manualpraktikum page1of54...page4of54 daerah (zone electrophoresis).pada teknik elektroforesis...

ManualPraktikum Page1of54

MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian Produksi Ternak)

Semester Genap 2020/2021

Page2of54

Tim Penyusun:

Hartutik, Prof. Dr. Ir., MP. IPU

Siti Chuzaemi, Prof. Dr. Ir., MS. IPU

Abd Manab, Dr. Ir. S.pt. MP

Aswah Ridhowi, S.pt., M.Sc

Asri Nurul Huda, S.pt., M.Sc. MP

Firmansyah Tri Saputra, S.pt., M.Sc

Firman Jaya, S.pt., MP

Tri Eko Susilorini, Dr. Ir. MP., IPM

Wike Andre Septian, S.pt., M.Si

Marjuki, Dr. Ir. M.Sc

Maniek E. Sawitri, Dr. Ir. MS

Aulia Puspita A.Y., S.pt., MP. M.Sc

Poespitasari Hazanah Ndaru, S.pt.,MP

Puguh Surjowardojo, Dr. Ir., MS

Muharlien, Dr. Ir., MP

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2020

MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian Produksi Ternak)


Page3of54

Materi I

ELEKTROFORESIS

Dasar Teori

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan

protein melalui perbedaan potesial partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis

kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik

(titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar

muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 1996). Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak

atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua

molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak

lebih cepat ke elektrode (David G. Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium

penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai

bermigrasi secara berangsur-angsur (Ricardson dkk. 1986) sesuai dengan porusitasgel.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti

protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan (mis: Commasie Blue) atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan

densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi

sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik

isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila

senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi

konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

yang akan dipisahkan. Sebagai akibatya adalah terbentuk pita (band) yang dapat diwarnai agar mudah

dilakukanidentifikasi.

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif

(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-

partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings,

1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul

berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam

(stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol bermuatan

listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan

muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter

kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik. Mobilitas

elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan dalam cm per detik yang disebabkan

karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat

ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu pada kondisi pengujian yangtepat.

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua

cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis

of54

daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang

mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik.

Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari

molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah

menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan

penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan

kertas sellulose poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut

sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa

digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang

digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan

pemisahan yang lebih baik.

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya

molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan

yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu

kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang

banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji,

1996)

1. Ukuran molekulprotein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

2. Konsentrasigel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul

protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3. Buffer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan.

Kekuatan ion yang tinggi dalam buffer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi

maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam buffer

akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein

sangatlambat.

4. Mediumpenyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil,

mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan

berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan

berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi

dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel

poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.

5. Kekuatanvoltase

• Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan

tingginya voltase yangdigunakan.

• Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam

dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai

selalu harus searah (bukan bolakbalik).

of54

6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan

mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan

mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

Elektroforesis gel

Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau protein

yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak

dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk

memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar.

Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid.

Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.

Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini merupakan teknik

yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak

dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. (David G. Watson, 2007).

Jenis-jenis Elektroforesis Gel

a. Elektroforesis gelagarosa

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan

fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu

memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan

densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982)

Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D- alaktosa

dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel

agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi

horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. (David G. Watson, 2007)

Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada

cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan

kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung

gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini

ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan

yang digunakan. (David G. Watson,2007)

Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak

melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa. Molekul

yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. (David G. Watson,2007)

Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya

daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu bermigrasi dengan

kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda.

Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium

bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel

agarosa atau poliakrilamid. (David G. Watson, 2007)

b. Elektroforesis GelPoliakrilamid

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh

ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer

terpolimerisasi menjadi rantai panjang.

of54

Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang dipisahkan

dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm

panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. (David

G. Watson,2007)

c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS (SDS-PAGE)

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel

poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil

suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini

menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer.

Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam

amino. . (David G. Watson,2007)

Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida.

Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding

dengan ukuran protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada

muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul

protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat

ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coonassie biru, yang akan

menampakkan beberapa pita. (David G. Watson, 2007).

Analisis Protein

Protein

Protein berasal dari bahasa Yunani proteios yang berarti pertama atau utama. Protein

merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan

ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis

berbagai reaksi biokimia di dalam sel. Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian biokimia

tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi dan enzim.

Semua jenis protein terdiri dari rangkaian dan kombinasi dari 20 asam amino. Setiap jenis

protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat baik

pada membran plasma maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria,

retikulum endoplasma, nukleus dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda tergantung pada

tempatnya. Protein-protein yang terlibat dalam reaksi biokimiawi sebagian besar berupa enzim

banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian terdapat pada kompartemen dari organel sel.

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar

makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsi dan nya, setiap

jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milieu. Protein

yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.

Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel

yaitu (1) memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk mengambil

kandungan sitoplasma dan organelnya serta (3) memisahkan organel-organel dan molekul

penyusunnya. Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan menggunakan

alat yang paling sederhana seperti homogeniser atau mortal sampai alat yang paling mutakhir seperti

pemakaian vibrasi dan sonikasi tergantung pada bahanyang akan dihomogenasi. Prosedur

(3) dilakukan dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi tertentu.

of54

Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi

fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan

pada suhu rendah (0-40C) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan

dianalisa).

Hasil homogenasi yang dinamakan homogenat biasanya masih berupa larutan keruh yang

terdiri dari debris sel (bagian sel yang tidak hancur), organel-organel sel dan makromolekul penyusun

sel diantaranya yaitu protein. Dengan sentrifugasi, debris dan organel sel akan mengendap di dasar

tabung sentrifus (dinamakan pellet), sedangkan makromolekul (termasuk di dalamnya protein) yang

ukurannya jauh lebih kecil daripada debris dan organel sel tidak akan mengendap tetapi terlarut dalam

buffer (dinamakan supernatan yang bening). Supernatan inilah yang dipakai sebagai sampel untuk

analisa protein dalamjaringan.

Untuk analisa protein yang di dalam plasma atau serum darah, prosedur fraksionasi (1) dan

(2) tidak diperlukan karena protein sudah terlarut dalam plasma darah, sedangkan sentrifugasi tetap

diperlukan untuk mengen-dapkan sel-sel darah sehingga protein yang terlarut dalam plasma atau

serum terdapat sebagai supernatan.

Beberapa teknik analisa protein membutuhkan prosedur isolasi yaitu memisahkan proteindari

makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dari protein lain yang tidak

diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan

sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan

aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya

pemisah terendah seperti pengendapan dengan amonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi oleh

berbagai faktor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperatur larutan.

Protein hasil sentrifugasi homogenat masih terdiri dari berbagai jenis protein (atau dinamakancrude

protein) ataupun protein hasil pengendapan amonium sulfat (jenis protein lebih spesifik) selanjutnya

dapat dianalisa secara kuantitatif maupun kualitatif. Analisa kuantitatif protein biasanya

menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang tertentu tergantung pada jenisprotein

dan pereaksi yang dipakai. Dengan spektrofotometer dapat diketahui banyaknya atau jumlah protein

dalam suatu sampel (biasanya dinyatakan dalam mg protein/ml sampel, mg protein/ml

sampelataudalamsatuanppmtergantung darisatuan yang dipakaipadasaat membuat kurva standar).

Analisa kualitatif protein dapat menggunakan kromatografi ataupun elektroforesistergantung

padatujuan analisa. Dalam prakteknya, baik analisa kualitatif maupun kuantitatif dapat

dipakai secara terpisah ataupun dipakai secara bersamaan dalam suatu rangkaian analisa.

Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat

Metode ini dapat dipakai untuk memisahkan protein albumin dari protein globulin dalam

plasma darah. Kelarutan protein dalam garam amonium sulfat sangat bervariasi tergantung pada

kekuatan ioniknya dan konsentrasi amonium yang ditambahkan. Proses ini dapat dikelompokkan ke

dalam dua bagian yaitu salting in dan salting out. Pada salting in, garam yang ditambahkan tidak

jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan menjadi larut dalam

larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan peningkatan konsentrasi

garam. Bila konsentrasi garam ditingkatkan terus, maka justru kelarutan protein menjadi turun.

Bahkan pada konsentrasi garam yang lebih tinggi lagi atau jenuh, protein akan mengendap. Proses

penambahan garam amonium sulfat jenuh pada isolasi protein ini dinamakan salting out.

Mekanisme dasar salting out sangat kompleks tetapi dapat diperkirakan bahwa pengendapan

terjadi karena persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Pada konsentrasi tinggi,

of54

kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat molekul air. Dengan

demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya tarik menarik antar molekul

protein lebih menonjol dibandingkan dengan tarik menarik antara air dan protein. Dalam kondisi

seperti itu protein akan mengendap.

Setiap jenis protein mempunyai ke-larutan yang berbeda pada amonium sulfat jenuh. Karena

itu, salting out biasa dipakai untuk mengisolasi protein tertentu. Dengan metode salting out protein

globulin akan mengendap sebagai pelet, sedangkan protein albumin terlarut dalam garam amonium

sulfat sebagai supernatan. Hal ini disebabkan karena perbedaan kelarutan albumin dan globulin dalam

garam amonium sulfat. Garam amonium sulfat juga diper-gunakan dalam pemurnian enzim. Garam

ini sangat larut dalam air, relatif murah dan dapat diperoleh dengan tingkat kemurnian tinggi serta

tidak menurunkan aktifitas molekul yang dianalisa. Selama proses salting out berjalan, sangat penting

untuk menjaga konsentrasi garam agar tidak menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi

pengendapan yang bersamaan antara protein yang ingin dimurnikan dengan protein yang tidak

diinginkan (protein pencemar). Dengan demikian selalu dilakukan pengadukan selama penambahan

garam dalam prosedur salting out.

Untuk mendapatkan hasil pengendapan yang sempurna dan maksimal, penambahan amonium

sulfat ke dalam larutan protein dilakukan secara bertahap. Pada setiap tahap penambahan garam,

endapan protein selalu dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang diperoleh disuspensikan

dengan larutan bufer fosfat pH 8,2. Dalam keseluruhan proses pemurnian protein, salting out tidak

hanya dilakukan sebagai tahap awal melainkan sering juga dilakukan sebagai tahap akhir.

Penambahan garam pada proses akhir pemurnian bertujuan untuk memperoleh protein yang lebih

pekat. Karena itu cara yang terakhir ini tidak ditujukan untuk memurnikan dan mengidentifikasi

protein melainkan ditujukan untuk memekatkan protein hasil.

METODE KERJA

Bahan : • Aquadest

• Trisbase

• Glisin

• SDS

• Bis-akrilamid

• Akrilamid

• Gliserol

Alat : • Elektroforesis

• Mikropipet

Cara Kerja : A. Menyiapkansampel

1. Sampel protein ditambah dengan Reducing Sample Buffer (RSB)1:1

dalam tabungEppendorf.

2. Kemudian sampel dipanaskan pada 100oC selama 5menit

3. Setelah dingin, bila sampel tidak langsung digunakan, sampel bisa simpan

pada-20oC

B. Menyiapkan separating dan stackinggel

1. Plate pembentuk gel disusun seperti petunjuk.

2. Separating gel 12,5 % dibuat dengan cara:

• Siapkan tabung polipropilen 50ml

of54

• Masukkan 3,125 ml stock acrilamid dalam tabungpolipropilen

• Masukkan 2,75 ml 1 M Tris pH 8.8, tabung ditutup lalu tabung

digoyang secaraperlahan

• Masukkan aquabidest 1,505 ml, tabung ditutup lalu tabungdigoyang

secara perlahan

• Masukkan 75µl SDS 10%, tabung ditutup lalu tabung digoyangsecara

perlahan

• Masukkan 75 µl APS 10 %, tabung ditutup lalu tabung digoyang secara

perlahan

• Masukkan 6,25 µl TEMED, tabung ditutup lalu tabung digoyangsecara

perlahan

• Segera tuang larutan ke dalam plate pembentuk gel menggunakan

mikropippet 1 ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembungudara)

sampai batas yang terdapat padaplate

• Perlahan tambahkan aquadest diatas larutan diatas larutan geldalam

plate agar permukaan gel tidakbergelombang

3. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan

terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk ).

Setelah itu,air yang menutup separating geldibuang.

4. Sesudah separating gel memadat, stacking gel 3% disiapkan dengan cara

yang sama yang sama dengan point B.2 diatas, dengan volume larutan

sebagaiberikut:

• Aquabidest 2,11 ml

• 30% acrylamide–bis 0,45 ml

• 1 M TrispH6.8 0,38 ml

• 10%SDS 30µl

• 10%APS 30µl

• TEMED 5 µl

C. Memasukkan sampel pada sumur gel

1. Plate yang sudah berisi gel dimasukkan dalam chamberelektroforesis

2. Running buffer dituang sampai bagian atas dan bawah gelterendam

3. Bila terbentuk gelembung udara pada dasar gel atau diantara sumursampel

harusdihilangkan

4. Marker standar sebanyak 3-5 µl dimasukkan pada salah satu sumur (bisa

disumur yang paling tepi atau pada sumur yangtengah)

5. Sampel sebanyak 10-20 µl (yang kandungan proteinnya minimal 0,1 µg

dan maksimal 20-40 µg) dimasukkan hati-hati ke dalam dasar sumur gel,

menggunakan Hamiltonsyringe

6. Syringe dibilas sampai 3x dengan menggunakan air atau denganrunning

buffer sebelum dipakai untuk memasukkan sampel yang berbeda pada

sumur gelberikutnya

D. Runningsampel

1. Untuk memulai running perangkat elektroforesis dihubungkandengan

power supply

of54

2. Running dilakuakn pada constant current 20 mA selama kurang lebih40-

50 menit atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasargel

3. Setelah selesai, running buffer dituang dan gel diambil dariplate

E. PewarnaanGel

1. Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein gel,

pewarnaan yang dipakai adalah Comasie Brilliant Blue atau SilverStain

tergantung kegunaan. Staining dilakukan selama 30menit

2. Larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel dan memperjelas

band protein yangterbentuk.

