novel mechanism of vitamin e protection against cyclosporine a cytotoxicity in cultured rat...

10
Novel mechanism of Vitamin E protection against cyclosporine A cytotoxicity in cultured rat hepatocytes David Andre Âs, Marõ Âa Cascales * Facultad de Farmacia, Instituto de Bioquõ Âmica (CSIC±UCM), Universidad Complutense, Plaza de Ramo Ân y Cajal sn, 28040 Madrid, Spain Received 28 February 2002; accepted 13 May 2002 Abstract Cyclosporine A (CsA) is the immunosuppressor most frequently used in transplant surgery and in the treatment of autoimmune diseases. It has been shown that CsA is able to generate reactive oxygen species and lipid peroxidation which are directly involved in the CsA hepa- totoxicity. As antioxidant, Vitamin E (VitE) has been used to diminish the toxicity of CsA in vitro. Besides its direct action as the classical antioxidant implicated in preventing lipid peroxidation, we decided to investigate the effect of VitE on the endogenous antioxidant defense system, such as Mn and CuZn superoxide dismutase (MnSOD, CuZnSOD) catalase and glutathione peroxidase (GPx) on CsA cytotoxicity in primary cultures of rat hepatocytes. In cells incubated in the presence of CsA, there was an increase in the expression and activity of MnSOD and CuZnSOD but not in that of catalase and GPx. However, when hepatocytes were coincubated with CsA and VitE, an increase in the expression and activity in all antioxidant enzymes (MnSOD, CuZnSOD, catalase and GPx) was observed. In conclusion, we suggest (a) that the imbalance between SOD and catalase/GPx by the effect of CsA is the main mechanism responsible for peroxide accumulation and cell death in hepatocytes, and (b) that the presence of VitE in culture media reduces the oxidative stress through the inhibition of lipid peroxidation, but also through the increase of the expression and activity of catalase and GPx which allows the restoration of SOD and catalase/GPx coordination, indispensable for the correct cell defense against ROS. # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: CsA; MnSOD; CuZnSOD; Catalase; Vitamin E; ROS 1. Introduction Cyclosporine A (CsA) is the immunosuppressor most frequently used in transplant surgery and in the treatment of autoimmune diseases [1,2] because of its speci®c inhi- biting effect on signal transduction pathways of cell T receptor through the formation of a CsA±cyclophilin com- plex [3,4]. The enzymes involved in CsA metabolism are hepatic CYP 3A isozymes [5,6] leading to a large number of demethylated and hydroxylated metabolites which still retain the undecapeptide nature of the parent compound [7,8]. As the clinical use of CsA presents the inconvenience of its adverse side effects, such as hepatotoxicity (choles- tasis and high levels of blood bilirubin) and nephrotoxicity, studies have been directed towards ®nding the way to counteract the toxicity of this drug [9±11]. Considering its character, most of the studies mentioned above inves- tigated the functional impairment of the liver manifested by parameters of hepatotoxicity. It has also been shown that CsA is able to generate reactive oxygen species(ROS) and lipid peroxidation [12± 15] which are directly involved in the CsA hepatotoxicity. This thesis led investigators to use antioxidants in order to diminish the toxicity of CsA. Among numerous antiox- idants checked, VitE was the best which reduced the CsA toxicity [15]. It is widely known that VitE is the main antioxidant that stabilizes cell membranes by interfering with lipid perox- idation [16]. On the basis of this consideration it has been accepted that the mechanism by which VitE exerts its protective effect is mainly due to lipid peroxidation inhibi- tion, and no later studies have investigated other possible pathways involved in VitE cytoprotection. In this context, we decided to investigate another pos- sible mechanism by which VitE exerts its protection. Thus, we studied the state of enzyme systems implicated in antioxidant defense in cells, such us MnSOD, CuZnSOD, catalase and glutathione peroxidase in primary cultures of Biochemical Pharmacology 64 (2002) 267±276 0006-2952/02/$ ± see front matter # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII:S0006-2952(02)01112-7 * Corresponding author. Tel.: 34-91-5436262; fax: 34-91-5436262/3941782/5447254. E-mail addresses: [email protected] (D. Andre Âs), [email protected] (M. Cascales). Abbreviations: SOD, superoxide dismutase; GPx, glutathione perox- idase; ROS, reactive oxygen species; CsA, cyclosporine A; VitE, Vitamin E.

Upload: david-andres

Post on 13-Sep-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

����� ������� � ����� � ��������� ���� ������������ ������������ � �������� �� ����������

���� ������� ���� �������

�������� �� ������� �������� �� ���������� ��� ������� ���������� ����������� ����� �� ���� ! ��"�� ��� #$%&% ������ �����

������� !" #�$���� !%%!& ������� '( �� !%%!

��������

����������� � )���* �� ��� ��������������� ���� ��+����� ���� � ������ ������� � � ��� ������� � �������� �������, -�

�� $�� ���. ��� ��� �� $�� �� ������ ������� ����� ������� � ����� ���������� .���� �� �������� ������� � ��� ��� ���/

����������, �� �������� ����� � )����* �� $�� ���� �� ������� ��� �������� � ��� �� ����, 0������ ��� ������ ���� � ��� �������

������� ��������� � �������� ����� ����������� .� ������� �� ��������� ��� � ��� � ���� � ��� �������� ������� �� ���

������� ���� �� � ��1 ���������� �������� )�23�� ��123�* ����� � ��������� ��������� )45�* � ��� ������������ �

������ �������� � �� ����������, - ����� ���$��� � ��� ������� � ���� ����� .� ������ � ��� ��������� � ������� � �23�

� ��123� $�� �� � ��� � ����� � 45�, 6�.����� .�� ���������� .��� �����$��� .��� ��� � ����� ������ � ���

��������� � ������� � �� ������� �7���� )�23�� ��123�� ����� � 45�* .� �$������, - ��������� .� ������� )* ���

��� ��$��� $��.�� 23� � �����845� $� ��� � ��� � ��� �� ��� �� ������� �������$�� �� �������� ��������� � ����

���� � ����������� � )$* ��� ��� ������� � ���� � ������� ���� ������� ��� �������� ������ ������� ��� ���$���� � �����

