PRINCIPALI MALATTIE PARASSITARIE DEI MOLLUSCHI BIVALVI

MAIN NOTIFIABLE DISEASES OF BIVALVE MOLLUSCS

Andrea Gustinelli

Produzioni nazionali molluschi dati 2018 su base Eurostat

VOCE COMMERCIALE PRODUZIONE (tons) PREZZO (eurotons)

OSTRICHE 80 7000

COZZE O MITILI 66000 900

VONGOLE VERACI 39000 6015

MALATTIE NOTIFICABILI PER OIE

OIE NOTIFIABLE DISEASES

1 Usually grow-out cultured mollusc populations are reared semi-intensively (in trays bags nets or on

ropes stakes and using bottom culture methods) and they have extensive interaction with natural

environments

2 Cultured mollusc populations frequently have components of their life cycle occurring in a wild state

(eg collection of wild spat for further grow-out) and such populations are not always accessible for

observation and sampling

3 Multiple culture methods for the same species may exist within the same jurisdiction and thus

represent different populations with respect to risk characteristics

4 Extremely large geographic areas may comprise many small contiguous farms or production units with

different ownership and management This can present challenges when designing sampling

programmes based on stock ownership

5 Molluscs can be sessile (eg adult oysters) at some points during their life cycle and very mobile at

other stages (eg oyster larvae)

6 Mollusc populations particularly wild molluscs may be difficult to locate due to their habitat (eg buried

clams subtidal populations)

7 Geographical areas frequently contain many species and age classes of molluscs derived from

different sources causing difficulty in identifying separate mollusc populations to which surveillance

programmes can be targeted

8 Wild mollusc populations are very important for the disease status of a country but are not necessarily

available for sampling at specific times

OIE

Guide for Aquatic Animal Health Surveillance

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

MALATTIE ESOTICHE ndash EXOTIC DISEASES

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Produzioni nazionali molluschi dati 2018 su base Eurostat

VOCE COMMERCIALE PRODUZIONE (tons) PREZZO (eurotons)

OSTRICHE 80 7000

COZZE O MITILI 66000 900

VONGOLE VERACI 39000 6015

MALATTIE NOTIFICABILI PER OIE

OIE NOTIFIABLE DISEASES

1 Usually grow-out cultured mollusc populations are reared semi-intensively (in trays bags nets or on

ropes stakes and using bottom culture methods) and they have extensive interaction with natural

environments

2 Cultured mollusc populations frequently have components of their life cycle occurring in a wild state

(eg collection of wild spat for further grow-out) and such populations are not always accessible for

observation and sampling

3 Multiple culture methods for the same species may exist within the same jurisdiction and thus

represent different populations with respect to risk characteristics

4 Extremely large geographic areas may comprise many small contiguous farms or production units with

different ownership and management This can present challenges when designing sampling

programmes based on stock ownership

5 Molluscs can be sessile (eg adult oysters) at some points during their life cycle and very mobile at

other stages (eg oyster larvae)

6 Mollusc populations particularly wild molluscs may be difficult to locate due to their habitat (eg buried

clams subtidal populations)

7 Geographical areas frequently contain many species and age classes of molluscs derived from

different sources causing difficulty in identifying separate mollusc populations to which surveillance

programmes can be targeted

8 Wild mollusc populations are very important for the disease status of a country but are not necessarily

available for sampling at specific times

OIE

Guide for Aquatic Animal Health Surveillance

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

MALATTIE ESOTICHE ndash EXOTIC DISEASES

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

MALATTIE NOTIFICABILI PER OIE

OIE NOTIFIABLE DISEASES

1 Usually grow-out cultured mollusc populations are reared semi-intensively (in trays bags nets or on

ropes stakes and using bottom culture methods) and they have extensive interaction with natural

environments

2 Cultured mollusc populations frequently have components of their life cycle occurring in a wild state

(eg collection of wild spat for further grow-out) and such populations are not always accessible for

observation and sampling

3 Multiple culture methods for the same species may exist within the same jurisdiction and thus

represent different populations with respect to risk characteristics

4 Extremely large geographic areas may comprise many small contiguous farms or production units with

different ownership and management This can present challenges when designing sampling

programmes based on stock ownership

5 Molluscs can be sessile (eg adult oysters) at some points during their life cycle and very mobile at

other stages (eg oyster larvae)

6 Mollusc populations particularly wild molluscs may be difficult to locate due to their habitat (eg buried

clams subtidal populations)

7 Geographical areas frequently contain many species and age classes of molluscs derived from

different sources causing difficulty in identifying separate mollusc populations to which surveillance

programmes can be targeted

8 Wild mollusc populations are very important for the disease status of a country but are not necessarily

available for sampling at specific times

OIE

Guide for Aquatic Animal Health Surveillance

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

MALATTIE ESOTICHE ndash EXOTIC DISEASES

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

1 Usually grow-out cultured mollusc populations are reared semi-intensively (in trays bags nets or on

ropes stakes and using bottom culture methods) and they have extensive interaction with natural

environments

2 Cultured mollusc populations frequently have components of their life cycle occurring in a wild state

(eg collection of wild spat for further grow-out) and such populations are not always accessible for

observation and sampling

3 Multiple culture methods for the same species may exist within the same jurisdiction and thus

represent different populations with respect to risk characteristics

4 Extremely large geographic areas may comprise many small contiguous farms or production units with

different ownership and management This can present challenges when designing sampling

programmes based on stock ownership

5 Molluscs can be sessile (eg adult oysters) at some points during their life cycle and very mobile at

other stages (eg oyster larvae)

6 Mollusc populations particularly wild molluscs may be difficult to locate due to their habitat (eg buried

clams subtidal populations)