KENDALA PADAELEKTROPHORESIS

Gel mengeras memerlukan waktu lama

• Terlalu sedikit APS atau TEMED. Naikkan komposisi sekitar50%

• Suhu terlalu rendah. Pembuatan gel sebaiknya dilakukan di suhuruang

• APS dan TEMED sudah terlalu lama. Gunakan yangbaru

• Kulaitas akrilamida yang buruk. Gunakan akrilamidaelectrophoresis-grade

• Ada bahan yang tidak dimasukkan. Pastikan bahan untuk pembuatan gel terdaftar dalam list

sehingga mudah dipantau

• Konsentrasi bahan yang tidak sesuai. Periksa konsentrasi supaya sesuai denganprotokol

Gel terlalu lunak

• Kualitas akrilamida yangburuk

• Pembentukan ikatan silang yang terlalu sedikit. Perhatikan konsentrasi bahan-bahan

penyusun

Tidak terjadi polimerisasi

• Suhu terlalurendah

• APS dan TEMED yang terlalu sedikit atau sudahlama

• Kualitas akrilamida yangburuk

Ada lekukan di permukaan gel

• Katalis yang berlebihan sehingga gel membeku terlalu cepat. Turunkan konsentrasi APSdan

TEMED masing-masing sekitar25%

• Inhibisi gel karena polimerisasi memerlukan waktu lebih dari 1 jam. Naikkan APS dan

TEMED sekitar50%

Gel mudah patah

• Terlalu banyak ikatan silang. Periksa konsentrasigel

Gel berwarna putih

• Terlalu banyak bis-akrilamida. Periksa konsentrasi bis

Kebocoran gel saat pembuatan

• Terdapat keretakan atau patahan kecil pada kaca plate. Periksa kaca plate danapabila

keretakan tidak terlalu parah maka bisa ditambal menggunakanparafilm

• Pemasangan kaca plate yang tidak sesuai. Pastika bagian bawah telah sejajar dan rata

sehingga tidak ada larutan yang bisakeluar

Gel retak saat polimerisasi

• Suhu yang terlalu tinggi. Pastikan reagen tidak terlalupanas

Sampel tidak jatuh sampai dasar sumur

• Konsentrasi gliserol yang kurang pada buffersampel

of54

• Sisir yang dilepas terlalu cepat saat gel dalam prosespolimerisasi sehingga terjadi webbing

pada sumur. Pastikan gel terpolimerisasi sempurna sekitar 30 menit sebelumdigunakan

Larutan sampel berwarna kuning

• Larutan terlalu asam. Tambahkan sedikit NaOH supaya larutan berwarnabiru

• Bromofenol biru yang terlalu sedikit pada buffersampel

Gel lepas dari kaca selama elektroforesis

• Kaca yang kurang bersih. Setelah dibersihkan dengan akuades, pastikan tidak ada sisa-sia

tetesan air di dalamcetakan

Dasar sumur tampak melengkung ke bawah saat elektroforesis

• Umum terjadi apabila tedapat molekul dengan massa molekul besar dan bermuatan terjebak

di sumur. Biasanya ditemukan pada sampel yang mengandung asam nukleat dengan jumlah

banyak. Periksa kandungan asam nukleat pada sampel dan bersihkan sampai ke jumlahyang

sewajarnya

Sumur yang buruk

• Sumur dapat rusak atau terdistorsi apabila sisir tidak dilepas dengan hati-hati. Lepaskan sisir

dengan gerakanvertikal

• Apabila sisir sulit dilepaskan dari gel penahan, turunkan konsentrasi gelpenahan

• Webbing di sumur dapat disebabkan sisir yang terlalu longgar atau gel mengeras terlalu

cepat. Pastikan sisir sesuai dengan cetakan kaca yang tersedia dan periksa konsentrasiAPS

dan TEMED

Gel retak saat elektroforesis

• Kondisi elektroforesis yang terlalu hangat. Hal ini umum terjadi pada geldengan

konsentrasitinggi

Beberapa pita tidak bergerak turun

• Hal ini dapat disebabkan oleh keberadaan gelembung udara pada jalur pergerakanpita.

Pastikan tidak ada gelembung saat menuanggel

Bagian atas gel yang terlalu lengket

• Terjadi penetrasi etanol yang digunakan untuk meratakan gel pemisah ke dalam gel. Pada

saat meratakan gel, jangan sampai etanol ikut tercampur. Jangan membiarkan etanol

tertinggal terlalu lama pada gel yang terlah terpolimerisasi atau bisa etanol bisa digantikan

denganair

Resolusi pita protein yang tidak sempurna

• Waktu elektroforesis yang tidak cukup. Tambahkan wakturunning

• Ukuran pori-pori gel pemisah tidak sesuai dengan ukuran protein yang akan dianalisa.Atur

konsentrasi gelpemisah

Pita protein memiliki ketebalan yang tidak seragam

• Sampel dimuat dengan tidak seragam. Pastikan dasar sumur lurus semua danhorizontal

of54

Gambar Elektroforesis Mini-Protean 3

of54

Proses Pembuatan Gel

Proses Memasukkan Sampel

of54

Proses Running

of54

Tanda Tangan Dosen/Asisten :

…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi II

Haemacytometer

Dasar Teori

Haemocytometer adalah alat awalnya dirancang untuk penghitungan sel darah . Sekarang

juga digunakan untuk menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya. Hemositometer ini

ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari tebal kaca slide mikroskop dengan lekukan

persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar. ruang ini diukir dengan laser-terukir grid garis

tegak lurus. Perangkat ini dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis diketahui,

dan kedalaman ruang ini juga diketahui. Oleh karena itu mungkin untuk menghitung jumlah sel atau

partikel dalam volume tertentu cairan, dan dengan demikian menghitung konsentrasi sel dalam cairan

secara keseluruhan.(Wiki,2011).

PEMERIKSAAN HITUNG JUMLAH LEUKOSIT / ERITROSIT

Menghitung jumlah sel-sel leukosit perliter darah (System International Units = SI unit) atau per satu

mmk darah. Nilai normalnya 4000 - 11000 / mmk.Untuk penerapan hitung leukosit ada dua metode,

manual dan elektronik. Pada umumnya metode elektronik belum digunakan secara umum.

Peralatan dan Bahan :

1. Haemocytometer

• bilikhitung

• pipetleukosit

• pipet eritrosit (untuk menghitungeritrosit)

Neubauer Improve : luas seluruh bilik 3 x 3 mm2. tinggi/dalam 0,1 mm. di dalam bilik terdapat :

kotak besar : 1 x 1 mm2

kotak sedang ada 2 macam :

ditengah : 1/5 x 1/5mm2

di empat sudut : 1/4 x 1/4 mm2

kotakkecil : 1/20 x 1/20mm2

2. Kacapenutup

3. Mikroskop

Bahan:

1. Spesimen

Darah vena atau darah kapiler

Cara Kerja

Mengisi pipet Leukosit

• Isaplah darah kapiler (kapiler, EDTA, atau oxalat) sampai pada garis tanda “0,5″tepat.

• Hapus kelebihan darah yang melekat pada ujungpipet

• Masukkan ujung pipet kedalam larutan TURK sambil mempertahankan darah tetap pada garis

tanda.

• Pipet dipegang dengan sudut 45 derajat dan larutan TURK dihisap perlahan-lahan sampai

garis tanda “11″ tepat. Hati-hati jangan sampai terjadi gelembungudara.

• Angkatlah pipet dari cairan; tutup ujung pipet dengan ujung jari kemudian lepaskan karet

penghisap.

of54

• Kocoklah pipet tadi selama 15-30 detik. jika tidak segera akan dihitung letakkan pipet dalam

posisihorizontal.

Mengisi kamar hitung

• Letakkan kamar hitung yang telah benar-benar bersih dengan kaca penutup yang terpasang

mendatar di atasmeja.

• Kocoklah pipet yang berisi tadi selama 3 menit terus menerus (jangan samapai ada cairan yang

terbuang dari pipet saatmengocok)

• Buang semua cairan yang ada pada batang kapiler pipet (3 – 4 tetes) dan kemudian sentuhkan

ujung pipet (sudut 30 derajat) dengan menyinggung pinggir kaca penutup pada kamarhitung.

• Biarkan kamar hitung tersebut terisi cairan perlahan-lahan dengan gaya kapilaritasnyasendiri.

• Biarkan kamar hitung yang sudah terisi tersebut selama 2-3 menit agar leukkosit-leukosit

mengendap. jika tidak akan dihitung segera, simpan kamar hitung tersebut dalam cawan peti

tertutup yang berisi kapasbasah.

Cara menghitung sel

• Pakailah lensa objektif kecil (pembesaran 10x). turunkan lensa kondensor atau kecilkan

diafragma mikroskop meja mikroskop harusdatar.

