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Tesis de Posgrado
Interferencia del aluminio con elInterferencia del aluminio con elmetabolismo del hierrometabolismo del hierro
Pérez, Gladys Mabel
Tesis presentada para obtener el grado de de la Universidadde Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:Pérez, Gladys Mabel. (). Interferencia del aluminio con el metabolismo del hierro. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3653_Perez.pdf
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Facultad de Ciencias Exactas aïNaturales
Univeígi’gladde Buenos Aires
INTERFERENCIA DEL ALUMINIO
CON EL METABOLISMO
DEL HIERRO
Autora
Lic. Gladys Mabel Pérez
DirectoraDra. Alcira Beatriz Nesse
Laboratorio de AnálisisBiológicos¿a 6 5 3. Departamento de Química Biológica
Tesispara optar a1títqu de Doctor de Ia Universidad de Buefios Aires
- 2003 í
Resumen
INTERFERENCIA DEL ALUMINIO CON EL METABOLISMO DEL HIERRO
El aluminio (Al) es un elemento ampliamente distribuido en la Naturaleza, dehecho, el tercero en abundancia. A pesar de su ubicuidad, no posee una funciónbiológica conocida, por lo tanto, su incorporación a los seres vivos puede provocarsignos de toxicidad. La sobrecarga con Al ha sido asociada con la aparición dediferentes desórdenes, tales como: defectos óseos, encefalopatía y alteracioneshematológicas. Estos signos de toxicidad, aunque fueron inicialmente detectados enpacientes con insuficiencia renal crónica, pueden presentarse también en individuos confunción renal intacta. El extenso uso de este elemento en la vida cotidiana lo convierte
en un riesgo potencial para la población en general.Una vez ingresado al organismo, el Al es conducido a través del torrente
sanguíneo por la misma proteína que transporta hierro (Fe), la transferrina (Ti) yacumulado en distintos órganos y tejidos. Diversos antecedentes permitieron relacionarla acumulación de Al con el desarrollo de anemia. Por lo tanto, el objetivo planteadopara desarrollar este trabajo de investigación fue estudiar la interferencia del Al con elmetabolismo normal de Fe. Para ello, se emplearon células de la línea eritroleucémicaK562, las cuales expresan receptores específicos para Tf (RTf y RTf2) en su membranay experimentan maduración eritroide por la acción de inductores, tales como hemina ybutirato de sodio.
Los resultados demostraron que el Al interfiere con el proceso de diferenciacióncelular, ya que provoca disminución del número de células hemoglobinizadas. Elcálculo de las Kd correspondientes mostró que el RTf posee afinidad similar por loscomplejos Tf-Fe y Tf-Al, lo cual conlleva al establecimiento de una relación competitivacuando ambos están presentes simultáneamente en el entorno celular. Esta situacióntrae como consecuencia la disminución de la incorporación total de Fe y, por lo tanto,de su utilización en la síntesis de hemo. Sin embargo, cuando el Al es removido,dependiendo de la duración de la exposición a este metal y de las condiciones deinducción, la captación de Fe excede a la de las células que no fueron expuestaspreviamente a Al. Esta observación sugiere la activación de algún mecanismo destinadoa compensar la menor incorporación del metal esencial por efecto del Al. La posibilidadde que la expresión del RTf o RTf2 fuera regulada positivamente fue descartada, ya quelos niveles de ARNm y de proteína no fueron modificados como consecuencia de laexposición a Al.
Además de las vías que median la incorporación de Fe unido a Tf, existenmecanismos alternativos para la captación del metal eSCncialcuando está presente en laforma de compuestos de bajo peso molecular. La remoción de Al, después de untratamiento previo, indujo una regulación positiva de estos sistemas de transporte de Feindependientes de Tf.
Puede concluirse que la presencia de Al en el entorno celular interfiere la normalincorporación y utilización de Fe. Ello induce una adaptación celular tendiente aalcanzar los niveles del metal esencial requeridos para el metabolismo. La regulaciónpositiva de las vías alternativas de captación de Fe, las cuales no participan en laincorporación de Al, da cuenta de parte de esta respuesta, aunque no puede serdescartada la posibilidad de que la afinidad de los receptores para Tf pueda sermodificada. Sin embargo, a pesar de estas adaptaciones, la presencia continua de Al enel medio impide a las células lograr la utilización adecuada de Fe en la síntesis dehemoglobina.Palabras clave: aluminio —metabolitnzodel hierro - célular K562 —reoqbtorde tranfim'na —¡inferir de hemoglobina —transpon‘e de hierro no unido a tranijïem'na
Abstract
ALUMINUM INTERFERENCE IN IRON METABOLISM
Aluminum (Al) is widely distributed in Nature and, in fact, it is the third elementmore abundant. In spite of this, its biological function is not known, and its incorporationto living beings proved to have toxic effects. The exposure to Al has been associated todifferent disorders, such as: bone defects, encephalopathy, and hematologic alterations.Even though these toxicity signs were first detected in patients with chronic renaldeficiency, they may be also observed in people with intact renal functions. The wide useof this metal in everyday life turns it into a potential hazard to the population in general.
Once it enters the organism, Al is transporth through the bloodstteam bytransferrin (Tf), the same protein that transports iron (Fe), and it is accumulated indifferent organs and tissues. Several facts related Al accumulation to the development ofanemia. Therefore, the aim of this work was to study Al interference with normal Femetabolism. Assays were carried out using cells from the erythroleukemic line K562,which express specific receptors for Tf (TfR and TfRZ) in their membranes andexperienced erythroid maturity due to the action of inducers such as hemin and sodiumbutyrate.
Results showed that Al interferes with the cellular differentiation process causing adecrease in the number of hemoglobinized cells. The determination of the correspondingKd showed that TfR has similar afftnity for complexes Tf-Fe and Tf-Al, thus establishinga competitive relation between them when they are simultaneously present in the cellularenvironment. This situation triggers a reduction in the total incorporation of Fe and, thus,in its utilization in the synthesis of heme. However, when Al is removed, depending on thelength of the exposure and on the induction conditions, Fe incorporation is higher than incells not previously exposed to A1. This suggests the existence of a certain mechanismdeveloped to compensate the lower essential metal incorporation caused by Al. Positiveregulation of TfR or TfR2 expression was discarded since RNAm and protein levels werenot modified by Al exposure.
Apart from the pathways that mediate Tf-Fe incorporation, there are alternativemechanisms for essential metal uptake when it is in the form of low molecular weightcompounds. The removal of Al after a previous treatment induced the positive regulationof these transport systems of Tf-independent Fe.
We may conclude that the presence of Al in the cellular environment interfereswith normal Fe incorporation and utilization. This induces a cellular adaptation intendedto reach the essential metal levels necessary for metabolism. The positive regulation of thealternative Fe uptake pathways, which do not participate in Al incorporation, partlyexplains this response, but the possibility that the affinity of Tf receptors may be modifiedshould not be discarded. However, in spite of these adaptations, the continuous presenceof Al in cellular environment prevents the adequate utilization of Fe in hemoglobinsynthesis.
Key words: alumínum —iron metabolism —K562 cel/J—tranfim'n receptor- hemoglobingnt/Jei‘z':—trampa” (y'z'ronnot bound to tramfenz'n
m1comuanero
flgmmsCImqu‘os
A flkira, quien me abrió las puertas de este laboratorio, pemiitiéndome integrarsu grupo de investigación. Por brindarme su entera confianza y haberme dado fuerzascada vez que flaqueaba ante los resultados. Por su apoyo incondicional, su integridadcientífica y su calidez humana.
A Gracieh, quien me guió y acompañó en mis primeros pasos en la investigacióncientífica, brindándome su amistad.
A Ca[i, quien, a pesar del poco tiempo desde que nos conocemos, me entregadiariamente su dulzura y afecto.
A (Danieüzy Wicoúís,mis compinches del laboratorio, con quienes comparto lasbuenas y malas de cada día, los cafecitos y mates amargos.
A mis vecinas, fina María, Irene, Mercedesy Emi, quienes también compartenmis días en la facultad, la pasión por la docencia y las charlas del mediodía.
Al (Dr. Marquez, por haberme transmitido con santa paciencia susconocimientos de radioquímica y haberme permitido el uso del laboratorio deradioisótopos.
A Cecilia, quien dedicó innumerables horas a la lectura de actividad de 1251y59Fe,siempre con una sonrisa en su rostro.
A Jorge, quien realizó la cuantificación de aluminio por espectrometría deabsorción atómica.
A Néstor y ‘Ïïto, por permitirme realizar la impresión de esta Tesis en sumaravillosa impresora láser.
A Rod},por ayudarme en el intrincado laberinto de la computación.
A la Univemkfaefzfe(Buenosflires, a todos los que la componen y defienden, paraque pueda seguir siendo gratuita, democrática y de alto nivel académico.
güufys (Pérez
ÍÜWDICE
Índice
INTRODUCCIÓN
ALUMINIO
Fuentes de exposición
Exposición ambiental
Emosición dietaria
Eposición iatroge'nica
Eagbosición ocupacional
Exposición cosmética
Aluminio en el organismo
AbsorciónJ excreciónSitios de acumulación
Inducción a’ealteraciones pato/¡biológicas
ALUMINIO Y HIERRO
Similitud entre ambos metales
Aluminio Jl metabolismo de hierro
METABOLISMO DEL HIERRO
Hierro
Absorción
Transporte
Rec@t0r de transfenina e incorporación celular de hierroH omeostasis celular de lJierro
Receptor2 a’etransfim'naVia de incorporación de bierro independiente de tranyerrina
CÉLULASK562
OBJETIVOS
\IG\U1U'|U1U'Ib->UJNNN
¡_¡ p-i
hip-l ._¡._¡
._¡ 4;
NNI-lD-¡b-¡h-¡r-i WNCDNCñU'l-P
NO\
28-29
MATERIALES Y MÉTODOS 30-59
CULTIVOS CELULARES 31
Medios de cultivo y soluciones buffer 31
Calidad del agua] reactivo: 31
Exterilizaeión de materiales] solucione: 31
Células K562 32
Desarrollo 32
Recuento] viabilidad 32
Crioprexeroaa'ón 32
Pnrzfitaeión de ee'lulaJviable: 33
Control de contaminación con mieoplaxrnat 33
INDUCCIÓN DE LAHEMOGLOBINIZACIÓN 34
Inductores 34
EJtandarizaeión de la dixo/ntión] mantzfleaciónde la bernina 34
Estandarización dela evaluación dela diferenciación celular 35
Comparatión de la Jensibilidad de la! te'eniea;mieroxtopiea: 35
Eva/nación de la te'enita mieroxeopieapor eomparaeión ton
una te'enieaeipeetrofotornétriea 36
Optimización de la inducción de la diferenciación celular 37
ESTUDIO DE LAINTERACCIÓNDE Tf-Fe YTf-Al CON LOSRTf 40
Reactivos 40
Preparación de ’25I-Tf-Al 40
Testigo de ’25I -Tf-Fe 41
Titulación de aponburnana conFe2+ 41
Asociación de Tf-Al a las células 42
Inhibición de la unión de Tf-Fe 43
Estudio del ciclo celular de Tf-Fe y Tf-Al 43
Determinación de los parámetros cinéticos 44
Determinación de la Máxima Capacidad de Unión de I25I-TfFe 44
Determinación del tiempo de equilibrio de unión 45
Determinación de la Kd de '25I-Tf-Fe 46
Determinaciónde la! Kd de Tf-Fe] Tf-Al 47
EVALUACIÓNDE LAEXPRESIÓN DE RECEPTORES PARATf
Mediante ensayos cinéticos
Por citometría de flujo
Ana/2'12}a’elo; receptora eagbreradoxen membrana
Ana/2'52";a’elo; receptora tota/e: (membrana + eitop/ayma)
Análisis de los niveles de ARNm de RTfy RTf2 por RT-PCR
Extraccion a’eARN total
Obtena'o'ndeADN «copia»
Dixerïoa’elorpn'merxpara RI}; RD?) GAPDH
Amp/zfieaez'o’ndefragmento; de/ADNepor PCR
Observación de lorfragmentos amp/zfieadox
Cuantz'jíeae‘iánde las bana'a;Reaetíoor
Calidady tratamientode!material
DETERMINACIÓN CUANTITATIVADE Al INTRACELULAR
Exposición celular a AlReactivos
Tratamiento del material
INCORPORACIÓNDE Fe MEDIADAPOR Tf
Preparación de 5“’Fe-Tfa partir de apon
Incorporación total de Fe
Con la pretenda .rz'mu/ta'neadeAl, durante todo elprocedimiento
En preJena'a o luego a’ela remoez'o'nde Al, durante elpulso a'e captación
Incorporación de Fe al hemo
Estandarz'zaa'o'n de la extraeez'o'norgánica a'e/ bemo
In/Jz'bz'ez'ánde la amm; de hemopor Jueeínz'l-aeetona
INCORPORACIÓNDE Fe INDEPENDIENTE DE Tf
Contacto previo con Al
Tratamiento previo con desferrioxamina o Fe
Presencia simultánea de Fe y AlMEDICIÓN DE ACTIVIDAD DE LOS RADIONUCLEÍDOS
ANALISIS ESTADÍSTICO
BIOSEGURIDAD
Índice
48
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49
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50
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51
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54
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58
59
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 60-122
CAPÍTULO I
Acción del aluminio sobre la síntesis de hemoglobina 61
I.7 In/Jibicióndela diferenciaciónde ce'lulai'K5 62 61Conclurione: 63
Diqución 63
CAPÍTULOII
Interacción del aluminio unido a transferrina con células K562 65
II. 7Arociación de TfAl a lo; receptoresde membrana 65
II.2 Inhibicióndela unión de Tf-Fepor lapreiencia de 'IÏ-Al 66
II.3 Determinaciónde la afinidad del RTfpor 1774/ 68
II.3.a) Determinación del tiempo de equilibrio de unión 69
II.3.b) Determinación de la Kd para la unión entre el RTfy el ligando trazador 71
II.3.c) Determinación de las Kd correspondientes a la
unión entre el RTf y Tf-Fe o Tf-Al 73
II.4 Comparación entre ÍOJ'ciclo;celu/are: a'e Tf-Al] Tf-Fe 76
II.5 IncorporacióncelulardeAl mediadapor U 78Conclusiones 79
Discusión 80
CAPÍTULOIII
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LAINCORPORACION DE HIERRO 84
III. 7 Dirminución de la captación total de Fe enprei‘enciaa’eAl 84
III.2 Incorporación total de Fe luegode la remocióndeAl 85
III.3 Incorporación de Fe al bemo enpreiencia o luegodela remocióna'eAl 90
ConcluJione: 95
Discurión 96
CAPÍTULO IV
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LA REGULACION DE LA
EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES PARATRANSFERRINA 99
I V. 7 Eagoreiióndel RTf 99
IV.1.a) Determinación cinética del número de RTf 100
IV.1.b) Evaluación delosniveles de ARNm del RTf 101
IV.1.c) Análisis de los niveles de RTf por citometría de flujo 103
I V.2 Expresión delRT]? 105Cant/mima 107Dímm'án 107
CAPÍTULO V
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LA INCORPORACIÓN DE
HIERRO INDEPENDIENTE DE TRANSFERRINA 109
V. 7 Regulación poxz'tz'vade la vía alternativa de incorporación
de Fe debidoal tratamientoprevio conA! 109
V.2 Estudio de regulaciónde la In'aalternativa de captación de Pe 111
V3 Intorporaa'o'n a’eFe a travéJ de la vz'aalternativa enprexencz'adeAl 114
V.4 Intorparaciáncelu/ardeA! no medíadapar Tf 115C ana/míanex 117
Dz'xwz'o'n 1 17
CONSIDERACIONES FINALES 123-127
DIFUSIÓN DE LOS RESULTADOS 128-129
BIBLIOGRAFÍA 130-140
HMMpmvaüáN
Introducción
ALUMINIO
El aluminio es el tercer elemento más abundante y el metal más ampliamente
distribuido en la corteza terrestre. Su presencia sólo es superada por oxígeno y silicio.
La combinación de esta disponibilidad con sus propiedades mecánicas y eléctricas, lo
convierten en un elemento de suprema utilidad en una gran variedad de aplicaciones
cotidianas.
A pesar de la ubicuidad del aluminio, la evolución no le ha conferido
esencialidad o utilidad en los sistemas biológicos. Durante mucho tiempo, este metal no
esencial fue considerado virtualmente inocuo para los seres humanos. Sin embargo, su
impacto sobre los sistemas biológicos ha sido objeto de mucha controversia en las
pasadas décadas y, actualmente, la profusión de investigaciones sugiere que el aluminio
puede producir efectos fisiológicos adversos en los organismos (Nayak, 2002).
Fuentes de exposición
Exposición ambiental
El aluminio natural se encuentra en el suelo y constituye alrededor del 8% de la
superficie terrestre. El flujo de polvo desde los minerales y los materiales rocosos es la
fuente más grande de partículas portadoras de aluminio, en las cuales el metal está
presente, principalmente, en la forma de aluminosilicatos. Tanto la erosión natural de la
corteza terrestre como algunas actividades -minería, agricultura- agregan
continuamente partículas de polvo al ambiente. Además, debido a la acción del hombre,
pueden existir concentraciones mayores de aluminio en los suelos donde se desechan
los residuos de ciertas industrias, refinerías, fundiciones, canteras y minas (Nayak,
2002).
La lluvia ácida constituye un aporte significativo de aluminio al medio, ya que
favorece la solubilidad del metal. Se ha estimado a nivel mundial que el 40% de los
suelos arables y quizás, tanto como el 70% de las tierras cultivables, son lo
suficientemente ácidas como para constituir un problema serio de toxicidad por
aluminio en la agricultura (Flaten el a/., 1996).
Introducción
Exposición dictada
La ingesta media de aluminio en un individuo adulto se encuentra entre 5 y 10
mg por dia (Yokel & McNamara, 2001).
El metal está presente en muchos vegetales debido a que son cultivados en
suelos que lo contienen. Cuando el pH del suelo es menor que 5, el catión es
solubilizado en el agua y absorbido por las raíces de las plantas.
El contenido de aluminio en los comestibles es altamente variable (Pennington
& Schoen, 1995) no sólo por el empleo generalizado de algunas de sus sales en la
manufactura de alimentos, sino también, como consecuencia del almacenamiento de los
mismos en contenedores como latas y envoltorios del metal. La mayor contribución al
aluminio dietario es realizada por cereales, quesos procesados y sal, que contienen
compuestos del metal agregados como aditivos. Durante el procesamiento industrial de
conservas de frutas y cerveza se utilizan ciertas sales de aluminio, las cuales también son
componentes habituales de polvos de hornear, conservantes y agentes emulsificantes.
Las latas de bebida y los utensilios de cocina constituyen fuentes adicionales del metal
en la dieta.
La presencia de aluminio en el agua de bebida deriva de su fuente natural y de
los métodos empleados para la potabilización, que incluyen una etapa de clarificación
química con aluminato de sodio, aluminato de amonio o sulfato de aluminio. La
cantidad del metal que permanece en solución en el agua de la red urbana, depende no
sólo de la concentración residual sino también, de otras variables regionales como el pI-I
y la coexistencia de otras sustancias. A pesar de que, en comparación con otras, esta
fuente de exposición representa una pequeña proporción de la ingesta diaria de
aluminio, la presencia de un porcentaje elevado de especies solubles del metal, de bajo
peso molecular, químicamente reactivas y, posiblemente, más fácilmente absorbibles,
sería responsable de la mayor biodisponibilidad del catión en ese medio (Rondeau 8:
Commenges, 2001).
Exposición iatrogénica
En los pacientes en estadio terminal de enfermedad renal, tanto la ingestión de
compuestos de aluminio prescriptos para contrarrestar la hiperfosfaternia, como la
hemodiálisis utilizando agua con elevado contenido del metal, han sido asociadas con la
Introducción
aparición de signos de anemia, alteraciones óseas y demencia (Wills 8: Savory, 1983). Si
bien en la actualidad se tiende a disminuir la concentración de aluminio en los líquidos
de diálisis a través del tratamiento del agua por ósmosis reversa, numerosos pacientes
manifiestan aún síntomas de «demencia alurnínica» (Di Paolo et al, 1997; Montenegro et
a/., 1998). Asimismo, el aluminio continúa siendo uno de los mayores agentes causantes
de alteraciones óseas en esos pacientes (Cannata Andia, 2000).
Si bien los individuos con insuficiencia renal tienen mayor riesgo de
acumulación del metal en el organismo debido a una función excretora disminuida, la
toxicidad por almninio no está limitada a ellos. Otros pacientes con función renal
normal y aún, individuos sanos, están expuestos al metal. La causa principal de esta
exposición se halla en el extenso uso del elemento en medicina, en la industria
farmacéutica, en la elaboración de vacunas y soluciones nutritivas.
Entre los medicamentos que contienen aluminio figuran aspirinas tamponadas,
antiácidos, suplementos de calcio, productos antidiarreicos y antihemorroidales, los
cuales son comúnmente usados sin prescripción médica y pueden contribuir a la
severidad de la exposición al metal.
El acetilsalicilato de aluminio es el analgésico y antipirético de elección por
aquellos individuos a quienes la aspirina ocasiona irritación de la mucosa gástrica. Los
antiácidos contienen dihidroxi-glicinato, dihidroxi-alantoinato o hidróxido de aluminio
y su ingestión cotidiana constituye una de las mayores fuentes del metal (Permington 8:
Schoen, 1995). Es importante destacar que la ingesta del cadón en consumidores
regulares de antiácidos, puede alcanzar el gramo por día.
En la producción de una gran variedad de vacunas se utilizan adyuvantes que
contienen aluminio, entre ellas, podemos mencionar las comúnmente usadas contra la
difteria, tétanos, hepatitis, rabia y ántrax.
Este metal es también un contaminante frecuente de soluciones intravenosas,
parenterales y fórmulas de nutrición enteral. Por lo tanto, bebés prematuros, pacientes
con quemaduras severas e individuos que reciben nutrición parenteral crónica han sido
identificados como victimas de intoxicación aguda con aluminio (Pavanetto et a/., 1989;
von Stockhausen e!al, 1990; Klein, 1991; Nayak, 2002).
Introducción
Exposición ocupacional
La exposición a aluminio es inevitable debido al aumento de su uso en la vida
diaria y en las industrias. El riesgo es potencialmente mayor entre ciertos grupos
ocupacionales, como por ejemplo, trabajadores de refinerías, fundiciones, canteras,
minas, imprentas y personal involucrado en la fabricación de productos metálicos. En
estos casos, la exposición se produce por el ingreso del metal a través de la piel o por
inhalación de polvos, vapores y humos (Elinder e!a/., 1991).
Exposición cosmética
La exposición a aluminio también puede ocurrir como resultado del uso de
compuestos del metal en la manufactura de cosméticos y antitranspirantes (Flarcnd,
2001). El lactato de aluminio es utilizado en cremas dentales para dientes sensibles. El
clorhidrato de aluminio, extensivamente empleado en la composición de
antitranspirantes, actúa suprimiendo el sudor por formación de un precipitado o
desnaturalizando queratina en la capa córnea que rodea los conductos de las glándulas.
Luego de una aplicación en la axila, la absorción de aluminio ocurriría,
presumiblemente, a través de la piel (lilarcnd, 2001). Por lo tanto, no debería ser
ignorada la posibilidad de que el metal contenido en estos productos afecte la salud
(Exley, 1998).
Aluminio en el organismo
Absorcióny excreción
La absorción intestinal de aluminio per Je es muy pobre, pero muchos
compuestos orgánicos dietarios, quelantes potenciales del metal, pueden aumentarla.
Del mismo modo, ciertas condiciones patológicas pueden también favorecerla,
aumentando la posibilidad de exposición sistémica (Cannata et a/., 1993, Nayak, 2002).
La incorporación de aluminio a nivel del tracto gastrointestinal podría ocurrir a
través de dos posibles mecanismos: la via integrina-mobilferrina que transporta iones
férricos y el pasaje del catión entre las uniones gap de los enterocitos, posiblemente en la
forma de citrato, superando de esta manera las membranas apical y basolateral de
dichas células (Ward & Crichton, 2001).
Introducción
Se ha sugerido que el metal inhalado en polvos y aerosoles puede penetrar
directamente al cerebro desde la nariz, a través de las neuronas olfatorias (distribución
trans-sináptica) o sistémicamente, a través del epitelio pulmonar o vía el tracto
gastrointestinal, cuando las partículas son degluu'das (Yokel, 2001). Actualmente se
considera que la absorción pulmonar es más eficiente que la gastrointestinal.
Las aplicaciones dérrnicas de compuestos de aluminio en cosméticos,
antitranspirantes y otros productos, no inducen generalmente efectos dañinos, por lo
que se supone que la piel constituye una ruta menor de ingreso del metal (Flarend,
2001).
Para poder ser incorporado al organismo a través de las vías gastrointestinal,
respiratoria y dérrnica, el aluminio tiene que atravesar la barrera epitelial. Sin embargo,
las administraciones intravenosas, intramusculares y parenterales de compuestos de
aluminio, crean un riesgo mayor de acumulación y toxicidad debido a que la
biodisponibilidad del metal en dichas situaciones es total.
La orina es el vehículo para excretar más del 95% del aluminio que ha alcanzado
el torrente sanguíneo. Por esta razón, una función renal reducida, incrementa el riesgo
de acumulación del metal. Sin embargo, el hallazgo de altas concentraciones de
aluminio en el plasma de animales con función renal normal, sobrecargados oralmente
con el metal, sugiere que los riñones no pueden remover completamente el aluminio
absorbido. De esta manera, es posible que el mismo se acumule en los tejidos y ejerza
localmente su toxicidad (Atwood & Ycarwood, 2000).
Sitios de acumulación
Frente a una alteración del delicado equilibrio entre absorción y excreción, ya
sea por incremento de la primera o por reducción de la segunda, el aluminio comienza a
acumularse en los tejidos en forma heterogénea. La distribución del metal entre los
distintos órganos varía según la ruta, la dosis y la duración del período de exposición
(Wilhelm et a/., 1990).
Introducción
En animales de experimentación con función renal normal, sobrecargados por
vía oral con el catión, se ha observado acumulación de aluminio en suero, hueso, riñón,
bazo, hígado, cerebro y corazón (Gar-bossa el a/., 1998b; Yokcl & McNamara, 2001).
Los pulmones, ganglios linfáticos, higado y bazo son los principales órganos de
acumulación luego de una exposición inhalatoria (Nayak, 2002).