7 Geographical areas frequently contain many species and age classes of molluscs derived from

different sources causing difficulty in identifying separate mollusc populations to which surveillance

programmes can be targeted

8 Wild mollusc populations are very important for the disease status of a country but are not necessarily

available for sampling at specific times

OIE

Guide for Aquatic Animal Health Surveillance

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

MALATTIE ESOTICHE ndash EXOTIC DISEASES

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

MALATTIE ESOTICHE ndash EXOTIC DISEASES

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

MALATTIE NON ESOTICHE ndash NOT EXOTIC DISEASES

MALATTIE DI MOLLUSCHI E CROSTACEI INSERITE NELLA DIRETTIVA 200688

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

bull Phylum Cercozoa

bull Ordine Paramyxida

bull Specie(s) Marteilia refringens

Responsabile di ricorrenti episodi di mortalitagrave a carattere devastante in

ostriche piatte (M refringens O) ndash Etiological agent of massive mortality

outbreaks

bull Specie ospite - Host species Ostrea edulis

+ M pararefringens (M refringens M) in Mytilus edulis e M galloprovincialis

+ M sydneyi in Crassostrea glomerata - ldquoMalattia QX ldquo

+ M cochilia in Cerastoderma edule

+ M octospora in Solen marginatus in Spagna

bull Localizzazione tratto digestivo

bull Parasite of the intestinal tract

MARTEILIOSI(S)

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

TASSONOMIA

TAXONOMY

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

La marteiliosi da M refringens era conosciuta in passato anche come ldquoAber diseaserdquo

dellrsquoostrica piatta (O edulis) ed egrave nota in Europa fin dal 1968 avendo causato

ricorrenti episodi di mortalitagrave devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel

giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione

Known since 1968 in Europe as laquoAber diseaseraquo caused massive mortalities in O

edulis in France and reducing of a half its oyster production in 10 years

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia

refringens (Rhizaria Ascetosporea Paramyxida) lsquocomplexrsquo with

consequences for policy and trade decisions

A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal

Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases

concluded that M refringens and M maurini were synonymous (EFSA 2007)

The synonymization of M refringens and M maurini had an important

consequence any new discovery of infection by either type could only be

reported as M refringens a notifiable pathogen to both the OIE and to the

European Commission under Directive EC20068

Kerr et al (2018)

MARTEILIOSI

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

M refringens and M pararefringens have different distributions There is currently

no evidence of M refringens north of France (Kerr et al 2018)

MARTEILIOSI

Consistent with these results are previous

findings of a programme monitoring for

presence of Marteilia and Bonamia in O

edulis running from 1982 to 2014 (Laing et

al 2014) In total 76 307 oysters from 144

sites in England and Wales were examined

by histology in which no cases of Marteilia

infection were found Similarly routine

sampling of 2985 Swedish oysters in 199-

96 and from 2006-15 by the Swedish

Veterinary Institute revealed no Marteilia

infections (unpublished data) and oysters

infected with Marteilia have also never been

recorded in Norway (Kerr et al 2018)

Arzul et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani

infected with M refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in

copepodid stage III (CIII) of Paracartia

grani (A) Alimentary canal epithelium (B)

digestive epithelium (C) germinal site of

ovary (Boyer et al 2013)

Carrasco et al 2018

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

Differenti stadi del parassita possono

essere osservati nelle ostriche infette

Different stages in infected oysters

bull I giovani plasmodi si rinvengono

nellrsquoepitelio dei palpi labiali e nello

stomaco

Young plasmodia in labial palps amp stomach

bull La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei

dotti della ghiandola digestiva

Sporulation in tubules and digestive glands

bull Gli sporangi sono rilasciati nel lume del

tratto digestivo ed eliminati con le feci

Possono sopravvivere nellrsquoambiente per

diversi giorni fino a 2-3 settimane in

relazione alle condizioni ambientali

Sporangia in the environment through

faeces

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

CICLO BIOLOGICO

Life cycle

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

bullMarteilia refringens egrave causa di elevate mortalitagrave nellrsquoostrica piatta sebbene si manifesti in

alcune popolazioni senza causare malattia Nei mitili in genere lrsquoinfezione egrave asintomatica

In some oyster population infection is asymptomatic as in mussels

bullLa morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione

Death in second-year specimen

bullI fattori che agiscono sulla risposta dellrsquoospite non sono noti ma si ritiene possano essere

dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

bullPuograve sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dallrsquoospite

Environmental survival up to 2-3 weeks

Fattori predisponenti sono

temperature gt17degC

Salinitagrave lt30permil

Tuttavia la malattia non egrave stagionale ed elevate mortalitagrave si possono verificare anche in

inverno

Marteilliosis is not really seasonal and mortality outbreak can occurr also during winter

Epidemiologia

Epidemiology

Predisposing factors

Water Temperature gt17degC

Salinity lt30permil

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Lrsquoemergenza di M refringens negli anni lsquo70 ed il suo impatto economico

e sociale egrave storicamente documentato per lrsquoostreicoltura francese di O

edulis Subito dopo la Francia anche le produzioni di Spagna Italia e

Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte

dellrsquoallevamento venne dirottato verso lrsquoostrica concava americana

Crassostrea gigas

Questrsquoultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e

Bonamia e unrsquoottima adattabilitagrave agli ambienti marini europei con ottimi

risultati produttivi

La produzione di O edulis in Europa non ha piugrave raggiunto i livelli

produttivi precedenti al 1970 quindi attualmente lrsquoostreicoltura europea si

basa sullrsquoallevamento di C gigas che recentemente egrave stata colpita da

focolai ad elevata mortalitagrave da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar)

