variedad
Orange Bri, en los dos ciclos de multiplicación se observa una tendencia
creciente respecto a la tasa de velocidad de multiplicación (Figura 21). Esto
podría ser explicado por el aumento en la capacidad morfogénetica a través
de los subcultivos (CONIF, 2005).
La variedad White Sim es la que tiene la mayor tasa de multiplicación,
seguida por Picote Vanesa. Sin embargo, el comportamiento de la variedad
Orange Bri es totalmente opuesto, ya que tiene una tasa de velocidad de
multiplicación de 22 explantes/día y termina con un valor 0.
102
0
0,5
1
1,5
2
Ciclo de propagación 1 Ciclo de propagación 2
Tiempo
Valo
res
tota
les
TVM
Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim
Figura 21. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de multiplicación 1 y 2 para cada variedad
El número de brotes no hiperhidratados para cada variedad durante las
diferentes fases es variable. En la Figura 22 se observa que la variedad
Picote Vanesa presenta el mayor número de brotes no hiperhidratados
(Figura 23 B) durante todas las fases con valores entre 24 y 19. Mercedes y
White Sim tienen un comportamiento similar entre sí; en el ciclo de
multiplicación 2 (T4) se presenta un ligero incremento en el número de brotes
no hiperhidratados para las variedades Mercedes y White Sim.
103
0
5
10
15
20
25
30
T1 T2 T3 T4
Tiempo
Núm
ero
de b
rote
s no
hi
perh
idra
tado
s
Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim
Figura 22. Número de brotes exitosos en cada variedad a través del tiempo
B A
Figura 23. Brotes de Dianthus caryophyllus obtenidos in vitro. A: Brote hiperhidratado de la variedad Mercedes. B: Brote no hiperhidratado de la variedad Picote Vanesa.
Como se describió anteriormente, la hiperhidratación es un desorden
fisiológico común en las plantas de clavel cultivadas en condiciones in vitro.
En las variedades de estudio se presentó este fenómeno desde la primera
fase. Los signos iniciales se manifestaron durante las primeras semanas e
incrementaron a lo largo del cultivo. Inicialmente se presentó en las hojas
104
que estaban en contacto con el medio. Las hojas se caracterizaron por
presentar una apariencia frágil y translúcida, en algunos casos se presentaba
oxidación en las puntas de los tejidos (Figura 23 A).
En la Figura 24, se presenta el número de brotes hiperhidratados por
variedad durante las fases del proceso de micropropagación, las cuales
mostraron un comportamiento similar. Inicialmente el número de brotes
vitrificados fue mayor pero con el tiempo disminuyó. Las variedades
Mercedes y White Sim obtuvieron los resultados más altos iniciando con 63 y
54 hasta 22 y 32 respectivamente. En las variedades restantes los valores
fueron similares se encontraron en un rango inicial de 36 a 26 y finalizaron
con un rango de 13 a 3.
0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4
Tiempo
Núm
ero
de b
rote
s hi
perh
idra
tado
s
Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim
Figura 24. Número de brotes hiperhidratados por variedad a través del tiempo.
105
6.2.5 Cálculo del potencial productivo El cálculo del potencial productivo se basó en la Tasa de pérdida (TP) y de
velocidad de multiplicación (TVM), calculada para la variedad White Sim, por
presentar el comportamiento más eficiente en el proceso de
micropropagación, en comparación a las demás variedades.
Con base en estos datos se estimó la producción de 5000 plantas enraizadas
de ésta variedad en un período de 6 meses. Teniendo en cuenta las mismas
condiciones de éste trabajo.
Para producir 77 plantas enraizadas fueron necesarios 50 esquejes de los
cuales se obtuvieron 149 meristemos, el 67.1 % (TP) fueron eliminados por
diferentes causas, dando como resultado 49 plantas, estas se incrementaron
a 77 plantas con una TVM de 1,5625. Con base en estos resultados se
estimó el cálculo para producir 5000 plantas.
3273 Esquejes = 9750 meristemos (67.1 % TP) = 3200 plantas * 1.5625
(TVM) = 5.000 plantas.
Establecimiento Meristemos obtenidos * Día (D) * 1 propagadora = 100 meristemos.
No. Días laborales * Mes (M) = 24
Meristemos trabajados * (M) * 1 propagadora = 2400 meristemos.