En pacientes con insuficiencia renal se presenta una situación compuesta ya que,
a la baja tasa de excreción, se suma la administración terapéutica de compuestos que
contienen hidróxido de aluminio y el empleo de líquidos de diálisis y fluidos
parenterales muchas veces contaminados con el cadón (W’ills8a Savory, 1983; Di Paolo
et a/., 1997).
Inducción de alteracionespatofisiológicas
Los efectos tóxicos inducidos por aluminio están bien documentados. Sin
embargo, a pesar del rol activo del metal en las células, no se conocen totalmente los
mecanismos que median su toxicidad (Atwood & Yearwood, 2000).
Varios órganos y sistemas son afectados en distinto grado como consecuencia
de la acumulación del metal. A continuación, se mencionan los de mayor relevancia.
o Sistema nervioso
El aluminio fue primariamente reconocido como agente neurotóxico en 1886,
en estudios realizados en soldados prusianos amputados, cuyas heridas habían sido
tratadas con alumbre para detener la hemorragia. Posteriormente, numerosas
investigaciones han sido desarrolladas para analizar la neurotoxicidad provocada por
este metal (jansson, 2001).
El cerebro constituye un sitio importante de acumulación de aluminio,
independientemente de su vía de ingreso al organismo. En animales de
experimentación, el desarrollo pre y postnatal de este órgano es afectado por niveles
elevados del metal. El cerebro parece ser uno de los órganos más susceptibles a la
toxicidad del aluminio en edades tempranas (Nayak, 2002).
Introducción
Diversas manifestaciones neurológicas han sido atribuidas a la intoxicación por
aluminio: pérdida de la memoria, temblores, depresión de la función motora, pérdida de
la curiosidad, ataxia, cambios de personalidad, psicosis intermitente y convulsiones
generalizadas con estado epiléptico. En niños pequeños, la neurotoxicidad del metal se
manifiesta fundamentalmente por la regresión de las aptitudes verbales y motoras
(Altmann, 2001).
La acumulación de aluminio en el cerebro ha sido también asociada con
condiciones neuropatológicas que incluyen: demencia senil y presenil, esclerosis lateral
arniotrópica, demencia Parkinsoniana, encefalopatía dialítica (demencia dialítica) y
placas seniles de la enfermedad de Alzheimer. Numerosos estudios epidemiológicos,
neuropatológicos y bioquímicos han sugerido una posible relación entre la
neurotoxicidad producida por aluminio y la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer
(Exley, 1999; jansson, 2001; Nayak, 2002). Aunque esta relación todavía es motivo de
controversia, no se puede ignorar la participación de la intoxicación alurnínica en el
desarrollo de severas manifestaciones neurológicas.
o Tejido óseo
Cuando se produce una exposición crónica a aluminio, el esqueleto es el
principal órgano de acumulación. Se ha sugerido que el metal se deposita en los huesos
y, ante un proceso de osteoporosis, la desmineralización ósea podría transferirlo a otros
órganos (Nayak, 2002).
La toxicidad músculo-esquelética inducida por aluminio se manifiesta en dolores
óseos, fracturas múltiples, osteomalacia, miopatía y falta de respuesta a la terapia con
vitamina D (Abreo, 2001).
0 Sistema eritropoyético
La modificación de los parámetros hematológicos constituye una evidencia
indirecta de la participación del aluminio como agente causante de anemia en pacientes
con insuficiencia renal crónica. Las primeras observaciones que permitieron asociar la
sobrecarga de aluminio con el desarrollo de anemia fueron realizadas en pacientes con
encefalopatía dialítica (Elliot 8: McDougall, 1978) y confirmadas en estudios posteriores
(O'Hare & Mumaghan, 1982; Wills & Savory, 1983; Touam et a/., 1983; Eschbach &
Introducción
Adamson, 1985; Abreo e! a/., 1989). La relación también fue demostrada en
experiencias con ratas urérnicas expuestas al metal, las cuales desarrollaron anemia y
mostraron inhibición del desarrollo de células progenitoras eritroides (Kaiser el al,
1984; Drüeke et a/., 1986; Nesse et a/., 1997).
Dada la multiplicidad de factores que afectan la eritropoyesis en los estadios
terminales de la enfermedad renal, la asociación entre aluminio y anemia pudo ser
establecida más claramente en experiencias realizadas en animales con función renal
intacta. Así, la anemia pudo ser inducida mediante distintos diseños experimentales que
incluían la administración oral de compuestos de aluminio. Los animales desarrollaron
signos de anemia y, en todos los casos, mostraron inhibición del desarrollo de células
progenitoras eritroides (Garbossa el a/., 1996; Garbossa et aL, 1998a). Este hallazgo
constituiría un indicio temprano de la alteración del sistema eritropoyético promovida
por aluminio en animales que no estaban depletados de hierro (Garbossa et a/., 1996;
Vittori et a/., 1999).
La acumulación de aluminio en hueso sustenta la hipótesis de que la presencia
del metal por períodos prolongados en la matriz ósea, produciría un efecto citotóxico
local sobre las células progenitoras critroides en la médula ósea (Kayc, 1983; Drüekc et
al., 1986; Watrin 8LGallc, 1986; Berry, 1996; Garbossa el a/., 1998b). En ese contexto, y
como consecuencia del implante de un alambre de aluminio en la médula ósea de ratas,
se observó disminución del número de eritroblastos en todos los estadios de
maduración (Zaman et 41.,1990).
Algunas investigaciones permiten sugerir que los efectos perjudiciales del
aluminio sobre el sistema eritropoyéu'co trascienden su acción sobre las células
inmaduras y se manifiestan también en los eritrocitos maduros del torrente sanguíneo.
Ya en 1929, Seibert y Wells observaron cambios morfológicos en glóbulos rojos de
conejos sobrecargados con el catión. La administración oral crónica de citrato de
aluminio aportó resultados similares en ratas, ya que el análisis por microscopía
electrónica de barrido reveló la pérdida de la forma bicóncava típica de los eritrocitos y
la concomitante aparición de células con características morfológicas patológicas
(Vittori etal, 1999).
Introducción
Una característica de la anemia inducida por aluminio en los modelos
experimentales es el aumento de la resistencia de los glóbulos rojos a la lisis en
soluciones hipotónicas (Scibcrt & Wells, 1929; Touam et al, 1983; Drüeke et a/., 1986;
Garbossa et a/., 1996; Garbossa el a/., 1998a). Este hallazgo es consistente con la
aparición de la morfología atípica mencionada, la que podría derivar de la incapacidad
de las células para mantener estable su superficie y controlar apropiadamente su
volumen. Además, el aumento de la resistencia osmóu'ca, unido a una leve
reticulocitosis y al acortamiento de la vida media eritrocitaria, suponen una mayor
destrucción celular (Touam et a/., 1983; Garbossa et a/., 1998a; Vittori et a/., 1999).
La información disponible acerca de los mecanismos a través de los cuales el
aluminio provocaría efectos perjudiciales sobre el sistema eritropoyético es escasa.
Varios caminos posibles han sido postulados, entre los que se incluye la interferencia
del aluminio en el metabolismo del metal esencial, hierro.
Introducción
ALUMINIO Y HIERRO
Similitud entre ambos metales
La química del aluminio presenta similitudes con otros dos grupos de
elementos: en primer lugar los metales divalentes magnesio y calcio y, en segundo lugar,
los iones metálicos trivalentes hierro y cromo (Williams, 1999). Particularmente,
aluminio y hierro exhiben varias propiedades físico-químicas similares, tales como radio
iónico, densidad de carga, capacidad de ser quelados por compuestos específicos y
características de solubilización e hidrólisis de sus sales (Ward & Crichton, 2001).
Ambos metales compartirían mecanismos de captación y regulación ya a nivel
del tracto gastrointestinal. En estados de deficiencia de hierro, paralelamente al
esperado incremento en la absorción del metal esencial, se produce un aumento de la
incorporación de aluminio. La lúperaluminemia parece provocar el mismo efecto que la
sobrecarga de hierro, pues la absorción intestinal de ambos metales disminuye
significativamente en animales intoxicados con aluminio (Cannata et a/., 1993).
Aluminioy metabolismo de bien-o
Indudablemente, el aluminio es incorporado y acumulado en diferentes órganos
donde produce lesiones bioquímicas relacionadas con diversas patologías. Esta
observación condujo al planteo del interrogante: ¿Cómo e: trampon‘adoestemetal a través
del tamnte Jangm'neo?
En general, los compuestos de aluminio poseen escasa solubilidad en el rango de
pH entre 5 y 7, excepto que el catión se encuentre unido a un ligando hidrosoluble. El
plasma contiene varias moléculas pequeñas y proteínas que podrían cumplir la función
de unir metales. De hecho, hierro y aluminio comparten la misma proteína de
transporte, transferrina (Tf). Aproximadamente, el 90% del hierro circula unido a Tf y
el resto se halla asociado con albúmina u otros constituyentes de bajo peso molecular.
La misma proteína constituye el principal vehículo para el aluminio (Trapp, 1983;
Martin, 1986) ya que transporta, aproximadamente, el 60% del metal. Una cantidad
cercana al 34% circula unido a albúmina y el resto, al anión citrato (Fatemi el al, 1991).
Introducción
La constante de unión de aluminio a Tf (2,5 x 1015M") es inferior a la del ligando
fisiológico hierro (3,0 x 1022M") (Cochran et a/., 1984). Sin embargo, debido a que el
nivel normal de saturación de la proteína con hierro en plasma oscila entre 25 y 45%,
aún a bajas concentraciones de aluminio existirían abundantes sitios libres para que este
metal pudiera unirse sin necesidad de competir con el hierro. De esta manera, la Tf
podría transportar ambos cationes simultáneamente y permitir que el aluminio acceda a
los diferentes órganos y tejidos del organismo.
Existiría, aparentemente, un balance entre los niveles de ambos metales en el
suero. La cantidad de hierro o aluminio podría influir sobre la capacidad de la Tf para
unir al otro elemento. En pacientes expuestos al metal no esencial, se observó una
correlación negativa entre los niveles de aluminio en suero y el porcentaje de saturación
de Tf con hierro (Cannata et a/., 1993; Lin et a/., 1995).
Por otra parte, el aluminio ejerce una acción inhibitoria sobre el desarrollo de
colonias eritroides in vitro,que depende de la disponibilidad de sitios libres de unión en
la molécula de Tf (Mladenovic, 1988; Garbossa et al, 1994). Este efecto inhibitorio
desaparece cuando la proteína se halla totalmente saturada con hierro (Garbossa et a/.,
1994).
Animales de experimentación sobrecargados con aluminio desarrollaron anemia,
aunque no se encontraron en ellos evidencias de deficiencia de hierro (Kaiser et a/.,
1984; Drüeke el a/., 1986; Vittori el a/., 1999).
Otros hallazgos demuestran también efectos del aluminio sobre mecanismos
que involucran al hierro. Se pueden mencionar: la disminución de la síntesis de
hemoglobina en células de la línea eritroleucémica Friend inducidas a diferenciación
(Abreo et a/., 1990), el incremento de protoporfirinas eritrocitarias debido a un posible
bloqueo en la inserción de hierro en el grupo hemo (Nasiadek & Chmielnicka, 2000) y
la alteración de la funcionalidad de enzimas involucradas en la biosíntesis de hemo
(Zaman et a/., 1990). Sin embargo, estos últimos resultados no son concluyentes debido
a que las enzimas estudiadas se encuentran presentes en exceso en los precursores
eritroides, por lo cual, un pequeño cambio en su actividad enzimática no tendría efectos
clinicos (jeffery, 1995).
Introducción
La presencia de aluminio podría alterar el destino normal del hierro,
disminuyendo, por lo tanto, su disponibilidad para la síntesis de hemo en células
eritroides. Normalmente, el hierro no es detectado en los lisosomas. Sin embargo, luego
de la exposición a aluminio, ambos cationes pudieron ser localizados formando un
compuesto insoluble dentro de estas organelas (Bommer et al., 1983; Warrin & Galle,
1986; Drücke et al, 1986). En el mismo sentido, la depresión del desarrollo de células
progenitoras eritroides, conjuntamente con la disminución del hematocrito y de la
síntesis de hemoglobina, se manifiestan aún en presencia de depósitos significativos de
hierro en la médula ósea de ratas intoxicadas con aluminio (Vittori et al, 1999). El
dramático incremento en los niveles del metal no esencial en diversos órganos, se
correlaciona positivamente con concentraciones aumentadas de hierro en hígado, bazo
y cerebro (Ward et a/., 2001). Se produciría así, una manifestación paradójica de
«deficiencia de hierro» a pesar de la abundancia del contenido total del metal en el
organismo.
Los antecedente: mencionado! .rugieren que la eaqboricio'na aluminio podria afectar el
metabolixmo del bierro. Lo: mismo: comtituyen clara: evidencia: a’eque el metal no esencia/podria
integ‘erir no .ro'loen la interacción del hierro con la célula, lino también, afictar Ju tránrito
intracelular, .ru utilización] au'n ma'r, lo: mecanismo: regulatorio! de la homeostaJiJ de hierro.
Si bien dit/87M!ertudioc ban tido realizado: para inuextzgarlo; efecto: de la acumulación
de aluminio sobre la búfiéOJtaJ‘iJcelular a'e hierro, loJ resultados obtenido: no son conclzglenter.La:
evidenciar indican alteraciones a a’ixtintocnine/er, aunque el o lo: ¡itior predio: de integferencia no
ban Jide identificado: aun.
METABOLISMODEL HIERRO
Hierro
El hierro es un elemento vital para todos los organismos vivientes. En la
primera etapa de la evolución de la vida, los seres vivos primitivos lo utilizaban como
parte de su sistema de generación de energía, existiendo en su estado ferroso debido al
escaso oxígeno ambiental. Cuando la concentración de oxígeno aumentó,
predominaron los compuestos oxidados y los organismos tuvieron que sintetizar
moléculas para quelar hierro con el fin de aprovechar mejor su presencia. En los
animales vertebrados, esta función es llevada a cabo por Tf y ferritina. Ambas son,
respectivamente, las proteínas de transporte y almacenamiento de hierro (Aisen 8L
Listowsky, 1980). Estas proteínas unen el metal muy estrechamente para evitar la
formación de productos hidrolíticos insolubles, pero como el proceso es reversible, el
elemento se encuentra disponible ante la demanda celular.
El hierro es almacenado predominantemente en hígado, bazo y médula ósea y es
transportado al resto de los tejidos a través de la circulación por Tf.
En el hombre, el hierro se encuentra distribuido en todas las células. En
soluciones acuosas, puede encontrarse en dos estados de oxidación estables: Fe2+ y
Fe”. Esta propiedad lo hace capaz de participar en reacciones que abarcan gran parte
de la bioquímica, incluyendo aquellas que controlan el flujo de electrones a través de
rutas bioenergéticas, la activación de oxígeno, nitrógeno e hidrógeno moleculares, la
descomposición de derivados tóxicos del oxígeno tales como peróxido y superóxido, la
síntesis de ADN y la unión de oxígeno por hemoglobina y rnioglobina (Aisen &
Lisrowsky, 1980). Entre las hemoproteínas que utilizan hierro como cofactor se
encuentran las que participan en el metabolismo del oxígeno (oxidasas, peroxidasas,
catalasas e hidroxilasas), en la transferencia de electrones (citocromos) y en la unión de
oxigeno (hemoglobina) (l’onka, 1997). En condiciones fisiológicas, el hierro siempre
está unido a una proteína ya que su presencia aislada, como en los casos de intoxicación
por el metal, produce daños graves en los tejidos. Esta toxicidad se debe a la habilidad
del hierro libre de generar, en conjunción con el oxígeno, radicales hidroxilos que
pueden causar peroxidación de las membranas lipídicas y otros constituyentes celulares
(Klausner er al, 1993). Por esta razón, su absorción, concentración y estado redox,
14
Introducción
deben ser regulados cuidadosamente: si es escaso, se produce anemia por deficiencia de
hierro y si está en exceso, causa siderosis y daño en los órganos.
Absorción
Un sujeto normal ingiere, aproximadamente, 12-18 mg de hierro diariamente, de
los cuales 1 mg es absorbido preponderantemente a través del duodeno. Diferentes
mecanismos han sido identificados para la absorción de hierro (Conrad 8a Umbreit,
2000):
0 Una reductasa férrica duodenal (Dcth) reduce los iones férricos, previo a su
entrada al enterocito vía el transportador de cationes divalentes DMI' 1 (DCTI,
Nrarnp2) presente en la superficie apical. Una vez dentro, el hierro en estado
ferroso puede ser almacenado en la proteína ferritina o alcanzar la membrana
basolateral donde es conducido por la proteína transportadora transmembrana
ferroporu'na (IREGI). Una oxidasa de membrana (bgbbaertz'n) o la
ceruloplasmina plasmática, promueven la oxidación del hierro, facilitando de
esta manera su incorporación a la apon circulante (Kaplan, 2002).
Los iones férricos pueden ser absorbidos vía una Bg-integrina de membrana y
luego, transferidos a la proteína chaperona mobilferrina. Para poder ser
utilizado, el metal debe ser convertido a su estado ferroso, paso que es realizado
por un gran complejo proteico citoplasmático llamado paraferritína. El mismo
está compuesto por Bs-integrina, mobilferrina, flavin monooxigenasa y Bz
microglobulina y utiliza una cadena de transporte de electrones con energía
derivada del NADPH, para llevar a cabo la reducción del hierro absorbido.
0 Otro mecanismo de captación y transporte, predominantemente para hemo,
involucra a un receptor de hemo putativo en la cara apical de la membrana del
enterocito. Dentro de la célula, el hemo es degradado por la hemooxigenasa y
los iones ferrosos liberados pueden seguir los mismos destinos detallados antes.
La absorción de hierro a nivel duodenal, está cuidadosamente regulada para
mantener un equilibrio entre la incorporación y la pérdida corporal. La membrana
basolateral del enterocito expresa receptores para Tf que permiten la entrada del hierro
transportado por la proteína. El metal liberado en este proceso «informa» a la célula
15
Introducción
sobre el estatus férrico del organismo. Probablemente, actúa regulando negativamente
la expresión de DMI' 1 y saturando a la mobilferrina de manera que no se una a la
integrina presente en la membrana apical del enterocito (Conrad & Umbrcit, 2000).
Transporte
Las transferrinas constituyen un importante grupo de proteínas con capacidad
para fijar metales, que se encuentran ampliamente distribuidas en los fluidos biológicos
y células de los vertebrados. Su ligando natural es el hierro trivalente, pero pueden unir
una variedad de iones metálicos multívalentes. Son glicoproteínas constituidas por una
única cadena polipeptídica, con masas moleculares relativas en el rango de 76 a 81 kDa,
en las cuales se detectan dos sitios de unión a hierro similares pero no idénticos.
Contienen hidratos de carbono unidos a la cadena polipeptídica formando dos ramas
idénticas y, aproximadamente, simétricas (Aisen 8LListowsky, 1980).
Existen tres tipos de transferrinas (van Eijk & De Jong, 1992): lactoferrina,
ovotransferrina y transferrina sérica, siendo esta última el prototipo y, por lo tanto, el
miembro del grupo más extensivamente estudiado.
La Tf es capaz de unir un átomo de ión férrico a cada uno de sus dos sitios, los
cuales poseen propiedades físico-químicas diferentes. El ubicado en la región C
terrninal de la proteína es el de mayor afinidad (Bali 8: Aisen, 1992).
Para que la unión con hierro pueda establecerse, se requiere la unión simultánea
de un anión: por cada ión férrico que se incorpora se liga concomitantemente un anión
carbonato o bicarbonato y se liberan, aproximadamente, tres protones. Los cambios de
cargas resultantes de este intercambio estarían relacionados con la afinidad diferencial
de los receptores por la Tf según su grado de saturación con hierro. Existe una
cooperatividad recíproca entre la unión del ión metalico y la del anión. Por lo tanto, se
reconoce que la Tf tiene un estricto requerimiento del anión sinergista para facilitar la
unión con el hierro. La función del anión sería la de actuar como ligando «reforzador»
de la unión entre la proteína y el metal.
A pH fisiológico, en presencia de ión bicarbonato y en ausencia de agentes
complejantes, el hierro se une a cualquiera de los dos sitios de la Tf humana. Luego,
factores cinéticos y de accesibilidad, gobiernan la distribución del metal entre los dos
sitios (Aisen 8: Listowsky, 1980).
Introducción
La capacidad total de fijación de hierro en plasma es proporcional a la
concentración de Tf. La cantidad del metal requerida diariamente es captada por la
proteína en las células del lumen intestinal y en los lugares de degradación de
hemoglobina (sistema reúculo-endotelial) (Conrad 8: Umbreit, 2000). A continuación,
transporta y cede al catión en los sitios de síntesis de hemoglobina y de enzimas que
contienen hierro. El 70% de la Tf plasmática normalmente no está saturada con el
metal esencial y, por lo tanto, la reserva total de esta proteina actúa como amortiguador
frente a las grandes cantidades de hierro absorbido o liberado las que, de otra manera,
resultarían tóxicas en su estado oxidado libre (Klausner etal, 1993). Otra de las ventajas
de que el hierro se combine con una proteína para ser transportado, es que se evita su
pérdida renal vía filtración glomerular.
Receptor de transfer'n'nae incorporación celular de hierro
El receptor de transferrina (RTf) es una glicoproteína homodimérica
transmembrana de aproximadamente 190 kDa. Ambos monómeros se encuentran
ligados entre sí por dos puentes disulfuro. Cada molécula de RTf posee capacidad para
unir dos moléculas de Tf.
Virtualmente, todas las células de los mamíferos poseen RTf en su superficie,
pero éstos se expresan en mayor número en progenitores eritroides, placenta e hígado
(Bcguin, 1992).
El hierro transportado por Tf ingresa a las células a través de un proceso de
endocitosis mediada por RTf. El primer paso, es la unión de Tf al receptor en la
membrana. A pH 7,4, el RTf posee una afinidad elevada por Tf diférrica, intermedia
por monoférrica y baja por apon. Por otro lado, forma un complejo estable con apon
en un medio de pH 5 (Young 8: Bomford, 1994).
Los RTf se encuentran agrupados en fosas (invaginaciones de la membrana
plasmática) revestidas internamente por la proteína clatrina. Una vez formado el
complejo RTf-Tf, el proceso de invaginación se completa, dando origen a una vesícula
revestida que es transportada junto con el complejo ligando-receptor al interior celular.
Una vez que la clatrina es removida, la vesícula resultante se fusiona con un endosoma
(Crichton e!a/., 2002).
Introducción
El interior del compartimiento endosomal posee un pH de, aproximadamente,
5,5 debido a la acción de una bomba de protones ATP-dependiente presente en su
membrana, la cual bombea protones desde el citosol al lumen del endosoma. A este pH
acídico, el hierro es liberado del complejo RTf-Tf como ion férrico. La unión
cooperativa metal-bicarbonato no sólo es importante para la asociación del hierro a la
Tf sino también, para su liberación. La unión anión-Tf, relativamente lábil, parece
proveer un mecanismo para la remoción fisiológica del hierro. El carbonato se desaloja
primero y, por ello, la unión metal-Tf es fácilmente interrumpida, produciéndose la
liberación del hierro mientras que la proteína permanece intacta (Aisen 8LListowsky,
1980). Posteriormente, el metal es reducido por una ferrireductasa endosomal y
transportado al citoplasma por el transportador de cationes divalentes DMT 1 (DCTI,
Nramp2) (Aisen et a/., 1999).
En contraste con la mayoría de los ligandos que, en este punto, se disocian de su
receptor y entran en una ruta de fusión con lisosoma y degradación, la alta afinidad del
RTf por apon a pH ácido, los mantiene unidos. El complejo RTf-apon es
transportado hacia la membrana plasmática donde, al tomar contacto nuevamente con
el medio extracelular de pH neutro, se disocia. La apoproteína queda entonces
disponible para captar nuevamente hierro y comenzar otro ciclo de transporte e
intemalización.
Una vez en el citoplasma, el ion ferroso incorporado puede seguir tres caminos
(Klausner et a/., 1993):
0 elpool de utilización, es decir, las proteínas celulares que requieren hierro
0 elpoolde almacenamiento, constituido primariamente por ferritina
0 el pool regulatorio, el cual incluye a las proteínas encargadas de «sensar» los
niveles intracelulares del metal.
Homeostasis celular de hierro
Los requerimientos de hierro varían según las condiciones celulares particulares
en un momento dado. Por ejemplo, las células que se encuentran en una etapa activa de
división o aquéllas que poseen necesidades metabólicas específicas, tales como la
producción de hemoglobina, requieren mayores aportes del metal.
Introducción
La homeostasis del hierro en células de mamíferos es regulada mediante el
balance coordinado entre su captación, utilización y almacenamiento intracelular. La
expresión de las proteínas claves involucradas en el metabolismo del hierro es
controlada post-transcripcionaimente por los niveles intracelulares del metal. El
mecanismo de regulación es mediado por interacciones específicas entre secuencias
IRE (iron mmomz've elementr) localizadas en los respectivos ARNm y proteínas
citoplasmáticas denominadas IRP (iron regulatogypmteím)(Aisen et a/., 1999).
Las IRE son secuencias de nucleótidos filogenéticamente conservadas. Están
constituidas por 28 bases que forman una estructura secundaria en forma de horquilla
(bairpz'no Item-loop),conformación que les permite interactuar con las IRP (Hentze 8:
Kühn, 1996).
Las secuencias IRE están localizadas en las regiones no codificantes o no
traducidas (UTRs) situadas en los extremos 5' o 3' de los ARNm. Dependiendo de la
posición en la que se encuentran, el efecto que ocasiona su interacción con las IRP es
diferente. Las IRE localizadas en la región UTR 5' actúan regulando la unión del
mensajero al ribosoma o sea, controlando la iniciación de la traducción y, aquéllas
ubicadas en la región UTR 3', modulan la estabilidad o degradación del ARNm por
acción de endorribonucleasas.
En células de mamíferos, han sido identificadas dos IRP (IRPl e IRP2). Estas
proteínas actúan «sensando» el contenido celular de hierro.
La IRPl es una proteína bifuncional que puede actuar como aconitasa
citoplasmáu'ca o unirse a secuencias IRE. Posee un cluster[4Fe-4S] en su sitio activo y
puede convertirse reversiblemente en su forma activa [4Fe-4S] o inactiva [3Fe-4S] en
respuesta a los cambios en la disponibilidad de hierro. Bajo condiciones de depleción
del metal, la apoIRPl puede unirse con alta afinidad a las secuencias IRE.
Contrariamente, cuando el aporte de hierro aumenta, la IRPl incorpora un átomo del
metal al cluster [4Fe-4S], adoptando una conformación en la cual es incapaz de
interactuar con el ARN, pero posee actividad aconitasa (Kaldy eta/., 1999). Por lo tanto,
las alteraciones en la actividad de la proteína ocurren sin cambios significativos en su
concentración.