(Segarra et al 2010)

Epidemiologia

Epidemiology

The emergence of M refringens in the 70s and its economic and social

impact is historically documented for the French oysterculture of O

edulis Immediately after France the productions of Spain Italy and

Portugal were also devastated by Marteiliosis and a large part of the

production was shifted to the American concave oyster Crassostrea

gigas

C gigas has shown considerable resistance to Marteilia and Bonamia

and excellent adaptability to European marine environments with

excellent production performances The production of O edulis in

Europe has no longer reached the production levels before 1970

therefore currently European oyster farming is based on the farming of C

gigas which has recently been hampered by high mortality outbreaks by

Ostreid Herpesvirus ( OsHv-1 lvar)

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Epidemiologia

Epidemiology

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

La prevalenza egrave molto variabile fino al 98 in O edulis

High ranges of prevalence values up to 98 in O edulis

Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione

dellrsquoallevamento e da tempi di esposizione allrsquoinfezione superiori ad 1 anno

Linfezione egrave letale per le ostriche un tasso di mortalitagrave del 50-90 egrave di

solito riportato durante lestate e lautunno ed egrave associato alla sporulazione

del parassita Allo stesso modo la morbilitagrave egrave piugrave alta durante i periodi piugrave

caldi

Mortality and morbility higher in warm periods

Le cozze sono meno influenzate dallrsquoinfezione ma episodi di mortalitagrave fino

al 40 sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al 2004)

e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalitagrave del 100 una

volta introdotte in una zona infetta

In mussels mortality up to 40 in farmed and 100 in wild population

Epidemiologia

Epidemiology

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli

digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti

Main lesions on digestive gland with loss of nutrient absorption

Vengono coinvolti lrsquoepitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli

stadi iniziali di infezione poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti

digestivi

Patogenesi

Pathogenesis

Young stages (without refringent granules)

of Marteilia refringens (arrowheads) within

the digestive epithelium of Ostrea edulis

HampE staining

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

La ghiandola digestiva in cui M refringens e le altre specie si localizzano egrave nei

molluschi un sito di digestione intracellulare dellrsquoalimento e uno dei principali siti per

lo stoccaggio delle riserve metaboliche

Picture Histological section of O edulis digestive gland showing M refringens sporangia (arrows) inside

the epithelium and free in the lumen (HampE)

Patogenesi

Pathogenesis

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Segni clinici non sono patognomonici sebbene spesso si osservi

dimagrimento pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita

atrofia delle gonadi ed elevata mortalitagrave

Clinical signs are not patognomonic slimming (loss of volume) paleness

growth reduction gonadal atrophy and high mortality rate

Patogenesi e Sintomatologia

Pathogenesis and clinical symptoms

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Histopathological sections of Marteilia spp parasites in host tissues hematoxylin and eosin staining (A)Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel Mytilus galloprovincialis Scale bar =50 lm (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle Cerastoderma edule Scalebar = 100 lm (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the oysterSacccostrea glomerata Scale bar = 20 lm (D) M sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of thedigestive tubules of S glomerata Scale bar = 40 lm

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor

Diff-QuiK ecc Morfologia del parassita (30ndash40 μm)

Smears of digestive gland stained with Hemacolor Diff-Quick Parasites morphology

Diagnosi(s)Esame macroscopico poco significativo trasparenza del

mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno)

emaciazione ghiandola digestiva di colore chiaro

rimpicciolimento e magrezza dellrsquoanimale in caso di grave

infezione

Macroscopic lesions not significative

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Esame microscopico a fresco

Fresh mount microscopy

In infezione avanzata sporangi maturi

con granuli rifrangenti possono essere

osservati in preparati a fresco dagli

individui aperti o appena morti o dalle

feci di molluschi vivi

Microscopia elettronica citopatologia

Electron microscopy citology

In infezione avanzata diverse fasi dei

parassiti possono essere osservate

negli epiteli del tratto digestivo

Diagnosi(s)

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Histology ndash golden standard

Indagini biomolecolari (PCR)

Molecular diagnosis (PCR + ISH)

La PCR egrave la tecnica di conferma ISH Smart 2 egrave in grado di rilevare le specie di

Marteilia incluse Marteilia refringens M pararefringens and M sydneyi

Diagnosi(s)

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Journal of Invertebrate Pathology February 2013 Volume 112 Issue 2 Pages 175ndash183

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Diagnosi(s)

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi egrave la restrizione delle

movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free

Stocks movimentation restricted from infected areas

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi piugrave

facilmente puograve ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante

il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad

utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinitagrave (35-37permil) per limitare lo

sviluppo di Marteilia

Stocking and ongrowing out of the warmer period andor in high salinity (35-37permil)

areas could greatly limit the infection risk

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea

ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilitagrave

Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono

altamente suscettibili allinfezione

Ostrea species are all susceptible

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in

Crassostrea gigas (Berthe et al 2004) questa specie appare resistente

alla infestazione del parassita

Crassostrea gigas is resistent (few report of infection without pathology)

Il mantenimento dellrsquoallevamento a basse densitagrave o in associazione a

specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas hanno dimostrato

di essere strategie efficaci di controllo dellrsquoinfestazione da Marteilia

Low farming densities and polyculture with C gigas seem effective

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

La diversificazione egrave una questione importante per i produttori percheacute aiuta ad

ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali

associate con patologie specie-specifiche

Ad esempio M cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di

Cerastoderma edule in Spagna Prevalenze e mortalitagrave associate hanno

raggiunto il 100 causando un collasso di una delle principali risorse

economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012

Great relevance of DIVERSIFICATION to face up with emergingnew diseases

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M refringens la

mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe

essere elemento importante di cui tenere conto per unrsquoefficace strategia

preventiva

Life cycle clarification assessment of presence of susceptible crustaceans

Misure di prevenzione e controllo

Prevention and Control

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

La Bonamiosi da Bonamia ostreae unitamente ad epizoozie causate da Marteilia

refringens ha causato drammatici cali nella produzione di Ostrea edulis in Francia

da 20000tanno degli anni lsquo70 a 1800 tanno nel 1995

Bonamiosis + Marteiliosis devasting outbreaks

Phylum

Haplosporidia

Specie(s)

Bonamia ostreae Bonamia exitiosa

Bonamia (Mikcrocytos roughleyi)

Bonamia perspora Bonamia spp

Specie ospite Host species

Ostrea edulis + altre specie di ostriche

Localizzazione protozoo intraemocitario (2-5 microm) chiamato anche microcell

Localization Emocytic protozoan so called microcell-

BONAMIOSI(S)

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

BONAMIOSI(S)

Ospiti recettivi alla malattia da Bonamia ostreae

Susceptible host species

Ostrica piatta Ostrea edulis

Ostrica cilena Ostrea chilensis

Ostrica olimpia Ostrea conchaphila

Ostrica piatta argentina Ostrea puelchana

Ostrica piatta australiana Ostrea angasi

Ostrica asiatica Ostrea denselammellosa

Ostrica suminoe Crassostrea ariakensis

Specie sensibile in natura susceptible species in natural environment

Molluschi bivalvi non suscettibili e non responsabili di trasmissione

Not susceptible species

Ostrica concava Crassostrea gigas

Mitili Mytilus spp

Vongole Ruditapes spp

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Bonamia ostreae registrata in Europa per la prima volta in Normandia nel 1979diffondendosi poi con la movimentazione di ostriche in Spagna Portogallo Grecia ItaliaRegno Unito e altri paesi europei MALATTIA NOTIFICABILE PER LA 200688 E LrsquoOIE

Bonamia exitiosa individuata in Nuova Zelanda Australia sud e nord America e dal 2007 inEuropa prima in Spagna quindi in Francia Italia e UK MALATTIA NOTIFICABILE PER LA200688 E LrsquoOIE

BONAMIOSI(S)

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Heart smear showing extracellular (1048772 ) and intracellular (1048772 ) Bonamia ostreae cells

within oyster haemocytes (blood cells)

BONAMIOSI(S)

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Agente eziologico - Etiological agent

MICROCELL

La cosiddetta ldquomicrocellulardquo egrave provvista di 1 nucleo ediversi organelli citoplasmatici2 forme- una di dimensioni 2-3 μm basofila citoplasma denso egraveforma solitamente libera nei tessuti extracellulareritenuta uno stadio di trasmissione- una di 25-5 μm piugrave chiara provvista di nucleo e diversiorganelli citoplasmatici egrave lo stadio vegetativo che sievidenzia nel citoplasma degli emociti e nelle celluleepiteliali branchiali = stadio parassitario (10 o piugraveparassiti)

2 STAGES 1 TRANSMISSION STAGE + 1 PARASITIC STAGE

Riproduzione per fissione binariaReproduction by Binary fission

BONAMIOSI(S)

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Ciclo biologico diretto

La trasmissione diretta da ospite a ospite (per coabitazione e inoculazione) egrave stata

dimostrata sperimentalmente suggerendo che non sono necessari ospiti intermedi

sebbene non sia conosciuto il ciclo vitale al di fuori dellrsquoospite

Direct life cycle through cohabitation or inoculation

Si sospetta il possibile ruolo di invertebrati acquatici quali vettori del parassita

Role played by aquatic invertebrates hypothized

Forme infettanti e vie di ingresso e di eliminazione non determinate anche se si

ritiene che lrsquoassunzione sia per ingestione con fagocitosi da parte degli emociti

(sono capaci di contrastare la lisi entroemocitaria)

Infective stages and penetration pathways unknown (ingestion and emocytes

phagocytosis)

Il recente riscontro del parassita in larve di ostrica ha suggerito che le larve

potrebbero contribuire alla diffusione del parassita TRASMISSIONE VERTICALE IN

DUBBIO PROBABILE INFEZIONE PRIMA DELLrsquoUSCITA IN AMBIENTE ESTERNO

BONAMIOSI(S)

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Stadi iniziali di malattia spesso accompagnati da infiltrazioni di emociti nel tessuto connettivodi branchie mantello e intorno allrsquointestino Molti degli emociti infiltranti contengono alloro interno ldquomicrocellulerdquo che sono spesso localizzati in vacuoli citoplasmatici

Le infezioni avanzate presentano diffusione sistemicaAdvanced infections are systemic

Bonamia exitiosa come B ostreae egrave intraemocitaria ma sistemizza rapidamentelocalizzandosi nei tessuti connettivi di branchie e mantello gravi infiltrazioni emocitarieBonamia exitiosa show higher systemic spreading

Il parassita si localizza solitamente negli emociti ma puograveessere osservato anche a livello extra-cellulare nelle branchiee nella ghiandola digestiva o libere nelle aree necrotiche deltessuto connettivoExtra-Hemocytic stages observed in gills digestive gland or inthe necrotic areas of connettive tissue

BONAMIOSI(S)Patogenesi - Pathogenesis

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Anche se molte ostriche infette non mostrano segni di malattia altre possonopresentare gaping discolorazione giallastra e lesioni gravi (es ulcere perforate)nel tessuto connettivo delle branchie del mantello e della ghiandola digestivaUsually signs of diseases are not evident sometime gaping yellowishdiscoloration and ulcers appear in the connective tissue of gills mantle anddigestive gland