����������� $�� ��� ������� ��� ������ � ��� ��������� � ������� � ����� � 45� .���� ���.� ��� ��������� � 23� �

�����845� ���������� �������$�� �� ��� ������� ���� �� ��� ���� 32, � !%%! �������� 2����� -�, ��� ������ ��������,

'�!(���) ���& �23�& ��123�& �����& ����� �& 32

� ���� ������

����������� � )���* �� ��� ��������������� ����

��+����� ���� � ������ ������� � � ��� �������

� �������� ������� 9'�!: $����� � ��� �����;� ���/

$���� � ��� � ���� ��������� ���.�� � ���� <

�������� ������� ��� ������ � ���=���������� ���/

���� 9(�>:, <�� �7���� ������� � ��� ���$����� ��

������ �?5 (� ���7���� 9@�A: ����� �� ���� ��$��

� ����������� � ����������� ���$������ .���� �����

���� ��� ����������� ���� � ��� ���� �������

9B�":, �� ��� ������ ��� � ��� ������� ��� ���������

� ��� ������ ���� � ����� ���� � ������������� )������/

���� � ���� ������ � $���� $�����$�* � ��������������

������� ��� $�� �������� ��.��� ;��� ��� .� ��

�������� ��� �������� � ���� ���� 9C='':, ���������

��� �������� ���� � ��� ������� ������� $��� ����/

������ ��� ������ �������� � ��� ����� �� �����

$� �������� � �������������,

-� �� ��� $�� ���. ��� ��� �� $�� �� ������

������� ����� �������) 32* � ����� ���������� 9'!=

'@: .���� �� �������� ������� � ��� ��� �������������,

<��� ������ ��� ����������� �� ��� �������� � ����� ��

������� ��� �������� � ���, ���� ������� ����/

���� ����D��� ���� .� ��� $��� .���� ������� ��� ���

�������� 9'@:,

-� �� .����� D�. ��� ���� �� ��� �� ������� ���

��$���7�� ���� ���$��� $� ���� ���� .��� ����� �����/

����� 9'A:, 3 ��� $��� � ���� ���������� �� �� $��

������� ��� ��� ������� $� .���� ���� ������ ���

���������� � ��� �� ���� ��� �� ����� ���������� ���$�/

���� � � ���� ������� ��� ���������� ����� �����$��

���.�� ������� � ���� �������������,

- ���� ������� .� ������� �� ��������� ����� ���/

��$�� ������� $� .���� ���� ������ ��� ���������, <����

.� ������� ��� ���� � �7��� ������� ��������� �

������� �� ��� � ������ ���� �� �23�� ��123��

����� � ��������� ��������� � ������ �������� �

0��������� 5��������� A> )!%%!* !AB=!BA

%%%A/!C@!8%!8E = ��� ��� ����� � !%%! �������� 2����� -�, ��� ������ ��������,

5--F 2 % % % A / ! C @ ! ) % ! * % ' ' ' ! / B

� ����������� �����, <��,F �(>/C'/@>(A!A!& �F �(>/C'/@>(A!A!8(C>'B"!8@>>B!@>,*+��� ��������) �����G ��,���,�� )�, ������*�

������G ��,���,�� )�, ������*,

,--���������) 23�� ���������� ��������& 45�� ��������� �����/

����& 32� ������� ����� �������& ���� ����������� �& ����� ����� �,

�� ���������� ���$��� � ��� ������� � ��� �� ���

���� ����,

� ��������� �� ����� �

#./. ��0����

<����� ������� ���� .��� ��� 0��.����D��, 2����

������ ���� �$������ ������ .��� �$���� ���

����D, �������� .� ��� 0��������, ���� �������

.� �$���� ��� 2���, ���.� D���� �������� $� ��,

���� H�� � �������, 5����� ���$����� .��� ���

��$������ )��123�� �23�� �����* � 2���

)�/����*, 2������ ��$����� .��� ��� 2��� �

2� ���7 0�����������,

#.#. ,�����

��� H���� ��� ��� ! ������ .��� ����� $���

.����� � '"%=!(% �� .��� ���� �� ��� ���� ���������,

��� ���� �������� ��� � ������� � ��� 1���� 2� �3�

��� ��� ��� �2 4�-����! ,����� ������� $� ���

����� ������ � 2������ � ��$������ $� ���

����� -������� � 6����, �� .��� �������� .��� ���

� .��� �� ��-, � ������� �� '!/�� �����/��D �����,

#.5. �������� ��� ������ �2 3������!���

6��������� .��� ������� $� ����� ��� ���� .��� ���/

����� � ������$�� ����.���� 9'B�'": � ���� ��$������

��������� $� ���� $��� ��������� .� �.�� ������

�� C%I, !� '%A ������ ������� ���������� .���

������ ��� A%� '@ �� ������� ������ )0����=���D�/

��* � ( �J ���$����K� ����;�� ����K� ������

)����*� ����������� $� '%% -L8�J ���������

@% ��8�J ������������ @% ��8�J ������� � '%I

��� �� ����� )#�2*, � ��� ( �� ���$��� � (B� � ������;�� @I �3!=C@I �� ���������� ��� ������ .�

������� .��� ���� ������ ����������� $� !I #�2

������ ��� �� ��� � ����, 6��������� .���

������� �� ��� ���� � ���� ��� � %=@% �� �� (�

A� � !! ��, ��� .� ��������� � ����D ������� �

�������� ��� ����� )��23* � ���� � ����� �

������ ������� � ��� ���� ������, ��23 ��/��/

�������� � �� ����� .��� %,!I, ���� ��/������/

��� .� @% ��,

#.&. ��������� �2 �!����6����! -! 478 ���9�0�

������������ .� ������� ���� ��� ���� � ���/

$�� ������ ����� ����������� )J�6* ��D�� ���

����� ���������� 9'C:, <�� ������ � ����������

J�6 �� ��� ����������� ������ .� ������� $� �����/

���� ���� �7��� ������� ����.�� ����� 9!%:� �

.� ��������� � �������� � ���� ������� �������,

#.:. 7���������� �2 ����������� 0�������� �2 ;�

6!3! � 3!�� )���������� ��* ��������� .�

�������� $� M�. ��������� ���� ��#6/�� � 6��

������������, <���� ���� �� ��$�� ����� ��������

��� ������ �� ��� ��� �����, 3�� ����� ��� ������ ���

����� ������ � ��#6/�� �� ������ ��� ��� ��������

$� ���������� �������� �� ����� ��#6� .���� �� ������

.���� ��� �����, -��������� 6!3! �� ��./��������/

.����� ���������� � ��� ������� � ����������� �����7�

��#6 �� ��� ������ M�������� ������� ��#, <����

M��������� ������� �� ���������� �� ��� ���� �

��������� �������� $� ��� �����, ��������� �����������/

���� ����$��� $��� M��������� .�� ������� $� L� �����&

��.����� ��� ���� ���$� �� �����7�� $� ���������� ��

�� ��������� �� ��������� .���� ��� ����K� ���$�� ����

������ ���� ����� ��� ������ � �������� $����� ���

M��������� .���� �� ���������� �� ��� ����������

���������� �� �����, #����.�� ��� ���$��� ��

!> �� .��� ���� ���������� .��� .���� .��� 502 �

���������� ������� .��� <����8��<�� ��� ���$���

.��� ������ �� (% �� � ! �J � 502 ������ @ ����#6/�� � '% �� 6� � (B�, <�� ����� .��� .�����.��� .��� 502 �� ������ ��� ����������� ��#6/�� �

6�� ����.�� $� ����� � #��2� M�. ���������

)0����/���D���* )�������� >"" � � �������

@!@ � �� ��#6& �������� >"" � � �������

A%@ � �� 6�*,

#.<. =, �6������� ��� =��3�� -��� ����!��� �2

��������� ���;7� ��>��;7 ��� 1�6

<��� �� )>� '%A �����* .� �������� ����.�� ���

�������� ��������8����� ����� ������ 9!':,

�$��� !% �� ��.� ��$������ �� ������� $��� �����$��� ��������������� � %,CI ����� ���� ������

%,AA � ����������� ��� ����� �� 4�� 2����<� ���/

$��� � ����� ��D�� �� ���$��� .��� L� �����,

6�$����7��� .� ������ ��� � ������$�� $� �����

9!!:, <�� ������� ����� � � �� �������� .� �����/

���� ���� ������ ��123�� �23� � 45� ����

���$� 9!(:� �$���� .��� (!5/��<5 ���� �����������

���/�$���� ������ D�� )������� J� � 2�����*, N�/

��;���� � ��� ;��� .� ��� ����� $� ���� �����/

������ )�������� ������* ���� ��� ��$����7��� .���

'"2 ��$����� �� ���$� � ����� �����, <��

���$����� � ��� ��������� � ��� ������ � � ���

��� +���;���� $� ���� ����������� ��� ���

;������ .� �� ������ �� '@I,

#.?. *��!� �������! ����!�

#����.�� ��� ���$��� �� (� A � !! �� .��� ����

���������� .��� .���� .��� 502 � ����� �� �������

��� ������ ��������� ��� ������� ������� ���������� �

�������� $� �� ���� )502* � ������� � ���, <��

!A" 7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?<

������� .� ����� ���� �� '@ �� � >� � ����������/ ��� �� ������� ���� ��$��� � ��� ������� ���� ��

�7��� ������� ����, �������� �7��� ���������

.��� ������� � ����.�F ����� .� ��������������/

������� ��������� $� ������� �������� $���$�� �

!>% � ���� ������� �������� � ��$����� 9!>:& �����/

����� �������� )��123� � �23�* .� �������

��������������������� $� �������� ��� ���$���� � ���

���������� � ���������, 2����� ����� )' ��* .�

���� �� ������� �23� ������� ��� ��� � ��123�

9!@:, 4�������� ��������� ������� .� ��������� �

����� ��� ����� ��� �������� � ������ � �����/

���� $� ��� ������ ���������� ������$�� 9!A:, 23�� �

����� ��������� .��� ��������� � ���� ��� ��������

������, 3� ��� � 23� �� ��� �� ���� � �7���

��� �������� @%I ���$���� � ��������� ����������,

3� ��� � ����� �� ��;�� � ��� ���� � �7���

��� ��� ���� ' ���� � ������� �������� ��� �� �

!@�, 5����� �������� .� ��� ����.�� 0�� ��� 9!B:���� $���� ����� �$��� � �����,

#.$. ���-������0 2� ��������� �2 ��>��;7�

���;7 ��� �������� �������

<����� ����� .��� .���� ��� � 502 � ����� � ���/

���� $� �� ������ @% �� <���� '@% �� ���� @ ��

��<�� %,@I ������ 5/>% � ��� ������� ���$�����

�������������� ���M������ )5�2#*� ������ � ���/

����� )2���*, 5����� ���������� .��� ���������

���� ��� 0�� ��� ����� )2���*, H���� ���� ������

.��� $����� � �+�� ������� � ����� $� �� )'!@ ��

<���=6��� �6 A,"� >I 2�2� !%I �������� � '%I !/

������������*, 5����� ������ .��� ��� ������� $�

H����� $��� �����, ���+���� � ���� ������ ������

�+�� ����� � ������ )!% ��* .��� ����� ��� '!I������ ���� ��� <���=6�� )0�� �*, 5������ .��� ���/

���� ������������������ � ��� ����� �� 5��# ���/

$��� )6�$��/5� ������� J� � 2�����* ���� ���

0�� � ��������������� <�� �� ����, #�� �����$�������

���$��� .��� $���D�� .��� '%I �/ � ����� ���D �

<502 �� ! ��, 5����� ��$��� ���� ������ ��1/

23� ��23� )��$������* .��� ������ � ������� �

'F!%%%%� 'F'%%% � 'F'%%%� ������������ �� !> �� � >�,� ��� .����� ��������� ������� ��$����� )��/�$/

$�� � ��/����� -�4/��������� ��O�����* .��� ������

� 'F'%%%% � 'F!%%% �������� ������������ �� ' �� � >�,0���� .��� .����� ���$��� � ��������� �����

��������������� ������ )��J� ������� J� �

2�����* � ������� �� ������������� ;��, �/����)2���* .� ��7�� � ���� � ����� ������,

