Determinacion de coliformes y escherichia coli

ndice

Objetivos2Antecedentes Bibliogrficos2Materiales y Mtodos2Muestras3Procedimiento4Datos Experimentales7Resultados7Discusin11Conclusin12Bibliografa13Anexos14

Objetivos

Determinar el nmero de grmenes coliformes en alimentos mediante ensayos presuntivo y confirmativo. Diferenciar las distintas especies de coliformes de acuerdo a ensayos bioqumicos.

Antecedentes BibliogrficosExisten diversosmtodospara cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de lastcnicasms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como losprocedimientosbasados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en mediosde cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias(UFC) o la estimacin por elmtododel Nmero Ms Probable (NMP).El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras dealimentosy aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos ysueloscontaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras desueloyagua, tanto parabacteriasaerobias como anaerobias.Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37c como lo hacen los totales.Aproximadamente el 95% delgrupode los Coliformes presentes en heces estn formados porEscherichia coliy ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de losanimalesdesangrecaliente, se considera que reflejan mejor la presencia decontaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas demateriaorgnica,pH, humedad. Desde hace muchotiempose han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica queel aguao el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores deenfermedades. L. ORTIZ, M. (2003) Material didctico de Microbiologa de Alimentos

Materiales y Mtodos-Bao termorregulador con circulacin de agua-Termmetro-Incubador-Balanza semianaltica-Homogeneizador con jarra-Pipetas de 1 y 10 mL estriles-Esptula-Frascos para dilucin-Cuenta colonias Quebec-pH metro-Caldo bilis lactosa verde brillante (BGLB)-Caldo lauril sulfato triptosa (LST)-Caldo EC-Agar eosina azul de metileno de levine (L-EMB)-Caldo triptona (triptfano)-Caldo RM-VP-Agar citrato de Simmons-Agar para recuento en placa (PCA)-Tampn fosfato para dilucin o equivalente-Reactivo de Kovacs-Reactivos Voges-Proskauer-Reactivos de tincin de Gram-Indicador Rojo Metilo

MuestrasLechuga Escarola Pan Ave Mayo

ProcedimientoExamen presuntivo para coliformes1. Pesar 50 g de alimento en una jarra estril de picadora. Agregar 450 mL de tampn fosfato y homogeneizar por 2 minutos. Si es necesario, la muestra para anlisis puede ser de 25 - 50 g, dependiendo de la disponibilidad de muestra.2. Preparar diluciones decimales con 90 ml de agua de dilucin estril ms 10 mL de la dilucin previa. El nmero de diluciones a preparar depender de la densidad de coliformes esperada. Agitar todas las suspensiones 25 veces en un arco de 29 cm por 7 seg. No usar pipetas para distribuir menos del 10% de su volumen total. Transferir porciones de 1 mL a 3 tubos LST para cada dilucin para 3 diluciones consecutivas. No deben transcurrir ms de 15 minutos desde que se homogeneiz la muestra hasta que todas las diluciones estn en un medio apropiado.3. Incubar los tubos por 48 +- 2 h a 35C. Examinar lostubos a las 24 2 h para apreciar la formacin de gas. Re incubar los tubos negativos por 24 h adicionales. Examinar por segunda vez la produccin de gas. Realizar un anlisis confirmativo para todos los tubos positivos presuntivos (que formaron gas).

Anlisis confirmativo para coliformes1. Agitar suavemente cada tubo LST positivo para gas y transferir una asada de suspensin a un tubo de caldo BGLB. Para esto, colocar el tubo LST en ngulo e introducir el asa evitando transferir la pelcula superficial (si est presente).2. Incubar los tubos BGLB por 48 2h a 35C. Examinar la produccin de gas y registrar el dato.3. Calcular el nmero ms probable (NMP) de coliformes basndose en la proporcin de tubos LST gases positivos para 3 diluciones consecutivas.