BONAMIOSI(S)

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Nelle fasi iniziali di malattia possono mancare manifestazioni evidenti di malattia

Talvolta si osservano ulcere ldquointaccaturerdquo e perforazioni delle branchie che

appaiono contornate da aloni verdi-giallastri + nel mantello e nella ghiandola

digestiva

Segni clinici ndash Clinical signs

BONAMIOSI(S)

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Presente tutto lrsquoanno con picchi di mortalitagrave che variano a seconda delle zone La prevalenza ingenere mostra due picchi uno in tardo invernoprimavera e lrsquoaltro in autunno Sembra che bassetemperature estive associate ad alte salinitagrave estive inducano prevalenze piugrave elevate nellrsquoinvernosuccessivoTwo peaksyear of prevalence and mortality on late winterspring and autumn when temperaturefluctuationSopravvivenza al di fuori dellrsquoospite piugrave bassa ad alte temperature (25degC) che a 4degC o 15degC (58 peralmeno 1 settimana) Survival in the environment higher at higher temperature (25degC)Fattori predisponenti alta densitagrave dei molluschi allevati stress torbiditagrave dellrsquoacqua scarsadisponibilitagrave di alimento ecc

Interessa tutte le classi di etagrave del mollusco anche sesoprattutto in situazioni di endemia si hanno maggioriprevalenze e maggiori intensitagrave con lrsquoaumentare dellrsquoetagrave(soprattutto gt 2 anni) eo della taglia Prepatenza dialmeno 3 mesi (infezione rilevata in ostriche laquodisease freeraquotrasferite da almeno 3 mesi in aree infette)All ages are affected in endemic areas but higherprevalence values and intensity are observed in gt 2-years-old Pre-patent period up to 3 months

BONAMIOSI(S)Epidemiologia - Epidemiology

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

ProfilassiCertificazione sanitaria degli animali di nuova introduzione = provenienza daaziendezone indenni (malattia notificabile in base alla Direttiva 200688 e allrsquoOIE)Prevention OIE and Directive CE 200688

ControlloLe mortalitagrave possono essere ridotte in sistemi drsquoallevamento in sospensioneabbassando le densitagrave di biomassa o allevando le ostriche piatte con Crassostrea gigasche non egrave suscettibile allrsquoinfezione La semina da nursery egrave consigliata percheacute quellada banchi naturali appare significativamente piugrave parassitataControl mortality rates could be reduced managing biomass density or throughpolyculture with C gigas

TerapiaNon attuabile Not feasibleBagni con acido peracetico (0001 e 0005) hanno mostrato di poter ridurre lacontaminazione delle ostriche da parte di B ostreae

BONAMIOSI(S)

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Diagnosi(s)

Sospetto in presenza di crescita rallentata

lesioni branchiali apertura delle valve

mortalitagrave elevata in Ostrea edulis

Tecniche diagnostiche

Tecnica citologica su impronta o striscio di

cuore (ventricolo) + branchie previa colorazione

Wright Wright-Giemsa o equivalenti

Cytology on heart imprintssmears stained by Hemacolor

Tecnica istologica sezioni sagittali del mollusco (cavitagrave

cardiaca gonadi e branchie) con evidenziazione delle

ldquomicrocellulerdquo Parassiti allrsquointerno degli emociti nel

tessuto connettivo di branchie intestino e mantello

spesso associati a risposta infiammatoria (non

attendibile nelle fasi iniziali di malattia)

Histology

BONAMIOSI(S)

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

PCRTecnica di conferma (diversi protocolli ufficiali)Golden standard

Ibridazione in situ (In Situ Hybridization)Sono stati messi a punto protocolli di ibridazione in situPuograve aiutare a diagnosticare le prime fasi dellrsquoinfezionepiugrave difficili da rilevare con la sola istologia

Microscopia elettronica - Electron microscopyNon puograve essere usata di routineRaccomandata se il parassita egrave osservato in nuovaspecie ospite

ISH - branchie di Ostrea edulis con Bonamia cells (in blu)

nel tessuto connettivo (Bismarck Brown counterstain)

BONAMIOSI(S)

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

bull Phylum PERKINSOZOA

bull Famiglia Perkinsidae

bull Specie(s)

Perkinsus olseni (sin Perkinsus atlanticus) (diffuso principalmente nel

Mar Mediterraneo + aree tropicali e subtropicali)

Mediterranean Sea and in tropical areas of South East + Australia

P marinus (Crassostrea virginica) in America settentrionale (coste

orientali) e centro-meridionale

In Northern Central and Southern America

P chesapeaki P mediterraneus ecc

PERKINSOSI(S)

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

OSTRICHE

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

Ostrica perlifera (Pinctada margaritifera)

ABALONE

Haliotis laevigata

H scalaris

H cyclobates

VONGOLE

Vongola verace (Ruditapes decussatus)

Vongola filippina (Ruditapes philippinarum)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus olseni

Suitable host for Perkinsus olseni

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Ostrica americana (Crassostrea virginica)

Mitilo (Mytilus edulis)

Ostrica del Pacifico (Crassostrea gigas)

Cappa molle (Mya arenaria)

Ostrica Suminoe (Crassostrea ariakensis)

in natura (in altre specie lrsquoinfezione egrave stata indotta sperimentalmente)

Ospiti recettivi allrsquoinfezione da Perkinsus marinus

Suitable host for Perkinsus marinus

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Attualmente sono da considerare valide 67 specie del genere Perkinsus

67 species of Perkinsus considered as valid

Perkinsus honshuensis in Ruditapes variegatus in Giappone e Corea

+ Italia

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Ciclo biologico le zoospore biflagellate (4-6times2-3microm) presenti nellrsquoacqua penetrano nei tessuti dellrsquoospite