No. de meses de trabajo = 4 = 9750 meristemos
Multiplicación Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora = 210 plantas
No. Días laborales * (M) = 24
106
Plantas propagadas * (M) * 1 propagadora = 5000 plantas.
Enraizamiento Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora = 210 plantas
No. Días laborales * (M) = 24
Plantas propagadas * (M) * 1 propagadora = 5000 plantas
Se realizó un análisis de costos para el proceso de micropropagación de
clavel (Variedad White Sim), de acuerdo con los parámetros operativos como
densidad de siembra, volumen los medios de cultivos utilizados, materiales,
prueba para la detección del virus moteado del clavel (CarMV) y personal.
• Densidad de siembra: Plantas * Frasco = 2
• Volumen de litro (L) de Medio de Cultivo MS Sigma * Frasco=0.20
• Costo (L) de medio * 100 plantas = $ 5.000
• Costo de 200 L de medio MS para 5000 plantas = $ 1.000.000
• Costo MS * Fase de Establecimiento = $ 500.000 (100 L)
• Costo MS * Fase de Multiplicación = $ 250.000 (50 L)
• Costo MS * Fase de Enraizamiento = $ 250.000 (50 L)
• Materiales * Mes = $ 500.000
• Materiales * 6 Meses = $ 3.000.000
• Costo propagadora * 1 Mes = $ 800.000
• Costo propagadora * 6 Meses = $ 4.800.000
• Prueba ELISA = $ 757.000 para 96 muestras = $ 7900 muestra.
• Costo TOTAL = $ 9.560.000 • Costo Unidad = $ 1912
107
El costo total de producción para 5000 plantas de la variedad White Sim es
de $ 9.560.000 incluido la evaluación del CarMV, lo que indica que cada
planta tiene un costo de $ 1.912. Este valor es superior comparado con el
costo de una planta obtenida por propagación convencional. Sin embargo, se
debe tener en cuenta que el valor agregado se encuentra en la calidad del
material vegetal (revigorización y control del CarMV).
108
7. CONCLUSIONES
• Se evidenció la capacidad morfogenética de la especie Dianthus
caryophyllus L. especialmente en las variedades Mercedes, Picote
Vanesa y White Sim. Se diseño un protocolo para la propagación in
vitro a partir de meristemos de estas variedades.
• La prueba ELISA detectó la presencia del virus moteado del clavel
(CarMV) en los esquejes y meristemos de las 5 variedades
estudiadas. La concentración del virus se redujo utilizando el método
combinado de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos.
• El estado fisiológico y la condición fitosanitaria de los esquejes que se
van a someter a cultivo in vitro son aspectos relevantes para el éxito
de los procedimientos dirigidos a la “limpieza” y/o eliminación del virus.
• La procedencia del material vegetal, es un factor que inciden
significativamente sobre el establecimiento, multiplicación y
enraizamiento in vitro de explantes de 5 variedades de clavel.
• La tasa de pérdida y la tasa de velocidad de multiplicación, dependen
de la variedad por lo que se concluye que la respuesta es específica
para cada genotipo.
• La tasa de pérdida durante el establecimiento se asoció con la
presencia de microorganismos (hongos y bacterias), oxidación e
hiperhidratación.
109
• La tasa de velocidad de multiplicación de las variedades Mercedes,
Picote Vanesa y White Sim pudo estar relacionada con características
fisiológicas inherentes al material vegetal.
• Las variedades Marfil y Orange Bri presentaron características
recalcitrantes al cultivo in vitro.
• Las 5 variedades son sensibles a la hiperhidratación en condiciones in
vitro. El aumento en la concentración de agar disminuye el porcentaje
de brotes hiperhidratados.
• El medio MS con macronutrientes diluidos a la mitad, sacarosa al 1.5
% y con 1 ppm de AIA fue adecuado para estimular la formación de
raíces en las plantas de las variedades Mercedes y Picote Vanesa. El
enraizamiento de las plantas in vitro de la variedad White Sim no
requiere de la adición de AIA al medio.
• Con base en el protocolo establecido para la variedad White Sim, se
estimó que para la producción de 5000 plantas madres se requiere un
período de 6 meses. El valor de una planta producida in vitro es de
$1.912.
110
8. RECOMENDACIONES
• Realizar un seguimiento en campo del material vegetal que se sometió
a cultivo in vitro para validar el proceso de micropropagación.