Introducción
La IRPZ posee un 62% de homología con la IRPI pero, a diferencia de ella,
carece del cluster[4Fe-4S] y no posee actividad aconitasa. Tiene capacidad de unirse con
elevada afinidad a secuencias IRE localizadas en los mensajeros. En su región N
terminal contiene una secuencia rica en cisteínas que es responsable de la degradación
de la proteína vía proteasoma cuando los niveles intracelulares de hierro son altos (Iwai
et a/., 1995). Por el contrario, cuando el aporte del metal disminuye, se produce la
síntesis de novode la IRPZ.
Tal como fue mencionado, la síntesis de las proteínas involucradas en el
metabolismo del hierro es regulada a través de la interacción IRE-IRP.
En la región UTR 3' del ARNm del RTf, hay cinco secuencias IRE altamente
conservadas. En este caso, la interacción IRE-IRP protege al mensajero de la
degradación, permitiendo, de esta manera la traducción del mensajero con la
consecuente síntesis del receptor (Casey e!a/., 1988).
La UTR 5' de los ARNm de las cadenas liviana y pesada de la ferritina (Leibold
& Munro, 1988) y de la enzima 5-arninolevulinato sintetasa (ALAS) (Cox et a/., 1991),
contienen una única secuencia IRE. En ambos casos, la interacción de las IRP con esta
secuencia bloquea la traducción.
El sistema IRE-IRP permite a las células regular en forma coordinada la
biosíntesis de las proteínas involucradas en la captación (RTf), utilización (ALAS) y
almacenamiento (ferritína) de hierro, durante las variaciones fisiológicas de su
biodisponibilidad (Hentze & Kühn, 1996).
En un estado de depleción de hierro, el objetivo de la célula es incrementar la
captación del metal y disminuir su utilización o almacenamiento. Las IRP activas se
unen a las secuencias IRE, aumentando la síntesis de RTf mientras que disminuyen la
de ferritina y ALAS.
Inversamente, cuando los niveles de hierro son altos, el metal es utilizado o
almacenado y su incorporación debe ser disminuida. Las IRP se disocian de las IRE y,
como consecuencia, el ARNm del RTf es degradado y la síntesis de ferritina y'ALAS
aumenta.
20
OwoIRE IRE _Rlbosoma
RNAsa
, RTf5
DEGRADACIÓN TRADUCCION
IRP inactivas
Sobrecarga mp1:aconitasa mp1:uniónIRE Deficienciade Pe IRP2:degradación IRP2:síntesis de Fe
IRP activas
IRE-IRP IRE-IRP G¡un5.
TRADUCCION TRADUCCION BLOQUEADA
Homcostasis celular de hierro
RTf: receptor de transferrina, IRE: iron reapomz'z/eelement, IRP: ¿ron rqgu/atog
protein.
21
Introducción
Receptor 2 de transfenï'na (RT2)
Recientemente, ha sido clonado, secuenciado y mapeado un gen humano
homólogo al del RTf, denominado RTf2, el cual se expresa predominantemente en el
hígado. La secuencia de aminoácidos, deducida a partir del ARNm, indica que codifica
para una proteína de membrana que posee un 45% de identidad con el RTf en su
dominio extracelular (Kawabata et a/., 1999).
También se han encontrado similitudes entre las propiedades moleculares del
RTf2 y del RTf2los dos receptores pueden unir Tf a nivel de la membrana y mediar la
incorporación celular de hierro (Kawabata et a/., 1999). En adición, ambos interactúan
con la Tf de una manera dependiente del pH: la holon es unida a pH neutro o
levemente superior, mientras que la apon lo hace sólo a pH ácido. Sin embargo, la
afinidad del RTf2 por la holon es 25 veces menor que la del RTf (Kawabata et a/.,
2000; West et a/., 2000).
La secuencia consenso de internalización del RTf2 no es idéntica a la del RTf.
Esto sugiere distintos mecanismos de endocitosis y, probablemente, un destino final
diferente de los endosomas formados (Kawabata elal, 1999).
Las regiones no codificantes del ARNm del RTf2 no poseen ninguna estructura
similar a las secuencias IRE (Kawabata et a/., 1999). Esto explicaría que, contrariamente
a lo que sucede con el RTf, la expresión del RTf2 no es afectada por los niveles de
disponibilidad de hierro (Kawabata et al, 2000). El proceso parece ser regulado por el
ciclo celular (Kawabata el al, 2000).
Las diferencias en la distribución tisular de ambos receptores, así como también,
sus distintos perfiles de expresión en células hepáticas y eritroides, sugieren funciones
fisiológicas diferentes. Las evidencias disponibles hasta el momento permiten sugerir
que el RTf2 estaría involucrado en el metabolismo del hierro, la función del hepatocito
y el proceso de diferenciación eritroide (Fleming e!al, 2000; Kawabata et a/., 2001a).
Según los antecedentes mencionados, las células podrían controlar la captación
del metal esencial mediante dos receptores diferentes para Tf: el RTf, de mayor
afinidad, cuya expresión es regulada por los niveles celulares de hierro y el RTf2, de baja
afinidad, el cual se expresaría dependiendo del ciclo celular o del estatus proliferadvo de
las células (Kawabata etal, 2000).
22
Introducción
Víade incorporación de hierro independiente de transfezn'na
El mecanismo de incorporación de hierro mediado por Tf ha sido considerado
durante mucho tiempo como la única vía de ingreso del metal a las células. Sin
embargo, se ha demostrado la existencia de un sistema independiente de Tf para la
captación de hierro.
Las evidencias más contundentes derivan de trabajos realizados en ratones
hipotransferrinémicos. Al nacer, los animales homocigotas para esta mutación, poseen
concentraciones de Tf en plasma menores que el 1% de los valores normales y exhiben
una anemia microcítica severa. Sin embargo, a pesar de la carencia de Tf, acumulan
hierro en tejidos parenquimáticos, tales como hígado y páncreas (Sturrock etal, 1990).
Como se ha mencionado, prácticamente todo el hierro plasmático circula unido
a Tf y el libre es prácticamente indetectable. En la hemocromatosis hereditaria, los sitios
de unión de la proteína al metal se encuentran saturados y, bajo estas condiciones, la
concentración de hierro no unido a Tf puede alcanzar concentraciones micromolares.
Paralelamente, se han encontrado depósitos masivos del metal en células hepáticas.
En las dos patologías mencionadas, ya sea por carencia o por saturación, la
apon no se encuentra disponible para cumplir con la distribución de hierro a las
células; por esta razón, el metal circula en plasma en forma de complejos de bajo peso
molecular y es removido del mismo mediante un sistema de transporte independiente
de Tf (Sturrock el a/., 1990). Esta vía de incorporación de hierro es un proceso
saturable, dependiente del tiempo y de la temperatura de incubación (Sturrock et a/.,
1990; Inman & Wcssling-Rcsnick, 1993). A diferencia de los mecanismos de captación
del metal esencial que involucran receptores para Tf, su actividad no es mediada por
endocitosis y no parece ser afectada por cambios en la tasa de crecimiento celular ni por
condiciones de depleción de hierro (Kaplan el a/., 1991).
A pesar de que la vía alternativa de captación de hierro ha sido descubierta hace
más de una década, existen aún discrepancias entre los resultados obtenidos por
diferentes autores y varios son los mecanismos propuestos.
23
Introducción
Debido a que el hierro se halla generalmente en el entorno celular en estado
oxidado, su reducción sería el paso previo a su captación; luego, una proteína
transportadora específica translocaría al cadón a través de la membrana Oordan 8:
Kaplan, 1994; Akompong el a/., 1995; Attieh et a/., 1999). La actividad ferrireductasa
sería, por lo tanto, la limitante de la velocidad del proceso (Randcll et a/., 1994). Este
sistema de transporte, parece ser funcionalmente similar al que media la liberación de
hierro desde el endosoma al citosol (Inman & Wessling-Resnick, 1993). Efectivamente,
la proteína transportadora transmembrana ha sido caracterizada e identificada en células
eritroides de ratones como DMTI (DCT1, Nrarnp2), la cual también media la
absorción de iones ferrosos dietarios por parte de los enterocitos (Canonne-Hergaux et
a/., 2001).
Por otra parte, dos proteínas -una de membrana y otra citoplasmática—,
involucradas en la captación de iones férricos por la vía independiente de Tf, han sido
aisladas e identificadas (Conrad et a/., 1994). Las mismas mostraron poseer tamaño
molecular e identidad inmunológica similares a los de Ba-íntegrina y mobilferrina. Estas
proteínas han sido caracterizadas como mediadoras de la captación de hierro en células
de la mucosa intestinal, las cuales carecen de RTf en su superficie absortiva.
Por lo tanto, existírían dos vías diferentes para la captación de hierro
independiente de Tf: los iones ferrosos serían transportados por la proteína DMTI,
mientras que los férricos utilizarían la mediada por Bs-integrina-mobilferrina.
Introducción
pH 7,4
[N
UTILIZACIÓN
67/70 ,
(PI ) 9 DEPOSITO(Ferfl'z‘z'na)
B3-integrina
REGULACIÓN(IRF)
Metabolismo celular de hierro
Tf: transferrina, RTf y RTfZ: receptores de transferrina, IRP: iron rqga/atogiprotein, DMTI: diva/entmetal tramporter.
Introducción
CÉLULAS K562
La línea celular K562 fue originalmente establecida en el laboratorio de Lozzio
& Lozzio, en la Universidad de Tennesse, a partir de la efusión pleural de una paciente
con leucemia rnieloide crónica en crisis blástica terminal (Lozzio & Lozzio, 1975).
Sobre la base de criterios morfológicos, la línea K562 fue considerada, en un
principio, como representativa de células granulocíticas primitivas. Sin embargo, su
naturaleza mieloide ha sido cuestionada.
El patrón de glicoproteínas expresadas en la membrana de estas células presenta
características comunes con el de eritrocitos normales. Ha sido demostrada la presencia
de glicoforina A, la principal sialoglicoproteína de glóbulos rojos humanos (Anderson et
a/., 1979). Esta observación, proveyó evidencia de la naturaleza eritroide de las células
K562. Además, expresan antígeno fetal «i» de superficie, isoenzimas de lactato
deshidrogenasa características de células eritroides embriónicas o fetales, cadenas de
globina fetal y embriónica y ARNm de globinas. La expresión fenotípica de estas
características eritroides es incrementada por la exposición de las células al agente
inductor hemina (Benz et a/., 1980).
El budrato de sodio, un ácido graso de cadena corta, induce a las células de esta
línea a formar partículas eosinofílicas similares a eritrocitos, las cuales reaccionan
positivamente luego de tinción con bencidina, indicando, por lo tanto, la presencia de
hemoglobina (Anderson etal, 1979). Paralelamente, se detecta un rápido incremento en
el contenido celular de ARNm de y-globina (Chénais et a/., 1997).
Las células K562 poseen también capacidad de diferenciarse in vitm al ser
inducidas con hemina, sintetizando grandes cantidades de hemoglobina
predominantemente de tipo embriónico (Portand y Gower 1) y fetal (Rutherford et al,
1979; Rutherford et al, 1981; Cioe el a/., 1981).
La hidroxiurea, compuesto antitumoral que regula la hemoglobinización durante
la diferenciación eritroide, es utilizada en la clínica para el tratamiento de pacientes con
anemia drepanocítica. Su empleo en ensayos in vítm induce la hemoglobinización de
células K562 en forma dependiente de la dosis empleada (Adunyah etal, 1995).
26
Introducción
El patrón de hemoglobinas sintetizadas varía según el inductor empleado. Sin
embargo, en ningún caso fue detectada la producción de hemoglobinas adultas (Cioe et
al, 1981).
El estudio de la captación de hierro en células eritroides es de particular interés
debido a su gran requerimiento del metal para la producción de hemoglobina. Para
realizar muchos de estos estudios se han empleado reticulocitos, pero aunque estas
células incorporan hierro activamente, cambian constantemente a medida que progresa
su diferenciación a eritrocitos.
Las células precursoras eritroides de médula ósea sólo pueden ser cultivadas z'rz
vitm por períodos cortos, ya que sufren diferenciación terminal y, además, no pueden
obtenerse poblaciones eritroides totalmente puras. Por esta razón, la línea K562
constituye un modelo de gran utilidad como fuente pura y abundante de células que
pueden ser mantenidas indefinidamente en cultivos en suspensión y ser inducidas para
culminar su maduración erittoide z'nvitro.
Las células de la línea K562 expresan un gran número de RTf en su membrana
(Klausner et al, 1983a), característica que ha permitido estudiar la incorporación,
distribución y utilización de hierro en estas células (Bottomlcy et al, 1985; Mattia et a/.,
1986). Además, el nuevo receptor para Tf, RTf2, posee un alto nivel de expresión en
estas células (Kawabata et al, 1999; Kawabata el a/., 2001b).
Por otra parte, las células de esta línea pueden ser desarrolladas en un medio
químicamente definido, en ausencia de suero fetal bovino como fuente de Tf, ya que
son capaces de mediar la captación de hierro a través de mecanismos independientes de
Tf (Inman 8CWcssling-Rcsnick, 1993; Conrad et a/., 2000).
Los antecedentes mencionados demuestran que, en esta línea celular,
coexisn'rían todos los mecanismos capaces de mediar la incorporación de hierro
conocidos hasta el momento: los mediados y los no mediados por receptores de Tf.
Todas las características descriptas, convierten a la línea celular K562 en un
sistema potencialmente útil para el estudio de la dinámica de la eritropoyesis humana, el
análisis de la expresión de genes específicos durante la diferenciación eritroide, la
regulación de la biosíntesis de hemo y hemoglobina y el estudio del metabolismo del
hierro.
OBJETIVO GENERAL
La acumulación de aluminio en pacientes y animales de experimentación ha sidorelacionada con la aparición de signos de anemia, aunque el mecanismo exacto por elcual se produce este efecto es aún desconocido.
El presente trabajo de investigación tiene como propósito:
Avanzar en el conocimientode lo: mecanirmor celu/anar] molecularesde la toxiddaa’poraluminio.
El hecho de que la exposición a este metal no esencial afecte la síntesis dehemoglobina, uno de los principales componentes celulares que requieren hierro, y quealuminio y hierro compartan características químicas y de transporte, permite postularque los efectos nocivos del aluminio sobre el sistema eritropoyétíco estaríanrelacionados, al menos en parte, con el metabolismo del hierro.
Por lo tanto, se plantea como hipótesis que :
El aluminio intefiere en el metabolismodel bienn.
Para demostrarla, se proponen los siguientes objetivos específicos.
OBJETIVOSESPECÍFICOS
> Determinar si el aluminio interfiere en el proceso de diferenciación eritroide decélulas K562.
> Establecer las características de la posible interacción del complejo formadoentre aluminio y transferrina a nivel de los receptores específicos para laproteína expresados en la membrana celular.
> Analizar si la presencia de aluminio afecta la incorporación celular de hierro y suutilización.
> Investigar la probable alteración de mecanismos específicos que intervienen enla homeostasis celular de hierro, como consecuencia de la exposición a aluminio.
29
MÁ‘IERMLES
‘YMQÉ‘ÏOfDOS
CULTIVOS CELULARES
MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES BUFFER
o Medio de culu'vo base
RPMI 1640, modificación Hepes (Sigma Chemical Co.), pH 7,0i0,3. Fuefraccionado y conservado a -20°C. Una vez descongelado, fue conservado a 4°Cprotegido de la luz.
Medio de cultivo completo (RPMI-SFB-PE)RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (SFB) (Bioser, GenS.A.), 100 U/ ml de penicilina (P) y 100 pg/ ml de estreptomicina (E) (PAALaboratories GmbH). Los factores del complemento del SFB fueron inactivados porincubación en baño de agua a 56°C durante 30 min.
Medio de cultivo para control de micoplasmas (RPMI-SFB-IO)RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de SFB.
Medio para lavado celular (RPMI-SFB-l)RPMI 1640 suplementado con 1% (v/v) de SFB.
Medio de incubación (RPMI-BSA)RPMI 1640 suplementado con 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) (SigmaChemical Co.).
Buffer fosfato salino (PBS)NaH2P04 1,9 mM; Nazl-IPO4 8,1 mM; NaCl 0,137 M; KCl 3mM; pH 7,4.
Bullet PBS-BSA
Solución bzgflïerPBS suplementada con BSA 1% (p/v).
Buffer para lavado celular (Tris-HCl)Tris 100 mM; NaHCOs 25mM; NaCl 40 mM; pH 7,4.
Calidaddel agua yreaca'vosLas soluciones, reactivos y medios de cultivo fueron preparados con agua deionizada decalidad ultrapura, con resistividad específica de 18 MQ (Simplicity 185, Millipore,Brasil).
Todas las sales, ácidos y solventes utilizados fueron de calidad analítica (Merck oMallinckrodt)
Estetilización de materiales y solucionesEl material fue esterilizado por calor seco (160-170°C, 90 min), por calor húmedo(121°C, 1 atrn, 30 min) o por radiación gamma, según las características del mismo.Las soluciones termolábiles fueron esterilizadas por pasaje a través de membrana deésteres de nitrato y acetato de celulosa, con poros de 0,22pm (Millipore), utilizando
presión positiva de nitrógeno.
31
CÉLULASK562
La línea celular eritroleucémica humana K562 fue cedida gentilmente por la Dra.Rolande Berthier (Unité INSERM 217, Centre d'Études Nucleaires, Grenoble, France)y posteriormente, adquirida a American Type Culture Collection (ATCC, cat n° CCL243).
Desarrollo
Las células fueron cultivadas en medio RPMI-SFB-PE, a 37°C, en estufa con atmósfera
controlada con 5% de C02 y 100% de humedad (Revco).El medio de cultivo fue renovado cada 72-96 h. Para ello, las células fueron
sedimentadas por centrifugación a 125 g (Hermle Z323 K) durante 10 min a 25°C yresuspendidas, ajustando la concentración a 2,5-4,0><105células/ml de medio RPMISPB-PE.
Cada cambio de medio fue rigurosamente registrado como un «pasaje o subcultivo».Con el objeto de evitar variaciones experimentales debidas a modificaciones en la líneacelular, las células fueron descartadas luego de 50 «pasajes».
Recuento y viabilidad
La viabilidad celular fue evaluada, simultáneamente con la determinación de la densidad
celular, por recuento diferencial en cámara de Neubauer, luego de efectuar una diluciónconveniente con Azul Tripán 4 g/l en NaCl 9 g/l (ICN Biomedicals, Inc.). Lamembrana plasmática de las células muertas pierde la propiedad de permeabilidadselectiva, de modo que el colorante penetra coloreando su citoplasma de color azuladoopaco. Las células vivas permanecen brillantes e incoloras (Phillips & Terryberry, 1957).El recuento diferencial fue realizado dentro de los 15 min. Con el objeto de minimizarel error de recuento, el número de células contadas nunca fue inferior a 200 y lasdeterminaciones fueron realizadas por duplicado o triplicado. La viabilidad se expresócomo porcentaje de células vivas. El valor normal osciló entre 89 y 95%.
Cn'opteservación
Para mantener invariables las características propias de la línea, 10-20x106 célulasfueron criopreservadas en 1 ml de SFB conteniendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)(Sigma Chemical Co.) como agente crioprotector. El DMSO difunde a través de lamembrana plasmática y liga moléculas de agua, por lo tanto, disminuye la formación decristales.
La suspensión celular, enfriada en baño de hielo, fue transferida a un criotubo estéril, elcual fue posteriormente ubicado en una gradilla sumergida dentro de un recipienteconteniendo alcohol isopropflico (Cryo 1°C Freezing Container «Mr. Frosty», Nalgene).El dispositivo fue colocado a —70°Cdurante 24-48 h. Posteriormente, el criotubo fuetransferido al tanque de nitrógeno líquido (—196°C).Para descongelar las células, el criotubo fue retirado del tanque e inmediatamentesumergido en un baño de agua a 37°C. La suspensión celular fue transferida a un tubo
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estéril y se agregó RPMI-SFB-PE según el esquema que se detalla a continuación,resuspendiendo suavemente luego de cada agregado para evitar la formación deespuma:
Tiempo(min) o 1 2 4 6 8 10
Medio (ml) 0,2 0,3 0,5 0,5 1 2,5 5
Luego de centrifugar a 125 g durante 10 min a 25°C para eliminar el crioprotector, elpaquete celular fue resuspendido en RPMI-SFB-PE. Una vez determinada la viabilidad,la suspensión celular fue transferida a una botella de cultivo estéril de 25 cm2 rotuladacon la fecha de descongelamiento y el número de pasaje. Transcurridas 24 horas decultivo en estufa, se renovó el medio y se controló la viabilidad celular.
Purificación de células viables
Las células viables fueron purificadas en gradiente de Ficoll-Paque Plus (5:1,077 g/ ml,Amersharn Biosciences) cada vez que la viabilidad descendía por debajo de 70-80%.Para ello, 8 ml de la suspensión celular fueron depositados cuidadosamente sobre 3 mlde solución estéril de Ficoll-Paque, de manera tal de obtener dos fases bien definidas.Luego de una centrifugación a 400 g durante 30 min a 25°C, las células viables ubicadasen la interfase formando un anillo de color blanco, fueron aspiradas y transferidas a untubo estéril. Se efectuaron dos lavados con medio RPMI y se centrifugó a 125g durante10 min a 25°C. El paquete celular fue resuspendido en RPMI-SFB-PE y se efectuó elrecuento y la determinación de la viabilidad celular. La suspensión celular fuetransferida a una botella de cultivo. Luego de 24 horas, se controló nuevamente laviabilidad celular. Los cultivos que presentaron mortalidad elevada aún luego de realizarla purificación por Ficoll-Paque, fueron descartados.
Control de contanzinación con rnicoplasmas
El colorante Hoechst n° 33258 (Sigma Chemical Co.) se intercala entre las bases delADN nuclear y, al ser excitado con la luz apropiada (1:350 nm), emite fluorescencia decolor verde-amarillento brillante. En los cultivos no contaminados, los núcleos
fluorescen sobre un fondo uniformemente oscuro. La observación de pequeñaspartículas fluorescentes en el citoplasma, en los límites celulares o en el espaciointercelular, ya sean éstas agregadas, distribuidas en cadena o formando un puntilladouniforme, indica contaminación con rnicoplasmas (Chen, 1977).Las células fueron suspendidas en RPMI-SFB, medio que carece de antibióticos yfavorece la salida de los rnicoplasmas al medio extracelular. Sobre un cubreobjerosubicado dentro de una caja de Petri estéril, se depositaron 1-2 ml de la suspensión(2,5x105 células/ml) y se incubó durante 48 horas a 37°C. Se agregaron 5 gotas defijador Camoy (metanol: ácido acético glacial; 3:1) y, luego de 2 minutos, el medio decultivo fue aspirado, quedando las células depositadas sobre el fondo. Se realizaron dos
33
Materiales y Métodos
pasos adicionales de fijación con 1-2 ml de fijador Carnoy, dejándolo actuar durante 5min. La placa de Petri se secó al aire.El cubreobjetos fue cubierto con 1 ml de una dilución 1:50 de colorante Hoechst enbufi'r McIlvaine, pH 5,5 (ácido cítrico 0,04 M; NazHPO4 0,12 M), dejando reposardurante 10 min a temperatura ambiente en total oscuridad. Posteriormente, se lavó 3veces con agua destilada y se dejó secar al aire.El cubreobjetos fue montado en sentido invertido sobre un portaobjetos.Inmediatamente, se realizó la observación bajo un aumento de 400x, empleando unmicroscopio de fluorescencia (Axiovert, Zeiss) con filtro de excitación BP-365 y filtrobarrera LP-397.
Una muestra enriquecida en linfocitos humanos de sangre periférica, fijada con elmismo procedimiento que se detalló anteriormente, fue utilizada como control negativode contaminación con micoplasmas.
INDUCCIÓN DE LAHEMOGLOBINIZACIÓN
INDUCTORES
Los inductores utilizados para analizar el proceso de hemoglobinización celular fueron:hemina humana (gentilmente proporcionada por la Dra. JM Tomio, Dpto. QuimicaBiológica, FCEyN), hemina bovina, bidmxiurea, batiran de sodio (Sigma Chemical Co.) y
erihquyetz'narecombinantehumana (Pronivel, cedida por el Dr. H Ostrowski, LaboratoriosElea).
Hemina, hidroxiurea y butirato de sodio fueron preparados y filtrados a través de filtrosesterilizantes inmediatamente antes de su utilización.
La eritropoyetina recombinante humana fue reconstituida, esterilizada por filtración,alicuotada y conservada a -70°C hasta el momento de su uso.
Estandatización de Ia disolucióny cuantificación de Ia hemina
La hemina es un compuesto fotosensible, de escasa solubilidad; por lo tanto, se realizóla estandarización de su solubilización y cuantificación.Una masa de 10 mg de hemina fue humedecida con 100 pl de etanol absoluto y 200 plde NaOH 1M, y disgregada con ayuda de una varilla. Se agregó NaHCOa 0,1M hasta unvolumen final de 10 ml y la suspensión se agitó durante 1-2 h, protegida de la luz. ElpH fue ajustado a 7,4 con HCl 1M.El espectro de absorción (Beckman DB) de una dilución de la solución de heminapresentó un máximo de absorbancia a 388 nm. Considerando la ecuación de la Ley deLambert-Beer, el coeficiente de absortividad molar (E) fue: 8=47,9 x 103 l x mol" xcm".
Cada vez que se preparó una solución fresca de hemina, se calculó su concentraciónempleando como datos la lectura de la absorbancia a 388 nm y el coeficiente deabsortividad molar.
34
Materiales y Métodos
ESTANDARIZACIÓN DE LA EVALUACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓNCELULAR
Se emplearon dos reacciones específicas basadas en la actividad pseudoperoxidásica dela molécula de hemoglobina, las cuales permiten realizar la identificación ycuantificación microscópicas de las células hemoglobinizadas.
0 Reacción con bencidina
La reacción se llevó a cabo incubando la suspensión celular, durante 10 min, conbencidina (Rhóne-Poulenc) 0,4% (p/v) en ácido acético 15% (v/v) (relación devolúmenes 5:2), en presencia de Hzoz 10 vol. Previamente, las células fueronlavadas dos veces con bzfier Tris-HCl 0,2 M, pH 7 o PBS para remover losinductores y evitar la formación de cristales que pudieran dificultar elreconocimiento microscópico de las células diferenciadas.El porcentaje de hemoglobinización fue determinado mediante el recuentodiferencial en cámara de Neubauer de las células hemoglobinizadas (coloreadas)con respecto a las células totales. Para disminuir el error, el número de célulascontadas nunca fue inferior a 400.