(branchie intestino o epitelio del mantello) andando spesso in posizione endoemocitaria (facilita la

diffusione) Allrsquointerno del mollusco la zoospora diventa trofozoita unicellulare (stadio vegetativo) (2-20 microm)

quindi trofozoita maturo (10-20 microm) caratterizzato dalla presenza di un vacuolo eccentrico contenente un

vacuoloplasto e di un nucleo posto perifericamente con al centro un endosoma (aspetto ad anello)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Life cycle of Perkinsus

Trasmissione diretta - Direct transmission

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

Zoospora (stadio infettante)

Zoospore ndash infective stage

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Schema di trofozoite di P marinus con le principali attivitagrave

biologicoenzimatiche (Joseph et al BMC Genomics 2010)Trofozoite di P olseni isolato in vitro Notasi il

vacuolo con il vacuoloplasto rifrangente (o) il

citoplasma granulare ed il nucleo eccentrico con un

nucleolo prominente (lt)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria) ndash

Trophozoite parasitic stage within the host

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus trophozoites copyIfremer (B Chollet)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

TROFOZOITE (fase parassitaria)

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Schema del ciclo vitale di Perkinsus olseni (da Auzoux-Bordenave et al 1995)

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

4) Popolazione cellulare in continua e simultanea proliferazione mediante

schizogonia e zoosporulazione con formazione di hypnospore o pre-zoosporangi

che una volta maturi produrranno centinaia di zoospore 5) trofozoite dal tipico

aspetto ad anello 6) formazione di uno schizonte maturo mentre rilascia trofoziti

(Burreson et al 2005)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Il trofozoita maturo va incontro a successive bipartizioni e

progressive divisioni (schizogonia) con formazione di uno schizonte

(15-100 microm) contenente 4-64 trofozoiti (in genere massimo 32) di 2-4

microm che vengono rilasciati per rottura dello sporangio e

disseminazione tramite emolinfa nei tessuti

Alla mortedecomposizione del mollusco in condizioni di anossia i

trofozoiti si trasformano in prezoosporangi o ipnospore che si

accrescono fino a 30-80 microm e quando rilasciati in acqua sviluppano

in zoosporangi allrsquointerno dei quali in pochi giorni si sviluppano

numerose zoospore biflagellate che fuoriescono attraverso una

struttura a tubo dello zoosporangio

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

SCHIZOGONIA (fase replicativa)

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Ciclo biologico di Perkinsus spp (Choi amp Park 2010)

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

CICLO BIOLOGICO DI PERKINSUS

ZOOSPORANGIO (fase proliferativa)

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA PERKINSUS

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus olseni

In Italia Perkinsus egrave stato osservato inizilmente nelle vongole filippine della Laguna di

Marano nel 1991 (Ceschia et al 1991)

In Portogallo a partire dallrsquoautunno 1983 a Perkinsus atlanticus si attribuisce

responsabilitagrave per le ldquoelevate e ciclicherdquo mortalitagrave delle vongole (R decussatus) allevate

lungo le coste della zona di Algarve (Portogallo meridionale) (Ruano amp Cachola 1986

Azevedo 1989)

Figueras (1989) segnala mortalitagrave in R decussatus allevate in Galizia (Spagna) nella Ria

de Vigo in concomitanza alla presenza di Perkinsus

Nel 2006 il parassita presente nel Mediterraneo egrave stato identificato come

Perkinsus olseni (Abollo et al 2006)

La Perkinsosi egrave comunemente considerata una malattia limitante la

produzione e motivo pertanto di gravi danni economici tanto da essere

inserita nella lista OIE riguardante i molluschi e oggetto di segnalazione dei

focolai rilevati

Perkinsosis is a limiting disease for mollusc production this is the reason for

its inclusion in OIE list of notifiable disease

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus olseni egrave ritenuto il responsabile del declino della

produzione di vongola filippina in Korea a causa delle

massive mortalitagrave (fino al 100) verificatesi a partire dagli

anni 90

P olseni is considered the main responsible of production losses of Manila

clam with mortality outbreaks up o 100 in 90s an economic losses up to 1460

USD million

Stime delle mortalitagrave ritengono che nel periodo 1991-2014

le perdite cumulative da Perkinsosi ammontino a US$ 1460

Milioni di dollari (Shinn et al 2015)

Perkinsus olseni

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

P marinus egrave considerato il responsabile di episodi

devastanti e recidivanti di mortalitagrave nelle acque del sud

degli Stati Uniti

Dal 1940 le frequenti mortalitagrave descritte in Virginia e

Maryland sembrano segnalare il momento

dellrsquointroduzione di questo patogeno

In numerose localitagrave del Golfo del Messico si sono

registrati focolai con prevalenza del 100

Perkinsus marinus

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI BIOTICI ndash Biotic factors

