prezentacija - lab. tehnologije u molekularnoj biologiji - dijabetes

7/27/2019 Prezentacija - Lab. Tehnologije u Molekularnoj Biologiji - Dijabetes.

http://slidepdf.com/reader/full/prezentacija-lab-tehnologije-u-molekularnoj-biologiji-dijabetes 1/13

PROJEKT:

MOGUĆE PRIMJENE MOLEKULARNO GENETIĈKMETODA U DETEKCIJI NASLJEDNOG DIJABETESLABORATORIJSKE TEHNOLOGIJE U MOLEKULARNOJ BIOLOG

FAKULTET ZDRAVSTVENIH STUDIJA

LABORATORIJSKA TEHNOLOGIJA

Mustafa Korjenić, Andrea Trupina, Danira Šljivo

2013/2014



DIJABETES MELLITUSuvod

Javlja se u dva osnovna oblika, koja su klinički različita.

•Tip 1 javlja se u mlađem životnom

dobu, predstavlja oblik zavistan od

insulina. Zahvata 0,4 % populacije.Na

nastanak dijabetesa tipa 1 utiču kako

genetika tako i spoljašnje okruženje .U

toku bolesti dolazi do ireverzibilne

destrukcije β ćelija pankreasa koje

produkuju insulin, a destrukciju više

imunskih mehanizama samog organizma,

kao rezultat interakcije infekcije i genetički loše programiranog imunskog odgovora.

Lučenje glukoze i insulina u krv



•Tip 2 je češći oblik dijabetesa. Javlja

se u kasnijoj životnoj dobi i to je insulin neovisni dijabetes. U 10% populacije.

Pretežno je javlja kod starijih osoba, a

može povoljno reagovati na smanjeno

unošenje ugljikohidrata. Većini oboljelih su

neophodni oralni hiperglikemici , a jednom

broju njih insulin. 1-3% žena u tokutrudnoće ima intoleranciju na glukozu

(gestacijski dijabetes). Poslije trudnoće

regulacija glukoze se normalizuje, iako se

kod ½ ili ¾ žena kasnije razvije dijabetes

DIJABETES MELLITUS

DIJABETES MELLITUS •



MONOGENSKIoblici dijabetesa Oblici koji su nastali mutacijom samo jednog gena. Rijetki su, a do sada jemonogenskih oblika dijabetesa. MODY maturity onset diabetes of the young

Juvenilni oblik dijabetesa odraslih ↓ ••Jedan od monogenskih oblika dijabetesa tipa 2.

••Javlja se do 25-e godine života.•Normo glikemija se održava bez inzulina najmanje 5 godina nako

dijagnoze.

••Nasljeđuje se autosomno dominantno.

••Prisutna je najmanje 3 generacije jedne porodice.



••MODY 2 – mutacija gena koji kodira glikolitički enzim glukokinazu. Narednih 5 mut

koji kodiraju transkripcione faktore i to :

••HNF -4α (asociran sa MODY1), hepatocitni nuklearni faktor

•• HNF - 1α (MODY3),

•• IPF1 (MODY4), insulin promoter factor

•• HNF- 1β (MODY5),

•• Neuro D1 (MODY 6) neuronal differentiation

MODY Genetička heterogenost ••Uzroci su najčešće mutacije,delecije i dr. anomalije na drugim genima.

••Postoji više podvrsta MODY dijabetesa ovisni o vrsti mutiranog gena.

••Svi navedeni geni su izraženi u β ćelijama. Mutacija bilo kojeg gena će dovesti do d

odnosno dolazi do nastanka dijabetesa mellitusa. Geni su prisutni i u drugim mjestim

abnormalnosti jetre, bubrega …

•• MODY 7 – KLF11 •• MODY 8 – CEL •• MODY 9 – PAX4 •• MODY 10 – INS •• MO

e.



MOGUĆE PRIMJENE MOLEKULARNO GENETIĈKIHMETODA U DETEKCIJI NASLJEDNOG DIJABETESA

tema

MATERIJAL: venska puna krv koja se vadi vacumtaner sistemom u epruvetu od 3ml sa EDTA.DNK se čuva na 4◦C

DO DNK IZOLACIJE.

DNK IZOLACIJA

Izolacija se vrši iz pune krvi metodom isoljavanja:

•• Liza ćelija sa jedrom – ekstrakcijskim puferom

•• Digestija proteina – proteinazama

Nakon digestije:

•• 6M rastvor NaCl-a za za uklanjanje zaostalih proteina.••DNK se izdvaja precipitacijom hladnim etanolom •Resolubinizira u tris-ED

destilovanoj vodi.

Za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolacije DNK koristi se UV spektrofotomet

dužine (230nm,260nm,280nm). Izražavaju se odnosi između vrijednosti.