0 Reacción con 2,7-diaminofluoreno (DAF)El protocolo utilizado se basó en la técnica descripta por Worthington et al (1987)con modificaciones introducidas en el laboratorio.
La solución madre de DAF (Sigma Chemical Co.) 1% (p/v) en ácido acético 90%(v/v) fue preparada mediante agitación vigorosa a temperatura ambiente yconservada a 4°C, en oscuridad, hasta un máximo de 10 días.
El reactivo colorimétrico de DAF se preparó en el día de uso mediante unadilución 1:12 de la solución madre en btgfir Tris-HCl 0,2 M, pH 7 - Hzoz 30 vol.Volúmenes iguales de las suspensiones celulares y del reactivo colorimétrico fueronmezclados y se incubó durante 15 min. El porcentaje de células hemoglobinizadasfue determinado mediante el recuento diferencial en cámara de Neubauer de las
células coloreadas con respecto a las células totales.
Comparación de Ia sensibilidad de las técnicas núcroscópicas
Las células (ZXI05/ml de RPIVfl-SFB-PE) fueron desarrolladas durante 48 horas bajodiferentes condiciones de inducción (hemina 25 HM, hidroxiurea 75 pM o butirato desodio 1,5 mM). Transcurrido el período de estímulo, el porcentaje de célulashemoglobinizadas fue determinado utilizando las dos técnicas microscópicas descriptas.El análisis de los resultados evidenció que la reacción con DAF resulta menos sensibleque la de bencidina. En el primer caso se obtuvieron porcentajes de hemoglobinización,en promedio, 49% más bajos que las mismas determinaciones efectuadas luego dereacción con bencidina (entre 26,5 y 75% menores según las distintas condiciones deinducción de las células).
Evaluación de 13 técnica microscópica por comparación con unatécnica cspecttofotomém'ca
La determinación microscópica del porcentaje de células hemoglobinizadas estáafectada por un componente de apreciación subjetiva del operador. Por esta razón, seestudió la correlación entre el porcentaje de células hemoglobinizadas obtenido concada uno de dichos métodos y la concentración de hemoglobina en células lisadas porreacción con DAF.El reactivo colorimétrico de DAF fue obtenido mediante una dilución 1:100 de la
solución madre de DAF en bzfiérTris-Urea-Ac.Fosfórico (0,1 M Tris, 6 M Urea), pI-I7,0.
Las células, lavadas dos veces con PBS y cosechadas por centrifugación, fueron lisadaspor agitación vigorosa con 0,5 ml de Igepal (Sigma Chemical Co.) 0,01%.Posteriormente, se agregaron 1,5 ml del reactivo colorimétrico y 27 pl de HzOz 30 vol,y se incubó 7 min a temperatura ambiente (Worthington etal, 1987).La concentración de hemoglobina fue obtenida por interpolación de la absorbanciamedida a 610 nm, en una curva de calibración realizada con solución testigo decianmetahemoglobina (Wiener Lab.).
A o
Hemoglobina(pg/célula)
Células hemoglobinizadas (%)
Figura 1: Correlación entre la concentración celular de hemoglobina y elporcentaje de células hemoglobinizadas determinado por tinción con bencidinaLas células (2,5x105/ml RPMI-SFB-PE) fueron inducidas o no a diferenciarse en presenciade hemina 25 HM o hidroxiurea 75 11M,durante 24 a 72 h. Posteriormente, fueron lavadasy divididas en dos alícuotas: en la primera se determinó el porcentaje de célulashemoglobinizadas por tinción con bencidina y en la segunda, se cuantificó la hemoglobinapor reacción con DAF (r2: 0,69; n= 35).
36
Hemoglobina(pg/célula)
Células hemoglobinizadas (%)
Figura 2: Correlación entre la concentración celular de hemoglobina y elporcentaje de células hemoglobinizadas determinado por tinción con DAFLas células (2,5x105/ml RPMI-SFB-PE) fueron inducidas o no a diferenciarse en presenciade hemina 25 pM o hidroxiurea 75 p.M,durante 24 a 72 h. Posteriormente fueron lavadas ydivididas en dos alícuotas: en la primera se determinó del porcentaje de célulashemoglobinizadas por tinción con DAF y en la segunda, se cuanúficó la hemoglobina porreacción con DAF (r2: 0,48; n= 38).
Los resultados presentados en las Figuras 1 y 2 demuestran que la determinación delporcentaje de hemoglobinización por reacción con bendicina se correlaciona mejor quela tinción con DAF con la concentración de hemoglobina determinadaespectrofotométricamente en lisados celulares.
Debido a que la reaa'io'ncon beba/diriademomoporeer mqyor sensibilidad que la de DAF J mojar
corre/ación con la determinación ¿peomfiitométrim de hemoglobina, fue la técnica elegida para
evaluar la difiremiacio’n celu/ar:
OP’I‘IMIZACIÓNDE LAINDUCCIÓN DE LADIFERENCIACIÓN CELULAR
Con el objeto de determinar las condiciones óptimas para inducir el proceso dediferenciación, las células fueron cultivadas durante diferentes períodos, en presencia dedistintas concentraciones de cada inductor. El porcentaje de células hemoglobinizadasfue determinado mediante el recuento diferencial luego de reacción con bencidina.Paralelamente, fueron realizados el recuento y la determinación de viabilidad celular.
Materiales y Métodos
Celulas
hemoglobinizadas
(%)
Comentración de hem'm (pM
Figura 3: Estandarización de la inducción con hemina.Las células fueron cultivadas en presencia de hernina 12,5; 25 y 50 pM. El número decélulas hemoglobinizadas fue determinado luego de 24, 48 y 72 h por reacción conbencidina y expresado como porcentaje con respecto al número total de células(Mediai'SEM, n=3).
+24ha '0--48hg +72h
«¿GEA¿se“’É’0
.C
(l) 150 250 3th
Concentración de OH-urea (pM)
Figura 4: Estandarización de la inducción con hidroxiurea.Las células fueron cultivadas en presencia de hidroxiurea 37,5; 75; 150 y 300 ¡JM y, luego de24, 48 y 72 h, se determinó el porcentaje de hemoglobirúzación por reacción con bencidina.Los resultados se expresan como MediaiSEM, n=3.
38
Los resultados presentados en la Figura 3 muestran un aumento de la diferenciacióncelular con concentraciones crecientes de hemina, alcanzando un platean entre 25 y 50pM, luego de 48 h. La viabilidad celular se mantuvo dentIo del rango de 89-95% en loscultivos inducidos con hemina 25 uM, mientras que disminuyó un 15-20% cuando laconcentración final empleada fue 50 pM.El porcentaje de células hemoglobinizadas se incrementó en el tiempo a medida queaumentó la concentración de hidroxiurea hasta 150 ¡JM (Figura 4). Sin embargo,concentraciones superiores a 75 uM tuvieron un efecto citotóxico, tal como seevidenció por la disminución del 20% en la viabilidad celular. Por otra parte, portratarse de un compuesto citostático, dichas concentraciones produjeron inhibición delcrecimiento celular.
En cultivos de células inducidas con butirato de sodio 1,5 mM durante 72 h, se observó
un moderado porcentaje de células hemoglobinizadas (14,8i2,8%; n=4). Por lo tanto,se realizaron ensayos de inducción de 120 h, obteniéndose 31,9i2,4% de célulasdiferenciadas. Bajo estas condiciones, se observó una disminución del crecimiento de,aproximadamente, un 40% con respecto a las células no inducidas, mientras que laviabilidad osciló entre el 80 y 90%.
La eritropoyetina, así como otros factores de crecimiento hematopoyético, puedeinducir diferenciación y proliferación de progenitores de médula ósea. La inducción delas células K562 fue ensayada con diferentes concentraciones de eritropoyetinarecombinante humana (entre 2 y 16 U/ ml) durante 1 a 6 dias. Los resultados obtenidosno mostraron aumento significativo en el porcentaje de células hemoglobinizadas conrespecto al control, bajo las concentraciones y tiempos de inducción empleados (9,7%vs 8,5% respectivamente; n=5).
Ha sido reportado que la adición simultánea de eritropoyetina y butirato de sodio(Hoffman et a/., 1979) así como también, de eritropoyetina e hidroxiurea (Adunyah etal, 1995), potencia la producción de hemoglobina. Los ensayos en los que se evaluó lacombinación de butirato de sodio con hidroxiurea así como la de eritropoyetina concada uno de ellos, permiten descartar la existencia del postulado efecto sinérgico, ya quelos porcentajes de hemoglobinización obtenidos en cada caso, no difirieronsignificativamente de los alcanzados empleando hidroxiurea o butirato de sodioindividualmente.
A pan'ir de todo; lo; rom/tado; pmJentador en ecte apafiado, la; concentracionesJ tiempo:
.re/eccionaa’otcomo optimo: para realizar la inducción de la diferenciación de ce'ln/ar K562 fueron:
bernina 25 [LM, 72/2; bidmm'nrea 75 ,uM, 72 by bntirato de ¡odio 1,5 772M,120 ly.
Ectar condicionafueron cop/cado; en today Zac experiencia decano/lada: para analizar la
integ‘érencia del aluminio con el metabo/ivno del bícn‘o.
39
Materiales y Métodos
ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE Tf-Fe Y Tf-Al CON LOS RTf
REACTIVOS
Preparación de 125]-TfiAIDebido a que comercialmente no puede adquirirse 125I-Tf-Al,ésta fue preparada a partirde 125I-Tf-Fe(NEN Research Products, Dupont).
Obtención de 125I-apon a partir de 125I-Tf-FeEl Fe fue separado de la proteína utilizando NazEDTA (Ácidoetilendiarninotetracético, sal disódica, Sigma Chemical Co.) como agente quelante.Un volumen de la solución de 125I-Tf-Fe(Ae=0,567 pCi/pg, A=5,7 pCi/pl) fuetratado con 20 volúmenes de EDTA 1 g/l, pH 7,4, durante 48 h. Posteriormente,se centrifugó en un tubo Centricon YM-IO (cut of 10.000 Da) (Centrifugal FilterDevices, Millipore) durante 1 h a 5000 g. La 125I-apon retenida fue lavada 2 vecescon 1 ml de agua deionizada (pH 7,4) cada vez. Todo el procedimiento fuerealizado a 4°C.
Titulación de apon humana con A13+Previo a la preparación de 125I-Tf-Al,se determinó la relación óptima Al:apon,necesaria para efectuar la saturación de la proteína con el metal. Para ello, se utilizóapon humana (SigmaChemical Co.), sin marca radioactiva.Iguales volúmenes de una solución de 65 pg apon/ ml en bufisrTris-HCl 50 mM,pH 7,4 y NaHC03 12 mM (McGregor eta/., 1990) fueron colocados en dos cubetaspara espectrofotómetro. Una solución fresca de citrato de Al 0,5 mM fue preparadaen el mismo bufler,a partir de AIC]; y citrato de Na mezclados mol a mol.La titulación fue efectuada por sucesiva adición de volúmenes apropiados de citratode Al a la solución de apon y de agua deionizada a la cubeta de referencia. Eltiempo de equilibrio luego de cada agregado de Al3+fue de 20 min.Las lecturas de absorbancia, realizadas en la región ultravioleta del espectro (entre220 y 320 nm), mostraron un máximo a 235 nm.La curva de titulación (Figura 5) fue obtenida graficando los valores de A8 (x104 M1 cm'l) en función de R, siendo A8 la absorbancia a 235 nm dividida por laconcentración de Tf en cada punto y R, el cociente entre la concentración de Al3+agregado y la concentración de apon (Faterni et41.,1991).
40
7.5
5.0
2.5
Asx103un"cm")
Figura 5: Curva de titulación de apon humana con aluminioLa saturación de la apon fue alcanzada por sucesiva adición de una solución de citratode Al. Se grafica A8 (x‘lO3M"cm") en función de R. A8 es la absorbancia a 235 nmdividida por la concentración de Tf en cada punto. R es el cociente entre laconcentración de Al3+agregado y la concentración de apon.
La relaciónmolar AÁ'Tf commondíente a/punto de saturación, determinado a pan/ir de losdato: de la Fágura 5, fue de 4,5 :7
o Preparación de 17-51-Ti'-Ala partir de 125I-aponLa 125I-apon fue saturada con Al utilizando la metodología detallada anteriormente(relación metalzproteína 4,5:1). La actividad específica de la solución resultante fuede 0,0556 pCi/Pg.
Testigo de mI-TílFe
La 125I-Tf-Fecomercial utilizada en las experiencias de unión a los receptores celulares einternalización, fue sometida al mismo procedimiento de lavado con agua deionizada entubo Centricon YM-10. Este paso fue necesario para obtener un testigo adecuado, yaque el 1251libre, remanente de la marcación de la proteína, es eliminado durante loslavados. La actividad específica de la solución resultante fue de 0,178 pCi/pg.
Titulaciónde apon humana conFe”
Iguales volúmenes de una solución de apon humana (Sigma Chemical Co.) 65 pM enbzfiíerTris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaHCO; 12 mM, fueron colocados en dos cubetaspara espectrofotómetro.La saturación de la apon con Fe3+ fue alcanzada mediante la continua adición devolúmenes apropiados de una solución de citrato férrico 0,34 mM, preparada a partir deFeC13.6I-I20(Mallinckrodt) y citrato de Na (Mallinckrodt), mezclados mol a mol. En lacubeta de referencia, se efectuaron las correcciones correspondientes a dilución.
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Materiales y Métodos
Transcurrido un período de equilibrio de 60 s después de cada agregado, se registraronlas absorbancias en la zona de longitudes de onda correspondientes al espectroultravioleta (220-320 nm) y visible (330-560 nrn) (Beckman DB), observándose unmáximo a 470 nm.
La curva de titulación (Figura 6) fue obtenida graficando los valores de Aa (x103 M-1
crn") en función de IL siendo A8 la absorbancia a 470 nrn dividida por la concentraciónde Tf en cada punto y R, el cociente entre la concentración de Fe3+ agregado y laconcentración de apon (Faterni etal., 1991).
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Figura 6: Curva de titulación de apon humana con citrato férricoLa saturación de apon se realizó por sucesiva adición de una solución de citrato férrico.Se grafica A8 (x103M"cm") en función de R. A8 es la absorbancia a 470 nm dividida por laconcentración de Tf en cada punto. R es el cociente entre la concentración de Fe3+agregado y la concentración de apon.
La Figura 6 permite determinar las condiciones para la saturación de Tf con Fe, ya quela curva alcanza una meseta característica.
La rte/aviónmolar FH+.'Tfneaesafiapara alcanzar dic/Jopuntofue de 2, 7:7.
ASOCIACIÓN DE Tf-Al A LASCÉLULAS
Se determinó la habilidad de los receptores de membrana para unir Tf cuandotransporta A1en lugar de su ligando fisiológico Fe.Las células, suspendidas en RPMI-SFB-PE, fueron incubadas a O°C durante 30 min, enpresencia de 125I-Tf-F'e o 125I-Tf-Al, a razón de 30 ng de ¡ZSI-Tf cada 1x106 células.Posteriormente, la suspensión celular fue dividida en dos alícuotas. La primera fuereservada para ser utilizada como testigo de la actividad total agregada. La segundaalícuota fue colocada en un tubo Centricon YM-lOO (cutof 100 kDa) (Centrifugal FilterDevices, Millipore) y las células fueron lavadas 2 veces con RPlVH-SFB-I, centrifugandoa 530g durante 30 rnin a 4°C.
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La actividad de 1251fue medida en los paquetes celulares retenidos en los filtros de lostubos Centricon y en el testigo de la actividad total agregada.Los valores de actividad de los testigos fueron: 16435 cpm para 125I-Tf-Fey 5347 cpm
para 125I-Tf-Al.Como puede deducirse a partir de estos datos, el tratamiento conEDTA empleado para obtener apon, trajo como consecuencia la disminución de laactividad específica de la proteina debido a la liberación de 1251.
INHIBICIÓN DE LAUNIÓN DE Tf-Fe
El efecto de la presencia de Tf-Al sobre la unión del trazador 125I-Tf-Fea los RTf demembrana, fue analizado a través de la siguiente experiencia.Las células fueron cosechadas por centrifugación a 230 g durante 10 min a 25°C yresuspendidas en RPMI-BSA, para de evitar la interferencia de la Tf-Fe presente en elSFB.
En cada tubo fue colocada una suspensión conteniendo 1><106células, 125I-Tf-Fe(2,5x10'9 M) (Ae=0,056 uCi/ug) y concentraciones crecientes de Tf-Al (O; 2,5x10'9;5x10'9 ó 10)<10'9M). Todos los tubos fueron llevados a un volumen final de 1 ml conRPMI-BSA.
Se realizaron incubaciones a distintos tiempos (4, 8, 15, 30, 60, 90, 180 y 300 minutos)para efectuar el seguimiento de la unión de 125I-Tf.Las incubaciones fueron realizadas a0°C, con agitación constante, para prevenir la endocitosis de los complejos RTf-Tfformados.
A los tiempos correspondientes, los tubos fueron retirados del baño y centrifugados a7200 g durante 1 min a 4°C. Alícuotas de 500 pl de cada uno de los sobrenadantesfueron reservadas y los paquetes celulares fueron lavados 3 veces con bzfierde lavado.Se determinó la actividad de 1251asociada a las células y la presente en lossobrenadantes.
ESTUDIO DEL CICLO CELULARDE Tf-Fe YTf-Al
La cinética del ciclo de endocitosis mediada por receptor llevado a cabo por 12SI-Tf-Feó 125I-Tf-Alunidas a los RTf, fue estudiada a través de la siguiente experiencia.Las células, suspendidas en RPMI-SFB-PE, fueron incubadas durante 15 min a 37°C enpresencia de 30 ng de 125I-Tf-Fe(Ae=0,153 pCi/pg) ó 125I-Tf-Al(Ae=0,048 pCi/pg),por cada 1><106células. Posteriormente, las suspensiones fueron lavadas 2 veces yresuspendidas en medio RPMI-SFB-l.Las células fueron divididas en tres alícuotas y colocadas en sendos tubos CentriconYM-lOO para ser sometidas a una incubación adicional a 37°C durante 0, 10 ó 30 min.Al final de cada período, fueron centrifugados a 530g durante 30 min a 4°C.Los sobrenadantes de cada tiempo de incubación fueron separados para medir laactividad de ¡251correspondiente a la 125I-apon liberada al medio luego de finalizar elciclo de endocitosis.
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Las células fueron sometidas a un tratamiento de hidrólisis ácida con el objeto de liberarla 125I-Tf-Feó 125I-Tf-Alunida a la superficie celular, según la metodología descriptapor Klausner et al. (1983a), con modificaciones. La suspensión celular fue acidificadapor tratamiento con solución de ácido ácéúco 0,25 M y NaCl 0,5 M, pH 2,3. Luego de5 min, se neutralizó con solución de acetato de sodio 1 M. Las células fueron
centrifugadas nuevamente a 530 g durante 30 min a 4°C y se determinó la actividad de1251presente en los sobrenadantes (ÍZSI-Tf asociada a la superficie celular) y en los
paquetes celulares retenidos en los filtros (mI-Tf intracelular).
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROSCINÉTICOS
Detemfinación de la Máxima Capacidad de Unión (MCU) de mI-Tf-Fe
La siguiente experiencia fue realizada con el objeto de determinar si la marcación de Tfcon el radionucleído 1251,afecta su capacidad de unión a los RTf.Las células fueron cosechadas por centrifugación y resuspendidas en RPMI-BSA demanera de eliminar la posible interferencia de la Tf-Fe presente en el SFB.Para determinar la unión total (UT), volúmenes crecientes de la suspensión celularfueron incubados en presencia de 125I-Tf-Fe(Ae=0,781 uCi/ug) 1><10'10M, durante 3 ha 0°C, con agitación constante.La unión no eipeafica (UNE) fue determinada en un ensayo paralelo, incubando 4x105células en presencia de Tf-Fe 1x10'6 M y 125I-Tf-Fe1x10"° M.Los volúmenes finales fueron ajustados a 1 ml con RPMI-BSA.Transcurrido el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de la unión, los tubosfueron centrifugados a 7200 g durante 2 min a 4°C. Se reservaron alícuotas de lossobrenadantes. Los paquetes celulares fueron lavados con 1 ml de bzfir de lavado.Se determinó la actividad de 1251asociada a las células, la libre presente en lossobrenadantes y la del testigo de 'ZSI-Tf-Fecorrespondiente.La unión ereafita (UE) fue determinada por diferencia entre la UT y la UNE en cadapunto.
14
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1/volumen
Figura 7: Determinación de la Máxima Capacidad de Unión de 125I-Tf-Fea losRTfSe grafica la inversa de la unión específica (l/UE) con respecto a la inversa de losvolúmenes de suspensión celular empleados en las incubaciones (1/volumen) (R2: 0,9851;n=2).
La ordenada al origen de la recta (Figura 7), representa la inversa de la máxima uniónespecífica posible cuando los receptores tienden idealmente a infinito. Considerando laactividad de ¡351total agregada, medida en el testigo correspondiente, la MCU de la 1251Tf-Fe a los RTf de las células K562, fue de 98%.
Por lo tanto, puede concluirse que la marcación de la proteína con ’251 no afectó Ju capacidad de
unión a lo: receptora eipeczficoc.
Determinación del tiempo de equilibrio de unión
El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de la unión de la 125I-Tf-Fea los RTfpresentes en la membrana fue determinado a través de la siguiente experiencia.Las células fueron resuspendidas en RPMI-BSA con el objeto de evitar la posibleinterferencia de la Tf-Fe presente en el SFB.Para obtener la curva de unión total (UT) de ‘25I-Tf-Fe a los receptores en función deltiempo, 4x10S células fueron incubadas con 125I-Tf-Fe(Ae=0,767 uCi/ug) 1x10'9 Mdurante diferentes tiempos (5, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240 y 300 min). Lasincubaciones fueron realizadas a 0°C, con agitación constante, con el objeto de prevenirla endocitosis de los complejos RTf-Tf formados. La viabilidad celular fue controlada alfinalizar los períodos de incubación.La determinación de la unión no eipeczfica(UNE) fue realizada en un ensayo paralelopreincubando las células durante 60 min a O°C en presencia de Tf-Fe, sin marcaradioactiva, 1x10'6 M (concentración 1000 veces superior con respecto a la del ligandomarcado '35I-Tf-Fe). Luego del período de preincubación, lz5’I-Tf-Fe 1x10'9 M fueagregada a todos los tubos y se incubó a O°Cdurante los tiempos indicados en UT.Los volúmenes finales fueron ajustados a 1 ml con RPMI-BSA.
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A los tiempos correspondientes, los tubos de UT y UNE fueron centrifugados a 7200gdurante 2 min a 4°C. Se guardaron alícuotas de 500 pl de los sobrenadantes. Lospaquetes celulares fueron lavados 3 veces con 1 ml de bzgfirde lavado.Se midió la actividad de 1251asociada a las células, la libre presente en los sobrenadantesy la del testigo de 125I-Tf-Fecorrespondiente.
Las mediciones de actividad en los paquetes celulares correspondientes a UT y UNE,' fueron expresadas como concentración molar de complejos ligando-receptor mediantela siguiente ecuación:
UT o UNE = 10-9x dpm M ec. [1]V x Ae x 2.220
Donde:
dpm son las desintegraciones por minuto medidas, corregidas por la actividad de fondo;V es el volumen empleado en el ensayo (1 ml); Ae es la actividad específica expresadaen Ci/mmol y 2.220 es un factor de conversión de dpm a nCi (Hulrne, 1992).La actividadunida enforma epeafica (UE) se calculó por la diferencia entre la UT y laUNE.
Detcaninación de Ia Kd de 1251-TfiFc
La curva de saturación del ligando trazador fue determinada empleandoconcentraciones variables de 125I-Tf-Fe(entre 0,1x10'9y 10x10'9Para determinar la unión total (UT), 4x105 células, resuspendidas en RPMI-BSA, fueron
incubadas con concentraciones crecientes de 125I-Tf-Fe(Ae=0,781 pCi/pg) (0,1; 0,25;0,5; 1; 2; 3; 4,5; 6 y IOXIO'9M) a 0°C, con agitación constante, durante 3 horas.
La unión no eipeafica (UNE) fue determinada para los puntos correspondientes a lasconcentraciones 0,1; 3 y 6><10‘9M de 125I-Tf-F'e,utilizando Tf-Fe, sin marca radioactiva,
en concentraciones 1000 veces mayores que las correspondientes a la proteína marcada.Los volúmenes finales fueron ajustados a 1 mi con RPMI-BSA.Finalizada la incubación, los tubos fueron centrifugados a 7200 g durante 2 min a 4°C.Se guardaron alícuotas de 500 ul de los sobrenadantes y los paquetes celulares fueronlavados con 1 ml de bzfiérde lavado.
Se midió la actividad de l251asociada a las células, la libre presente en los sobrenadantesy la de los testigos correspondientes a cada concentración de ¡ZSI-Tf-Fe.La um'o'neqáeafica(UE) fue determinada por diferencia entre la UT y la UNE.La actividad de ¡251asociada a las células en forma específica (B, bound) y la librepresente en los sobrenadantes (F,fi'ee) fueron expresadas como concentración molar decomplejos ligando-receptor o de 125I-Tf-Felibre respectivamente, utilizando la ecuación[1].
La constante de disociación (Kd) de la 125I-Tf-Fepor el RTf de células K562, fuedeterminada mediante un analisis de Scatchard y utilizando el programa LIGAND(Munson & Rodbard, 1980).
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Determinación de las Kd de Tf-Fey TÍZAI
Ensayos de unión competitiva fueron realizados utilizando ‘25I-Tf-Fe 0,5><10'9M como
ligando trazador y cantidades variables (entre 1x10“12y 1><10'6M) de Tf-Fe o Tf-Alcomo competidores no marcados.Las células (4x105/ ml RPMI-BSA) fueron incubadas con 125I-Tf-Fe(Ae=0,764 uCi/pg)y las cantidades correspondientes de Tf-Fe o Tf-Al, a 0°C, con agitación constante,durante 180 min. El punto correspondiente a la máxima unión, fue determinado enausencia de competidor. Finalizada la incubación, las células fueron separadas porcentrifugación a 7200 g durante 2 min a 4°C. Alícuotas de 500 pl de los sobrenadantesfueron reservadas y los paquetes celulares, lavados con 1 ml de bzgfirde lavado.Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado.Se midió la actividad de 125Iasociada a las células, la libre presente en los sobrenadantesy la del testigo de 'ZSI-Tf-Fecorrespondiente.Con los datos obtenidos, se construyeron las curvas de desplazamiento del ligandotrazador correspondientes a cada competidor. El análisis de las mismas, a través delprograma ALLFIT, permitió calcular las «dosis efectivas 50» (DEso) para Tf-Fe y Tf-Al.Las Kd correspondientes a cada competidor fueron determinadas utilizando la ecuaciónde Cheng-Prusoff (Calvo, 1987; Cheng & Prusoff, 1973).