Gli esemplari adulti mostrano solitamente valori di prevalenza maggiori

rispetto ai giovanili presenti nella stessa area presumibilmente per la

maggiore capacitagrave filtrante e il prolungato tempo di esposizione che li

caratterizza

Adults show higher prevalence values than younger stages for a higher

filtering ability and higher exposition timelapse

Non sono necessari ospiti intermedi ma la compresenza di specie sensibili

complica lrsquoepidemiologia della malattia

Direct life cycle rarr no intermediate host

Presence of different susceptible species complicate parasite epidemiology

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

EPIDEMIOLOGIA

FATTORI ABIOTICI - Abiotic factors

La bassa salinitagrave (lt12 ppt per P marinus e lt15 ppt per P olseni) egrave un fattore

limitante Low salinity (lt12 ppt for P marinus e lt15 ppt for P olseni) as

limiting factor

La stagionalitagrave influenza lrsquoandamento dei valori di prevalenza e intensitagrave la

temperatura influisce maggiormente quando presenta ampie fluttuazioni

Lrsquoinfezione comincia nella tarda primavera a T gt20degC e raggiunge il suo

apice in estate con le maggiori mortalitagrave in Agosto e Settembre

Seasonality of the diseases with highest mortality rates during summer

Lrsquoesposizione allrsquoinquinamento o a basse concentrazioni di ossigeno

disciolto aumenta la prevalenza di infezione

Environmental pollution and low pO2 lead to prevalence increase

Le ipnospore sembrano resistere a lungo anche per mesi nellrsquoambiente

High environmental persistence of hypnopsore

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

PATOGENESI

Localizzazione Tessuto connettivo di tutti gli organi ed epitelio delle branchie +

emociti per la diffusione sistemica

Primary localization of Perkinsus in the connective tissues and gill epithelium then

systemization through emocytes

Alle prime osservazioni istologiche (Mackin 1951) si ritenne che la porta drsquoingresso

fosse lrsquoepitelio intestinale dellrsquoostrica Infestazioni sperimentali hanno

successivamente dimostrato che gli epiteli delle branchie dei palpi labiali e del

mantello hanno importanza similare se non superiore

Epithelia of gills labial palps and mantle as main entrance pathway

I trofozoiti in accrescimento e divisione nei tessuti dellrsquoospite provocano unrsquointensa

reazione infiammatoria ed incapsulamento del parassita da parte degli emociti

Lrsquoinfiammazione provoca lesioni simili a un ldquogranulocitomardquo

Trophozoites cause massive inflammatory reaction by the emocytes with parasites

encapsulation in granulocytomas

La proliferazione del parassita comporta la distruzione di tessuto connettivo ed

epiteliale ed egrave generalmente associato a temperature gt20degC

La morte puograve avvenire dopo 1-2 anni di infezione dellrsquoospite anche in relazione a

fattori ambientali predisponenti

Dead of the host after 1-2 years pi influenced by environmental factors

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Nei casi piugrave gravi di malattia si possono osservare le valve aperte una colorazione grigiastra

dei tessuti ed un calo nellrsquoaccrescimento fino ad emaciazione

In particolare in Crassostrea virginica P marinus causa pallore della ghiandola digestiva

diminuzione dellrsquoindice di conversione emaciazione apertura delle valve retrazione del

mantello ritardo nello sviluppo gonadico formazione di ascessi nei casi piugrave gravi

Gaping greyish discoloration impaired growth as main gross aspects heavier in C virginica

affected by P marinus

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

American oysters (Crassostrea virginica) on right shows typical gross signs of infection with Perkinsus marinus Specimen

on left is healthy Source E Burreson

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

In corso di infezioni da P olseni si verifica distruzione dei tessuti connettivi ed epiteliali con formazione

talvolta di lesioni simil-ascessuali Possono essere presenti delle cisti biancastre distribuite nei tessuti del

mantello e tra le lamelle branchiali nellrsquointestino ghiandola digestiva reni gonadi I primi stadi dellrsquoinfezione

si hanno nellrsquoepitelio del tratto digestivo nelle branchie e nei palpi Gli stadi intermedi possono provocare

ascessi Nei casi terminali si possono avere diffuse infezioni sistemiche edemi necrosi generalizzata dei

tessuti e incremento della pigmentazione cellulare Il parassita puograve essere incapsulato dagli emociti

soprattutto nelle prime fasi dellrsquoinfezione Microscopicamente si evidenzia iperplasia branchiale

Nodular lesions abscessus-like and gill cells hyperplasia

SINTOMATOLOGIA - SYMPTOMS

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Tessuto connettivo di Ostrica americana (Crassostrea virginica) a sinistra il tessuto

sano mentre a destra quello di unrsquoostrica affetta da Perkinsosi con evidente infiltrato

infiammatorio Bar=20 microns HE stain

ISTOPATOLOGIA

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Focal abcesses with P olseni cells in the connective tissue of the

digestive gland from a moderately infected clam Ruditapes

philippinarum (HampE)

ISTOPATOLOGIA

Schizonti (ldquorosetterdquo) di P marinus nel

tessuto connettivo della ghiandola digestiva

di C virginica allrsquoesame istologico

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

ISTOPATOLOGIA

Trofozoiti di Perkinsus mediterraneus in diverse specie di molluschi A e B) mantello di Arca noae con cisti contenente

numerosi trofozoitiC) visceri di Ostrea edulis con trofozoiti a diverso stadio di maturazione D) trofozoiti nella ghiandola

digestiva di Chlamys varia circondati da una spessa capsula fibrosa (Ramilo et al 2015)

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus sp evidenziato con lrsquoesame istologico (1000 X)

ISTOPATOLOGIA

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus marinus nel tessuto connettivo della ghiandola digestiva e nellrsquoepitelio

intestinale di Crassostrea virginica (HE)

ISTOPATOLOGIA

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

DIAGNOSI(S)

Accrescimento ridotto tendenza allrsquoapertura delle valve e mortalitagrave in zone dove la

malattia egrave presente alimentano il sospetto anche se i segni clinici non sono

patognomonici

Clinical symptoms and gross pathology

La conferma della presenza del parassita si attua con

Tecnica istologica (branchie ghiandola digestiva tessuto gonadico)

Histology on gills and digestive gland

Tecnica colturale di Ray

Rayrsquos thioglycolate

Esame citologico di emolinfa previa colorazione

Cytology

PCR

PCR

Microscopia elettronica

EM

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Perkinsus sp evidenziati con la tecnica colturale di Ray