• Kamar hitung dengan bidang bergaris diletakkan di bawah objektif dan fokus mikroskop

diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Dengan sendirinya leukosit-leukosit akan jelas terlihat.

• Hitunglah semua leukosit yang terdapat dalam keempat “bidang besar” pada sudut-sudut

“seluruh permukaan yangdibagi”.

• Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke bawah dan dari

kanan ke kiri dan seterusnya.

• Kadang ada sel yang menyinggung garis suatu bidang, sel-sel yang menyinggung garis batas

sebelah kiri atau garis atas haruslah dihitung.

• Sebaliknya sel-sel yang menyinggung garis sebelah kanan dan bawah tidak boleh dihitung.

Perhitungan

• Pengenceran yang dilakukan pada pipet adalah 20kali.

• Jumlah semua sel yang dihitung dalam keempat bidang itu dibagi 4 menunjukkan jumlah

leukosit dalam 0,1 µl. Kalikan angka tersebut dengan 10 (untuk tinggi) dan 20 (untuk

pengenceran) untuk mendapatkan jumlah leukosit dalam 1 ul darah. Singkatnya : Jumlah sel

yang terhitung dikali 50 = jumlah leukosit per µldarah.

Catatan :

Pengenceran yang lazim digunakan untuk menghitung leukosit adalah 20 kali, tetapi menurut

keadaan (leukositosis tinggi atau leukopenia) pengenceran dapat diubah sesuai keadaan tersebut,

lebih tinggi pada leukositosis dan lebih rendah pada leukopenia. Sedian darah dengan oxalat yang

tidak segera dipakai ada kemungkinan terjadi penggumpalan leukosit. Jika darah tepi banyak

mengandung sel darah merah berinti maka sel tersebut akan diperhitungkan seperti leukosit, untuk

koreksi dapat dilakukan pemeriksaan sedian hapus yang dipakai untuk hitung jenis leukosit,

persentase sel darah merah berinti di catat. misalnya ; didapatkan 10.000 leukosit per µl darah dan

dari hitung jenis didapatkan tiap 100 leukosit ada 25 sel darah merah berinti, maka jumlah leukosit

yang sebenarnya adalah:

of54

Gambar kamarhitung Luasan untuk menghitung

Jumlah selLeukosit

Ukuran kamar hitung

of54

Laporan Sementara :

of54

Materi 3

Keselamatan Kerja di Laboratorium

Upaya Pencegahan dan Tindakan Terhadap Kecelakaan

1. Kebakaran

Bahan kimia atau reagensia yang mudah terbakar antara lain: benzena, alkohol, eter, aseton.

Tindakan pencegahan agar tidak terjadi kebakaran:

• Tempat penyimpanan bahan kimia terpisah darilaboratorium

• Ruangan dirancang agar ventilasi baik, bebas dari sumber percikan listrik, asap rokok, bersuhu dingin dan kering (tidaklembab)

• Perlu diperhatikan bahwa bahan-bahan ini dapat berinteraksi dan bereaksi sehingga

mampu menimbulkan ledakan atau kebakaran, sehingga bahan-bahan ini harus disimpan

dengan urutan yang terpisah. Misalnya: asam sulfat dengan klorat, perklorat, permanganat,

air, asam asetat dengan asam kromat, asam nitrat, perklorat, peroksida, Na-nitrat dengan

amonium nitrat, kalium permanganat dengan etilen, asam sulfat, gliserin.

Tindakan yang dilakukan apabila terjadi kebakaran:

• Segera memindahkan bahan kimia yang menyebabkan kebakaran dan menjauhkkan

bahan kimia lain yang mudahterbakar

• Untuk memadamkan api digunakan alat pemadam kebakaran atau pasir. Penyebab kebakaran dari bahan kimia CCl4 dan NaHCO3 dapat dipadamkan dengan alat pemadam kebakaran. Jika memungkinkan tidak menggunakan air sebagai alat pemadam, kecuali

bila kobaran api sudah meluas.

• Korban kebakaran harus segera diselamatkan melalui pertolongandarurat.

• Jika seseorang pekerja laboratorium terbakar, pakaian segera di lepas, penderita dilarang

berlari karena mengundang angin yang kan memperbesar nyala api. Luka bakar diambil

tindakan pertama dengan mendinginkan dengan air dingin, kebersihan luka dijaga, dan

menutup dengan kain bersih. Bila kuka bakar melepuh jangan digaruk dan segera dibawa

ke rumahsakit.

• Jika api telah padam, pintu, jendela dibuka untuk sirkulasiudara.

• Bahan-bahan yang rusak dibersihkan dan dilakukan observasi terhadap bagian-bagian yangrusak.

• Dalam keadaan luka bakar ringan, daerah luka sebaiknya didinginkan dengan air dingin,

jaga kebersihan dan luka korban ditutup dengan kain yang bersih. Bila luka bakar berat,

penderita sebaiknya berbaring dan ditenangkan. Setelah baju diambil dengan gunting,

tindakan darurat selanjutnya adalah menghubungi dokter atau membawa ke rumah sakit.

2. Kaca Pecah

Tindakan yang harus dilakukan apabila terkena kaca:

• Pecahan kaca di dalam luka harusdiambil

• Setelah itu luka diberi desinfektan, agen penekan dan hemostatis serta diberi obat yang dapat menghentikanhemorhagi.

• Luka yang besar dan diikuti dengan pendarahan harus di bawah pengobatandokter.

• Jika serpihan kaca masuk ke dalam mata, jangan diusap tetapi dicuci dengan air. Dan

jika diperlukan perlu ke dokter atau rumahsakit.

of54

3. Bahan Kimia Tumpah PadaKulit

Bahan kimia yang dapat merusak kulit adalah asam dan basa keras. Dalam melaksanakan

tugas di laboratorium disarankan, sebagai berikut:

• Pada saat menuang bahan kimia dari botol harus hati-hati jangan sampai menetes ke

meja dan tertinggal di meja.

• Pada saat menggunakan bahan kima, jangan meletakkan bahan kima tersebut dekat dengan mata, dan jangan mengocok karena dapattumpah

• Melarutkan asam sulfat dengan air harus sedikit dmei sedikit agar gelas tidakpecah.

• Pipet atau buret harus digunakan untuk pengambilan asam atau basa yangpekat.

• Tindakan terhadap bhan kimia yang mengenai bagian kulit dapat dicuci dengan air yang cukup. Demikian juga bila terpercik dengan bahan kimia, tidak boleh

menggosok (mengucek), tetapi harus dicuci dengan air yang mengalir. Selanjutnya dibasahi dengan larutan penetral berupa asam atau basa yanglemah.

• Apabila bahan kimia mengenai mata, maka dicuci dengan air secukupnya, tanpa diberikan penetral. Bila rasa sakit yang berlanjut maka diperlukan pertolongan dokter. Khusus gas amonia perlu perhatian serius karena dapat menyebabkan kebutaan.

4. Menghirup GasBerbahaya

Pada saat melaksnakan pencampuran bahan-bahan kimia berikut ini akan

menimbulkan gas beracun. Karena itu dikerjakan dengan hati-hati. Misalnya: senyawa nitrat

dengan asam sulfat menimbulkan gas nitrogen oksida, senyawa sulfida dengan asam

menimbulkan gas asam sianida. Gas beracun yang berasal dari bahan kimia masuk melalui

pernapasan, korban merasa tercekiki, karena menyumbat saluran pernapasan. Upaya

pencegahan dan pertolongan pertama yang dapat diberikan:

• Jangan sekali-kali menghirup gasberacun

• Melengkapi laboratorium dengan lemari asam (fume hood), pintu jendela yang dapat

dirancang dengan ventilasi yang baik sehingga membatasi pemaparan gasberacun.