• Aplicar nuevamente los métodos de Termoterapia y Cultivo in vitro de
meristemos al material vegetal.
• Realizar controles activos en los bancos de plantas madres.
• Evaluar diferentes condiciones para la propagación in vitro de las
variedades Marfil y Orange Bri con el fin de optimizar la TVM.
111
9. LITERATURA CITADA
ANTHONY, J. M., T, SENARATNA., K.W, DIXON., K, SIVASITHAMPARAM
& E, BUNN. 1999. In vitro regeneneration of recalcitrant Australian plants. In
Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 35: 1062.
ARBELAEZ, G. 1987. Fungal and bacterial diseases on Carnation in
Colombia. Acta Horticulturae.216: 151-158.
ARBELAEZ, G. 1999. Overview of the cut flowers pathology in Colombia.
Acta Horticulturae. 482: 91 – 94.
AZCON - BIETO, J & M, TALON. 2001. Fundamentos de Fisiología Vegetal.
Mc.Graw-Hill Interamericana. España 522 p.
BAKER, R & H, KINNAMAN. 1973. Elimination of pathogen from shoot – tip
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Methods and Applications. Academic Press. New York. U.S.A. 735 – 739.
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126
ANEXOS
ANEXO 1. Composición del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) (1962) Soluciones Referencia (SIGMA) Reactivo mg/L Macronutrientes A3795 Nitrato de Amonio 1650 P8291 Nitrato de Potasio 1900 P8416 Fosfato de Potasio 170 monobásico C2536 Cloruro de Calcio 440 Dihidrato M7774 Sulfato de Magnesio 370 Heptahidrato Micronutrientes B9645 Ácido Bórico 6,2
M7634 Sulfato de Manganeso 15,5
Monohidrato Z1001 Sulfato de Zinc 8,6 Heptahidrato C2911 Cloruro de Cobalto 0,025 Hexahidrato M1651 Molibdato de Sodio 0,25 Dihidrato C3036 Sulfato Cuprico 0,025 Pentahidrato Vitaminas T3902 Tiamina-HCl 0,1 P8666 Piridoxina-HCl 0,5 N0765 Ácido NicotÍnico 0,5 Yoduro de Potasio KI 0,83 Glicina G6143 2 EDTA E6635 EDTA 37,3 F8263 Sulfato de Hierro 27,8 Heptahidrato Mio - inositol I3011 100
127
Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada método de cada variedad
Método de Termoterapia
Esqueje Control positivo Picote Vanesa Oranbri Mercedes Marfil
White Sim
Control negativo
1 1,27 1,3 1,326 1,101 0,889 1,131 0,1042 1,131 1,272 1,416 1,344 1,121 1,472 0,1173 1,129 1,235 1,438 1,208 1,312 1,348 0,184 1,126 1,258 1,312 1,37 1,345 1,399 0,122
Método Cultivo de tejidos in vitro
Meristemo Control positivo P. Vanessa Oranbri Mercedes Marfil White Sim
Control negativo
1 0,987 1,042 1,076 1,085 0,222 1,042 0,1092 1,121 1,101 1,356 0,945 0,864 1,011 0,1283 1,138 1,196 1,128 0,834 0,94 0,975 0,154
Método Termoterapia y Cultivo de tejidos in vitro
Meristemo Control positivo P. Vanessa Oranbri Mercedes Marfil White Sim
Control negativo
1 0,987 0,568 0,609 0,446 0,163 0,882 0,1092 1,121 0,132 0,155 0,896 0,152 0,845 0,1283 1,138 0,655 0,15 0,828 0,159 0,258 0,154
Anexo 3. Componente I Atenuación del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba ELISA para los 3 métodos.
Prueba de Normalidad Test Statistic p Value
Shapiro-Wilk W 0.858396 Pr < W <0.0001
128
Prueba de Normalidad Test Statistic p Value
Kolmogorov-Smirnov D 0.171259 Pr > D <0.0100
Anexo 4. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la prueba ELISA para los 3 métodos.