Tecnica colturale di Ray - Rayrsquos thioglycolate

Branchie poste in tioglicolato-brodo con aggiunta di antibiotici

ed incubazione a 25degC per 5-7 gg

DIAGNOSI

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Ipnospore colorate con Lugol dopo coltura in Rayrsquos fluid thioglycolate

medium 100x (foto Tina Crosby) (Petty 2010)

Hypnospore stained by Lugol iodine solution after Rayrsquos medium incubation

DIAGNOSI(S)

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

DIAGNOSI(S)

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Per rilevare lievi infezioni di Perkinsus con la tecnica RFTM egrave prevista

lrsquoincubazione di frammenti del cuore del retto del mantello e delle branchie

(Ray 1952 1954)

Per la diagnosi di routine le branchie vengono incubate in RFTM e le

hypnospore blu scuro vengono contate

La determinazione del tasso di infezione viene fatta secondo la scala proposta

da Mackin (Mackin 1954) in cui un valore numerico di 05 1 2 3 4 o 5 viene

assegnato per le infezioni che vanno da lieve a grave rispettivamente

Oltre alla semplicitagrave la tecnica RFTM si egrave dimostrata essere piugrave sensibile se

retto e tessuti branchiali sono incubati in Thioglycolate Medium

rispetto allrsquoosservazione diretta al microscopio ottico

Tecnica colturale di Ray

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Controllo sanitario degli animali di nuova introduzione

Sanitary monitoring of new batches

Limitazioni movimenti commerciali (P marinus

esotico per il territorio comunitario)

Restriction of Movimentations

Selezione di ceppi resistenti attualmente non efficace

Genetic selection not effective for Perkinsosis

Profilassi - Prevention

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Sono state impiegate procedure tradizionali di allevamento selettivo

nel tentativo di ottenere ceppi resistenti di ostriche

stocks di ostriche che mostrano bassa mortalitagrave nelle zone di pesante

pressione da Perkinsus sono stati utilizzati come riproduttori per

ottenere una progenie resistente attraverso piugrave generazioni (Andrews

e Ray 1988 Krantz e Jordan 1996)

Il successo del programma di allevamento selettivo per lo sviluppo di

ceppi di ostriche che avevano mostrato buona resistenza verso

Haplosporidium nelsoni (Ford e Haskin 1988) hanno incoraggiato

negli USA questi tentativi

Purtroppo i ceppi di ostriche H nelsoni-tolerant sono risultati

altamente sensibili a P marinus

Selection of resistent strain effective for Haplosporidium nelsoni but

not at all for Perkinsus marinus

Profilassi - Prevention

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Diverse strategie sono state analizzate e sviluppate per attenuare le conseguenze

drammatiche delle epizoozie di Perkinsosi negli ospiti molluschi con un grado

variabile di efficacia

Strategie precoci riguardano soprattutto un cambiamento nella gestione dei siti

produttivi in base anche allrsquoepidemiologia della malattia

Tre fattori principali vanno considerati a monte di questo cambiamento gestionale

Three main management aspects

1) le aree a bassa salinitagrave sono caratterizzate da livelli di infezione nulli o bassi ma

la crescita di ostriche egrave molto lenta mentre llsquoincidenza dellrsquoinfezione egrave generalmente

molto piugrave alta in aree ad elevata salinitagrave ma le ostriche mostrano una crescita piugrave

rapida

1) Low salinity areas show the lowest infection levels but slower gorwth

2) La temperatura ha un ruolo importante nella trasmissione dellinfezione e

sullrsquointensificazione dellrsquoinfezione e della mortalitagrave

2) Temperature

3) I molluschi infetti sono lrsquoorigine degli stadi infettanti

3) Direct transmission from infected molluscs

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Negli USA questi tre aspetti sono stati la base sulla quale coinvolgere gli allevatori

Sulla base del primo punto il cambiamento gestionale ha significato lrsquoacquisto di seme non

infetto di ostriche provenienti da aree a bassa salinitagrave e suo utilizzo in

aree ad alta salinitagrave per raggiungere la taglia di mercato

1) Juveniles from low salinity areas

Il secondo punto ha suggerito che il seme dovrebbe essere trapiantato subito dopo il termine

del periodo infettivo e successivamente raccolto subito prima che si verifichi la mortalitagrave di

massa consentendo cosigrave alle ostriche di crescere in un periodo senza infezione seguito da

un periodo di progressione dellinfezione senza elevata mortalitagrave Nelle aree in cui il clima

caldo dura piugrave a lungo il periodo di tempo per evitare le perdite da Perkinsosi egrave piugrave breve

Questo ha portato ad una diminuzione delle dimensioni da mercato delle ostriche

2) Stocking after critical period (summer) and harvesting before the following one

=

Smaller oysters

Sulla base del terzo punto la raccolta dovrebbe essere fatto accuratamente in modo che i

molluschi infetti non permangano nellrsquoambiente e fungano da serbatoio dellrsquoinfezione

3) Earlier infected molluscs removal

Strategie di gestione della Perkinsosi

Management of Perkinsosis

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective

Terapia non attuabile sui molluschi infetti (elevata

resistenza) soprattutto dal punto di vista

ecologicoambientale

Therapy not feasible

Indicazioni su base sperimentale riportano lrsquoutilizzo efficace

di acqua dolce (10 minuti) filtrazione + raggi UV e utilizzo di

cloro-derivati e disinfettanti a base di N-halamina (Delaney

et al 2003) per inattivare gli stadi liberi presenti nellrsquoacqua

Freshwater + filtration + UV + Chlorine derivates effective