UNIVERSIDAD MAYORFACULTAD DE CIENCIAS SILVOAGROPECUARIASESCUELA MEDICINA VETERINARIALaboratorio de Microbiologa VeterinariaDra. Maria Teresa Calderon.Dra. Nicole Cuthbert.Santiago2012LAB!AT!" N# 1Materiales de to$a de $uestra% T&cnicas de obtenci'n de $uestras% Medidasde Bioseguridad( Mane)o de desin*ectantes + en*er$edades de riesgo,ro*esional.-sterili.aci'n"ntroducci'nSe entiende por esterilizacin, la destruccin completa o la eliminacin total delos microorganismos patgenos y saprfitos que se encuentran en el interior o en lasuperficie de los objetos o sustancias.La eliminacin de los microorganismos puede conseguirse medianteprocedimientosfsicosoqumicos. Losmtodosfsicosseincluyenenel trminoesterilizacin y los mtodos qumicos en el de desinfeccin.Sin embargo, ello no constituye una regla fija, cualquiera que sea elmtodoempleado, fsicooqumico, laaccinletal parael microorganismopuedeser lamisma, as por ejemplo; la ebullicin (fsico coagula el protoplasma de las bacterias,esto mismo puede conseguirse con una sal de metal pesado.Clasi*icaci'nLos procedimientos de esterilizacin pueden clasificarse, como se !a dic!o, endos grandes grupos" fsicos y qumicos.Los mtodos fsicos conducen especialmente a lo que se designa con el nombrede asepsia (ausencia totalde grmenes patgenos y se basan en la aplicacin deagentes fsicos corrientes o naturales, comoson por ejemplo" la temperatura (calor,la luz y la filtracin.Losmtodosqumicos, conducenm#sbienalaantisepsia(impedimentooretraso deldesarrollode microorganismospatgenosen relacin con elorganismo$i$o y la desinfeccin (destruccin de microorganismos patgenos y saprfitos porfueradel organismo$i$o. %mbos resultados deri$andelaaplicacindeciertassustancias qumicas que poseen poder bactericida y que conocemos como antispticosy desinfectantes.-sterili.aci'n ,or calora/ -sterili.aci'n ,or calor seco. Alalla$a0Ladestruccindelos microorganismos mediantelallamaes unprocedimiento muy eficaz cuando el material a esterilizar es indestructible o se $aa inutilizar. Se aplica para esterilizar el asa de platino que se calienta al rojo blanco(&'(()*, esp#tulas, pipetas, bocas de tubos o matraces, etc. +mpleando la llamadel mec!ero ,unsen (en estos -ltimos casos se !abla mas bien de flameado. 1orairecaliente0+lairecaliente confinado a temperatura de &.()* a &/()*mantenido durante una !ora, destruye con seguridad, todas las bacterias y susesporas. 0arasuaplicacinserecurreal !ornodeairecaliente, siendoel m#susado el2orno 1asteur( que se compone de una caja met#lica de pared triple, lacentral de menos altura, disposicin que determina los espacios concntricos quese comunican superiormente, un canastillo met#lico colocado en su interior, puertaytermmetro. *omofuentedecalorlle$aunmec!eroparagasoresistenciaselctricas.+l !orno 0asteur se emplea para esterilizar material de $idrio (tubos, cajas 0etri,pipetas, etc.inalterableaesatemperatura. Nuncasee$,lea,araesterili.ar$edios de culti3o.b/ -sterili.aci'n ,or calor h4$edo 5coagulaci'n de las ,rotenas $icrobianas 1or agua en ebullici'n0 el agua en ebullicin es suficiente para matar las formas$egetati$as de las bacterias, pero no sus esporas.Se utiliza para esterilizar jeringas,agujas,pinzas,etc.1ue se depositanen unrecipiente u otro artefacto especial que contiene agua. +l calor es suministrado pormec!eros ,unsen o resistencias elctricas.Se mantiene la ebullicin dellquidodurante el tiempo que se considere necesario (mnimo &( minutos. 