#.A. ����������� ����!���

<�� ������� .��� �������� � ��� � 2� � ��� ������/

���� �$�������� ) ��� ����*, <��� ������ �� .���

������� $� ���� 2�����K� � ����, )* ���� ���� ���

����������� ������, <� ������ ��� � ������ ���/

��� .���8.������ ����� �.�/.� ��3�� ���� .� ����,

5��.��� ��������� .��� �������� �������� 2��/

���=��.�=P���� ���� 3�� ����, )$* �� ������ ��� ��

����, #�� �� ������ � � %�%@ .� ������� � ����;��,

� �������

5./. ��, �!����6����!. ���������� -! B��*

-������ �� ���������� � �� ��� �� ������ �� ���

����� � ���$����� ������������, 5����� ��������� ���/

����� .��� ������� �� ������� ���������� � ���

��� % �� @% �� �� (� A � !> ��� � J�6 ��D�� .�

������� � ���� � ���� ��������, #��, ' ���.�� �

��������� � ��� ����� ��� ��� ��������� � ��� � ���.�

����/ � ����/�������, <�� ��.��� ���������� � ���

���� $�� �� ���� ����;�� �������� ��, ������� � J�6

��D�� � !> �� � ���$���� ��M����� ���� � ����

���$�� �������� �������� .��� �������� .��� '% ��.��� ��� ����� !@,@ � !," ��, '(,! � ',> )� � %�%@*, ��@% �� ��� �� ������ ��, ������ .��� ������� ������

���� �� !/ ��� )!!AI* ��� ������ ���� !C,C � (,% ��,

'(,! � ',! )� � %�%@*,#��, ! ���.� ��� � ��� � ���� .�� �����$��� .���

��� )%=@% ��* � !> ��, H� �$����� ��� ���� ������

�������� ���� ����� � ���� $��;��� � ��� .� ����;/

�� � ����� '% � @% �����, <���� ���� ���� ��������

�� ����� � '"�%� '�! ��, !@�@� !�" )B%I� � � %�%@* �!%� !�' ��, !C�C� (�% )ABI� � � %�%@*� ������������,

5.#. *22��� �2 B��* �� ;� ���������

#��, ( ���.� ��� � ��� � ���� .�� �����$���

.��� ��� )%=@% ��* �� !> �� � �������� ������� �

#��, ', <��� ������ � ��������� � ���� � ��� )%=@% ��* � �������������� � �� ����������, 6��������� .��� ���$��� .��� ��� )%=

@% ��* �� (� A � !> ��, J�6 ��D�� �� ����������� ������ .�

������� � ������������ ����, �� �� �������� � ��� �� � 2� �

��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � ������� $� ����

2�����K� � ����, �� ������ .��� ��������� ���� ��� � � � %�%@ )*

���� ���� ��� ����������� ������,

7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?< !AC

�������� � �� ����������, <�� ����� �$���� ������

������ ��� ���� �������� ��� ������ � ���������

������� $� ��� � ��� � ���, <���� ����/�������

����� .��� ����;�� � ��� '% � @% ��.��� �����

� 'A@C � 'B' ��, !@'> � !>C )A@I� � � %�%@* � !%%%� '"C ��, (%!! � !CC )AAI� � � %�%@*� ������������,#��, > ���.� ��� � ��� � ���� � ���������� �������

� �������� � �� ���������� .�� ���$��� .��� ���

)%=@% ��* �� !> ��, -� � $� �$������ ��� ��������������� �������� �������� .�� ��� ���������

�������, �� ������ .��� ����;�� � @% �� ��� �

�������� ���$��� .��� �� .������ ����, 6�.����� �

����;�� �� ������ .��� �$������ $��.�� ��� ��������

������ .��� �� .������ ����,

5.5. =, ����� �2 �����6����� ���!���� �!����.

*22��� �2 B��*

#��, @ ���.� ��� ������� $��� ����� )#��, @�* �

��� +���;���� $� ���� ����������� )#��, @0* � ���/

����� ������� ������� )��123�� �23�� �����

� 45�* � (� A � !! �� � ���$��� .��� ��� �

$���� �� ������� � ���� @% ��, H� �$����� �����123� � �� ��� �� ������ ����;�� �������

� ( � A �� � ���$��� .�� ���$��� � ��� $����

� ����, 6�.����� � !! �� � ������� ��� ����� �

��123� �������� ������� ����;���� .��� '% �

@% �� ��� ������ ���� �� (/ ��� )('%I* ��� ������

���� )>"%� >! ��, '@@� 'A� � � %�%@*, H�� �����/����� .��� �����$��� � ��� ������� � ��� �

���� ��� ��123� � �� ����� ���.�� �����������

������ ��� ������ � !! �� ���� �� >/ ��� )>'%I* ���

������ ���� )'%(>� CC ��, !@!� !B� � � %�%@* �@% �� ���� �� ��� ������ �$���� � ��� ������� �

��� ������� .� ������ �� � ��� $���� )>'%I ��,

('%I� ������������*,

�23� � �� ����� ����.�� ���� � ���� ����/

��� ������ ��� ������ ����;�� ����� � @% �����

#��, !, � ��� � ���� � ��������� � ���� � ��� )%=@% ��* �� !> ��,6��������� .��� ���$��� .��� ��� )%=@% ��* � ��� $���� ��

������� � @% �� ���� �� !> ��, J�6 ��D�� �� ����������� ������

.� ������� � ������������ ����, �� �� �������� � ��� �� � 2�

� ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � ������� $� ���� �.�/

.� ��3�� ����, 5��.��� ��������� .��� �������� ��������

2�����=��.�=P���� ���� 3�� ����, �� ������ .��� ���������

���� ��� � � � %�%@ )* ����� ���� ����� �������� )$* �� ��������� �� ����,

#��, (, � ��� � ���� � ��� ���������� ������� � ��������� �

�������� � �� ���������� � ��� ������� � ��� )%=@% ��* �� !> ��,#����.�� ���$��� .��� ���� � $���� �� ������� � @% �� �����

���������� .��� ������� .��� ������� � ���$��� .��� @ �� ��#6/

�� � ! �J 502 �� (% �� � (B�, <�� ������ .��� ����� � ��� ���������� ��������� .� ��������� $� ��. ���������, �� ��

��������� � �$����� ���� ) ���������� �������*, �� �� �������� �

��� �� � 2� � ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � �������

$� ���� �.�/.� ��3�� ����, 5��.��� ��������� .��� ��������

�������� 2�����=��.�=P���� ���� 3�� ����, �� ������ .���

��������� ���� ��� � � � %�%@ )* ����� ���� ����� �������� )$*

�� ������ ��� �� ����,

#��, >, � ��� � ���� � ��� ���������� ������� � ���������� �

�������� � �� ���������� � ��� ������� � ��� )%=@% ��* �� !> ��,#����.�� ���$��� .��� ���� � $���� �� ������� � @% �� �����

���������� .��� ������� .��� ������� � ���$��� .��� '% �� 6� �

! �J 502 �� (% �� � (B�, <�� ������ .��� ����� � ��� �

��������� ��������� .� ��������� $� ��. ���������, �� ��

��������� � �$����� ���� ) ���������� �������*, �� �� �������� �

��� �� � 2� � ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � �������

$� ���� �.�/.� ��3�� ����, 5��.��� ��������� .��� ��������

�������� 2�����=��.�=P���� ���� 3�� ����, �� ������ .���

��������� ���� ��� � � � %�%@ )* ����� ���� ����� �������� )$*

�� ������ ��� �� ����,

!B% 7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?<

#��, @, � ��� � ��� � ���� � ��� ��������� � ��123�� �23�� ����� � 45� � ������ �������� � �� ����������, ������� $��� ����� �

45�� ������ �23� � ��123� � ���, �� .� ������� � ��7�� $� ������� $������ ���� �����$���� 45�� ������ �23� �

��123� �����, 5�� � ���.� ������������ ������� $���� .��� '"2 � �� ���$� �� �� �����7��� � ��� 0 ���.� ��� +��� ����� �

�$����� ���� ��� ��������� .��� '"2 � ��, <�� ����� �� �������� � ��� �� � 2� � ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � ������� $� ����

�.�/.� ��3�� ����, 5��.��� ��������� .��� �������� �������� 2�����=��.�=P���� ���� 3�� ����, �� ������ .��� ��������� ���� ��� �

� � %�%@ )* ����� ���� ����� ���������� ���� �������� )$* �� ������ ���� ��� ���������� ��������� .������ ����,

7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?< !B'

#��, A, � ��� � ��� � ���� � 45�� ������ �23� � ��123� ��������� � �������� �� ����������, <�� ��������� � 45�� ������ ��123� �

�23� .��� ������� � ������$�� 9!>=!A:, 45� ��������� � ����� ��� ����� ��� �������� ������, 3� ��� � 23� �� ��� �� ���� � �7���

��� �������� @%I ���$���� � ��������� ����������, 3� ��� � ����� �� �� ��� � ��� ���� � �7��� ��� ��� ���� ' ���� � �������

�������� ��� �� � !@�, <�� ����� �� �������� � ��� �� � 2� � ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � ������� $� ���� �.�/.� ��3��

����, 5��.��� ��������� .��� �������� �������� 2�����=��.�=P���� ���� 3�� ����, �� ������ .��� ��������� ���� ��� � � � %�%@ )* �����

���� ����� ���������� ���� �������� )$* �� ������ ���� ��� ���������� ��������� .������ ����,

!B! 7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?<

#��, B, ��123�� �23�� ����� � 45� ������ � �������� � �� ���������� ���$��� .��� ��� � $���� �� ������� � ����, 5����� ������ .���

����� $� H����� $��� �����, - ��� � � $� �$������ ��� ����� ��� ��J ��������, 5�� 0 2��.� ��� +��� ����� � ��������������� �����

� ��� � $� ���� ����������� ��������� � �$����� ����, �� �� �������� � ��� �� � 2� � ��� �� ���� �$�������� ) ��� ����* � �������

$� ���� 2�����K� � ����, �� ������ .��� ��������� ���� ��� � � � %�%@ )* ���� ���� ��� ����������� ������,

7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?< !B(

� �� ������� � ���$��� �����, H�� ���� .� ����

�� ������� ����� � ����;�� ����� .��� �������� � (

� A �� � ���$��� � � ��������� � ��� �����&

��.����� � !! ��� ������� � �23� � �� .���

�������� � ��� ��� '=@% �� ���,

- ��� ��� � ������ � �� ����� ����.�� ����;/

�� � ����/������� ����������� ������� � ( �� .��

����� .��� ���$��� .��� ���, �� ����;�� �����

.��� �������� � A � !! �� ���� ��� �������, - ������

����� ����� .� ����/������� ������� � �����

� ��, H�� ���/������ ����� .��� �����$��� .���

����� ����� � �� ����.�� ����;�� ������ � (

� A �� ������ ��� ������ �� ������ � ' �� � ( ��

)@AA� @C ��, (%C� !"� � � %�%@* � � '% �� ��� �

A �� )!"B� !B ��, ''>� '!� � � %�%@*, �+����� � !! ��� ���$���� ����� .��� ����;�� ������� ��� ' ��

@% �� ���.���� ��� �� ����� .� ������ )'C"� 'B ��,

@� '�(� � � %�%@*, -� .� ��� �$������ ��� ��� ������������� ����� � ������ ����� ������������� ���������

.�� ��� ������ � ���$��� �������,

H�� 45� � �� ������ .��� ������ � �� ������

.��� �$���� ���� ������� � �������� ���$��� .���

��� ���, 6�.����� .�� ���������� .��� �����$���

� ������� � ����� 45� �������� ����� ����;����

������� � !! �� � ���$��� � ����/�������

���,

H�� ��� ������ � ������� �7��� � ��� .���

������� � ����� ������ .��� ��� ��� � � �����

�����$��� .��� ����� � �� ������ .��� ����;����

������� � ����� ����� ������� ������ � ����� ��������

������ .��� ��� �������,

5.&. *��!���� �������! ��� ������ ����� �2

����0����� �����6����� �!����

#��, A ���.� ��� �7����� ������� � ��123��

�23�� ����� � 45� � ���/������ ����������

���$��� .��� �� .������ ����, 0������� ��� �������

���.�� ��� ��� ������� � ����� �7���� ����.��

������ ����� � ������� ������� �� ����� ���.