260/280nm – procjena čistoće DNK (idealna čistoća 1,8)

230/260nm – kontaminacija fenolom i proteinima (idealno ispod 0,5)



Za PCR JE POTREBNO:•• TAQ polimeraza

•• Prajmeri

•• Reakcijski puferi•• Destilovana voda

•• Matrica (lanac) DNK

•• Mg + joni

•• Nukleotidi

MOGUĆE PRIMJENE MOLEKULARNO GENETIĈKIHMETODA U DETEKCIJI NASLJEDNOG DIJABETESA

PCR polimeraza lančana reakcija

••Metoda kojom se mala količina DNK umnožava u velik

TAQ - Thermus aquaticus koja žna temperaturi oko 70 oC. Uslje

toj temperaturi vrši replikacijumolekula.Napravljena reakcion

aparat nazvan Termocycler koji



3 koraka PCRa PCR aparat



MLPA multiple ligation dependant probe amplification

••Metoda bazirana na PCR-u. Koristi 45 proba, a svake od njih jerazličitu DNK sekvencu (najčešće su to egzoni specifičnog gena o

procjenu relativnog broja kopija svake DNK sekvence.

••Probe se sastoje od dva dijela (5´ i 3´), koji se sastoje od specifza hibridizaciju i univerzalne prajmerske sekvence koja omogućav

amplifikaciju svih proba tokom multiplex PCR-a. Jedan ili oba dijelaadaptersku sekvencu koja koja omogućava diferencijaciju tokom ele

osnovu veličine probe, odnosno na osnovu produkta amplifikacije.



2.Hibridizacija DNK : Predstavlja pro

polinukleotidna lanca po principu

azotnih baza povezuju vodoničnim vInkubacija se vrši na 95◦C 1 minut,

60◦C.

MLPA se sastoji iz 5 koraka

1.Denaturacija DNK : Denaturacija DNA je proces u

kojem se razdvajaju dva komplementarna lanca,

a molekula prelazi u konformaciju nasumicnogklupka. Odvija se na 95◦ C, 5 minuta. Potom

slijedi hlađenje i uzorci se vade iz termo bloka.

DENATURACIJA

DNK



3.Ligacija:

Spajanje razdvojeni DNK lanaca

pomoću DNK ligaza. Inkubacija ide

na 95◦C 15 minutam a zatim na

98◦C 5 minuta.

LIG

4.PCR reakcija:Se odvija u 35 ciklusa. 30 sekundi na 95◦C,

30 sekundi na 60◦C, 60 sekundi na 72◦C.Završava se 20 minutnom inkubacijom na

72◦C i pauzira na 15◦C. Dobiveni produkti se

čuvaju na 4◦C umotani u aluminijsku foliju

(zbog osjetljivosti florescentnih boja na

svjetlost) do procesa separacije fragmenata.




5.Separacija: Amplificiranih produkata vrši se kapilarnom elektroforezom.

Putovanje nabijenih čestica u otopini elektrolita pod djelovanjemelektričnog polja visokog potencijala (do 30 kV) u uskoj kapilari prema jednoj od elektro

••Ispitivane probe se mogu obraditi pomoću softvera coffalyser.net. Softver omopodataka u dva koraka.

•• Analizu DNK fragmenata i komparativnu analizu uzoraka.

•• Analizm sirovih podataka na sekvenceru (elektroferograma) procjenjujemo kva

•• Analiza DNK fragmenata omogućava otkrivanje grešaka u toku pripreme uzorka

ili nepotpune separacije fragmenata, tako da se neadekvatni uzorci mogu odbac


OBRADA podataka



zaključak •• Na kraju sa sigurnošću možemo reći da nasljeđivanje (genetika) ima v

nastanku različitih oblika dijabetesa. Te da primjenom različitih meto

slučaju MLP metode bazirane na PCR-u) možemo otkriti ko može oboljeti okada i način nastanka bolesti.

•• Kao npr. MODY dijabetes koji se javlja do 25 godine života, nasljeđuje s

dominantno i javlja se u najmanje 3 generacije porodice.

ISTRAŽIVANJE:

„Nedavno je otkriveno da nekodirajući dio gena ili "smeće DNK" važan uzročnik nastanka mnogPokazalo se da "smeće DNK", za koje su naučnici dugo vremena smatrali da nema neku funkciju, im

nastanku kompleksnih oboljenja kao što su dijabetes, kronova bolest, multiple skleroza, lupOvo otkriće moglo bi da dovede do niza novih terapija i lijekova.

U istraživanju, koje je trajalo devet godina, sudjelovalo je 440 naučnika iz 32 laboratorije u Velikoj BritSingapuru i Japanu.“

http://www.abrasmedia.info/content/nekodiraju%C4%87i-dio-gena-ili-sme%C4%87e-dnk-va%C5%BEan-uzro%C4%8Dnik-nastanka-mnogih-oboljenja

prezentacija - lab. tehnologije u molekularnoj biologiji - dijabetes

Documents