1or 3a,or *luente0 +s un !ec!o conocido, que el $apor fluente o $apor acti$o queemanaderecept#culosometidoaunafuentecalricaesunefecti$omododeesterilizacin. Se utiliza para la esterilizacin de instrumentos de ciruga, equiposde lec!era, industria conser$era, etc. Su temperatura alcanza apro2imadamente a&(()*. si se mantiene sin presin y a ni$el del mar. 3na simple e2posicin al $aporfluente por &4 minutos es suficiente para destruir todas las formas $egetati$as delas bacterias, pero no sus esporas, para conseguir este -ltimo objeti$o es necesariorepetir el mtodo en forma intermitente, como se describe m#s adelante. -sterili.aci'n inter$itente( *raccionada o tindali.aci'n0*onsiste en elcalentamiento discontinuadoa &(()* durante '( minutos, operacin que se repite' $eces con inter$alos de 56 !oras.+nbacteriologa, seusaprincipalmente, paraesterilizar mediosdeculti$oquelle$an sustancias que se someten a temperaturas mayores durante largo tiempo(medios con az-cares. 1or 3a,or de agua a ,resi'n0Las esporas de algunas bacterias resistentemperaturas de &(()*. Slo son destruidas cuando se aumenta la temperatura,sometiendo el $apor a presin. +n ausencia de aire, el $apor a presin tiene unatemperatura constante, por lo tanto, si conocemos la presin podemos f#cilmentedeterminar la temperatura.7apor a &(()* &,( atm7apor a &(4)* &,5 atm7apor a &&()* &,6 atm7apor a &&4)* &,8 atm7apor a &5()* 5,( atm+nel laboratorioesteprocedimientotieneaplicacinenlaesterilizacindelquidos, medios de culti$o, etc. susceptible de e$aporacin y para los cuales no puedeemplearse el calor seco.Los aparatos empleados para la esterilizacin, bajo las condiciones se9aladas sedenominanautocla$es. +l m#s usadoes el autocla$ede*!amberland, queest#constituido por un depsito cilndrico de paredes met#licas a cuya abertura se adaptauna tapa tambinmet#lica, por medio de un anillo de cauc!o y que se cierra tambin!ermticamente por tornillos articulados u otros sistemas mec#nicos especiales, lle$aadem#s un manmetro, un termmetro, lla$e de escape y $#l$ula de seguridad. +lcalor es suministrado por resistencias elctricas o por gas.Laesterilizacindematerial delaboratoriose!acegeneralmente, a&5()*durante 5( minutos, dependiendo esto -ltimo de la cantidad o $olumen de material omedio de culti$o a esterilizar. Si este mtodo se realiza en condiciones adecuadas seasegura una absoluta esterilizacin.1asteuri.aci'nSu principio b#sico es el calentamiento a temperaturas inferiores a &(()*. +steprocedimiento se emplea para destruir la mayora de los microorganismos patgenosno esporulados y enzimas. :ienen gran aplicacin en !igiene, en la pasteurizacin dela lec!e y en otros productos deri$ados.Se tom como referencia para la eliminacin de esos microorganismos. Latemperatura mnima mortal delMycobacteriumtuberculosis, quees de.')*durante '( minutos. +n la pasteurizacin de la lec!e se pueden seguir los siguientesprocedimientos.a/ M&todo lento 5VAT/0 Se coloca lec!e en depsitos especiales y se le somete alatemperaturade.4)*durante'(minutos. :ienelades$entajadealteraraunque en un grado mnimo las cualidades fsico ; qumicas de la lec!e y dereducir el contenido de $itamina % y esterilizacin fra?.M:TDS D- -ST-!"L";AC"la$eoLla$a"ncineraci'nSecoAire caliente 52!N 1AST-7!/ 51?0@C A 1B0@C ,or 1 hora/Calor>sicos -bullici'n24$edo Va,or *luente Va,or de agua a ,resi'n5A7TCLAV-/5120@C ,or 20 $inutos/>iltraci'n7ltra3ioleta!adiaciones!adiaciones5al*a( beta( ga$$a(etc./ B"S-C7!"DAD -N LAB!AT!"S0ara comenzar a trabajar en un Laboratorio Bicrobiolgico es necesario que el alumno conozca y aplique las Nor$as de Bioseguridad y las Buenas 1r6cticas de Laboratorio5CL1/. +sto le permitir# por una parte, mantener sus culti$os microbianos en condiciones libres de contaminacin para as obtener resultados confiables, y por otra parte, e$itar accidentes y contaminaciones no deseadas de si mismo, de sus compa9erosy del medio ambiente.La ,ioseguridad en el Laboratorio de Bicrobiologa estudia el riesgo de da9o a las personas y medio ambiente, para limitarlo o reducirlo a un ni$el aceptable mediante el uso de pr#cticas seguras. +l riesgo se !a definido como el producto entre la magnitud deun peligro potencial y su probabilidad de ocurrencia. Las tcnicas de ,ioseguridad !an surgido de acuerdo a las necesidades de e$itarlos accidentes en los laboratorios, debido a la e2istencia de distintos grados de riesgosdeterminados por la $ariedad de microorganismos y el a$ance de las tcnicas de culti$oy mantencin de cepas in $itro.