• Upaya penyelamatan, korban harus segera dipindahkan ke tempat yang berudara

terbuka dan segar serta dijauhkan dari bau gas beracun. Ditidurkan telentang dan diberi selimut.

5. Menelan Bahan Kimia yangBeracun

Upaya pencegahan dan pertolongan pertama yang dilakukan:

• Pada saat memipet bahan kimia harus dilakukan denganhati-hati.

• Bila terlanjur masuk ke dalam mulut, harus segeradiludahkan.

• Bila sudah tertelan maka harus diupayakan agar korban muntah sehingga bahan kimia beracun keluar dari muut dengan menggunakan obat muntah (emetics), misalnya larutan garam 20%

• Bila berhasil (sembuh), perawatan lebih lanjut diberikan obat penawar racun (antidotes) seperti: airsusu.

6. Tersengat AliranListrik

Kejadian tersengat listrik dapat dicegah dengan cara:

• Menggunakan sepatu sebagai alaskaki

• Jangan menyentuh sumber listrik dalam keadaan tangan basah ata pada saat yang bersamaan memegang keran air distilasi karena dapat menimbulkan shock listrik yang berujung padakematian.

of54

Korban yang tersengat listrik sampai (shock) atau pingsan, sumber listrik harus dicabut

terlebih dahulu dan baru penderita ditenangkan. Apabila sampai menderita luka bakar,

perlu diberikan tindakan darurat dan kemudian dibawa ke dokter atau rumah sakit.

7. Ledakan

Upaya menurunkan bahaya ledakan pada pekerja laboratorium dengan membuat dinding

besi, beton atau kaca. Sumber ledakan biasanya berasal dari:

• Pemanasan bahan kimia yang mudahterbakar

• Proses destilasi bahankimia

• Senyawa keras (caustics), seperti: metal Na, KclO,H2O2, yang dicampur dengan pelarut yang mudah menguap seperti: eter, gas metana,asetilin.

• Bahan kimia yang inkompatibel disimpanberdekatan.

Jika ledakan luka robek dan terbakar sebaiknya diberikan tindakan darurat dan korban

sebaiknya dibawa ke dokter atau ke rumah sakit setelah distabilkan.

Saran Dalam Penggunaan Alat Agar Aman:

Dalam penggunaan alat disarankan untuk melaksanakan hal-hal berikut

• Tangan harus dicuci bersih dan dijagakering.

• Jangan mengambil cawan untuk ditimbang dengan menggunakan tangan, namun harus denganforceps.

• Sering terjadi tutup desikator lepas saat diangkat, oleh karena itu memegang desikator

harus penuh hati-hati. Tutup desikator tidak boleh diletakkan terbuka di atas meja. Plate

(bagian bibir desikator) harus bersih dan terbebas dari bahan sampel yang dikeringkan.

Sampel yang dikeringkan dalam desikator jangan terlalupenuh.

• Timbangan analitis harus dalam keadaan kering dan pintu tertutup. Dihindari bahan yang lembab, kotor dan berlemak disekitar tempat menimbang (balance pan). Jangan memegang batu timbangan dan sampel yang ditimbang dengantangan.

• Penggunaan oven harus sesuai instruktur kerja atau yang telah didemonstrasikan oleh teknisi atauinstruktur.

Saran Sebelum Melaksanakan Analisis

Sebelum melaksanakan analisi disarankan, sebagai berikut:

• Belajar dari teknisi atau instruktur tentang prosedur analisis yangdilaksanakan.

• Dilarang memulai analisi sebelum mengerti prosedur analisi, setelah mengerti baru

menyiapkan bahan dan alat yangdiperlukan.

• Peraturan penggunaan laboratorium harus memakai sepatu tertutup dan jaslaboratorium.

• Setelah selesai menimbang, alat harusdibersihkan.

• Hati-hati dalam menuang bahan kimia dari botol. Jangan meninggalkan tetesan di luar botol

dan mengenailabel.

• Perhatikan apakah pipet yang digunakan itu loop pipet (pipet yang harus ditiup)

• Bila memanaskan atau memasak bahan dalam laeutan harus dimulai dengan api yang kecil terlebih dahulu.

• Jangan melaksanakaan pencampuran asam pekat dengan basapekat.

• Bila melarutkan asam atau basa pekat dengan air, maka asam atau basa pakai itu dituangkan

ke dalam air, jangan sebaliknya(Berbahaya!)

• Jangan melarutkan KOH dan NaOH ke dalam airpanas

• Semua bahan kimia yang mempunyai titer tertentu harus distandarisasi terlebih dahulu sebelumdigunakan.

of54

• Perlu diperhatikan dalam pelaksanaan analisis, adaistilah:

1. Air: adalah aquadestilata, kecuali secara spesifik disebut airkran

2. Alkohol: adalah etil alkohol 95%. Bila ingin membuat alkohol yang lebih encer, misalnya

a% dapat dibuat dengan mengencerkan a ml alkohol 95% tersebut dengan air sehingga

menjadi 95ml

3. Etil eter: etil eter yang bebasperoksida

4. Tanda (1+1), (1+2) dan seterusnya: angka pertama adalah volume kimia yang digunakan

dan angka kedua adalah volumeair.

• Bila menggunakan tanur untuk pengabuan sampel harus dimulai dari suhu rendah secara bertahap naik ke suhu tinggi yangdiinginkan.

• Gelas piala, cawan dan alat dari gelas yang masih panas jangan dimasukkan langsung ke dalam air tetapi diletakkan di atas kayu yang disediakan. Jangan diletakkan di atas meja atau di atas segelporselin.

• Alat-alat yang dipecahkan harus segera diganti, bila praktikan yang melakukan maka harus

segera mengganti

• Setelah selesai analisi, alat yang digunakan dicuci sampai bersih dan bila perlu beberapa alat dikeringkan, kemudian disimpan pada tempat yangdisediakan

• Sebelum meninggalkan laboratorium agar diperiksa sekali lagi listrik, air, gas dan botol bahan kimia sehingga terjaga kondisi laboratorium yangaman.

of54

Laporan Sementara :

of54

Manual Praktikum

MK Teknik Analisis Laboratorium (Nutrisi dan Makanan Ternak)


Tim Penyusun:

Hartutik, Prof. Dr. Ir., MP. IPU

Siti Chuzaemi, Prof. Dr. Ir., MS. IPU

Abd Manab, Dr. Ir. S.pt. MP

Aswah Ridhowi, S.pt., M.Sc

Asri Nurul Huda, S.pt., M.Sc. MP

Firmansyah Tri Saputra, S.pt., M.Sc

Firman Jaya, S.pt., MP

Tri Eko Susilorini, Dr. Ir. MP., IPM

Wike Andre Septian, S.pt., M.Si

Marjuki, Dr. Ir. M.Sc

Maniek E. Sawitri, Dr. Ir. MS

Aulia Puspita A.Y., S.pt., MP. M.Sc

Poespitasari Hazanah Ndaru, S.pt.,MP

Puguh Surjowardojo, Dr. Ir., MS

Muharlien, Dr. Ir., MP

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2020

of54

Manual Praktikum

MK Teknik Analisis Laboratorium (Nutrisi dan Makanan Ternak)


A. Materi Laboratorium

Materi I

Analisis Van Soest

Dasar Teori

Sistem analisa Van Soest menggolongkan zat pakan menjadi isi sel (cell content) dan dinding

sel (cell wall). NDF mewakili kandungan dinding sel yang terdiri dari lignin, selulosa, hemiselulosa,

dan protein yang berikatan dengan dinding sel. Bagian yang tidak terdapat sebagai residu dikenal

sebagai Detergent Soluble (NDS) yang mewakili isi sel dan mengandung lipid, gula, asam organik,

non protein nitrogen, peptin, protein terlarut dan bahan terlarut dalam air. Serat kasar terutama

mengandung selulosa dan hanya sebagian lignin, sehingga nilai ADF lebih kurang 30 persen lebih

tinggi dari serat kasar pada bahan yangsama.