DEso
Kd = ec. [2]1 + [*L]
Kd (125I-Tf-Fe)
Donde:
DEso es la dosis efectiva 50, calculada para cada uno de los competidores; [*L] es laconcentración de ligando trazador utilizada (0,SXIO'9M) y Kd (‘25I-Tf-Fe), la constantede disociación correspondiente a la 125I-Tf-Fe,determinada a través de la experiencia desaturación de los receptores con el ligando trazador.
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE
RECEPTORES PARATf
A) MEDIANTE ENSAYOS CINÉTICOS
Con el objeto de «desocupar» los receptores de membrana, permitiendo que lasmoléculas de Tf unidas fueran liberadas o endocitadas, las células fueron incubadas
durante 30 min a 37°C en RPMI-BSA. Luego, fueron centrifugadas y resuspendidas enmedio fresco.
Posteriormente, 4x10S células fueron incubadas con 125I-Tf-Fe (Ae=0,290 pCi/pg)1x10'9 M, a 0°C, con agitación constante, durante diferentes tiempos: 5, 30, 60, 90, 120,180 y 240 min. El volumen final fue ajustado a 1 ml con RPMI-BSA.Finalizado el tiempo de incubación, los tubos fueron centrifugados a 9500 g durante 2mín a 4°C. Se reservaron alícuotas de 500 ¡.¿lde los sobrenadantes y los paquetescelulares fueron lavados con 1 ml de btgfir de lavado. Se midió la actividad de 1251
asociada a las células, la libre presente en los sobrenadantes y la del testigo de 125I-Tf-Fecorrespondiente.Toda la experiencia fue realizada por triplicado.La actividad medida en los paquetes celulares y la del testigo, fue expresada comoconcentración molar de complejos receptor-ligandoformados y de 125I-Tf-Fetotalrespectivamente, empleando la ecuación [1].La curva de asociación en el tiempo (time-town) fue construida graficando laconcentración molar de RL en función del tiempo de incubación. El analisis de losdatos, a través del programa Graph Pad PRISM, permitió determinar la concentraciónde RL correspondiente al equilibrio de la unión.La concentración molar de RTf fue calculada utilizando la ecuación:
RTf = RLeg*g1+ KxLegfl M ec. [3]KxLeq*
Donde:
RLeq*, deriva de las curvas de asociación en el tiempo analizadas a través del programaGraph Pad PRISM; Leq* es la concentración libre de 125I-Tf-Fe,calculada mediante ladiferencia entre la concentración molar de ligando trazador agregado y la de loscomplejos ligando-receptor formados y K, es la constante de afinidad del RTf por 1251Tf-Fe (5,88x10BM"). «eq», denota medidas correspondientes al equilibrio (Hulme,1992).El número de RTf fue calculado sobre la base de su concentIación molar, el número decélulas utilizadas en el ensayo y el volumen final de reacción.
B) Pon CITOMETRÍADE FLUJO
Analisis de Ios receptores expresados en membrana
Las células (1x106) fueron lavadas dos veces con PBS-BSA, centrifugando a 400 gdurante 10 min a 4°C, cada vez. El paquete celular fue incubado durante 30 min a O°Ccon anticuerpo monoclonal anti-CD7] humano (PharMingen, Becton Dickinson Co.), arazón de 0,3 ug/ 106 células. Luego de efectuar 2 lavados con la misma solución, lascélulas fueron incubadas durante 30 min adicionales a 0°C, con anticuerpo anti-IgG deratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína -FITC- (Dako A/ S) (5 ¡lg/106células). Los lavados fueron repetidos con el objeto de remover el exceso del segundoanticuerpo y las células, resuspendidas en 500 pl de PBS-BSA.Para evaluar la unión inespecífica del primer anticuerpo, se realizaron ensayos paralelosen los cuales las células fueron incubadas con el anticuerpo control de isotipocorrespondiente -IgG2a de ratón- (Serotec), a razón de 0,3 ¡lg/106 células. Este reactivofue gentilmente donado por los Dres. Alberto Fosau' y Pablo Baldi del Instituto deEstudios de la Inmunidad Humoral de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de laUniversidad de Buenos Aires. Posteriormente, las células fueron lavadas e incubadas
con el segundo anticuerpo-FITC, tal como se detalló antes.Cuando fue necesario, las muestras fueron fijadas en parafonnaldehido 0,5 °/o(v/v) enbzgfir PBS y conservadas a 4°C durante un máximo de 2 días. Previo a su análisis,fueron lavadas y resuspendidas en 500 pl de PBS-BSA.Las muestras fueron analizadas por citometn'a de flujo empleando un citómetro OrthoCytoron Absolute Oohnson & Johnson), perteneciente al Servicio de Citometn'aLANAIS, Hospital de ClínicasJosé de San Martín.
Análisis de los receptores totales (membrana + citoplasma)
Las células (1x105) fueron fijadas con 100 ul de paraforrnaldehído 1% (v/v) en bzfiïerPBS, durante 20 min a 25°C. Luego de lavar con PBS-BSA, el paquete celular fueincubado con anticuerpo monoclonal anti-CD71 humano (0,3 ug/ 106células) en 50 ulde solución de permeabilización (0,5% saponina, 10% BSA en bzfiér PBS), durante 30min a 25°C. El exceso del primer anticuerpo fue eliminado por lavado con la mismasolución. El paquete celular fue incubado durante 30 min adicionales a 25°C, con elsegundo anúcuerpo-FITC (5 ¡lg/106 células) en 10 pl de solución de permeabilización.Luego de lavar con bzgfir PBS, las células fueron resuspendidas en 500 pl deparaformaldehído 1% (v/v) en PBS.La intensidad de fluorescencia en las muestras fue analizada por citometría de flujo talcomo fue descripto en al apartado anterior.
C) ANÁLISISDE LOSNIVELES DE ARNm DE RTf YRTÍZ POR RT-PCR
Los niveles de ARNm de RTf y RTfZ fueron evaluados mediante RT-PCR (Revem
TammptaJe-Poymeraie Chain Reactz'on).Con el objeto de controlar la variabilidadinterensayos, debida a diferente eficiencia en la extracción de ARN, en el pasaje a ADN«copia» y/o en la PCR, fue realizada la amplificación en paralelo del ARNm de unaproteína no relacionada con el metabolismo del Fe. Como «estándar interno» fueseleccionada la enzima glucolítica gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDI-I).
Extracción de ARN total
La extracción de ARN total se basó en el método desarrollado por Chomczynski 8LSacchi (1987). Un volumen de suspensión celular conteniendo 5x106 células, fuecentrifugado a 600 g durante 10 min a 25°C. El paquete celular fue homogeneizado con0,5 ml de Trizol Reagent (Gibco BRL) e incubado durante 5 min a 25°C. Se agregaron0,1 ml de cloroforrno y se agitó vigorosamente, dejando reposar por 3 min a 25°C.Luego de centrífuga: a 9500 g durante 15 min a 4°C, la fase acuosa superior fuetransferida a un nuevo tubo e incubada con 0,25 ml de alcohol isopropílico durante 10min a 25°C. El precipitado resultante (ARN) fue separado por centrifugación a 9500 gdurante 10 min a 4°C y lavado por agregado de 0,5 ml de etanol 75%. El ARN total fueobtenido por centrifugación a 7500 g durante 5 min a 4°C, secado brevemente al aire,redisuelto en 30 pl de Hzo-DEPC e incubado durante 10 min a 55-60°C.La absorbancia a 260 nm de una dilución 1:100 del ARN en agua-DEPC, fue utilizadapara cuantificar el ARN total, considerando como unidad de absorbancia, lacorrespondiente a una solución de ARN de 40 pg/ ml (Sambrook & Russell, 2001).La integridad del ARN fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa 1%(p/v), conteniendo bromuro de eddio (50 pg/ 100 ml). La solución bzgfirTBE (en HzoDEPC) fue utilizada en la preparación del gel y para realizar el desarrolloelectroforético. El volumen de solución correspondiente a 1 pg de ARN total, fuemezclado con 5 pl de bzgfir de siembra y sometido a electroforesis. El desarrollo serealizó a 10 V/ cm durante 1 h (Sigma Chemical Co., E 0638). La integridad eintensidad de las bandas predominantes de ARN risosomal obtenidas (288 y 188)fueron observadas en un transilurninador (Hoefer Macro Vue UV-20).El ARN total fue fraccionado y conservado a -70°C hasta el momento de suutilización.
Obtención de ADN «copia»
El ADNc (ADN «copia») fue sintetizado a partir del ARN total, por transcripciónreversa de los ARNm utilizando oligo(dT) como pn'mery la enzima transcriptasa reversaM-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus). Se empleó el kit «Ready To Go T-PrimedFirst-Strand Kit» (Amersham Biosciences). Cada síntesis fue realizada a partir de 2,5 pgde ARN total.
El ADNc fue fraccionado y conservado a -20°C hasta el momento de su utilización.
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Diseño de losprimers para RTI;RTIZy GAPDH
Las secuencias de los ARNm de RTf, RTf2 y GAPDH fueron obtenidas de la base dedatos del National Center for Biotechnology Information (NCBI Sequence Viewer) delNational Institute of Health. Los pares de primers fueron seleccionados teniendo encuenta sus propiedades físico-químicas (longitud, composición de bases, temperatura deme/tz'ng-Tm-, etc.) como así también la ausencia de formación de estructurassecundarias (baírpz'nloops) y la no-complementariedad entre ellos. Por otra parte, seconsideró la longitud del fragmento amplificado en cada caso.
O RTf: los primer: fueron seleccionados entre diversas combinaciones desarrolladaspor Tsuchihashi etal. (1998). Tamaño del fragmento amplificado: 1052 pb.Forward: 5’ AGC AGG GAA AAT CAC CTI" TG 3’Reveri'e: 5’ GGT TCA A'I'I' CAA CAT CAT GGG 3’
0 RTÍ2: La secuencia de los primer: fue seleccionada entre diversos pares diseñadospor Kawabata etal. (1999). Tamaño del fragmento amplificado: 299 pb.Forward:5’ GTG GTC AGT GAG GAT GTC AA 3’Reverte: 5’TCA TCG ACC CAG TGC AGG GTG 3’
o GAPDH: La secuencia del par de primer; fue diseñada por McKinney & Robbins(1992). Tamaño del fragmento amplificado: 240 pb.Forward:5’TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G 3’Reoerra 5’TCC 'I'I'G GAG GCC ATG TAG GCC AT 3’
Amplificación de fragmentos delADNcpor PCR
Se realizó la estandarización de las condiciones óptimas para amplificar cada uno de losfragmentos correspondientes a RTf, RTf2 y GAPDH. Las variables consideradasfueron:
a) Cantidad de ADNc inicial: se realizaron reacciones de PCR a partir de diferentesvolúmenes de diluciones seriadas de ADNc (sin diluir, 1:10 y 1:100).
b) Concentración de Mg”: las concentraciones finales de MgClz ensayadas fueron1,0; 1,5; 2,0; 2,5 y 3,0 mM.
c) Temperatura de annealing. se realizaron reacciones de amplificaciónprogramandoel terrnociclador con un gradiente de temperatura entre 56 y 64°C.
d) Número de ciclos: una condición esencial para poder comparar la abundanciarelativa de un determinado ARNm luego de diferentes condiciones de cultivocelular, es establecer el número de ciclos en el cual la cantidad de producto de PCRobtenido es directamente proporcional a la concentración inicial de ARNm. Paraello, se realizaron reacciones de PCR variando el número de ciclos entre 16 y 45.
Las condiciones óptimas seleccionadas finalmente para cada fragmento fueron:
51
0 RTf: desnaturalización inicial (batflan) a 94°C durante 5 min28 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, amen/ing a 60°C durante 40 s y
elongación a 72°C durante 1 min. Elongación final a 72°C durante 10 min.
0 RTfZ: desnaturalización inicial (botHart) a 94°C durante 5 min
33 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, amen/ing a 64°C durante 40 s y
elongación a 72°C durante 1 min. Elongación final a 72°C durante 10 min.
0 GAPDH: por ser utilizado como estándar interno, la amplificación fue realizadacon las mismas condiciones establecidas para RTf o RTf2, según el caso.
Las concentraciones finales de cada uno de los reactivos fueron: Mg2+ 1,5 mM, Taqpolimerasa 0,625 U/ 25 pl (Amersham Biosciences), primer: 0,25 pM (Invitrogen-LifeTechnologies), dNTPs ZOOpM(Amersham Biosciences).El volumen final de reacción fue de 25 pl. En cada ensayo de amplificación fue incluidoun control negativo en el cual se omitió el agregado de ADNc, con el objeto decomprobar que los reactivos no estuvieran contaminados con ADN exógeno.Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador Eppendorf(Mastercycler gradient).
Observación de 10sfragmentos amplítïcados
Los productos de amplificación fueron analizados mediante electroforesis en gel deagarosa (Biodynamics S.R.L.) conteniendo bromuro de etidio.Volúmenes de 10 ¡.11de cada una de las mezclas de PCR fueron homogeneizados con 4pl de hifi!“ de siembra y sometidos a electroforesis en un gel de agarosa 1,5% (p/v),bromuro de etidio SOpg/100 ml de bzgfirTBE. Se incorporó un marcador de númerode pares de bases de ADN (Biodynarnics S.R.L.) para controlar el tamaño de losfragmentos amplificados.El desarrollo electroforético fue realizado a voltaje constante (19 V/ cm) en una cubaelectroforética Liberty 2 (BiokeyAmerican Instruments, Inc. USA) durante 25 min.Las bandas obtenidas fueron observadas en un transiluminador (Hoefer Macro VueUV-20). y los geles, fotografiados empleando una cámara digital (Kodak DC 120).
Cuantítïcación de las bandas
Las fotos digitalizadas fueron analizadas empleando los programas Array Gauge versión1.2 (Fujifilm) e Image Gauge versión 3.12 (Fujifilm).El valor cuantitativo de intensidad, en unidades arbitrarias, calculado por el programapara cada una de las bandas correspondientes al RTf o RTf2, fue relativizado conrespecto al correspondiente al estándar interno GAPDH.
52
Reactivos
v/ H20-DEPC (diedipirocarbonato):El volumen de DEPC (Amersham Biosciences) correspondiente, fue agregado alagua deionizada para dar una concentración final de 0,1% (v/V). Luego de dejarbajo agitación magnética durante toda una noche, la solución fue esterilizada porcalor húmedo en autoclave (121°C, 1 atrn, 30 min).
v’ Buffer para el desarrollo electroforético (TBE):Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8.
J BUÍÏCI'de siembra:
Azul de Bromofenol 0,25% (p/v) (Mallinckrodt), sacarosa 40% (p/v) (Merck) enTBE.
Calidady tratamiento de]material
Para la extracción de ARN así como para las reacciones de RT-PCR, se empleó materialplástico descartable libre de enzimas degradadoras de ADN (ADNasas) y ARN(ARNasas).
El material plástico no descartable, así como la cuba utilizada para la separaciónelectroforética del ARN, fueron tratados con solución de NaOH 0,5 M durante 10 min,
con el objeto de inactivar las ARNasas presentes. Posteriormente fueron enjuagadosexhaustivamente con Hzo-DEPC. Todo el material plástico fue esterilizado porautoclavado.
Con el objeto de evitar la introducción de ARNasas foráneas, todos los procedimientosfueron realizados con guantes, en gabinete de flujo laminar. Se utilizaron equipos demicropipetas automáticas separados para el trabajo con ARN y ADN, de manera deprevenir la contaminación del ARN con ADNc o productos de amplificación de PCR.
DETERMINACIÓN CUANTITATIVADE Al INTRACELULAR
EXPOSICIÓN CELULAR AAl
Luego de exposición a Tf-Al o citrato de Al durante 96 h, las células fueron lavadas dosveces con solución de NaCl 9 g/l, centrifugando a 125 g durante 10 min a 25°C, cadavez. El paquete celular fue lisado por adición de 1 ml de agua deionizada y tres ciclos decongelamiento-descongelamiento realizados por inmersión sucesiva en nitrógenolíquido y en baño de agua a 37°C. Luego de centrifugar a 3900 g durante 15 rnin a 25°C,el sobrenadante fue colectado y conservado a -20°C.La determinación de Al fue llevada a cabo en un espectrómetro de absorción atómica(Shimadzu AA-6501,Japan) acoplado a un atornizador con horno de grafito (ShimadzuGFA-óOOO,Japan) con autoramb/er(Shimadzu ASC 6000,]apan).Como control, se determinó el contenido de Al en el medio de cultivo, en el aguadeionizada y en la solución de NaCl 9 g/l.
53
REACTIVOS
Í La Tf-Al fue preparada tal como se describió en la pág. 40.Í La solución de citrato de Al se preparó a partir de A1C13.6H20y citrato de
Na.2HzO, en relación molar 1:1,5.
TRATAMIENTO DEL MATERIAL
Todo el material de laboratorio recibió un tratamiento previo con el objeto de eliminarla contaminación con trazas del metal. Una vez limpio y seco, el material de vidrio fuesumergido en HCl 30% durante 24 h y el de plástico, durante 1-2 h. Posteriormente, fueexhaustivamente enjuagado con agua deionizada ultrapura hasta obtener reacciónnegativa para cloruros y alcanzar neutralidad. Finalmente, fue secado en atmósfera librede polvo y conservado en las mismas condiciones hasta su uso (Vittori etal, 1999).
INCORPORACIÓN DE Fe MEDIADAPOR Tf
PREPARACIÓNDE 59Fe-TfA PARTIRDE apon
La saturación de la apon humana con iones férricos, fue efectuada bajo las condicionesdetalladas en la pág. 41.
Para optimizar las lecturas de actividad de 59Fe, la proteína fue saturada empleando56Fe3+(isótopo estable) y 59Fe3+(isótopo radioactivo), los cuales fueron agregados enrelación molar 24:1 respectivamente. Para ello, los volúmenes correspondientes decitrato 56Fe y citrato S9Fe (Ae=18,4 pCi/pg, A=1,25 pCi/pl) (NEN Life ScienceProducts Inc.) fueron incubados con la solución de apon durante 24 h a 4°C.
INCORPORACIÓNTOTAL DE Fe
La incorporación total de 59Fefue determinada bajo diferentes condiciones:
ConIapresencia simultánea de Al, durante todo elptocedímiento
Las células fueron inducidas o no a diferenciación durante 4 h (2,5><10°/mlRPMI-BSA)ó 24 h (1,5x106/ ml RPIVH-SFB-PE), en presencia de Tf-Al 1,0 pM (30-60 nCi/106células) y 59Fe-Tf1,0 pM. Finalizado el período de incubación, fueron lavadas con bzfirde lavado y centrifugadas a 600 g durante 10 min a 4°C. Como control, fueronrealizados cultivos paralelos en los cuales se omitió el agregado de Tf-Al.La radioactividad asociada a los paquetes celulares fue determinada en cada caso.
54
Materiales y Métodos
En presencia o luego de Ia remoción de AI, durante el pulso decaptación
Las células (4-5x105/ml RPMI-SFB-PE) fueron estimuladas o no a diferenciarsedurante 1, 3 ó 7 dias, en presencia de Tf-Al 10 pM. Al final del período de inducción,las células correspondientes a cada tratamiento fueron lavadas, resuspendidas en medioRPMI-BSA a una densidad de 2,0-3,5><106células/ ml y divididas en dos botellas. Unade ellas, fue incubada a 37°C con 59Fe-Tf 1,0 ¡1M (20-50 nCi/ 106 células) y la otra, con
igual concentración de 59Fe-Tf más Tf-Al 1,0 pM. Luego de 4 h de incubación, dosalícuotas fueron tomadas de cada suspensión. La primera fue reservada para medir laincorporación de 59Feal grupo hemo (ver apartado siguiente). Las células de la segundaalícuota fueron lavadas, centrifugando a 600 g durante 10 min a 4°C. Se midió laradioactividad asociada a los paquetes celulares. Como control, se realizaron cultivosparalelos en ausencia de Tf-Al durante todo el procedimiento.
INCORPORACIÓNDE Fe ALHEMO
Las células reservadas en los ensayos de incorporación total de 59Fe descriptas en elapartado anterior, fueron lavadas con el objeto de remover el radionucleído libre,centrifugando a 600 g durante 10 min a 4°C. Posteriormente, el paquete celular fuelisado y se realizó la extracción orgánica del grupo hemo con ciclohexanona, tal comose detalla a continuación. Luego de centrifugar la emulsión a 3900 g durante 30 min a25°C, la fase orgánica conteniendo al hemo, fue transferida a un vial para determinar laactividad de 59Feasociada a ella.
Estandan'zacíón de 12extracción orgánica del hemo
Con el objeto de efectuar la extracción del grupo hemo, se emplearon dos técnicas queutilizan diferentes solventes orgánicos.La primera fue desarrollada según Teale (1959), con modificaciones introducidas ennuestro laboratorio, utilizando metil-etil-cetona (butanona) (Merck).La segunda fue realizada esencialmente como describen Bottomley et al. (1985) e Inman& Wessling-Resnick (1993), empleando ciclohexanona (Merck) para extraer el hemo enla forma de cianmetahematina.
La estandarización de los procedimientos de extracción fue realizada empleando unasolución estándar de hemoglobina 14,9 g/ dl (Wiener Lab.), variando los volúmenes dereactivos y los tiempos de incubación y de centrifugación. La eficiencia de lasextracciones fue evaluada espectrofotométricamente (Beckrnan DB) a 545 nm contra elblanco respectivo de solvente.Los resultados probaron que la ciclohexanona es el solvente más adecuado ya que larecuperación de hemo por este procedimiento fue del 90-98%, sin que fuera necesariorealizar una segunda extracción. La butanona presentó dificultad para lograr una buenaseparación entre la fase orgánica y la acuosa.
Materiales y Métodos
El protocolo desarrollado finalmente consistió en lisar 1x107 células con 1 ml dereactivo de Drabkin (Wiener Lab.), agitando vigorosamente. Luego de incubar durante10 minutos a 0°C, la solución fue acidificada agregando 200 pl de HCl 1M. Laextracción se realizó por adición de 1,5 ml de ciclohexanona, vortexeando la emulsióndurante 5 minutos. Luego de centrifugar a 3915 g durante 30 minutos a 25°C, la faseorgánica conteniendo el hemo en forma de cianmetahematina, fue recuperada.
Rumba deDrab 'n: ferricianuro de K 0,6 mM; cianuro de K 0,8 mM; fosfato diácido de
K 1mM; Nonidet P40 0,05%; pH 7,2.
Inhibición de Ia sintesis de hemo por succiniI-acetona
La síntesis de novode hemo puede ser bloqueada por tratamiento con succinil-acetona(4-6-ácido dioxoheptanoico) (SA), un potente inhibidor de la 5-aminolevulinatodehidrasa, la segunda enzima involucrada en la ruta de biosíntesis de dicho grupo(Kawasaki et a/., 1996; Richardson et a/., 1996).
El siguiente ensayo fue realizado para comprobar que la actividad de 59Femedida en losextractos orgánicos corresponde efectivamente al radionucleído incorporado al hemo.Las células (1,4x106/ml de RPMI-SFB-PE) fueron pretratadas durante 30 min a 37°Ccon SA 2 mM (Sigma Chemical Co.) (Bottomley et a/., 1985). Posteriormente, fueroninducidas o no a diferenciarse con hernina 25 pM o butirato de sodio 1,5 rnM durante24 h. Esta incubación fue llevada a cabo en presencia de 59Fe-Tf1,0 pM (30-60 nCi/106células) con o sin agregado de Tf-Al 1,0 pM. Como control, fueron realizados losmismos ensayos con células que no tuvieron tratamiento previo con SA.Finalizada la incubación, se determinó la incorporación total y al hemo del trazador.
Cuando las células fueron tratadas previamente con SA, la captación total de 59Fedisminuyó levemente. Los resultados obtenidos, expresados como porcentaje de 59Feincorporado con respecto a los cultivos sin pretratar fueron: NI: 84%, NIN: 70%, H:770/0, HA]: 850/0, B: 82°/o, BA]: 870/0.
Por otra parte la incorporación de 59Feal grupo hemo fue totalmente inhibida. Esteefecto mostró ser independiente de las condiciones de inducción de las células y de lapresencia o no de Al en el medio de cultivo. Los resultados, expresados tal como seindicó antes, fueron: NI: 3%, NIN: 4%, H: 16%, HA]:19%, B: 4%, Bm: 5%.
Por lo tanto, puede concluirse que la metodología empleada para la determinación de lautilización de Fe en la síntesis de hemo fue adecuada.
56
Materiales y Métodos
INCORPORACIÓNDE Fe INDEPENDIENTE DE Tf
La captación de 59Fea través de la vía alternativa fue determinada luego de un pulso enpresencia del radioisótopo. Se estudió el efecto de diferentes condiciones de cultivoprevias así como de distintos tratamientos durante la incorporación del trazador, através de los ensayos que se detallan a continuación.
CONTACTO PREVIO CON A1
Las células (3,5X105/ml RPMI-SFB-PE) fueron expuestas a Al durante 3 ó 7 días.Posteriormente, fueron inducidas o no a diferenciación eritroide.
Finalizado el período de inducción, las células fueron lavadas con bujfir PBS con elobjeto de remover el suero presente en el medio y resuspendidas en RPMI-BSA.Luego de efectuar el recuento, 5x106 células fueron incubadas con 59Fe-citrato 0,5 pM
(Ae=20 pCi/pg, A=0,4O “Ci/pl) (Perkin Elmer Life Sciences Inc.) durante un pulso de2 h a 37°C. Posteriormente, las suspensiones celulares fueron lavadas con buflerTrisI-ICl y centrifugadas a 600 g durante 10 min a 4°C. Se midió la actividad de 59Fe
presente en los paquetes celulares.
TRATAMIENTO PREVIO CON DESFERRIOXAMINAO Fe
Las células (5,5x105/ml RPMI-SFB-PE) fueron cultivadas en presencia de FeCla 100pM o desferrionamina 100 pM (Df, Sigma Chemical Co.) durante 24 h. Posteriormente,fueron lavadas con bzfier PBS y resuspendidas en RPMI-BSA. 5x106 célulascorrespondientes a cada tratamiento, fueron sometidas a un pulso de incorporación deS"Fe-citrato 1 HM y, posteriormente, procesadas tal como fue descripto en el apartadoanterior. Se determinó la actividad de 59Fepresente en los paquetes celulares.