%dem#sesnecesarioconsiderarquemuc!osdelosaccidentesnoslopuedenafectar al operario sino, que tambin a la comunidad en general, al infiltrar cepas quesean e2ticas para el pas. Bioseguridad0+s un conjunto de normas destinadas a regular di$ersas accionestendientes a proteger la salud de las personas frente a riesgos por agentes biolgicos,qumicos o fsicos.+l cumplimiento de estas normas, unidos al empleo de tcnicas adecuadas de trabajo enlos laboratorios, disminuyeel riesgo para el personal y para la integridad de losproductos.La manipulacin de agentes biolgicos representa un riesgo para las personas e2puestasdirecta o indirectamente, y para el ambiente.L a e2posicin a unriesgobiol'gicose puede producir en formadirectaoindirecta. +n*or$a directaocurre cuando las personas manipulan directamente unagente biolgico mediante tcnicas y procedimientos establecidos. Si durante lamanipulacin ocurriese un accidente, el material biolgico puede ser esparcido al medioambiente del laboratorio. +sto podra contaminar a las personas, a los equipos, mesonesinstrumentos, etc.La eD,osici'n indirecta a un riesgo biolgico puede ocurrir, por ejemplo, al tratarinadecuadamente (sin seguir las normas establecidas, material biolgico contaminado.0or ejemplo, descuidar las normas para desec!ar los medios de culti$o con crecimientode bacterias, pro$enientes de muestras de clnicas $eterinarias o de cepas puras. +stopodra contaminar el ambiente e2terno y a las personas que $i$an en l, sin que ellastengan conocimiento de lo ocurrido. +s por esto que elriesgo indirecto constituye unpeligro potencial mayor, ya que al ser desconocido no puede ser e$itado.LaCrganizacinBundial delaSalud5MS/!adefinidociertoscriterios,araclasi*icar agentesbiol'gicosseg-nsupeligrosidadparael laboratorioyparalacomunidad. +stos son los siguientes"&.D *apacidad patognica de la bacteria5.D Bodo de transmisin" contacto directo, indirecto, $a area (aerosoles,$e!culo(utensilios,alimento, $ectores (otros organismos $i$os'.D Eango de !ospederos6.D or$aci'ndeanillo"puedeserdetama9o$ariado, ad!eridoonoalapared del tubo; consistencia $ariada (pelcula tenue, grumosa omembranosa; aspecto di$erso (seco, !-medo, etc..B. >or$aci'n de ,elcula o 3elo0 puede ser de diferente consistencia, gruesao fina, lisa o rugosa, !-meda o seca, ascendente por el tubo; al agitar puedemantenerse o caer al fondo del mismo.C. >or$aci'nde ,reci,itado*loculoso0al agitar el tubo el precipitadodesciende formando largos flculos !asta el fondo del tubo (la floculacin esla dispersin de grumos slidos en una solucin coloidalD. >or$aci'nde,elcula$e$branosa0formadaporunamembranam#sgruesa que la forma pelicular o de $elo.-. Desarrollo de su,er*icie ausente0cuando se trata de bacteriasmicroaerfilas o anaerobias absolutas no se obser$a ning-n desarrollosuperficial, pero si se ad$ierte turbidez del medio en la parte inferior.Turbide. del $edioBuc!as bacterias se desarrollan produciendo enturbiamiento del medio debido ala abundante suspensin celular. +sta turbidez tiene distintos grados y se la clasificaseg-n su mayor o menor intensidad en le$e, moderada o fuerte y por su duracin entransitoria o persistente.>or$aci'n de sedi$entoBuc!os culti$os presentan sedimentos de diferente aspecto. Se clasifican en"loculoso cuando el aspecto es granuloso grueso, granular cuando es granuloso fino,escamoso y viscoso" La cantidad puede ser nula, escasa o abundante.Desarrollo del culti3o en $edio s'lidoLa morfologa colonial en medio slido es caracterstica de cada tipo bacteriano.