$� � �� �����, <���� ��� ������� �7����� �������

� ����� ����� ������ .��� ��� � ���� .��� ������ ��

��� �$���� ��� ���/������ �����,

#��, B ���.� ������������ H����� $��� ����� �

��123�� �23� � ����� � !! �� � ���$���

.��� ��� � ��� $���� �� ������� � ����, �������

����� ������� .��� ����� �$���� $� ������� $���� ���

������ ����� � ��� ������� �7���� ����� ����.��

��� ��� ����� � ����� � ����� ���.�� $� � ��

����� � !! �� � �������, - ���� ��� ��.����� .� �����

�� ������ ��� ������� � ��� ����� �$���� � �����

������ .��� ��� � ����� �$���� � ����� �����$���

.��� ��� � ����� $����� ����� ���������� .���

������ ��� � �� ���� ��� � � �� ���� ���$����

���� .� ����� �� �����7� ��� �.�/.� ��3�� ���� ��

������ ��� ��,

� ����������

��� �� ��� ���� ���� ��+����� ���� � ������

������� $����� � ��� ����� ���������������� ����

9!":, 6�.����� ��� ������ ��� �� �������� $� ������

���� � ���� ���� � ����������� ������������� � ������/

����� � ������������� 9'%�''�!C:, 5������� ������� � ���

����� ���$������ ��� 32 ��������� � ��������

������ ������� �� ������� � ��� ������������� 9'>�'@:,

<��� �������� ��� �� �� ��� �������� � ����� ��

������� ��� �������� � ���, ���� ��� �� ����/

����� .� ����� ����� )����� �/����������� � �� ��/

�����* � .� ������� ����� ���������� � ��� �������

J�6 ������ ��� )�� �� ���.*, ���� .� ��������

$����� �� .� ��� ���� � ������ �������, H� ���

����D�� ��� ���� .� $�� �� ������� ��� 32 ���������

������ $� ���� .����� �� ������ ����� ��� �� ���� $�

�������, -� �� .����� D�. ��� ���� �� ��� �� ���/

���$�� ������� ��� ��$���7�� ���� ���$��� $�

���� ���� .��� ����� ���������� 9'A:& � � ��� $��� �

���� ����������� �� �� $�� ������� ��� ��� �������

$� .���� ���� ������ ��� ���������� � ��� �� ���� ��� ��

����� ���������� ���$����, 6�.����� � ���� ��������

.��D� ��� $�� ��������� �� ����� ����� �����$��

�������� $� .���� ���� ������ ���� ��������� � ���/

����� ������ ��������, <���� ���� .� ������� ��� ������/

��� � ��� ������� �7����� ������ ��123��

�23�� ����� � 45�� ��� ����� � ������ � ���

�7����� ������� � ���������� ������ .��� ��� �

$���� �� ������� � ����,

��� � ��� ������� �7���� $��� �������

�� $� ����� ����� ���� � ���� �� ��� ���� 32&

��� ��������� � �� � ���� �� ������� �� �����

� ;���� ���������, -����� ��� �������� ���� � 23�

� ����� �� ��� �� ���� �� ��� ������� ����

����� ��������, 2��������� �� �� ������� � ���$��

������� ������ ���������� �� � ������ � ������/

���� ��������� ���� � $����� ������ � �����, 23�

�� ��� �7��� ��� ������� 3!�� )���������� ��* ��

6!3! � ����� �� ��� �7��� ��� �������� 6!3!,

-� �� $�� ������$�� ��� ����� � ��� ������ �

6!3! �������� �������� ����� ����7�� $� 23� 9(%:�

� ��� ���� ������ � ��������� ���$�� ����� �������

9(':,

3�� ������� ���. ��� � ���������� ���$��� �� !! ��

� ������� � ���� ��� ��� ���������� ������ ����� �

�7����� ������� � ��123� ����.�� ������ �

������� �� ��� �������� ������ ������� $� ���, �

������� �������� ��� � $� �$���� ��� �����

�������� �� ��� ��� $�� � �� ������ � ��123� �

������ ����� ��������� .�� ���� � ���$���

�������� .���� �� � ������� .��� ��� ������� ���/

������� ������$�� $� ����� ������ 9(!:, �������������

�������� ���������� ������ ��� $����� � �������

���� �������� ������ �� ������� � ��� � !! �� �

���$���,

!B> 7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?<

�23� �� ��� ��� ��� � 23� ������ � ����������

.���� ��� �������� � ����� ������� ���� ����� �

3!�� �D�� ����, 3�� ������� ���. ��� � ��������

������ ������� �23� �� ������ ������ �� ��123�,

5����� ������ �������� ������ �������� �� $�� ��

������ �23�� $�� �� ��123�, -� �� D�. ���

��� �������� �������� � ���������� .�� ���

$���D� ��� �����$����� ������� ���� 9((:� ��������

������ � ����������� �!� ��������� �

�������� � ����������� ������� ������� ���, <����

����� ���� ��� �������� ������������� ��������

9(>=(A: � ��� ��$��+��� ������ � 32 ���������,

- ���� .�� ��� ������ �23� ������� ����� $� ������

���� ��� �������� ������ ������� $���� � �����������

����� .���� �23� �� ������, ������������� ��� 32

������� �� �� ����������� � ����������� ������ ����

��� �� ���$���7�� $� ���������� 5/>@% (� ��� ���

������� 32 9(B�(":,

�� ������$�� ����������� ��� �������� ���� $��.��

23� � ����� �� ���� ������� �� ��� � ;����

��������� ���� 32, H�� ���������� .��� ���$���

.��� ���� ����� � �� ����� ��� �� ������, -