PRESENCIA SIMULTANEADE Fe YAl
Las células K562, mantenidas en fase logarítrnica de crecimiento en RPIVII-SFB-PE,fueron lavadas con btfiíerPBS y resuspendidas en RPMI-BSA. Alícuotas conteniendo5x106 células, fueron incubadas con 59Fe-citrato 0,5 pM durante 2 h a 37°C, en
presencia de: citrato de Al 20 pM, FeCla 20 pM o FeCl; 200 pM. Luego del pulso deincorporación de 59Fe,las suspensiones celulares fueron procesadas tal como se detallóanteriormente. La actividad de 5"Fefue determinada en los paquetes celulares.
Materiales y Métodos
MEDICIÓN DE ACTIVIDADDE LOS RADIONUCLEÍDOS
La actividad del radionucleído 1251(t‘/2 = 60,14 d; B’; y 35 keV) fue medida pordetección de la radiación gamma característica utilizando la técnica de centelleo. Lamedición se llevó a cabo en un detector de centelleo inorgánico con cristal de NaI (T1),de 3X3 pulgadas. El registro se llevó a cabo acoplándolo a un espectïómetro multicanalde 2048 canales (Canberra series 35 Plus, USA).
El sistema detector fue calibrado en energía utilizando una fuente estándar de ¡291,lacual consiste en un patrón simulado de 1251preparado a partir de 1291(BaconLaboratories, Argentina).La actividad de fondo fue medida durante al menos 20 minutos, en ausencia de lafuente radioactiva, y descontada de los valores de actividad de interés.Los tiempos de medición para cada muestra fueron seleccionados de manera demantener un error estadístico límite de 1%. Este valor fue elegido luego de realizar elestudio estadístico sobre un número apropiado de replicados.
La actividad del radionucleído 59Fe (t'/2 = 44,6 d; B'; 'y 1099, 1292 keV) fue medida pordetección de la radiación gamma característica utilizando la metodología detallada para1251.
La calibración en energía se realizó empleando una fuente patrón de 60Co (CNEA,Argentina).El equipo de medición se encuentra ubicado en el laboratorio de Radioquímica(Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Físico-Química, Facultad deCiencias Exactas y Naturales, UBA), el cual posee la habilitación correspondiente de laAutoridad Regulatoria Nuclear (ARN) para manejo de material radioactivo.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Métodos no pararnétricos específicos fueron utilizados para realizar comparacionesentre grupos de observaciones independientes de «n»pequeño.El testde Mann-Whitney fue empleado para comparar la distribución poblacional entredos tratamientos. Para evaluar varios grupos se utilizó el test de análisis de varianza deKruskal-Wallis. Para decidir si el parámetro de centralidad de la población de la cualprovienen las muestras coincide o no con un valor determinado (100%), se empleó eltest de Wilcoxon (.rágnea’rank tesi).Para describir el modelo lineal de asociación entre variables se calculó el coeficiente decorrelación «r»de Pearson.
58
BIOSEGURIDAD
Material radíoactivo: La manipulación del material radioactivo se realizó según lasnormas de seguridad vigentes. El material descartable empleado en las experienciasen las que se utilizaron los radionucleídos 1251y S9Fe,así como también, los líquidosproducto de los lavados efectuados, fueron descartados en recipientes apropiados.Posteriormente, se depositaron en el cuarto de decaimiento perteneciente allaboratorio de Radioquímica.
Línea celular K562: Trabajo en gabinete de seguridad biológica clase II.Manipulación con guantes y descarte del material en agua con hipoclorito de sodio.
Bromuro de etídio y colorante de Hoechst: Por tratarse de agentes intercalantesdel ADN, su manipulación fue realizada con guantes. Los geles conteniendobromuro de etidio fueron inactivados bajo luz ultravioleta durante 1 h y,posteriormente, descartados como residuos peligrosos.
Cíclohexanona: Fue desechada en un recipiente apropiado para solventesorgánicos, según las normas establecidas por el Servicio de Higiene y Seguridad enel Trabajo de la FCEyN.
Hemina, hidroxiurea, butírato de sodio, bencr'dina, díaminotluoreno,díea'lpirocarbonato: Fueron manipulados utilizando barbijo y guantes. Su descartese realizó de acuerdo a las normas establecidas por el Servicio de Higiene ySeguridad en el Trabajo de la FCEyN.
CAPÍTULOI
ACCIÓN DEL ALUMINIO SOBRE LA SÍNTESIS DE
HEMOGLOBINA
I.1 INHIBICIÓN DE LADIFERENCIACIÓN DE CÉLULASK562
El término anemia es utilizado para referirse a una condición patológica
caracterizada por la disminución de la concentración de hemoglobina en sangre.
Tal como fue descripto en la Introducción, el aluminio (Al) ha sido reconocido
como una causa de desórdenes hematológicos, relacionándolo, en particular, con la
aparición de anemia. Hallazgos previos de nuestro laboratorio que demostraron
inhibición del desarrollo de células progenitoras eritroides como consecuencia de la
exposición a Al, contribuyeron a plantear el siguiente interrogante:
¿Interfiere el aluminio en la síntesis de hemoglobina?
Las células de la línea eritroleucémica humana K562 experimentan maduración
eritroide, sintetizando hemoglobina, como respuesta al estímulo de sustancias que
actúan mediante mecanismos diferentes. En la presente experiencia fue utilizada
hemina, compuesto que aporta grupo hemo preformado a las células, además de
butirato de sodio e hidroxiurea, los cuales inducen la síntesis de hemoglobina a través
de cambios bioquímicos que no han sido totalmente aclarados aún.
El efecto del Al sobre la diferenciación celular fue analizado en cultivos
estimulados con los mencionados inductores, en presencia de compuestos del metal y
de su proteína transportadora, Tf. Los resultados se muestran en la Figura I.1.
61
60.,4o“Nam 'Ñ
NI NI+A| H H+Al B B+Al U U+AlCélulashemoglobinapositivas
(%)
Figura I.1:Efecto del Al sobre la diferenciación eritroide de células K562Las células fueron inducidas a diferenciarse con hemina 25 uM (H), butirato de sodio 1,5mM (B) o hidroxiurea 75 pM (U). El período de inducción para los cultivos estimuladoscon H y U fue de 72 h y para los de B, de 120 h. Las incubaciones fueron realizadas enausencia o presencia (+Al) de Tf-Al 10 pM. Como control de diferenciación espontáneafue empleado un cultivo de célulasno inducidas El número de células hemoglobinapositivas, determinado por tinción con bencidina, se expresa como porcentaje con respectoal número total de células. Este valor fue significativamente menor (n=13; P<0,01; textdeMann-Whitney) en los cultivos inducidos a diferenciación, desarrollados en presencia de Al,que en aquéllos en los cuales se omitió el agregado del metal.
Bajo las condiciones experimentales empleadas, la hemina probó ser un agente
inductor más eficiente que hidroxiurea y butirato de sodio. El porcentaje de células
hemoglobinizadas se incrementó, con respecto a la diferenciación espontánea de las
células no inducidas, 9 veces cuando se empleó hemina, 7 con hidroxiurea y 3 con
butirato de sodio.
La viabilidad celular no fue afectada significativamente como consecuencia del
cultivo en presencia de inductores, variando entre 81 y 90 °/oen todas las experiencias.
Sin embargo, se encontró una disminución en la tasa de crecimiento celular, la cual fue,
en promedio, 15 y 37 °/omenor en los cultivos inducidos a diferenciación eritroide con
hidroxiurea y butirato de sodio respectivamente, con relación a la de las células no
inducidas. Como consecuencia del estímulo con butirato, se observó una significativa
reducción del tamaño celular.
Debido a la presencia de Al en el medio, el número de células hemoglobina
positivas disminuyó significativamente (18, 31 y 61 °/o en cultivos inducidos con
62
hemina, hidroxiurea o butirato de sodio, respectivamente). Los valores de
hemoglobinización, expresados como Mediana de los datos de 13 ensayos
independientes, fueron: 68% (H+Al) vs. 83% (H), 42 (U+Al) vs. 61 (U) y 12% (B+Al)
vs. 31% No se observaron diferencias significativascuando células no inducidas
fueron cultivadas en medio rico en Al, probablemente, debido al reducido porcentaje de
células diferenciadas espontáneamente (NI: 9%; NI+Al: 10%) y a la variabilidad de los
datos.
La presencia de Al en los cultivos no afectó la tasa de crecimiento ni la
viabilidad celular.
CONCLUSIONES
Í La presencia de Al afecta el proceso de diferenciación eritroide de las células
K562 desencadenado por hemina, hidroxiurea o butirato de sodio, reduciendo
significativamente el número de células hemoglobinizadas.
v/ La viabilidad celular y la tasa de crecimiento no son alteradas por la presencia de
Al en los cultivos.
Se sugiere que el aluminio interfiere en 12producción de hemoglobina
en células de 1alínea eritroleucémica K562a través de un mecanismo que noinvolucra una acción citotóxica directa de] metal.
DISCUSIÓN
La línea eritroleucémica humana K562 demostró ser un modelo experimental
apropiado para el estudio de la interferencia del Al con el proceso de diferenciación
eritroide. Estas células producen pequeñas cantidades de hemoglobina, nivel de
producción que es incrementado por la acción de los agentes inductores hemina,
hidroxiurea y butirato de sodio.
Los porcentajes máximos de hemoglobinización fueron obtenidos luego de 72 h
de estimulo con hemina o hidroxiurea, mientras que la respuesta a la inducción con
butirato de sodio fue más lenta (ver Materiales y Métodos, pág. 39). Esta observación
concuerda con lo reportado por Cioe et al. (1981), quienes observaron que los tiempos
necesarios para que la síntesis de hemoglobina sea incrementada por acción del butirato
63
Resultados y Discusión - Capítulo I
de sodio, son más prolongados que los obtenidos con otros inductores. Cuando las
células K562 son inducidas a diferenciación con budrato de sodio, aumenta la síntesis
del grupo hemo; sin embargo, cuando la hemina es utilizada como agente diferenciador,
este efecto no es detectado (Kawasaki et a/., 1996). La hemina agregada en forma
exógena a las células en cultivo, podría interactuar con las cadenas de globina para
formar hemoglobina sin inducir la síntesis de novode hemo (Granick ¿t Sassa, 1978). El
mayor lapso necesario para que se produzca la síntesis de hemoblobina en células
tratadas con butirato de sodio, sugiere que se activaría la ruta de síntesis de hemo y que
esto podría requerir varios días.
Los datos presentados muestran que, independientemente del inductor
empleado, la presencia simultánea de Al y Tf afecta el proceso de diferenciación celular,
provocando una disminución significativa del número de células hemoglobinizadas.
Este efecto se debería a la alteración de mecanismos involucrados en la síntesis de
hemoglobina y no a una acción citotóxica directa del metal, ya que la viabilidad celular y
la tasa de crecimiento no fueron afectadas en los cultivos realizados en presencia de Al.
Aunque la línea K562 ha sido utilizada en diversos trabajos para estudiar la
interferencia del Al con el metabolismo del hierro (Fe), no se han realizado
investigaciones para evaluar el efecto del Al sobre la síntesis de hemoglobina en estas
células. Sin embargo, es interesante destacar que el metal ha mostrado efectos
inhibitorios similares a los presentados aquí, en otro tipo celular. Abreo et al. (1990)
utilizaron células de la línea eritroleucérnica Friend inducidas a diferenciación eritroide
con dimetilsulfóxido (DMSO). En ese modelo experimental, encontraron una
reducción significativa de la producción de hemoglobina cuando las células fueron
inducidas a diferenciación en un medio que contenía Tf saturada con Al.
El metal podría ejercer su acción a diferentes niveles. Algunos antecedentes
permiten suponer que el Al podría inhibir la actividad de enzimas involucradas en la
biosíntesis de hemo (Zaman et a/., 1990; Nasiadek & Chmielnicka, 2000) y/o afectar la
síntesis de globina (Hanas & Gunn, 1996; Zhang et al, 2002). Por otra parte, el catión
podría interferir en la captación, transporte y/o acumulación intracelular de Fe.
Cualquiera fuera el mecanismo involucrado, nuestros resultados demuestran una
disminución de la producción de hemoglobina debido a la presencia de Al durante el
proceso de diferenciación celular.
Resultados y Discusión - Capítulo II
CAPÍTULOII
INTERACCIÓN DEL ALUMINIO UNIDO A TRANSFERRINA
CON CÉLULAS K562
II.1 ASOCIACIÓNDE Tf-Al A LOSRECEPTORES DE MEMBRANA
Los resultados presentados en el capítulo anterior, demostraron que el Al
produce disminución de la síntesis de hemoglobina en células K562 inducidas a
diferenciación eritroide. Una hipótesis que permitiría explicar dicho efecto, apoyada por
los antecedentes presentados en la Introducción, es que el Al afectaría el metabolismo
normal del Fe, ya sea a nivel de su captación como también, de su utilización.
Dado que la Tf es el principal vehículo para el transporte de A1 a través de la
sangre, podría ser la proteína responsable del pasaje del cau'ón a los tejidos por un
proceso de endocitosis mediada por receptor (Trapp, 1983; Martin, 1986). Por lo tanto,
el Al, vehiculizado por Tf, podría interferir en el metabolismo del Fe interactuando a
nivel de la membrana con los RTf. El primer interrogante que surgió para probar esta
hipótesis fue:
¿Puede el complejo Tf-Alunirse alos receptores presentes en la membrana delas células K562?
Con el objeto de responder a esta pregunta, se realizaron ensayos en los cuales
se utilizó Tf marcada radioactivamente con l251y unida a Al. Las células fueron
sometidas a una incubación a 0°C, condición en la cual pueden formarse los complejos
Tf-RTf, pero no se realiza la internalización de los mismos. Los resultados se muestran
en la Tabla II.1.
65
Resultados y Discusión - Capítulo II
Li ando Actividad de 125Ig (asociada/inicial)
‘ZSI-Tf-Al 25 i 1,1 %
125I-Tf-Fe 33 i 0,3 °/o
Tabla II.1: Asociación de 1¿"’I-Tf-Ala los RTf de células K562
Las células fueron incubadas a O°C durante 30 min en presencia de 125I-Tf-Alo 125I-Tf-Fe.Posteriormente, las suspensiones celulares fueron divididas en dos alícuotas. La primera fuereservada para ser utilizada como testigo de la actividad total de ¡251agregada (actividadinitial).Las células de la segunda alícuota fueron lavadas con el objeto de remover la 'zsI-Tflibre, permaneciendo solamente la asociada a la superficie celular. La actividad de '251fuemedida en los paquetes celulares (actividadarmada) y expresada como porcentaje conrespecto a la actividad inicial. Los resultados se presentan como Media i SEM detriplicados.
El análisis comparativo de los resultados obtenidos en las incubaciones con 1251
Tf-Al y ‘25I-Tf-Fesugieren que la Tf sería capaz de unirse a los receptores expresados
en la membrana de las células K562, a pesar de portar Al en lugar de su ligando
fisiológico Fe. El receptor aparentemente reconoce a la molécula de Tf
independientemente de cuál sea el metal que se encuentre unido a ella.
11.2 INHIBICIÓN DE LAUNIÓN DE Tf-Fe POR LAPRESENCIADE Tf-Al
Los resultados anteriores sugieren que el RTf de las células K562 podría
interactuar con el complejo Tf-Al en un medio en el cual su ligando fisiológico, Tf-Fe,
está ausente. Sin embargo, en condiciones fisiológicas, esta situación podría ser
diferente. Ambos complejos coexisten en el plasma y el RTf podría, por lo tanto,
discriminar entre ambos. Para esclarecer esta situación, se planteó a continuación la
siguiente pregunta:
¿Se establece una relación de tipo competitiva por la unión al RTf como
consecuencia de la presencia simultánea de Tf-Aly Tf-Fe en el medio?
Con el objeto de analizar este interrogante, fue diseñada una experiencia en la
cual se utilizó 125I-Tf-Fecomo ligando trazador y Tf-Al como competidor no marcado.
66
Para detenninar la cinética de unión a los RTf, las células fueron incubadas
durante diferentes períodos a 0°C en presencia de 125I-Tf-Fe.El desplazamiento de la
unión del ligando trazador fue analizado en incubaciones paralelas en las cuales se
agregaron diferentes concentraciones de Tf-Al. Los resultados obtenidos están
graficados en la Figura II.1.
2000“
' (a)
E15003m- ' (b)S!
.3 1000- . (c)'u8-; ' (d)57- 5002
o 5'0 100 150 200 2-30 300
Tiempo de incubación (min)
Figura II.1: Inhibición de la unión de mI-Tf-Fe por Tf-AlLas células, suspendidas en RPMI-BSA, fueron incubadas a 0°C en presencia de ‘ZSI-Tf-Fe2,5)(10'9 M (a) y, en ensayos paralelos, con agregado de Tf-Al 2,5)(10'9 M (b), Tf-Al 5><10'9
M o Tf-Al 10x10'9 M A diferentes tiempos, las células fueron centrifugadas ylavadas. La actividad de 1251asociada a los paquetes celulares fue determinada en ensayosduplicados y graficada en función del tiempo de incubación.
La curva (a) muestra la evolución en el tiempo de la unión a 0°C de 125I-Tf-Fea
los receptores específicos de membrana de las células K562. Se puede observar un
comportamiento cinético clásico de asociación exponencial de un ligando a su receptor.
Las curvas (b), (c)y (d) indican que el agregado de diferentes concentraciones del
ligando no marcado Tf-Al provoca disminución de la unión del trazador 125I-Tf-Fe.
El efecto del agregado de dosis crecientes de Tf-Al, luego de 180 rnin de
incubación a 0°C, puede observarse más claramente en la Figura II.2.
67
Resultados y Discusión - Capítulo II
2000
1500 «w
1000
Actividadde125I(cpm)
go
Tf-Al 0 Tf-AI 1 Tf-Al 2 Tf-AI 3
Tratamientos
Figura II.2: Relación entre la concentración de Tf-Al y la inhibición de la uniónde 125I-Tf-Fea los RTfEl eje de ordenadas representa la actividad de 'ZSIasociada luego de incubat las célulasK562 durante 180 min a 0°C, en presencia de 'ZSI-Tf-Fe 2,5x10'9 M (TjïA/ 0) y lassiguientes concentraciones de Tf-Al: 2,5)(10'9 M (TfA/ 7); 5x10'9 M (Tf-A/ 2); 10x109 M(Tf-A/ 3).Los datos graficados corresponden a los obtenidos en la experiencia de inhibición de launión de 'ZSI-Tf-Fepor Tf-Al (Figura 11.1),transcurridos 180 min de incubación a 0°C
La Figura 11.2muestra que la unión de 125I-Tf-Fea los receptores específicos de
la membrana celular disminuye en relación inversa con la concentración de Tf-Al
presente en el medio, en el rango comprendido entre 2,5x10'9 y 10x 10'9 M. El valor
—0,96del coeficiente r de Pearson, muestra el grado de correlación lineal negativa entre
ambas variables.
Estos resultados indican que el complejo Tf-Al se comporta como un
competidor de Tf-Fe por su asociación a los RTf presentes en la superficie de las
células K562.
II.3 DETERMINACIÓNDE LAAFINIDADDEL RTf PORTf-Al
Los resultados presentados hasta aquí, demuestran la capacidad del RTf
presente en las células K562, para reconocer a la Tf a pesar de portar un ligando no
fisiológico. Más aún, los complejos Tf-Fe y Tf-Al compiten entre sí por su unión al
receptor cuando se hallan presentes simultáneamente en el medio. Sin embargo, la
afinidad del RTf por la proteína transportando uno u otro metal, podría no ser la
misma debido a la posibilidad de que la Tf adopte una conformación estructural
68
Resultadosy Discusión - Capítqu II
diferente según el catión ligado (Batdstuzzi el al, 1995). Por lo tanto la situación a
estudiar a continuación fue:
¿Cuál es la afinidad del RTf por Tf-Al?
Para responder a esta pregunta fueron realizados ensayos cinéticos con el fin de
determinar las constantes de disociación (Kd) correspondientes a la unión del RTf con
Tf-Fe o Tf-Al.
Cabe aclarar aquí que la determinación de la Kd de Tf-Al fue realizada a través
de un ensayo de competición, debido a que comercialmente no puede adquirirse 1251
Tf-Al y a que el tratamiento de 125I-Tf-Fecon EDTA para obtener apon marcada
radioactivamente, modifica la actividad específica de la proteína (ver Materiales y
Métodos, pág. 40).
Los pasos seguidos fueron:
a) Determinación del tiempo de equilibrio de unión del ligando trazador a los
RTf, necesario para realizar las experiencias de saturación y competición.
b) Determinación de la Kd correspondiente al ligando trazador 125I-Tf-Fe
mediante una experiencia de saturación de los receptores específicos de membrana.
c) Determinación de las Kd correspondientes a Tf-Fe y Tf-Al a través de
ensayos de competición, empleando dichos complejos como ligandos no marcados y
125I-Tf-Fecomo radioligando. Las Kd correspondientes a cada uno de los competidores
fueron calculadas mediante la ecuación de Cheng-Prusoff (ec. [2] de Materiales y
Métodos), utilizando como dato la Kd del ligando trazador determinada en b).
II.3.a) Detcmzinacíón del tiempo de equilibrio de unión
El tiempo de equilibrio de unión es un parámetro que indica el tiempo que debe
transcurrir para que la cantidad de complejos ligando-receptor que se forman sea igual a
la de aquéllos que se disocian.
Para deterrninarlo, fue construida una curvade madaa'o'n del radioligando 125I-Tf
Fe a los receptores específicos de las células K562 en función del tiempo.
La unión total (UT) fue determinada en incubaciones con el trazador durante
diferentes tiempos a 0°C para impedir la endocitosis de los complejos RTf-Tí
formados.
69
Resultadosy Discusión - Capítqu II
La unión no eipeafira (UNE) fue medida en ensayos paralelos preincubando las
células en presencia de un exceso de Tf-Fe, de manera que los sitios en los cuales la 125I
Tf-Fe puede unirse inespecíficamente, son bloqueados por el ligando frío. Los
resultados mostraron que la UNE no fue modificada por el tiempo de incubación,
obteniéndose un valor medio de O,69i0,05 pM (n=30).
La um'o'neipeczfica(UE) fue calculada descontando de cada dato de UT, el valor
promedio de la UNE.
Todas las incubaciones fueron realizadas en medio en el cual el SFB fue
reemplazado por albúmina para evitar la interferencia de la Tf-Fe. Los resultados se
muestran en la Figura II.3.
120
Uniónespecífica(pM)
I I I l I I1 so 1oo 150 zoo 250 aoo
Tiempo (min)
Figura II.3: Curva de asociación de 125I-Tf-Fea los RTf de células K562La UE (UT-UNE) de 'ZSI-Tf-Fea los RTf, expresada como concentración molar decomplejos ligando-receptor, se grafica en función del tiempo de incubación (MediaiSEM,n=3).UT: Las células fueron incubadas a 0°C en presencia de 125I-Tf-Fe 1x10"9 M durantediferentes tiempos (5, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240 y 300 min) y se midió la actividad de“SI asociada a los paquetes celulares.
UNE: Las células fueron preincubadas durante 60 min a 0°C en presencia de Tf-Fe 1x10‘6M. Posteriormente, se agregó 'zsI-Tf-Fe 1><10'9M y se incubó a 0°C durante los períodosindicados. A los tiempos correspondientes, las células fueron procesadas y se midió laactividad de 12SIasociada a ellas.
70
Resultadosy Discusión - Capítqu II
Tal como se observa en la Figura II.3, el tiempo de equilibrio de unión, bajo las
condiciones experimentales empleadas en los ensayos, fue alcanzado luego de 180 min
de incubación a 0°C. Durante ese período, la viabilidad celular no se vio afectada.
Este lapso fue utilizado en las incubaciones de las experiencias siguientes,
mediante las cuales se determinaron las constantes de disociación correspondientes a la
unión entre el RTf y Tf-Fe o Tf-Al.
II.3.b) Detemzinaciónde Ia deara 12unión entre e] RTf y c1ligandotrazador
La constante de disociación (Kd) constituye la concentración de ligando libre a
la cual se alcanza el 50% de saturación de los receptores disponibles. Este parámetro
caracteriza la cinética de interacción entre un receptor y su ligando. Con el objeto de
determinar la Kd correspondiente a la unión entre el RTf y la 125I-Tf-Fe,se realizó una
experiencia de saturación de los receptores presentes en las células K562 con el ligando
trazador.
La unión total (UT) fue determinada incubando durante 180 min, a 0°C, un
número constante de células en presencia de concentraciones crecientes de 125I-Tf-Fe.
La unión no eipeafira (UNE) se midió luego de preincubar con un exceso de Tf
Fe.
Los datos de la actividad de 1251 asociada a los paquetes celulares
correspondientes a los ensayos de UT y UNE, y los de los testigos de la actividad total
agregada, fueron analizados a través del programa LIGAND. Como resultado, pudo
determinarse la Kd para la unión entre 125I-Tf-Fey el RTf:
Kd mn”, = (l,73:l:0,33)x10-9M
La unión eipeafim (UE) fue determinada mediante la diferencia entre la UT y la
UNE correspondientes a cada concentración de 125I-Tf-Feutilizada.
Con los datos obtenidos fue construida la curva de saturación de los RTf de las
células K562 con el ligando trazador que se muestra en la Figura II.4.
7l
Resultados y Discusión - Capítulo II
30
A ur
A - UE2B,_¿sm
v UNE
v 0 160 260 360 460 560 660 760
F(x10-11M)
Figura 11.4:Curva de saturación de los RTf con mI-Tf-FeEl eje de las abscisas (F, five) representa la concentración molar de 125I-Tf-Fe quepermaneció libre y el de las ordenadas (B, bound),las concentraciones molares de complejosRTf-Tf correspondientes a la UT, UNE y UE.UT: Las células fueron incubadas a 0°C en presencia de concentraciones crecientes deTf-Fe (0,10; 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 3,00; 4,50; 6,00 y 10,00x10'9 M) durante 180 min. Laactividad de 125Ifue medida en los paquetes celulares, en los sobrenadantes y en los testigosde actividad total agregada.UNE: Las células fueron preincubadas durante 60 min a 0°C, en presencia de Tf-Fe 1><10'6M. Posteriormente, se agregó 'zsI-Tf-Fe y se incubó a 0°C durante 180 min. La actividad de'251fue medida en los paquetes celulares y en los sobrenadantes.UE: fue calculada por la diferencia entre los valores de UT y UNE correspondientes a cadaconcentración de ligando trazador.Las actividades correspondientes a UT, UNE y UE fueron expresadas como concentraciónmolar de complejos ligando-receptor (B) y las medidas en los sobrenadantes, comoconcentración molar de 'ZSI-Tf-Felibre (F) (ec. [1] de Materiales y Métodos).