+s -til su obser$acin en un culti$o primario, para determinar si se trata de un culti$opuro o la muestra est# contaminada. Las caractersticas m#s importantes son"pigmentaci/n. orma. dimensiones. elevaci/n. contorno y supericies.+l color depende si e2iste presencia de pigmentos carotenoides. +lStaphylococcus aureus, por ejemplo, presenta pigmentacin amarilla.La superficie puede ser lisa, rugosa, mucosa, anular concntrica o con surcos radiales.La superficie lisa se debe a la presencia de c#psula o a las cadenas laterales de lospolisac#ridos de la membrana e2terna de los gram negati$os y est# muc!as $ecesasociada a la $irulencia del microorganismo. Las colonias rugosas tienen una superficie seca formada por clulas que carecen dec#psula o que crecen en forma filamentosa. +n algunos microorganismos las cepasrugosas no poseen $irulencia.3n caso in$erso es elMycobacterium tuberculosis cuyas cepas patgenas presentancolonias secas por el >factor cuerda? y las cepas mutantes de menor $irulencia son deaspecto mas liso. La superficie mucosa se obser$a en bacterias fuertementecapsuladas como -lebsiella.Las formas $aran de puntiformes (Q& mmde di#metro !asta circular,filamentosa, rizoide o irregular.+l borde puede ser entero, ondulado, lobulado, mellado, filamentoso ofestoneado. Ctros rasgos son el olor y los caracteres pticos, el olor es caracterstico a$eces de algunas bacterias; por ejemplo"Pseudomonastiene olor a flores y unacoloracin$erdosaenel mediodeculti$olquido. Loscaracterespticosincluyenaspecto opaco, trasl-cido, opalescente o iridiscente.Sie$bra en anaerobiosisLosmediosdeculti$oparalasbacteriasanaerobiasposeen, engeneral, lasmismassustanciasnutriti$asquelosmediosparalasbacteriasaerobias, peroesnecesario pri$arlos de o2geno libre o en disolucin mediante procedimientos fsicos,qumicos o biolgicos.a.E M&todos *sicos0 &.D +2pulsin del aire por ebullicin.5.D +2traccin del aire mediante bomba de $aco.b.E M&todos 8u$icos0&.D Sustancias reductoras t2icas para las bacterias por cuyo moti$o no debenadicionarse directamente a los medios de culti$o, sino en un lugar adecuado del frascoo contenedor donde se !an depositado los tubos, placas, etc. sembradas.5.D Sustancias reductoras no t2icas para las bacterias y que se agregan directamentea los medios de culti$o. +j." glucosa al & 5 R, *istina al (,(4 R, etc.c.E M&todos biol'gicos0&.D *ulti$o simbitico deuna especie aerbica conotraanaerbica. La bacteriaaerbica estricta utiliza el o2geno.5.D :ejidos animales que pueden adicionarse a los medios lquidos. +j." :rocitos de carne, !gado, cerebro, etc.Laboratorio N@ G"nter,retaci'n + 3aloraci'n de los halla.gos obtenidos en culti3os a ,artir de$uestras ,atol'gicas + ,re,araci'n de antibiogra$as ,or $&todo de di*usi'nen agarAntibi'ticos + Antibiogra$asAntibi'ticosSeg-n SaTsman, %H:P,PC:P*C es toda sustancia qumica producida pororganismos $i$os (,acterias, !ongos o plantas que tienen poder de in!ibir eldesarrollo o destruir bacterias y otros microorganismos en soluciones dbiles.-n general los antibi'ticos se di3iden en F grandes gru,os01.ENaturales0%quellos que son sintetizados directamente por microorganismos.2.ESe$isint&ticos0Son aquellos que siendo sintetizados por microorganismos, se utiliza su n-cleoestructural ysemodificanpor agregacindeciertosradicalesqumicos. +j"%mo2icilina, *lo2acilina, deri$an todas de la 0enicilina G.F.E Sint&ticos0Sonaquellossintetizadosporel !ombreuna$ezquese!aconocidoformaestructural. +j" *loranfenicol.Modo de acci'n de los antibi'ticosLos antibiticos act-an como bacteriost#ticos o como bactericidas. Seg-n esto, UaIetz!a di$idido los antibiticos en 5 grupos"Bactericidas00enicilina +streptomicina, ,acitracina, Heomicina, 0olimi2ina ,Bacteriost6ticos0:etraciclina, *loranfenicol, +ritromicina, Ho$obiocina.Medida de acti3idadLa acti$idad de la penicilina se mide por su accin sobre la cepa @de+stafilococo (o la cepa 5(J de la Lood and