�������� ������� 9'>: .� ���������� ��� ��� �������

�������� ������� .���� ������ � ���������� ����� ����/

�����, <�� ������� � ���������� ����� �� �������

������� ��� ������� � $��� 23�� .���� ��� ��������

������ �� ��� �� ��� �������� �� ���$���� � ������

��� �� �7��� �������$�� �� ��� �������� � 6!3!,

��������� ��� ����� �7��� �������$�� �� ��� ���������

���� 6!3! � ����� ���������� 45�� ��� �� ������ ���

��� ��������� � ����� ������ .��� ���.�� ��� ����/

���� ������ �D�� ����,

H�� ���������� .��� �����$��� .��� ��� � �����

��� ����� � ������� � ��123� � �23� � �����

����� .� ������ �� ��� �$���� ��� ���������� ������

��� .��� ���, 6�.����� ������� � ����� �7���� .�

�������� � ��.�� ���������� � ���� ������� ���

���� �������� ��� ������� � ����� �7���� � ������

�������� � ����� ��� ������ � � �� ������ �� �

����� ������ .��� ��� ���, 6�.����� ��� ���� ������/

�� ���� ��� ���D ���� � ���������� ���$��� .���

���� .� ��� ������� ������� � ����� � 45� ���

������� � �� ������ ������ ����� � �7����� ����/

��� � ������� �� ��� �������� ������� .���� ��������� �����

�� ������� � ;������ ��� ��������� �������, <���� ���

������� � ���� � ������� ����� �������� ��� ��������

���� $��.�� 23� � ����� � 45� ��� ����� ���

��������� � 6!3!,

- ��������� .� ������� ���F )* ��� ��$���

$��.�� 23� � �����845� $� ��� � ��� � ��� ��

��� �� ������� �������$�� �� �������� ������/

��� � ���� ���� � �������� ���������� � )$* ���

������� � ���� � ������� ���� ������� ��� ��������

������ ������� ��� ���$���� � ����� ���������� ) .�����

D�. �������*� $�� ��� ������� ��� ������ � ���

��������� � ������� � ����� � 45� .���� ���.�

��� ��������� � 23� � �����845� ����������

�������$�� �� ��� ������� ���� �� ��� ���� 32,

�������� ������

<�� ������ .���� ��D� �� ��D ������� ������ �� ���

���$�� ������� ������� � 5�� ����� ���D J��� ��

��� ���� � ����� � ��� �������� � ��� ��������,

H� �� ��� ���� �� �� ��, ���� H�� ��� ������� J��,

)0���� 2.��7����* �� ��� ������� �� � � ���� � ��,

Q,J, <���� �� ��������� �������� �� .��� ��� ������

45�� ��123� � �23� ���� ���$��, <��� �����

.� ��������� $� #-2 )#��� �� -���������� 2����*

CC8'%>@ � ��� )������� ������� �� �����*

%","8%%'A,'8'CC",

����������

9': P� 0�, -��������������� ������, ���� 3�� -�����

'CC!&>F@@(=A%,

9!: 0���� Q#� 0�� 4� ���� -� ������ 5� #�� �� ������� ���

�������� Q�, - ���� ������������ � ���� � ���������� � ����

�����, ��� 5������ 'CCA&(@F''@=!>A,

9(: J�� Q� #���� Q� Q�� J� H2� #����� Q� H����� -� 2�����$�� 2J,

�������� �� ����� ����� � ����������=���������� � �

#P05=#P @%A ���������, ���� 'CC'&AAF"%B='@,

9>: ����� 52� L��� P2� #������ 2� ����� ��� ��������� ��

�$���� 4 � 6��7�$��� J�, <�� ����� � ���������� � � #P @%A

������� ���� ���� � ��� ������� � < J����������, ��03 Q

'CC%&CF>>!@=(',

9@: ������� 2�� J�� �Q�� ����� J� H�� Q??� ���� 22, -��$����

� ���� ���$����� � �� � ��� ����� ���������� $� #P@%A �

����������, <����� 5��� 'CC'&!(F!B"A=",

9A: 5���D������ <� ������ ��� ����� ��� 2.��� ��� <���� 5��

0��� J1, ����������� ���$����� $� �� ����� ����������, ���/

���� �� ��������� � �7���)�* ����� �� ����������� 5/>@%

(�, ���� ���$ ������ 'CC(&!'FB(%=B,

9B: P��$�� <� #����� �� ������ L�, ���������� ���$����� � ���

�����F ����� ����� � ���������� 5/>@%--- ��� ���� � ��� �O��

����������/���$���7�� �7��� ������ ��������� � ����������

.��� ����� �����, ��� 5������ <��� 'C""&>(FA(%=@,

9": ����� 4, ���$����� � ����������, <����� 5��� 'C"@&'BF'C=

!@,

9C: 0�.��� �J, 2������ � ���������� � ���$����� �������� � ���

� ��������� ������� �������, <����� 5��� 'CC%&!!F''(@=A,

9'%: 4� �-� #�����7 �� ��� �� ��R�7 ��� Q����7 , ������/

����� � �������������F � ��� � �������� ������� .��� ������/

����� � $����� ����� �������� � ��� ��, ��� ��� 5������ 5������

'CC@&!!F!A%=@,

9'': ���77� 4� 5����� �, ����������/������ ��� ��� ����� �

���������� ���� � ����, P���� -� 2���� 'CC@&@!F2B%=>,

9'!: H�� �� <������$��� �#� ����7/#�����7 �� 5����� 5� ������� �,

��� � ��������� � ���������� � � ����� �������������, <��/

��� 5��� 'CC>&!AF!C'!=>,

9'(: H�� �� <������$��� �#� ����7/#�����7 �� 5����� 5� 6��� 2�

<������ H�� ������� �, ���������� �/������ �������� ������ �

�� ����������, Q 5��� ��� <��� 'CCB&!"%F'(!"=(>,

9'>: ������ �� 27 �� 1���7 �� �����7 ��� ������ �, ����� �

������� �� ��� ������� ������ $� ����������� � � �������� �

���������� ��� !/ � '!/����/��� ���, 0������ 5������

!%%%&@CF'%C'='%%,

7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?< !B@

9'@: ������ �� �����7 ��� ���7/#����7 �� 1���7 �� ������ �,

625B% ������� $� ����������� � � �������� �� ����������F � ���

� ����� � �������, Q 6����� !%%%&((F@B%=C,

9'A: <���� �J, 0�������� ������� ��������� ���� ����� �������/

��� ����, �� Q ��� ���� 'CB%&!(F''(B=C,

9'B: ����7/#�����7 �� 0���� J� #�����7/2���� J� �����7 ��� ��/

���� �, ��������� $��.�� ������ ��� ������ � ��������

� ����� ���� ����� ������� � ��������� ������ $� ����/

�������, 6�������� 'CC(&'"FC'!=",

9'": 2���� 3� -������ � ���������� $� �������� ��� ����, -F

<���� ��� #�7��� Q�� �������, ������� � ����������� ���, '�,

��. ?��DF ������� 5����� 'CC(, �, !('=A',

9'C: H����� ��� ����� �� �7��� ��D�� � ������� � ������������

� �������� �����, -F <��� ��� #�7��� Q�� �������, - ����� ��������

��������, ������� � <���������, ��. ?��DF ������� 5����� 'CC>,

�, >A=C,

9!%: ����� �� J���� �����������, L�/������� .��� �������

� ���6, -F 0�������� 6L� ������, ������� � �7�����

������ ���, (, 4����F ����� ������ H������� 'C"B, �, ''"=

((,

9!': �����7��D� 5� 2���� �, 2����/���� ������ � �� ������� $�

��� �������� ��������/�����/������ ��� ��������, ��

0������ 'C"B&'A!F'@A=C,

9!!: ����� �, ���������� � ������ ��� ��$����7��� ��� $�

����������� ������, �� 0������ 'C"A&'@!F(%>=B,

9!(: <���� QJ� <���� P-, -��$����� � �������� ������ ����� ��� $����� �

������� ��������� ������ �� �������� �������� � �������� � ��

���� ��������, ����������� 'CC@&'(AF!>!=@!,

9!>: ��$� 6� 6������/��������F �������/�������� �������������

)�� ','',',A*, -F 0�������� 6L� ������, ������� � �7�����

������ ���, (, (�� ��, 4����F ����� ������ H������� 'C"B,

�, !B(="!,

9!@: ��� ������ #� ������ H� ������ � 2��������� ���������

����� � ��������� ��������� � ���������� � ���

$�� ������, -F 4���.�� � ���� 4� �������, 3���� ������

� ����� ������� �������� ���, !, ��. ?��DF ��������� 'C"(, �, !"=

((,

9!A: 4�S7��� H�� P����� 6� #����� J, � �������� ������� ���� �����/

���� �� ��������� ��������� � $����, P�� ���� P�� 0������

'CB>&'!F>>>=@!,

9!B: 0�� ��� ��, ��� � �������� ������ �� ��� +��� ����� �

�������� ����� � ������ �������� ��� �������� � ������/���

$����, �� 0������ 'CBA&B!F!>"=@>,

9!": 2��� �6� ����� #Q� -��������������, -F 5�� H�� ������,

#������ ���������, (�� ��, ��. ?��DF �� 5����� 'CC(,

�, C%(='@,

9!C: ����� 4�� ��$�����/��� H� J���� �� ��7� �� 3���$����� ��

5�7���� �� ��� 4� 0�����/0������ �� 0�7�� #� 0��� #� �����

4, 6������������ � �������� ����������� � � ������ .��� ����

��������� ������� � ���� ������� �������, J���� 'CC@&'@F(!%=(,

9(%: ����� 5� 5��D� �� 2�� 4� ������ ��� ����� � 1$��� -� �������

5, <�� $��� $��.�� ��81/���������� �������� � �����

���� ��� ���������� � ����� �������� ����� �� �������� ������,

0����������� 'CC'&(%FC(%@='(,

9(': 4������7� ��������/������� ��, ���������� � ��� D�����

�������� �� ��� TT������� ��$�����KK �������� � $���� �����

����� $� ������� ��������, Q �7��� -��$ 'CCA&'%F'AB=B@,

9(!: ���� � 6� H������ ��� 6����� � � <D���� � ���� 6?�

?� 05� ������� �, ��������� � ���� ����� �� �������

�7���� � ��� ����D ������� �� ������ � ������ �������� � ��

����������, Q ���� 5������ 'CCA&'AAF>@(=A%,

9((: 6������ �5� ������ ��, -��$���� � �!�/������ ����/�/������� �.����� � ����� � ���� ���������� $� ���������� ��

���$$�� ����� $� ��� ���$���� $���� �� ����������/�����

��������/������ ���/��� �������� � �������� �� �������� .���

��� ���� ��������� ��������, 0������ Q 'CC%&!A"F'@(=A%,

9(>: Q�� P� 5����� �, - ����� � ����������� � � ��� ��������� �

������� �� D���� ����������, #�02 J��� 'C"@&'"(F'AB=C,

9(@: Q�� P� ������� �� 2����7 5, -��$���� � ������ � D���� ����/

������ ������� ��� ��� ������ .��� ����������� �, ������

'C"B&>@F>(=@,

9(A: #������ �� ����� 4� ����� �, ����� � ����������� � �������/

���� ������ �����, Q 0������ 0�����$� 'C"B&'CF!CB=(%(,

9(B: 2���� #� 4����� Q� ����� PJ� P� 0�� 2����$�� 6H, 4������ �

����� ��� ������ ����� ��� ���$����� � ����������� �F

����/� ��� ���������� .��� ���$����� ���$����, ��� ���� 0��/

���� 'CC(&'!!F'%'='!,

9(": 2���� #� 4����� Q� ����� PJ� P� 0�� 2����$�� 6H, 3����

����� ������ $� ��� ���������� 5>@% ������ � ������� ����/

��� �� ����������� ��������, <����� 5��� 'CC>&!AF!"AC=B%,

!BA 7. ,������ �. �������� @ ����3����� �3������0! <& �#%%#� #<?�#?<