115];
A través de la curva correspondiente a la um'o'nespeczficade la Figura II.4, se
comprueba la saturación de los RTf presentes en la membrana de las células K562 con
el ligando trazador. Esta condición permitió que los datos correspondientes a la UE y a
la concentración de 125I-Tf-Felibre, fueran sometidos a un análisis de Scatchard, cuya
representación gráfica se muestra en la Figura 11.5.
BIF 0.1
I I I I
0 50 100 150 200
B (x 10-12 M)
Figura II.5: Análisis de Scatchard de los datos de la experiencia de saturación dereceptores con 125I-Tf-FeEl eje de abscisas representa la concentración molar de complejos ¡ZSI-Tf-Fe-RTE(B, bound)correspondiente a cada concentración de ligando trazador empleada en la experiencia desaturación. En el eje de ordenadas (B/F) se grafica el cociente entre dicha concentración yla del radioligando 125I-Tf-Feque permaneció libre en el sobrenadante (F,fm) en cada caso.Bondad de ajuste a recta: R2=0,90.
El análisis de Scatchard de los datos obtenidos en la experiencia de saturación,
resultó en una isoterma típica de unión.
La Kd correspondiente a la unión de la 125I-Tf-Feal RTf de las células K562 fue
calculada a partir de la pendiente de la recta (-6,7x103 M"), obteniéndose un valor de
(1,49i0,10)x10'9 M. Éste coincide con el determinado a través del análisis de las
mediciones de actividad realizado con el programa LIGAND (Kd = (1,73i0,33)XI0'9
M).
II.3.c) Detemu'nación de las Kd correspondientes a Ia unión entre el
RTfy Tf-Fe o TflAJ
Para determinar las Kd correspondientes a la unión del RTf con Tf-Fe o Tf-Al
fueron realizados ensayos de unión competitiva utilizando 125I-Tf-Fecomo ligando
trazador y concentraciones crecientes de Tf-Fe o Tf-Al como competidores no
marcados.
Las curvas de desplazamiento de la unión de 125I-Tf-Fe,correspondientes a cada
uno de los competidores, fueron construidas con los datos de actividad de 1251medidos
en los paquetes celulares de cada experiencia. Las mismas están graficadas en la Figura
II.6.
o 0-6“Qm
0.4
0.2
0.3 l I-12 -1'1 -io -'9 -i3 -7 -6
log [competidor] (M)
Figura II.6: Competición de Tf-Fe o Tf-Al con 125I-Tf-Fepor la unión al RTfLas células, suspendidas en RPMI-BSA, fueron incubadas a O°C en presencia de 'ZSI-Tf-Fe0,5x10'9 M y concentraciones crecientes de Tf-Fe o Tf-Al durante 180 min. Lasconcentraciones de cada uno de los competidores fueron: 1x10”, 1x10'“, 1x10"°, 5x10"°,1x10”, 5x10'9, 1x10'8, lx‘lO'7y 1x10'6. El punto correspondiente a la unión máxima (B0)fuedeterminado en ausencia de competidor. Luego de 180 min, las células fueron cosechadaspor centrifugación y lavadas. La actividad de “SI fue medida en los paquetes celulares y enlos sobrenadantes.
El eje de abscisas representa el logaritmo de la concentración molar de cada competidor yel de ordenadas (B/Bo), el cociente entre la actividad de '251 medida en cada ensayorealizado en presencia de competidor (B)y la correspondiente al control (Bo).
La Figura II.6 muestra las curvas sigmoideas características del establecimiento
de una relación competitiva entre dos ligandos por la unión a un receptor. En las
mismas puede observarse la disminución de la unión del trazador a medida que se
incrementa la concentración de cada uno de los competidores.
74
La medición de la actividad de 12SIasociada a los paquetes celulares, la libre
presente en los sobrenadantes y la de los testigos correspondientes a ambas
experiencias de competición, permitió comprobar que en ningún caso la depleción del
ligando ttazador superó el 10% de la actividad total de 1251agregada.
Los datos obtenidos en ambas experiencias de competición, fueron analizados a
través del programa ALLFIT. El mismo permitió determinar las «dosis efectivas 50»
(DEso), o sea, la concentración de cada uno de los ligandos no marcados que produce
50% de inhibición de la unión del ligando trazador:
DE“ para Tf-Fe - (2,25i0,16)x10-9M
DEsopara Tf-Al = (l,77:t0,33)x10-9M
Los datos de las DEso y de la Kd para la unión entre el RTf y el ligando trazador
(determinada en el punto anterior), fueron utilizados para calcular las Kd
correspondientes a cada uno de los competidores mediante la ecuación de Cheng
Prusoff (ec. [2] de Materiales y Métodos).
Kdmpe = (1,75:t0,14)><10-9M
Kan.“ = (1,37:t0,11)><10-9M
La comparación de las curvas de competición obtenidas para Tf-Fe y Tf-Al
sugiere que existe un comportamiento similar de la Tf cuando se encuentra saturada
con uno u otro metal. Esta observación fue comprobada mediante el cálculo de las
correspondientes constantes de disociación, las cuales son del mismo orden de
magnitud, no habiéndose encontrado diferencias estadísticamente significativas entre
ambas.
Por lo tanto, puede concluirse que el RTf presente en la membrana de las células
de la línea K562 posee afinidad similar por la Tf cuando ésta transporta Al y cuando
porta su ligando fisiológico Fe.
75
Resultadosy Discusión - Capítqu II
II.4 COMPARACIÓNENTRE LOSCICLOS CELULARESDE Tf-Al YTf-Fe
Tal como fue descripto en la Introducción, la incorporación celular de Fe unido
a Tf se realiza a través de la vía clásica mediada por receptores específicos expresados
en la membrana celular. Una vez que la Tf-Fe se ha unido al RTf, el complejo es
endocitado, el Fe se disocia de la proteína y es liberado al citoplasma. La apon
permanece asociada al RTf y es transportada nuevamente a la superficie donde es
liberada, quedando disponible para captar Fe de los sitios de depósito y/o absorción.
Dado que tanto Tf-Fe como Tf-Al poseen capacidad para unirse a los RTf
presentes en la membrana de las células K562, el interrogante que se planteó a partir de
esa observación fue:
¿Cumple el complejo RTf-Tf-Al un ciclo endocítico similar al realizado por RTfTf-Fe en células K562?
Para analizar esta situación, fue diseñada la siguiente experiencia en la cual se
estudió el comportamiento cinético de ambos complejos.
Las células fueron preincubadas en presencia de 125I-Tf-Fe o 125I-Tf-Alpara
permitir la formación de los complejos ligando-receptor respectivos. Una vez removida
la ‘25I-Tf no asociada, las suspensiones celulares fueron sometidas a incubaciones
adicionales a 37°C durante diferentes tiempos para permitir que los complejos
formados en la preincubación prosiguieran con el proceso endocítico.
La actividad de 12SIcorrespondiente a la apon exocitada luego de finalizar el
ciclo intracelular fue medida en el sobrenadante. La discriminación entre la actividad de
¡251internalizada por las células y la que aún permanecía asociada a la membrana fue
realizada mediante un tratamiento con solución ácida que hidroliza la unión Tf-RTf.
Los resultados, que representan el tránsito intra/ extracelular de los complejos
'ZSI-Tf-Fe o 125I-Tf-Al,se muestran en las Figuras II.7 y II.8 respectivamente.
76
Resultados y Discusión - Capítulo II
coO
enO
+ extracelular+ Intracelular+ membrana
Distribuciónde125I-Tf
(%deltotal)Ná OO
0 10 20 30
Tiempo de incubación (mln)
Figura II.7: Cinética del ciclo de endocitosis de Tf-Fe en células K562Las células fueron incubadas en presencia de 125I-Tf-Fedurante 15 min a 37°C. El ligandolibre fue removido por centrifugación. La suspensión celular fue dividida en tres alícuotas,cada una de las cuales fue sometida a una incubación adicional a 37°C durante O, 10 ó 30min. Luego de centrifugar, los sobrenadantes fueron separados y se midió la actividad de'25]presente en el medio (extracelular).La 'ZSI-Tf-Fe unida a la superficie fue disociada de losRTf por tratamiento con solución ácida (pH 2,3) durante 5 min. Luego de centrifugar, sedeterminó la actividad de 'ZSIen los paquetes celulares (intracelular)y la liberada por eltratamiento ácido en los sobrenadantesfirtembrana).Las actividades fueron expresadas comoporcentaje con respecto a la actividad total y gtaficadas en función del tiempo deincubación.
0O
+ extracelular+ IntraceIuIar+ membrana
Distribuciónde125I-Tf
(%deltotal)8s
O 10 20 30
Tlempo de incubación (min)
Figura II.8: Cinética del ciclo de endocitosis de Tf-Al en células K562Las células fueron incubadas en presencia de 'zsI-Tf-Al durante 15 min a 37°C.Posteriormente fueron procesadas tal como se detalló en la leyenda de la Figura II.7. Lasactividades fueron expresadas como porcentaje con respecto a la actividad total y graficadasen función del tiempo de incubación.
En la Figura II.7 puede observarse que la actividad de ¡251intracelular disminuye
con el transcurso del tiempo a medida que la 125I-Tf-Fe,incorporada durante la primera
incubación a 37°C, va completando su ciclo de endocitosis. Paralelamente, la actividad
de ¡251en el medio extracelular aumenta como consecuencia de la 125I-apon liberada
luego de ceder a la célula el Fe transportado.
Las curvas de la Figura II.8, construidas con las medidas de actividad de 125I
obtenidas en las incubaciones de las células con 125I-Tf-Al, presentan un
comportamiento cinético similar al de las correspondientes a 125I-Tf-Fe.
Estos resultados sugieren que la Tf, además de ser capaz de unirse a los RTf
presentes en la membrana de las células K562, podría realizar el ciclo de endocitosis
mediada por receptor independientemente de que el catión transportado por ella sea Fe
oAl.
II.5 INCORPORACIÓN CELULARDE A1MEDIADA POR Tf
Si el RTf es capaz, luego de reconocer y unir a la Tf portando Al, de efectuar un
ciclo endocítico similar al realizado con su ligando fisiológico, es de esperar que en
células crecidas en un medio conteniendo Tf y Al, se produzca acumulación intracelular
de este metal. El interrogante planteado a continuación fue entonces:
¿Ingresa aluminio a las células K562cuando son cultivadas
en presencia de Tf-Al?
Para hallar la respuesta, el contenido celular de Al fue determinado luego de 4
días de cultivo en presencia del metal. Los resultados se muestran en la Figura 11.9.
Resultados y Discusión - Capítulo [I
ContenidodeAl (ng/1o7células)
C AI
Figura II.9: Incorporación celular de A1vía TfLas células fueron cultivadas en presencia o ausencia (C) de Tf-Al 10 pM, durante 96h. Luego de exhaustivo lavado, los paquetes celulares fueron lisados por agregado de aguadeionizada y tres ciclos de congelamiento-descongelamiento. El contenido de Al fuedeterminado en los sobrenadantes por espectrometría de absorción atómica. Seencontraron diferencias significativas (n=10; P<0,001; test de Mann-Whitney) entre losensayos llevados a cabo en presencia de Al con respecto a los controles correspondientesrealizados sin adición del metal.
Los datos presentados en la Figura 11.9demuestran que el Al, agregado al medio
de cultivo conjuntamente con la Tf, pudo ser incorporado a las células K562.
CONCLUSIONES
Í El complejo Tf-Al puede asociarse a las células K562. El RTf expresado en la
membrana de las mismas, posee capacidad para reconocer a la proteína
transportadora Tf, a pesar de que ésta porte Al en lugar de su ligando fisiológico
Fe.
Í Tf-Al se comporta como un competidor de Tf-Fe por la unión a los RTf de
superficie. Como consecuencia, la presencia de Tf-Al provoca una disminución
en la asociación de Tf-Fe relacionada inversamente con la dosis.
J El RTf expresado en la membrana de las células K562 posee similar afinidad
por Tf-Fe y Tf-Al. Las constantes de disociación correspondientes a la unión del
receptor con ambos ligandos son del mismo orden de magnitud, indicando que
79
la proteína transportadora sería reconocida independientemente del catión
ligado.
v/ La interacción de Tf-Al con los RTf no se produciría solamente a nivel de la
superficie celular. El complejo formado cumpliría un ciclo de endocitosis con
una cinética similar a la del ciclo realizado normalmente para incorporar el Fe
necesario para el metabolismo celular.
Í El Al, transportado por Tf, es incorporado a las células K562.
La relación competitiva que se establece entre Tlee y TfiAlpor su
unión a los RTf expresados en la membrana, penm'te sugerir que la presencia
conjunta de ambos complejospodría mterf‘edten 1acaptación celular normalde Fe.
DISCUSIÓN
En el plasma, el Al circula predominantemente unido a Tf, aunque la albúmina y
el citrato contribuirían en menor escala a su transporte (Trapp, 1983; Martin, 1986,
Fatemi el al, 1991). Aunque la Tf tiene capacidad para ligar un átomo de Al a cada uno
de sus dos sitios de unión a metales, su afinidad por Fe es mayor que por Al (Martin,
1986). Consecuentemente, no sería de esperar que el Al compita con Fe por su
transporte. Sin embargo, la saturación normal de Tf con Fe en el plasma humano es de
alrededor de 30%, por lo tanto, la proteína posee abundantes sitios libres para
transportar Al (Wilhelm elal, 1990).
A partir de este concepto, planteamos entonces la importancia de profundizar
en el estudio de la interacción del complejo Tf-Al con los receptores específicos cuando
alcanza el entorno celular y su interferencia en la unión de Tf-Fe a dichos sitios.
Los resultados mostraron que el complejo Tf-Al es capaz de unirse a la
superficie de las células K562 (Tabla II.1). Más aún, Tf-Al compitió con Tf-Fe por la
unión a los RTf de membrana. La inhibición de la unión del ligando trazador 125I-Tf-Fe
fue directamente proporcional a la concentración de Tf-Al presente en el medio
(Figuras 11.1 y 11.2).
80
Para determinar los parámetros que caracterizan la interacción de Tf-Al y Tf-Fe
con los RTf, fueron calculadas las constantes de disociación para los complejos ligando
receptor sobre la base de datos obtenidos en ensayos cinéticos de saturación y
competición. El valor obtenido para la Kd correspondiente a la unión de Tf-Fe al RTf
(1,73x10'9 M) es del mismo orden de magnitud que los determinados previamente por
otros autores en células K562 (Klausner et a/., 1983b: 1,9x10'9 M; Louache et a/., 1984:
2x10'9M; Young 8LGarner, 1990:3,57x10'9
Tanto la naturaleza monofásica de las curvas sigmoideas de la experiencia de
competición (Figura 11.6)como el ajuste a recta del análisis de Scatchard de los datos de
la experiencia de saturación (Figura II.5), indicarían la existencia de una única población
de sitios de unión para Tf. Sin embargo, tal como fue mencionado en la Introducción,
recientemente ha sido descripto el RTf2 (Kawabata el a/., 1999). Debido a que la
afinidad de este receptor por Tf-Fe es, aparentemente, mucho menor que la del RTf
(West et a/., 2000), su existencia no fue puesta de manifiesto en nuestro análisis de
Scatchard ni en los realizados anteriormente por otros autores (Klausner et al, 1983b;
Hunt et a/., 1984; Louache et a/., 1984).
Los ensayos competitivos que permitieron caracterizar la cinética de unión de
Tf-Al a los RTf se basaron en la habilidad de este ligando para restringir la unión de
125I-Tf-Fe.Para llevarlos a cabo, se empleó Tf-Fe o Tf-Al como ligandos no marcados y
‘251-Tf-Fecomo ligando trazador. La observación de las curvas sigmoideas obtenidas en
cada caso (Figura 11.6),sugiere un comportamiento similar de los dos competidores en
lo que respecta a su capacidad de inhibir la unión del ligando trazador. Esta observación
fue corroborada al analizar los datos de cada una de las experiencias de competición. El
análisis demostró que la concentración de Tf-Fe o Tf-Al necesaria para inhibir en un
50% la unión del trazador, o sea, la «dosis efectiva 50», es similar. Los resultados
sugieren que el receptor reconocería por igual a la Tf transportando Fe o Al. Esta
hipótesis fue corroborada por la observación de que ambas interacciones ligando
receptor exhiben constantes de disociación del mismo orden de magnitud (apartado
II.3.c).
81
Resultados y Discusión - Capítulo II
A pesar de la abundancia de trabajos realizados para investigar la toxicidad de
Al, la Kd que caracteriza la unión de Tf-Al al RTf no ha sido determinada por otros
autores en células K562. Morris et al. (1986) compararon la afinidad del RTf expresado
en células de Ia línea de neuroblastoma humano IMR 32 por Tf-Fe y Tf-Al. Los valores
de Kd correspondientes a ambos complejos fueron 1,66 y 2,88 nM, respectivamente.
Dado que las Kd son del mismo orden de magnitud, estas células serían también
capaces de unir e internalizar Al casi tan eficientemente como Fe.
El estudio de los ciclos de endocitosis realizados por Tf-Fe y Tf-Al, una vez
unidos a los RTf de superficie (Figuras II.7 y 11.8),demostró que ambos proceden con
una cinética similar. Por lo tanto, el Al podría ser incorporado a las células K562
mediante el mismo mecanismo por el cual ingresa normalmente el Fe.
La tasa de internalización de los complejos Tf-Fe y Tf-Al demostró ser similar
en células de la línea IMR 32 (Morris et al, 1986). De la misma manera, la cinética de
interacción de ambos complejos a nivel de la membrana de reticulocitos humanos,
también fue similar (Cochran et a/., 1991).
Tal como fue mencionado, se ha encontrado acumulación de Al en diferentes
Órganos y tejidos de animales y pacientes con insuficiencia renal (Wills & Savory, 1983)
e inclusive, en ratas con función renal normal crónicamente expuestas al metal
(Garbossa el a/., 1998b; Vittori et al, 1999). Considerando estos antecedentes y los
resultados obtenidos al estudiar el ciclo celular realizado por Tf-Al en células K562, fue
posible postular que este metal se acumular-ía intracelularmente. Esta hipótesis fue
corroborada por los resultados presentados en la Figura II.9, los cuales muestran la
incorporación de cantidades significativas del metal en células cultivadas en presencia
de Tf-Al.
Resultados similares fueron obtenidos en otros tipos celulares. Reticulocitos de
conejo, células eritroleucémicas Friend y de neuroblastoma (Neuro 2A), cultivadas en
medios que contenían Tf-Al, incorporaron Al en forma proporcional al tiempo de
exposición (Abreo et a/., 1990; Abreo et a/., 1999). Por lo tanto, estas células adquirirían
Al vía endocitosis mediada por receptor. En otras experiencias, la incorporación celular
del metal mostró ser dependiente de la concentración de Tf-Al a la que fueron
expuestos cultivos primarios de oligodendrocitos de rata (Golub et a/., 1996) y de
linfocitos humanos (McGrcgor et a/., 1991).
82
Resultados y Discusión - Capítulo II
Los datos presentados en este capítulo, ponen en evidencia, por primera vez, la
capacidad de Tf-Al no sólo de interactuar con los RTf de membrana de las células
K562 de manera prácticamente idéntica a la de Tf-Fe, sino también, de poder acceder al
compartimiento intracelular a través de un proceso de endocitosis similar. Como
consecuencia, podría producirse acumulación del metal no esencial.
Resultados y Discusión - Capítulo III
CAPÍTULOIII
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LAINCORPORACIÓN DE
HIERRO
III.1 DISMINUCIÓN DE LACAP'I‘ACIÓNTOTAL DE Fe EN PRESENCIA DE Al
Teniendo en cuenta que Fe y Al son transportados por la misma proteína y que
los complejos formados con ambos iones metálicos interaccionan con los receptores
específicos de manera similar, es probable que la presencia de Al en el medio perturbe
la incorporación y/o la utilización normal de Fe en células K562. De hecho, hemos
observado que el Al produce disminución de la síntesis de hemoglobina en estas células
cuando son inducidas a diferenciación eritroide. Considerando que el camino
metabólico de síntesis de hemoglobina está estrechamente relacionado con la
disponibilidad de Fe, se planteó el siguiente interrogante:
¿La captación normal de hierro es afectada por la presencia de aluminio?
La siguiente experiencia fue llevada a cabo para determinar la incorporación
total de Fe en condiciones bajo las cuales podría establecerse una interacción
competitiva entre ambos metales en el entorno celular. Se evaluó, por lo tanto, si el Al
interfiere con la captación de Fe a través de la vía mediada por RTf.
Diferentes trabajos apoyan la idea de que la hemina, una vez ingresada a las
células, aportar-ía parte del grupo hemo necesario para la síntesis de la hemoglobina
(Granick 8: Sassa, 1978). Por esta razón, y con el propósito de utilizar células con
diferentes necesidades del metal esencial, el butirato de sodio fue empleado como
inductor alternativo.
Las células, inducidas o no a diferenciarse durante distintos períodos, fueron
cultivadas con la presencia simultánea de 59Fe-Tf y Tf-Al. La actividad de 59Fe,
correspondiente al metal incorporado bajo cada una de las condiciones de cultivo, fue
medida en los paquetes celulares una vez transcurrido el período de incubación. Los
resultados se presentan en la Figura III.1.
100
4hI24h
Incorporaciónde59Fe
(%delcontrol)
NI+AIINI H+A|IH B+AIIB
Figura III.1: Disminución de la incorporación total de Fe en presencia de A1Células no inducidas o inducidas a diferenciación con hemina o butirato de sodio, fueroncultivadas durante 4 h ó 24 h, en presencia de concentraciones equimolares de Tf-Al y 5(’FeTf (NI+Al, H+Al, B+Al). En cultivos paralelos, se omitió el agregado de Tf-Al (NI, H, B).Luego del período de incubación, las células fueron lavadas y centrifugadas. Laradioactividad fue determinada en los paquetes celulares. Los resultados (MediúSEM,n=5) se expresan como porcentaje de 59Fe incorporado por las células cultivadas enpresencia de Tf-Al con respecto a los controles incubados sin Al.Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas:a) entre cada uno de los ensayos y el valor 100% correspondiente a la actividad medida enlos controles (P<0,05; textde Wilcoxon, ¡tgnedrank text).
b) entre los ensayos de 4 y 24 h correspondientes a cada tratamiento (P<0,05; ter!de MannWhitney).
Los datos presentados en la Figura III.1 muestran que, independientemente del
estado de inducción, la presencia de Al en el medio de cultivo provoca una disminución
significativa del 59Feincorporado por las células.
Las diferencias significativas entre los resultados de los ensayos realizados en
presencia de Al durante 4 y 24 h, tanto en células no inducidas como en las estimuladas
con hemina o butirato de sodio, evidencian una tendencia de aumento progresivo de la
captación de 59Fecon el tiempo de incubación.
III.2 INCORPORACIÓNTOTAL DE Fe LUEGO DE LAREMOCIÓN DE Al
El efecto inhibitorio producido por Al sobre la captación de Fe, podría ser el
resultado de una alteración celular irreversible o involucrar un mecanismo tal que, una
vez eliminada la causa de la interferencia, permita a las células recuperar su condición
normal.
85
Resultadosy Discusión - Capítqu Il]
Por lo tanto, fue importante analizar el siguiente interrogante:
¿La remoción del aluminio del medio revierte su inhibición sobre la captaciónde hierro?
Para estudiar esta situación, las células fueron cultivadas con o sin inductor, en
presencia de Tf-Al durante diferentes tiempos. Finalizado el periodo de inducción, se
realizó un pulso de incorporación de 5"Fe durante el cual la Tf-Al fue mantenida o
removida del medio. Paralelamente, se realizaron cultivos control en ausencia de Al
durante todo el procedimiento. La captación total de 59Fe,determinada bajo cada una
de las condiciones, se representa en las Figuras III.2, III.3 y III.4.
ElAIpresenteI AIremovido
Incorporaciónde59Fe
(%delcontrol)
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.2: Incorporación total de Fe en presencia o luego de la remoción deA1,en células no inducidas a diferenciaciónLas células fueron cultivadas en presencia de Tf-Al durante 1, 3 ó 7 días. Posteriormente,fueron lavadas, resuspendidas en medio RPMI-BSA y divididas en dos poblaciones. Laprimera fue incubada durante 4 h a 37°C sólo con 5OFe-Tf(A! removido)y la segunda, conigual concentración de 5°Fe-Tf y de Tf-Al (Al presente). Las células fueron lavadas,centrifugadas y se midió la radioactividad asociada a los paquetes celulares. Como control,fueron realizados cultivos paralelos en ausencia de Tf-Al durante todo el procedimiento.Los resultados (MediaiSEM, n=5) están expresados como porcentaje de 59Feincorporadoa las células en presencia o luego de la remoción de Ai, con respecto al controlcorrespondiente.Se encontraron diferencias estadísticamente significativas:a) entre los ensayos en los cuales el Al fue removido del medio y aquéllos en los que elmetal estuvo presente durante todo el procedimiento (P<0,05; textde Mann-Whitney).b) en el ensayo en el cual el Al, luego de 7 d de exposición, fue removido antes del pulsocon el trazador, con respecto al valor 100% correspondiente al control (P<0,05; test deWilcoxon, ¡igual rank text).
86
N O o
..¡ UI Ol l l l lll l l ll
ElAIpresenteI AIremovido
Incorporaciónde“Fe
(%delcontrol)
3Q
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.3: Incorporación total de Fe en presencia o luego de la remoción deAl, en células inducidas con herninaLas células fueron estimuladas a diferenciarse con hemina en presencia de Tf-Al durante 1,3 ó 7 días. Luego del período de inducción, fueron lavadas, resuspendidas en RPMI-BSA ydivididas en dos poblaciones. La primera fue incubada durante 4 h a 37°C sólo con 5"Fe-Ti"(A! removido)y la segunda, con igual concentración de 5oFe-Tf y Tf-Al (A! prwente). Laradioactividad asociada a los paquetes celulares fue medida luego de efectuar los lavadoscorrespondientes. Se realizaron cultivos controles en ausencia de Tf-Al durante todo elprocedimiento. Los resultados (MediaiSEM, n=5) se expresan como porcentaje de 5"Feincorporado en presencia o luego de la remoción de Al, con respecto al controlcorrespondiente.Se hallaron diferencias estadísticamente significativas:a) entre los ensayos en los cuales el Al fue removido del medio y aquéllos en los que elmetal estuvo presente durante todo el procedimiento (P<0,05; textde Mann-Whitney).b) en los ensayos en los que el Al fue removido luego de 3 ó 7 d, respecto del valor 100%correspondiente al control (P<0,05; 1er!de Wilcoxon, signedrank text).