Homocedasticidad Prueba Pr > FLevene 0.8008
Anexo 5. Tabla de los tratamientos (método y variedad) para aplicar la prueba Kruskall – Wallis
Método Variedad Tratamiento Método Variedad Tratamiento
Sin termoterapia Control + 1 Termoterapia Mercedes 12Sin termoterapia P. Vanessa 2 Termoterapia Control - 13Sin termoterapia Orange Bri 3 Termoterapia W. Sim 14Sin termoterapia Marfil 4 Combinado Control + 15Sin termoterapia Mercedes 5 Combinado P.Vanessa 16Sin termoterapia Control - 6 Combinado Orange Bri 17Sin termoterapia W. Sim 7 Combinado Marfil 18Termoterapia Control + 8 Combinado Mercedes 19Termoterapia P. Vanesa 9 Combinado Control - 20Termoterapia Orange Bri 10 Combinado W. Sim 21Termoterapia Marfil 11
129
Anexo 6. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba Kruskall – Wallis para las variables método y variedad
Kruskal-Wallis Test Chi-Square 61.4789DF 20Pr > Chi-Square <.0001
Anexo 7. Componente I. Atenuación del CarMV . Prueba Duncan para las variables método y variedad
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Duncan Grouping Media N TR
A 1.3730 4 10
A 1.3375 4 14
B A 1.2663 4 9
B A C 1.2558 4 12
B A C 1.1867 3 3
B A C 1.1668 4 11
B A C 1.1640 4 8
B A C 1.1130 3 2
B A C 1.0820 3 1
B A C 1.0820 3 15
B C 1.0093 3 7
D C 0.9547 3 5
130
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Duncan Grouping Media N TR
E D 0.7233 3 19
E 0.6753 3 4
E 0.6617 3 21
E F 0.4517 3 16
G F 0.3047 3 17
G 0.1580 3 18
G 0.1308 4 13
G 0.1303 3 6
G 0.1303 3 20
Anexo 8. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha).
Fuente g.l Suma Cuadrados Cuadrado medio F-valor Pr > F
Modelo 4 0.06221913 0.01555478 4.10 0.0138
Error 20 0.07593129 0.00379656
Total 24 0.13815042
131
Anexo 9. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.82700 5 ORANBRI
A 0.79297 5 PICOTE
B A 0.75371 5 WHITE
B 0.70158 5 MERCEDES
B 0.70057 5 MARFIL
Anexo 10. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha).
Fuente g.l Suma Cuadrados Cuadrado medio F-valor Pr > F
Model 4 1.12258713 0.28064678 11.11 <.0001
Error 20 0.50512795 0.02525640
Corrected Total 24 1.62771508
132
Anexo 11. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.8063 5 MARFIL
B 0.4037 5 MERCEDES
B 0.3206 5 WHITE
B 0.2462 5 PICOTE
B 0.2282 5 ORANBRI
Anexo 12. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 1).
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 0.02160494 0.00720165 1.09 0.3803
Error 16 0.10534979 0.00658436
Corrected Total 19 0.12695473
133
Anexo 13. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 1).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N Variedad
A 0.13333 5 WHITE
A 0.07407 5 MERCEDES
A 0.06667 5 PICOTE
A 0.04444 5 ORANBRI
Anexo 14. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1).
Fuente g.l Suma Cuadrados Cuadrado medio F-valor Pr > F
Model 4 0.83866536 0.20966634 4.34 0.0110
Error 20 0.96715700 0.04835785
Corrected Total 24 1.80582236
134
Anexo 15. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.5311 5 ORANBRI
B A 0.4098 5 MERCEDES
B A 0.3689 5 PICOTE
B C 0.2127 5 WHITE
C 0.0000 5 MARFIL
Anexo 16. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 2).
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 0.08125000 0.04062500 1.24 0.3245
Error 12 0.39375000 0.03281250
Corrected Total 14 0.47500000
135
Anexo 17. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de Multiplicación 2).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.3125 5 WHITE
A 0.1875 5 PICOTE
A 0.1375 5 MERCEDES
Anexo 18. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2).
Fuente g.l Suma Cuadrados Cuadrado medio F-valor Pr > F
Model 4 1.93154882 0.48288721 21.32 <.0001
Error 20 0.45295820 0.02264791
Corrected Total 24 2.38450702
Anexo 19. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2).
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.95161 5 ORANBRI
136
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.90063 5 MARFIL
B 0.50847 5 MERCEDES
C B 0.37745 5 WHITE
C 0.26177 5 PICOTE
137