Prosedur kerja analisis kadar ADF, NDF, selulosa, hemiselulosa dan lignin menurut Van

Soest, (1976) :

Penentuan Kadar Acid Detergent Fiber (ADF)

1. Timbang sampel 0,3 gram (a gram) kemudian masukkan kedalam tabung reaksi 50ml

2. Tambahkan 40 ml laritan ADF kemudian tutup rapat tabung reaksitersebut

3. Refluks dalam air mendidih selama 1jam

4. Saring dengan sintered glass yang telah diketahui beratnya (b gram) sambil diisap dengan

pompa vacum

5. Cuci dengan lebih kurang 100 ml air mendidih sampai busa hilang dan 50 mlalkohol

6. Ovenkan pada suhu 100oC selama 8 jam atau dibiarkanbermalam

7. Dinginkan dalam eksikator lebih kurang ½ jam kemudian timbang (c gram)Perhitungan:

Penentuan Neutral Detergen Fiber (NDF)

1. Timbang sampel 0,2 gram (agram)

2. Masukkan kedalam tabung reaksi 50ml

3. Tambahkan 25 ml larutan NDS, kemudian tutup rapat tabung reaksitersebut

4. Refluks dalam air mendidih selama 1jam

5. Saring dengan sintered glass yang telah diketahui beratnya (b gram) sambil diisap dengan

pompa vacum

6. Cuci dengan lebih kurang 100 ml air mendidih hingga busahilang

7. Cuci dengan lebih kurang 50 mlalkohol

8. Ovenkan pada suhu 100oC selama 8 jam atau dibiarkanbermalam

9. Dinginkan dalam eksikator lebih kurang ½ jam kemudian timbang (c gram)Perhitungan:

of54

Penentuan Selulosa dan Lignin

1. Sintered glass yang berisi ADF diletakkan diataspetridisk

2. Tambah 20 ml H2SO472%

3. Sekali-kali diaduk untuk memastikan bahwa serat terbasahi dengan H2SO4 72%tersebut

4. Biarkan selama 3jam

5. Hisap dengan pompa vacum sambil dibilas dengan air panassecukupnya

6. Ovenkan selama 8 jam pada suhu100oC atau dibiarkanbermalam

7. Masukkan ke dalam eksikator kemudian timbang (dgram)

8. Masukkan kedalam tanur listrik atau panaskan hingga 500oC selama 2 jam, biarkan agak

dingin kemudian masukkan kedalam eksikator selama ½jam

9. Timbang (e gram)Perhitungan:

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi II

Pengukuran Kecernaan In vitro (Tilley dan Terry, 1963)

Dasar Teori

Alat :

- Labu ukur 3500ml

- Penangas yang dilengkapi dengan stirer

- Inkubator

- Karetpenutup

- Rak

- Centrifuge 2500 rpm

- Kertassaring

- Oven 1050C

- Eksikator

- Tanur

Bahan kimia :

MgCl2, CaCl2, aquades, cairan rumen, larutan buffer, gas CO2, air es, larutan HCL, pepsin. Kecernaan

secara in vtro dengan menggunakan cairan rumen sapi sebagai media percobaan untuk mengukur

kecernaan BK dan BO (Tilley dan Terry, 1963), yang dimodifikasi oleh Van der Meer (1980).

Cara Kerja :

1. Kedalam Labu ukur 3500 ml dimasukan:

- 520 ml larutana

- 5,2 g MgCl2 (larutanb)

- 5,2 g CaCl2 (larutanc)

Kemudian ditambahkan aquades sampai tepat 2069,6 ml, ambil dikocok. Diukur pH nya (Ph

= 6,9) pada temperatur 38-39 0C.

2. Mengambil cairan rumen yang telah disaring kemudian dimasukkan ke dalam larutan buffer

dengan perbandingan cairan rumen : larutan buffer 1 : 4. Selanjutnya dialiri gas CO2dan

dipanaskan di atas penangas yang dilengkapi dengan stirer pada suhu 39 0C selama 20 menit.

3. Menimbang 0,5 gram sampel (BK 88-92 %), lalu dimasukkan ke dalam tabung fermentor

yang diberi nomor (untuk setiap sampel dilakukan 2 kali ulangan), dan dimasukkan ke dalam

inkubator pada suhu 39 0C (sekitar 1 hari sebelum pelaksanaan). Ukuran sampel0,5

– 1,0 mm.

4. Kedalam tabung fermentor yang telah ditambahkan sampel 0,5 gram ditambahkan 50 ml

campuran larutan buffer dan cairan rumen dengan perbandingan 4 : 1. Sebelum tabung

ditutup dengan karet, dialiri lebih dahulu dengan CO2selama kurang lebih 15 detik agar

kondisi an-aerob. Tabung-tabung tersebut dimasukkan rak dan dimasukkan ke dalam

inkubator dengan suhu 390C.

5. Setelah 1 jam inkubasi, kocok pelan-pelan setiap tabung dengan tangan agar seluruh

partikel sampel menjadi basah. Pengocokkan selanjutnya dilakukan setiap 8jam.

6. Dibuat 4 tabung yang terdiri dari 2 tabung untuk blanko dan 2 tabung untuk standar berupa

rumput gajah yang telah diketahui kecernaan secara invivo.

of54

7. Setelah inkubasi berlangsung selama 48 jam tabung-tabung diambil dari inkubator dan

aktifitas mikroba dihentikan dengan cara direndam dalam aires.

8. Dilakukan centrifuge pada 2500 rpm selama 15menit.

9. Residu sampel yang hasil centrifuge pada 2500 rpm selama 15 menit akan ditambah dengan

50 ml larutan HCL – Pepsin, dimasukkan kembali ke dalam inkubator pada suhu 39 0C,

selanjutnya diinkubasikan selama 48 jam, tanpa penutup bunsen valve dan dikocok 2 kali

sehari.

10. Kemudian didigeti selama 48 jam, tabung diambil dan dipindahkan isi tabung fermentor ke

dalam kertas saring yang telahditimbang.

11. Kertas saring dan residu dikeringkan dalam oven 105 0C satu malam, kemudian didinginkan

dalam eksikator dan ditimbang untuk mengetahui kehilangan bahankering.

12. Bahan organik diperoleh dengan mengabukan kertas saring dan residu dalam tanur pada suhu

550 0C selama 4 jam atau sampai sampel berwarna putih, didinginkan di dalam eksikator dan

ditimbang.