Mtodo de caldo EC para coliformes fecales y test confirmativo para E. coli.1. Agitar suavemente cada tubo LST positivo para gas y transferir una asada de cada suspensin a un tubo de caldo EC. Incubar los tubos 48 2 h a 45,5 +- 0,2C.2. Examinar la produccin de gas a las 24 +- 2 h; si es negativa, examinar nuevamente a las 48 +- 2 h. Usar los resultados de este test para calcular el NMP de coliformes fecales.3. Estriar una asada de suspensin de cada tubo gas positivo en agar L- EMB. Incubar 18-24 h a 35C. Examinar las placas en busca de colonias sospechosas de ser E. coli, planas y de centro oscuro, con o sin brillo verde metlico.4. Transferir 2 colonias sospechosas de cada placa L-EMB a agar PC tendido para anlisis morfolgico y bioqumico. Incubar los tubos de agar tendido 18-24 h a 35C. Si no hay colonias tpicas presentes, transferir una o ms colonias lo ms parecidas a E. coli. Sacar una colonia de cada placa.5. Interpretacin. Todos los cultivos que (a) fermentan lactosa con produccin de gas dentro de 48 h a 35C, (b) aparezcan como bacilos cortos Gram negativos no formadores de esporas, y (c) dan el patrn IMViC ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2) son considerados E. coli. Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de tubos EC en 3 diluciones sucesivas que contengan E. coli. Para convertir el NMP/g de la columna de la tabla seguir este procedimiento: si los inoculados fueron 0,1, 0,01 y 0,001 para cada 3 tubos (10-1,10-2,10-3), y el resultado es 3, 1,0, la tabla da 4,27 como NMP/g. Al multiplicar por 10 se hallaran los inoculados de la tabla (1, 0,1 y 0,01), por lo tanto, el NMP/g es 42,7. (se comenz con dilucin 0,1 o 1/10).

Tabla 1. Para 3 tubos cada uno con 0.1, 0.01, y 0.001 g de inculo, los NMPs por gramo e intervalos de confianza del 95 por ciento.

Tubos positivosNMP/gLmite confianzaTubos positivosNMP/gLmite confianza

0.100.010.001BajoAlto0.100.010.001BajoAlto

0001100420--

Datos Experimentales

Resultados

De los tubos se obtuvo los siguientes resultados (a las 24 horas) para coliformes totales

Dilucin

10-1 d110-1 d210-1 d310-2 d110-2 d210-2 d310-3 d110-3 d210-3 d3

++++-+---

321

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey, luego de la incubacin por 24 horas, se obtuvo los siguientes resultados:

Disolucion 10-1 Lechuga

Disolucion 10-1 Lechuga

Metodo caldo EC

Tubos con solucion BVB

Disolucion 10-2 Lechuga

Tubos Con Caldo Peptonado

Discusin

El empleo de este medio de cultivo(Caldo EC, Caldo Bilis Verde Brillante)ahorra tambin energa; pues se requiere de una incubacin a 37C durante solo 24 h, comparada con varias incubaciones de 1 a 2 das (incluyendo una a 44.5 C), utilizadas en la tcnica tradicional. Adems, al detectarse simultneamente los organismos Coliformes y E. Coli se reduce a casi una tercera parte la cristalera empleada por el mtodo tradicional

Conclusin

Se puede concluir con respecto a los objetivos antes relacionados que la determinacin de bacterias Coliformes y E. Coli, pueden estar presentes tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden transmitir a travs de las heces fecales.La mayora de los enterococos, estreptococos y dems grupos o gneros microbianos son algunos patgenos y no patgenos, de estos se pueden preparar fermentaciones, que mediante un largo proceso, llegan a ser elaboradas en productos comestibles, garantizando al consumidor la mayor seguridad al consumir ese producto fermentado.

Bibliografa THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993)AnlisisMicrobiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza. MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf. FACULTAD DECIENCIASBIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo enMicrobiologa:ManualdeLaboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima.

Anexos

Cuenta Colonias: Un contador de colonias es un instrumento utilizado paracontar colonias de bacteriaso de otrosmicroorganismosque crecen en una placa de agar.Ejemplos de determinacin de NMP en series de 3 tubosEjemplo Cantidad muestra (g. o mL.) Lectura NMP 0,1 0 ,01 0,001 0,0001 0,00001 A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3 2 0 930 B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3 2 0 9300 C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0 1 0 30 D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3 2 2 2100 E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3 3 3 >110000

Nmero de tubos positivos / Nmero de tubos inoculados