Dihitung presentase KcBK dan KcBO dikalikan kecernaan sampel standar sebagai faktor

korelasi. Berikut rumus kecernaan bahan kering (KcBK) dan kecernaan bahan organik (KcBO)

yaitu :

1. Kecernaan Bahan Kering (KcBK)(%)

2. Kecernaan Bahan Organik (KcBO)(%)

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi III

Pengukuran produksi gas (Makkar et al. 1995)

Dasar Teori

Alat-alat :

1. Syringe (diameter 32 mm, panjang 200 mm, volume 100ml)

2. Waterbath

3. Termometer

4. Erlenmayer 2000ml

5. Pipetpiston

6. Timbangananalitik

7. Beakerglass

Bahan kimia :

1. NaHCO3

2. NH4HCO3

3. Na2HPO4

4. KH2HPO4

5. MgSO47H2O

6. NaCL

7. CaCL2 2H2O

8. MNCL2 4H2O

9. CoCl2 6H2O

10. FeCL3 6H2O

11. Resazurin

12. Na2S9H2O

13. NaOH 1 M

Prosedur:

Sampel digiling dengan ukuran 1 mm dan ditimbang sebnayak 0.5 gram BK dimasukkan

dalam dasar syiringe (dengan ukuran diameter 32 mm, panjang 200 mm, volume 100 ml). Selanjutnya

sebelum piston dimasukka ke dalam syiringe, terlebih dahulu diolesi dengan dengan vaselin. Ujung

dari syringe dihubungkan dengan selang karet silicon panjangnnya sekitar 5 cm dan dapat ditutup

dengan klep plastik. Cairan rumen yang digunakan dalam pengukuran gas tersebut berasal dari 1 ekor

sapi PFH jantan yang berfistula, yang telah disaring terlabuh dahulu. Cairan rumen sebelum

dimasukkan dalam sringe dicampur terlebih dahulu dengan larutan buffer dangan perbandingan

1:3.41(v/v).

Larutan buffer (tipa 1 liter) terdiri dari : NaHCO3 35 gram + NH4HCO3 4 gram, dilarutkan

dalam 1 liter aquadest. Larutan makro mineral (tiap 1 liter) terdiri dari : Na2HPO4 5,7 gram +

KH2HPO4 6,2 gram + MgSO4 7 H2O 0,6 gram + NaCL 2,22 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest.

Larutan mikro mineral (tiap 100 ml) terdiri dari CaCL2 2 H2O 13,2 gram+MNCL2 4 H2O 10

gram+CoCl2 6 H2O +FeCL3 6 H2O 0,8 gram, dilarutkan dalam aquadest sampai volumenya 100 ml.

Larutan resazurin : 0,1 gram resazurin dilarutkan dengan aqudest sampai volumenya 100 ml.

Redukter solvent (dibuat sesaat sebelum mengambil cairan rumen) terdiri dari Na2S 9H2O 0,58 gram

+ NaOH 1 M 3,7ml.

Larutan buffer campuran terdiri dari :

- Aquadest : 1095ml

- Buffer : 730ml

of54

- Makro mineral : 365ml

- Mikro mineral : 0,23ml

- Resazurin : 1ml

- Reduktor : 60ml

Larutan buffer campuran ini dimasukkan dalam labu, dicampur dan dipanas-kan pada suhu

390C dalam waterbath. Gas CO2 dialirkan, sementara itu reduktor ditambahkan. Larutan yang

berwarna kebiru-biruan akan berubah menjadi agak merah kemudian menjadi tidak berwarna.

Cairan rumen dari cairan feses sebanyak 660 ml masing-masing dimasukkan kedalam labu, dan

CO2 tetap dialirkan dalam labu. Larutan buffer campuran dengan cairan rumen tersebut dimasukkan

dalam syringe dengan menggunakan pipet otomatis sebanyak 50 ml. Gelembung-gelembung udara

yang ada dalam syringe dikeluarkan secara perlahan melalui selang silikon selanjutnya klip plastik

pada selang silikon ditutup dan dibaca volumenya (V0), kemudian syringe ditempatkan dalam

waterbath pada suhu 390 C. Blanko dibuat dengan cara seperti diatas hanya tanpa penambahan

sampel. Pada pengukuran volume produksi gas dicatat setelah inkubasi 2, 4, 8, 12, 24, dan 48 jam.

Produksi gas dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Vblanko = Vblanko t – VO

Produksi gas =(V1-V0-Vblanko)

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi IV

Pengukuran NH3

Dasar Teori

Prinsip:

Amonia (NH3) akan menguap apabila bereaksi dengan Natrium Karbonat (NaCO3), kemudian

ditangkap oleh asam borat (H3BO4) berindikator Metil Merah dan Brom Kresol, kemudian dilakukan

titrasi dengan H2SO4 0,005 N sampai warna semula, banyaknya H2SO4 untuk merubah warna

merupakan indikasi banyaknya kandungan NH3.

Alat-alat:

Petridish volume Conway, pipet ukur, beaker glass, buret dan PH meter.

Bahan:

Sampel cairan rumen, vaselin, H2SO4 pekat, larutan H3BO3 4% berindikator metal merah dan

brom kresol hijau, Na2CO3 jenuh dan H2SO4 0,005N.

Prosedur Kerja:

1. 5 ml cairan rumen dari syringe setelah pembacaan produksi gas pada inkubasi jam 24 jam ke

botol yang telah diisi 5 tetes H2SO4 pekat guna menghentikan proses fermentasi mikroba serta

mengikat N agar tidakmenguap.

2. Sebelumnya cawan Conway dan tutupnya telah diolesivaselin

3. kemudian sebanyak 1 ml cairan supernatan dimasukkan kedalam salah satu ujung alur cawan,

sedangkan pada ujung yang lain dimasukkan 1 ml NaCO3jenuh.

4. Pada bagian tengah cawan dimasukkan 1 ml larutan H3BO3 berindikator metil merah dan

Brom Kresol hijau ber PH5,2.

5. Cawan conway ditutup dengan cepat dan rapat lalu cawan dimiringkan dengan harapan

larutan Na2CO3 jenuh dapat bercampur dengansupernatan.

6. Setelah disimpan selama 24 jam dalam suhu kamar, dilakukan titrasi pada larutan H3BO3

dengan menggunakan larutan H2SO4 0,005 N hingga warna berubah dari biru menjadi merah

jingga (seperti warnasemula).

Kadar NH3 mg/100 ml cairan rumen dihitung dengan rumus:

KonsentrasiNH3 = ml titrasi H2SO4 x n H2SO4 x BM NH3 (mg/ml cairanrumen)

ml sampel

mlH2SO4 = TitrasiH2SO4

nH2SO4 = Normalitas H2SO4 (0,005N)

BM NH3 = berat molekul NH3(17)

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

B.M ateriLapang

Materi I

Pengambilan Sampel Pakan, Feses dan Urin

Dasar Teori

Pada periode pengumpulan data, pakan yang diberikan pada tiap ekor ternak dan yang tersisa,

urine dan juga feses yang dikeluarkannya ditimbang setiap hari dan sampel masing-masing diambil.

Kemudian sampel yang terkumpul dianalisa kandungan zat makanannya di laboratorium.

Alat yang digunakan :

1. Timbangananalitik

2. Kantongplastik

3. Label

4. Alatsemprot

5. Penyaring

6. Gelasukur

Prosedur Pengambilan Sampel :

1. Pengambilan sampel bahan pakan:

• Sampel hijauan 200 g, diambil setiap kali pemberian pakan dimasukkan dalam kantong

plastik dan diberilabel

• Sampel konsentrat 50 g, diambil satu kali karena kandungan nutrisinya konstan, masukkan

dalam kantong plastik dan diberilabel

2. Pengambilan sampel sisa pakan

• Diambil pada pagi hari

• Ditimbang seluruh sisa pakan dan diambil sampel sisa pakan sebanyak 10 % dari bobot

sisa pakan, dimasukkan dalam kantong plastik dan diberilabel

3. Pengambilan sampelurine

• Diambil pagi hari seluruhurine

• Disaring urine dan dimasukkan dalam gelas ukur (ukurvolume)

• Diambil sampel sebanyak 10%

• Dimasukkan botol, ditetesi dengan H2SO4 dan diberilabel

4. Pengambilan sampelfeses

• Diambil feses pada pagi hari danditimbang

• Diambil sampel sebanyak 10 % dari bobotfeses

• Dimasukkan dalam kantong plastik, semprot formalin dan diberilabel

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi II

Kecernaan In Vivo

Dasar Teori

Pengukuran daya cerna secara in vivo merupakan cara pengukuran daya cerna suatu pakan

dengan menggunakan hewan percobaan. Pakan yang diuji diberikan secara langsung pada hewan

percobaan, kemudian diukur berapa jumlah yang dikonsumsi dan yang dikeluarkan lewat feses. Pakan

yang dikonsumsi merupakan selisih antara jumlah pakan yang diberikan dan jumlah pakan yang

tersisa. Pengukuran ini menggunakan kandang khusus yang disebut kandang metabolis, yaitu

kandang yang dilengkapi dengan tempat pakan, tempat minum dan tempat koleksi feses serta urine.

Dalam pelaksanaannya, pengukuran daya cerna dengan cara ini dilakukan paling sedikit

selama 14 hari yang dibagi menjadi dua periode yaitu periode pendahuluan (preliminary period) dan

periode pengumpulan data (collecting period). Periode pendahuluan dilakukan sedikitnya selama 7

hari atau sampai hewan percobaan terbiasa dengan pakan yang sedang diuji. Hal ini ditandai dengan

konsumsi pakan yang relatif konstan setiap hari. Tujuan periode ini adalah agar terjadi penyesuaian

hewan percobaan terhadap pakan yang sedang diuji dan untuk meniadakan pengaruh pakan yang

dikonsumsi oleh ternak pada beberapa waktu sebelumnya. Setelah periode pendahuluan dilaksanakan

maka diikuti dengan periode pengumpulan data yang dilakukan selama 7-14 hari. Pada periode ini,

pakan yang diberikan pada tiap ekor ternak dan yang tersisa dan juga feses yang dikeluarkannya

ditimbang setiap hari dan sampel masing-masing diambil sebanyak kurang lebih 10 %. Kemudian

sampel yang terkumpul dianalisa kandungan zat makanannya di laboratorium.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

- Timbangan

- Kandang metabolis sebanyak ternak yangdigunakan

- Ember penampung/pengumpul feses masing-masing kandang 1buah

- Ember pengumpul urine masing-masing kandang 1buah

- Kantong plastik tempat sampel urine, feses, pakan hijauan dankonsentrat

- Sebuah freezer ataukulkas

- Spidol permanen untuk memberitanda

- Gelas ukur 10ml

- Chopper untukhijauan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

- Kambing

- Pakan ternak kambing (hijauan dankonsentrat)

- Airminum

- Larutan H2SO410%

- Formalin

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

of54

Materi III

Kecernaan In Sacco

Dasar Teori

Untuk mengetahui nilai manfaat suatu pakan perlu dilakukan percobaan kecernaan pakan pada

ternak, karena dari hasil analisis kimia terhadap suatu pakan hanya menggambarkan nilai zat-zat makanannya

tanpa nilai manfaatnya. Kecernaan in sacco merupakan pengukuran kecernaan pakan dengan memasukkan

bahan pakan dalam kantong nilon ke dalam alat pencernaan ruminansia. Kecemaan secara in sacco dengan

menggunakan metode kantong nilon adalah suatu metode yang sederhana untuk mendapatkan informasi

dasar tentang nilai nutrisi pakan (kecernaan), dengan cara menempatkan kantong nilon berisi sampel pakan

di dalam rumen selama waktu tertentu. Pori-pori kantong nilon berkisar antara 20- 50m yang ditempatkan

dalam rumen temak ruminansia meialui canula, berat sampel yang di masukkan kedalam kantong nilon

berkisar 2,5-5 gram bahan kering. Faktor yang mempengaruhi kecemaan in sacco antara lain : lama inkubasi,

ukuran sampel dan saat pencucian. Masa inkubasi pakan di dalam rumen meialui percobaan kecemaan in

sacco adalah 12-36 jam untuk konsentrat, 24-60 jam untuk hijauan bemilai nutrisi baik dan 48- 72 jam untuk

hijauan berserat kasar tinggi, sehingga dengan mengetahui jumlah pakan yang hilang dari

kantong nilon, maka dapat diketahui koefesien kecemaan dan laju degradasi.

Penentuan degradasi bahan pakan di dalam rumen pada berbagai masa inkubasi telah

dijelaskan oleh Ørskov et al. (1980).

Penyiapan sampel

Materi yang digunakan adalah satu ekor sapi berfistula rumen dengan diameter bagian dalam

1 cm. Selama percobaan, sapi diberi makanan basal yang mengandung bahan pakan sesuai perlakuan

secara ad libitum. Kantung yang digunakan dalam percobaan berbahan polyester dengan ukuran 6 cm

x 12 cm dengan lubang pori-pori lebih kurang 60 mikron. Berat kantung nilon kering sekitar 0,5 g-

1,0 g. Setiap kantung diberi nomor sebagai tanda perlakuan, dan setiap bahan pakan membutuhkan

dua kantung untuk pengamatan secara duplo. Sampel yang digunakan adalah bahan pakan kering

udara (as fed basis) dan telah dihaluskan dengan hammer mill sampai berukuran 1 mm.

Prosedur Teknik Kantung Nilon

Teknik kantung nilon ini dapat digunakan untuk menyaring pakan pada tingkat taksiran awal

nilai gizinya. Prosedur teknik kantung nilon adalah sebagai berikut:

1. Timbang kantung nilon kering, kemudian catat bobot kantung (agram).

2. Timbang 3 gram untuk bahan pakan hijauan atau 5 gram untuk bahan pakan sumber

protein (biji-bijian), kemudian catat bobot bahan (bgram).

3. Ikat kantung nilon pada tali plastik yang telah diberi pemberat.ƒ

4. Masukkan ke dalam rumen untuk inkubasi pada waktu yangberbeda-beda.

Masa inkubasi

Sampel dimasukkan kedalam rumen untuk inkubasi selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, 24 jam,

48 jam, dan 72 jam. Masa inkubasi 0 jam berarti sampel tidak dimasukkan ke dalam rumen,

tetapi cukup dicuci dengan air mengalir selama lima menit untuk menghilangkan partikel-

partikel terlarut, kemudian dikeringkan pada 60ºC selama 18–24 jam. Mengambil kantung

dari rumen, pencucian, danpengeringan:

of54

1. Keluarkan kantung nilon beserta tali dari dalam rumen dan masukkan ke dalam timba

yang berisi air hangat untuk menjaga fermentasi dan mencuci partikel-partikel pakan keluar

darikantung.

2. Lepas kantung nilon dari tali pengikat dengan menggunakangunting.

3.Cuci kantung nilon dengan air mengalir sampai air berwarnajernih.

4. Keringkan kantung nilon pada 60ºC selama 18-24 jam atau sampai beratnya tidak

berubah.

5. Timbang kantung nilon beserta bahan pakan, catat bobot sampel (cgram).

6. Persentase residu sampel dapat dihitung menggunakanrumus:

Laju degradasi BK dapat dihitung menggunakan persamaan Ørskov dan McDonald

(1979):

p = a + b (1- e -ct), di mana:

p = degradabilitas pada waktu t.

a = bagian yang dapat larut dalam air (%, waktu 0 jam)

b = bagian yang potensial dapat didegradasi (%)

c = laju degradasi dari b (%/jam)

e = konstanta eksponensial

t = waktu inkubasi (jam)

Nilai parameter degradasi a, b, dan c dihitung dengan menggunakan paket program

Neway Excel.

of54


…………………………………………………

Laporan Sementara :

manualpraktikum page1of54...page4of54 daerah (zone electrophoresis).pada teknik elektroforesis...

Documents