0¿'“’ == 150 rm8 .9.
5 g ElAIpresente0 _ .g .3 IAI remowdo9-.\°o V0s
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.4: Incorporación total de Fe en presencia o luego de la remoción deAi, en células inducidas con butirato de sodioLas células fueron estimuladas a diferenciarse con butirato de sodio en presencia de Tf-Aldurante 1, 3 ó 7 dias. Posteriormente, fueron lavadas, resuspendidas en RPMI-BSA ydivididas en dos poblaciones. La primera fue incubada durante 4 h a 37°C sólo con 5"Fe-Tf(Al mmozzído)y la segunda, con igual concentración de 5"Fe-Tf y Tf-Al (A/pmrenle). Se midióla radioactividad asociada a los paquetes celulares. Cultivos paralelos en ausencia de Tf-Aldurante todo el procedimiento fueron realizados como control. Los resultados(Mediai'SEM, n=5) se expresan como porcentaje de 59Fe incorporado a las células enpresencia o luego de la remoción de Al, con respecto al control correspondiente.No se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los ensayos en los cuales elAl fue removido del medio y el valor 100% correspondiente a la actividad medida en loscontroles.
Tal como era de esperar teniendo en cuenta los resultados observados en la
Figura III.1, la permanencia de Al durante las dos etapas de la experiencia (el período
de inducción y el pulso de incorporación), trajo como consecuencia una reducción de la
captación de 59Fecon respecto a las cantidades de trazador incorporadas por las células
cultivadas en ausencia de Al durante todo el procedimiento. Este efecto no fue
modificado por la condiciones de diferenciación celular ni por la duración del
tratamiento previo (Figuras III.2, III.3 y III.4, A/prei'eflte).
88
Resultados y Discusión - Capítulo III
Cuando el Al fue removido del medio durante el pulso de captación de 59Fe,la
incorporación del trazador aumentó. La respuesta fue diferente dependiendo de las
condiciones de inducción y de la duración del período de incubación. Las células no
inducidas, luego de 1 ó 3 días, incorporaron cantidades de 59Fe similares a las de las
cultivadas en ausencia de Al durante todo el procedimiento. Luego de 7 días de
tratamiento previo, dicha captación superó significativamente a la del control respectivo
(Figura III.2). Estos resultados, expresados en términos de velocidad de incorporación
de Fe, evidenciaron un aumento de 47,3i11,2 pg Fe/ 106células/ h por sobre un valor
basal determinado en los cultivos controles de 131,4i17,1 pg Fe/ 106células/ h.
Cuando las células fueron estimuladas a diferenciarse con hemina y el Al fue
removido del medio luego de 1 día, la incorporación del trazador fue regularizada,
alcanzando los niveles del control. Cuando el tratamiento previo con Al fue realizado
durante 3 ó 7 días, la captación de 59Fe,luego de remover el Al, fue significativamente
superior a la de las células cultivadas en ausencia total del metal competidor (Figura
III.3). Este efecto fue similar al observado en los cultivos no inducidos luego de 7 días,
sólo que, en las células estimuladas con hernina se manifiestó más tempranamente. La
expresión de los resultados en términos de velocidad, evidenció un incremento de
29,9i10,5 pg Fe/ 106 células/h por sobre un nivel basal de 99,6i18,7 pg Fe/ 106
células/ h, ya a partir de los 3 dias de tratamiento previo.
Si bien en los cultivos inducidos con butirato de sodio el efecto del Al demostró
ser reversible, la incorporación del trazador 59Feno superó el valor correspondiente a
las células cultivadas en ausencia total del metal (100%), (Figura III.4).
Resultados y Discusión - Capítulo III
III.3 INCORPORACIÓNDE Fe AL HEMO EN PRESENCIA o LUEGO DE LA
REMOCIÓN DE A1
La hemoglobina pertenece a la familia de las hemoproteínas ya que posee hemo
como grupo prostático. Durante el proceso de diferenciación eritroide, se sintetizan
grandes cantidades de hemo y, por lo tanto, el requerimiento de Fe en esta etapa es
mayor.
Teniendo en cuenta que la presencia de Al en el medio de cultivo impidió que
las células incorporaran normalmente Fe, es de esperar que se produzca un efecto
inhibitorio similar sobre la utilización del metal para la síntesis de hemo. Sobre la base
de esta hipótesis, surgió la siguiente pregunta:
¿La incorporación de hierro al hemo es afectada por la presencia de aluminio?
Más aún, de ser afirmativa la respuesta, resultaba interesante investigar si la
remoción de este metal no esencial del medio permitía también a las células recuperar la
capacidad de sintetizar el hemo requerido para cubrir sus necesidades metabólicas. Por
lo tanto, a continuación, se planteó la siguiente pregunta adicional:
¿La remoción del aluminio permite revertir su efecto inhibitorio sobre la
utilización de hierro para la sintesis de hemo?
Para estudiar la respuesta celular en ambas situaciones, fueron utilizadas células
reservadas de los tratamientos realizados para evaluar la incorporación total de 59Fe
(apartado III.2). Los cultivos, inducidos o no a diferenciación eritroide durante
diferentes períodos en presencia de Tf-Al, fueron sometidos a un pulso de captación de
59Fedurante el cual la Tf-Al fue mantenida o removida del medio. La utilización del
metal trazador para la síntesis de hemo bajo cada una de las condiciones, fue evaluada
luego de realizar la extracción orgánica de dicho grupo. Los resultados se presentan en
las Figuras III.5, III.6 y III.7.
90
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0¿‘'“ e 150 a 7 w a w —
s .2.
5 É AIpresente0 _ .g .g IAIremowdoE.\°o V0E
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.5: Incorporación de Fe al hemo en presencia o luego de la remociónde Al, en células no inducidas a diferenciaciónLas células fueron cultivadas en presencia de Tf-Al durante 1, 3 ó 7 días. Posteriormente,fueron sujetas a un pulso de 4 h de incorporación de S913een presencia de 59Fe-Tf, duranteel cual la Tf-Al fue rem0vida (A! removido)o mantenida (A! presente). Las células fueronlavadas, lisadas y se realizó la extracción orgánica del hemo. Se determinó la actividadcorrespondiente al 5"Fe incorporado a dicho grupo. Como control, fueron realizadoscultivos paralelos en ausencia de Tf-Al durante todo el procedimiento. Los resultados(Mediai'SEM, n=5) se expresan como porcentaje de 5oFe incorporado al hemo, enpresencia o luego de la remoción de Al, con respecto a los cultivos controles realizados sinAl.
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas:a) entre los ensayos en los cuales el Al fue removido del medio y aquéllos en los que elmetal estuvo presente durante todo el procedimiento (P<0,05; textde Mann-Whitney).b) entre los ensayos en que el Al fue rem0vido y el valor 100% correspondiente a laactividad medida en los controles (P<0,05; textde Wilcoxon, .rt'gnedrank text).
Resultados y Discusión - Capítulo III
200d)
LL8 Ao 3 150 r'u z
5 É 100 , EIAIpresente0 _ wm WH ,g 3 IAI remowdoO
g a‘ï 50 r0E
0 7
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.6: Incorporación de Fe al hemo en presencia o luego de la remociónde Al, en células inducidas con heminaLas células fueron inducidas a diferenciación con hernina en presencia de Tf-Al durante 1,3 ó 7 días. Posteriormente, se realizó un pulso de incorporación de 5"Fedurante el cual laTf-Al fue removida (Al mmovido)o mantenida (A! patente) en el medio. El hemo fueextraído con ciclohexanona y se determinó la actividad de 5¡’Feincorporado al mismo. Serealizaron cultivos control en ausencia de Tf-Al durante todo el procedimiento. Losresultados (MediaiSEM, n=5) se expresan como porcentaje de 5"Feincorporado al hemo,en presencia o luego de la remoción de Al, con respecto a los controles correspondientes.Se hallaron diferencias estadísticamente significativas:a) entre los ensayos en los cuales el Al fue removido del medio luego de 7 días detratamiento previo y aquéllos en los que el metal estuvo presente durante todo elprocedimiento (P<0,05; textde Mann-Whitney).b) en el ensayo en el cual el Al fue removido luego de 7 d, respecto al valor 100%correspondiente al control (P<0,05; testde Wilcoxon, ¡gned rank text).
0LL3 A
85 g EIA/presente0 _ .g g IAIremowdoE} .\°o V0E
1d 3d 7d
Período de tratamiento previo
Figura III.7: Incorporación de Fe al hemo en presencia o luego de la remociónde Al, en células inducidas con butirato de sodioLas células fueron estimuladas con butirato de sodio en presencia de Tf-Al durante 1, 3 ó 7dias. Luego, fueron sometidas a un pulso de incorporación de 5"Fedurante el cual la Tf-Alfue retirada (Al removido)o mantenida (A/preiente) en el medio. El hemo fue extraido y semidió la actividad del trazador incorporado. Los cultivos control fueron realizados enausencia de Tf-Al durante todo el procedimiento. Los resultados (MediaiSEM, n=5) seexpresan como porcentaje de 5"Fe incorporado al hemo, en presencia o luego de laremoción de Al, con respecto a los controles correspondientes.Se encontraron diferencias estadísticamente significativas:a) entre los ensayos de 1 y 3 días en los cuales el Al fue removido del medio respecto deaquéllos en los que el metal estuvo presente durante todo el procedimiento (P<0,05; ter!deMann-Whitney).b) en los ensayos en los que el Al fue removido luego de 3 ó 7 d, respecto al valor 100%correspondiente al control (P<0,05; ter!de Wilcoxon, ngnm'rank text).
Como puede observarse en las Figuras III.5, III.6 y III.7 (A! preiente), la
presencia de Al provocó disminución de la incorporación de 5"Fe al hemo, tanto en
células inducidas a diferenciarse con hernina o butirato de sodio como en las no
estimuladas. Este efecto posee un patrón similar al observado cuando se analizó la
captación celular total de 59Fe bajo las mismas condiciones (Figuras III.2-III.4, A!
presente),indicando una asociación entre la disminución en la adquisición del catión y su
menor utilización. Mientras el Al permaneció en el medio, las células no pudieron
alcanzar los niveles de biosíntesis de hemo correspondientes a los cultivos realizados en
ausencia total del metal competidor.
93
Cuando el Al fue removido antes de realizar el pulso de captación del trazador,
el comportamiento celular fue diferente dependiendo de las condiciones de inducción
previas. En las células no inducidas (Figura III.5), la incorporación de 59Feal hemo una
vez eliminado el Al, excedió los niveles observados en los cultivos controles realizados
en ausencia del metal durante todo el procedimiento. Esta respuesta fue independiente
de la duración del tratamiento previo con Al.
Normalmente, sólo una pequeña fracción (7-8°/o)del Fe total incorporado por
las células es utilizado en la síntesis de hemo. En los cultivos inducidos con hemina,
este porcentaje se reduce aún más debido a que el inductor aportaría grupo hemo
preformado para la síntesis de hemoglobina (Granick & Sassa, 1978; Hoffman et al,
1980). La actividad neta (cpm) medida en los extractos orgánicos de los ensayos con
hemina fue, en promedio, 7 veces menor que la observada en los cultivos no inducidos,
aunque la expresión de los resultados como porcentaje respecto del control, no permite
ponerlo de manifiesto. La variabilidad de los resultados y, en consecuencia, la magnitud
de los errores (SEM) calculados pueden ser atribuidos a estos valores tan bajos. Los
datos sólo permiten demostrar diferencias significativas luego de 7 días de tratamiento
previo con Al. Sin embargo, es evidente al comparar las barras de la Figura III.6, que la
respuesta celular luego de la remoción de Al del medio es similar a la observada en las
células no inducidas (Figura III.5): la incorporación del trazador al hemo superó a la de
los controles independientemente del tiempo de cultivo previo en presencia de Al.
Las células estimuladas a diferenciarse con butirato de sodio, luego de un día de
tratamiento con Al, evidenciaron un comportamiento similar al de las no inducidas y las
estimuladas con hemina cuando el metal no esencial fue removido previo al pulso de
incorporación de Fe (Figuras III.5-III.7). Sin embargo, transcurridos 3 ó 7 días de
cultivo, la incorporación del trazador al hemo no alcanzó los niveles de los controles, a
pesar de que la captación total de 5"Fefue la adecuada (Figura III.4 y III.7).
94
CONCLUSIONES
J Mientras que el Al se halla presente conjuntamente con el Fe, provoca una
disminución significativa en la incorporación total de este metal esencial. El
efecto observado es independiente del estado de inducción celular así como
también de la duración de la exposición a Al.
Í Luego de la remoción de Al, después de distintos períodos de exposición, se
produce un incremento en la incorporación de Fe. La magnitud de este aumento
depende de las condiciones de inducción y de la duración del período de
incubación previo en presencia de Al. En cultivos de células no inducidas y en
los estimulados con hemina, la captación total de Fe, luego de 7 ó 3 días
respectivamente, excedió al de células control cultivadas en ausencia de Al
durante todo el procedimiento. Cuando las células fueron inducidas con butirato
de sodio, la incorporación de Fe recuperó los niveles del control respectivo sin
llegar a excederlos, resultado que fue independiente del tiempo de tratamiento
previo.
v/ La presencia continua de Al interfiere en la incorporación de Fe al hemo. La
captación y la utilización celular del metal esencial disminuyen en forma paralela.
Este efecto no depende de la condición de diferenciación de las células ni de la
duración del tratamiento previo con Al.
v/ Luego de la exposición a Al, su remoción provoca respuestas diferentes sobre la
síntesis de hemo, dependiendo del estado de inducción celular. La incorporación
de Fe al hemo en los cultivos estimulados con butirato de sodio, expuestos
previamente a Al, no llega a recuperarse totalmente luego de la eliminación del
metal no esencial, a pesar de que la captación total de Fe es normal. En cambio,
en las células no inducidas y en las estímuladas con hemina, la cantidad de Fe
incorporado al hemo supera los valores de los controles respectivos en forma
similar a lo observado en la captación total.
95
Resultados y Discusión - Capítulo III
Tanto Ia incorporación total como 1a utilización de Fe para 1asíntesis
de hemo disminuyen como consecuencia de 1apresencia permanente de A1
en el medio. Sin embargo, 1a respuesta manifestada cuando este meta! es
removido, sugiere la activación de algún mecanismo celular con eipropósito
de compensar Ia disminución de 1adisponibilidad dei Fe requerido para unmetabolismo normal.
DISCUSIÓN
La producción normal de hemoglobina requiere de un aporte adecuado de Fe.
Este metal forma parte del grupo prostático de dicha proteína, el hemo. Aunque
prácticamente todas las células de los mamíferos sintetizan hemo, las cantidades
mayores son producidas durante el curso de la diferenciación eritroide para realizar la
síntesis de hemoglobina. El hecho de que el 85% del hemo en el organismo sea
sintetizado por las células progenitoras eritroides, enfatiza la importancia de su
requerimiento para el proceso eritropoyético.
El efecto inhibitorio del Al sobre la síntesis de hemoglobina (Capítulo I) así
como la interacción competitiva entre Tf-Al y Tf-Fe a nivel de los receptores de
membrana (Capítulo II), permitieron postular que existiría una disminución de la
captación de Fe cuando ambos metales se hallan presentes simultáneamente en el
entorno celular. Corroborando esta hipótesis, los resultados presentados en este
capítulo demostraron una inadecuada incorporación de Fe mientras el Al permanece en
el medio de cultivo (Figuras III.1-III.4). Una perturbación similar ha sido observada
también por varios autores en otros tipos celulares (McGregor et al, 1990; Golub et aL,
1996). En reticulocitos humanos, la presencia de cantidades crecientes de Tf-Al se
relacionó positivamente con el grado de inhibición competitiva de la incorporación de
59Fe(Cochran efal, 1991).
Por otra parte, los resultados permitieron demostrar que la interferencia en la
captación total de Fe provocada por Al involucra un mecanismo reversible y no tóxico,
al menos durante los tiempos de exposición empleados. Esta afirmación surgió a partir
del hallazgo de un rápido incremento en la incorporación de Fe cuando el Al fue
removido luego de diferentes períodos de exposición (Figuras III.2-III.4).
96
Dado que, como consecuencia de la presencia de Al en los cultivos, se produce
una perturbación en la captación de Fe, podría esperarse una respuesta de adaptación
de las células con el objeto de obtener el metal esencial requerido para un metabolismo
normal. La relación observada entre la captación total de Fe y la duración de la
exposición a Al (Figura III.1) aportó un primer indicio en este sentido. Más aún, los
resultados obtenidos cuando el Al fue removido del medio durante el pulso de
incorporación de 59Fe, pusieron en evidencia esa adaptación celular. Bajo estas
condiciones, las células no inducidas y aquéllas estimuladas con hernina, adquirieron
cantidades de Fe mucho mayores que las incorporadas por los controles respectivos
realizados en ausencia total de Al (Figuras III.2 y III.3). En los cultivos estimulados con
butírato de sodio pudo observarse un efecto reversible sobre la captación total de Fe ya
que, cuando el Al fue eliminado, la internalización del trazador alcanzó los niveles de su
control. Sin embargo, estas células, a diferencia de las inducidas con hernina, no
manifestaron el mecanismo de adaptación mencionado, ya que, aún luego de 7 días de
tratamiento, la cantidad de Fe incorporado no superó a la de las células sin
pretratamiento con Al (Figura III.4).
Dado el requerimiento esencial de Fe para la síntesis del grupo prostático hemo,
investigamos el efecto del Al sobre la incorporación de Fe a dicho grupo. Los ensayos
en los cuales ambos metales estuvieron simultáneamente presentes, demostraron que la
menor incorporación total de Fe trae como consecuencia una disponibilidad disminuida
del metal para la biosíntesis de hemo (Figuras III.5-III.7), lo cual conduciría, finalmente,
a la disminución de la síntesis de hemoglobina observada (Figura I.I). Un efecto similar
fue descripto en cultivos de células de médula ósea de rata. Luego de exposición a Al, la
incorporación de 59Feal hemo disminuyó significativamente en relación directa con la
concentración de Al en el medio (Zaman elal, 1990).
El análisis comparativo de las mediciones de actividad de 59Fe total y hémico
(cpm) de los ensayos correspondientes a las Figuras III.2-III.7, condujo a la siguiente
observación: a pesar de que la síntesis de hemo disminuye por la presencia de Al en el
medio, las células no derivan una mayor proporción del Fe incorporado hacia la síntesis
de dicho grupo, ni aún aquéllas inducidas a diferenciación. El porcentaje del Fe total
que fue incorporado al hemo por las células desarrolladas bajo diferentes condiciones,
no fue modificado por la exposición a Al. La relación observada entre los niveles
97
Resultadosy Discusión - Capítqu III
celulares de Fe y la síntesis de hemo apoya la hipótesis propuesta por otros autores de
que la producción de hemoglobina sería controlada por el contenido celular de Fe
(Kawasaki el al, 1996; Ponka, 1999; Wiley & Moore, 2000).
La remoción de Al, previo al pulso de incorporación del trazador, demostró que
la interferencia de ese metal sobre la utilización de Fe es reversible en células no
inducidas y en aquéllas estimuladas con hemina (Figuras III.S y III.6).
En forma similar a lo que ocurre con la captación total, la remoción de Al
evidenció distintos efectos sobre la utilización de Fe dependiendo de la condición
fisiológica de las células. Un efecto irreversible fue observado en los cultivos inducidos
con butirato de sodio. A pesar de que la remoción de Al permitió que los niveles de
internalización de Fe alcanzaran los valores normales (Figura III.4), las células fueron
incapaces de utilizar el metal en la biosíntesis de hemo en niveles adecuados cuando el
período de tratamiento previo con Al fue prolongado (Figura III.7). Estos resultados
sugieren que el efecto inhibitorio del Al en este caso, no sería ejercido solamente a nivel
de la captación de Fe, sino que podría afectar algún paso posterior involucrado en la
transferencia del metal a los sitios de utilización. Esta hipótesis es reforzada por la
observación de que los cultivos inducidos a diferenciación eritroide con butirato de
sodio son los que presentaron mayor inhibición en la síntesis de hemoglobina (61%)
como consecuencia de la presencia de Al en el medio (Capítulo I).
Independientemente del estado de inducción celular, la presencia continua de Al
provoca disminución tanto de la incorporación total como de la utilización de Fe para
la biosíntesis de hemo. La respuesta adaptadva manifestada en células estimuladas con
hemina y en las no inducidas, una vez que el Al fue removido del medio, podría ser
explicada por diferentes mecanismos. Dado que el tratamiento con desferrioxarnina, un
compuesto con capacidad para quelar átomos de Fe, provoca un aumento en el número
de RTf expresados en la membrana celular (Mattia et al, 1984; Casey et al, 1988), es
factible postular una respuesta similar como consecuencia de la exposición a Al. De
hecho, este mecanismo fue propuesto como responsable del incremento significativo
en la captación de Fe, luego de la remoción de Al, observado en células de
neuroblastoma y de la línea eritroleucémica Friend (Abrco et al, 1990; Abreo et al,
1999).
98
CAPÍTULOIV
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LA REGULACIÓN DE LA
EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES PARATRANSFERRINA
IV.1 EXPRESIÓNDEL RTf
La regulación del número de RTf expresados en membrana es mediada por los
niveles intracelulares de Fe. Bajo condiciones de elevado aporte del metal, la expresión
del RTf disminuye. Inversamente, cuando el metal es escaso, un mayor número de RTf
es expresado en membrana.
Las condiciones empleadas en las experiencias descriptas en el Capítulo III, bajo
las cuales la presencia simultánea de 59Fe-Tf y Tf-Al provocó una disminución en la
incorporación del trazador, se asemejarían a una situación de depleción de Fe. Para
explicar el aumento en la captación de Fe observado luego de remover el Al, se postuló
una respuesta celular de aumento en la expresión de los RTf para compensar la menor
incorporación de Fe debida a Al.
Por lo tanto, a continuación nos planteamos como interrogante:
¿La expresión del RTf es regulada positivamente como consecuencia del
tratamiento previo con aluminio?
Para hallar la respuesta, la expresión del RTf fue evaluada desde tres aspectos
diferentes:
a) Determinación cuantitativa del número de RTf a partir de la unión máxima del
ligando trazador 125I-Tf-Fea las células K562 (ensayos cinéticos).
bV Evaluación de los niveles de ARNm del RTf (RT-PCR).
CV Análisis de los niveles de RTf (antígeno CD71) en membrana, por reacción con
el anticuerpo correspondiente (citometría de flujo).
99
IV.1.a)Detemainación cinética del número de RTí
El número total de receptores presentes en la membrana celular, puede ser
calculado matemáticamente si:
- se conoce la constante de afinidad (Ka) por su ligando y
- se determina la concentración de complejos ligando-receptor correspondiente
al equilibrio de la unión.
En el Capítulo II, hemos calculado la Kd (1/ Ka) que caracteriza la unión entre
el RTf de las células K562 y la 125I-Tf-Fe. Por lo tanto, y para determinar la
concentración de complejos RTf-Tf una vez alcanzado el equilibrio de unión, se
realizaron ensayos cinéúcos de asociación del radioligando a los receptores en función
del tiempo.
El efecto del Al sobre el número de RTf fue evaluado en células cultivadas
previamente en presencia del metal.
sin pretra tar prctra tadas con A1
Número de2 . .
RTf/célula 36 000 264 OOO
:l: DE i- 11.3OO i 9900
Tabla IV.1:Efecto del A1sobre el número de RTf en membranaLas células, suspendidas en RPMI-SFB-PE, fueron cultivadas durante 72 h en presenciafl>retratadarcon A!) o ausencia de Al (Jin pretratar). Posteriormente, fueron incubadas enRPMI-BSA durante 30 min a 37°C con el objeto de desocupar los RTf de membrana.Luego de ser resuspendidas en medio fresco, las células fueron incubadas con 125I-Tf-Fedurante diferentes tiempos a 0°C. La actividad de 125Iasociada a los paquetes celulares y ladel testigo de actividad total agregada, fueron determinadas y expresadas comoconcentración molar de complejos ligando-receptor y de radioligando total,respectivamente (ec. [1], Materiales y Métodos). Se determinó la concentración decomplejos ligando-receptor correspondientes al equilibrio de la unión, analizando las curvasde asociación (time-course)con el programa Graph Pad Prism. El número de RTf fuecalculado utilizando la ecuación [3] de Materiales y Métodos.
100
El número de RTf expresados en la membrana de las células K562, determinado
a través de esta metodología (2,4-2,6 x105/célula), es similar al reportado por otros
investigadores (Klausner et a/., 198321: 1,6x105/ célula; Klausner et al, 1983b:
1,5x105/ célula; Hunt etal, 1984: 2,0x105/ célula).
Los resultados indican que, cuando las células fueron crecidas durante 72 h en
un medio suplementado con Al, el número de RTf presentes en la membrana celular
fue un 12% mayor que el determinado en las células cultivadas en ausencia del metal
(P<0,05; testde Mann-Whitney).
Cabe aclarar que la cuantificación de los RTf a través de esta metodología,
presenta la limitación de suponer que la afinidad del receptor no es modificada como
consecuencia del tratamiento previo con Al.
IV.1.b)Evaluación de los niveles de ARNm del RTt'
Tal como fue descripto en la Introducción, la regulación de la expresión del RTf
se produce post-transcripcionalmente. La tasa de degradación y, por lo tanto, la vida
media de su ARNm, es regulada mediante la interacción entre las secuencias IRE
localizadas en el mensajero y proteínas IRP que «sensan» los niveles intracelulares de
Fe.
El pool citoplasmáúco del metal esencial podría disminuir como consecuencia de
la interacción competitiva entre Tf-Fe y Tf-Al en la membrana, desencadenando la
respuesta fisiológica. Por otra parte, el Al podría interactuar con las IRP e interferir en
el mecanismo que regula los niveles de ARNm del RTf, ya que se demostró que el
metal puede acceder a las células a través de la vía mediada por Tf (Capítulo II).
Para investigar los efectos probables del Al, la expresión del ARNm del RTf fue
analizada por RT-PCR en células inducidas o no a diferenciación eritroide y cultivadas
durante diferentes períodos en presencia del metal.
101
abcdenga;
RTf 1052pb hfl
GAPDHüüuüüüü 24opb
Figura IV.1:Efecto del A1sobre los niveles de ARNm del RTfLas células fueron inducidas o no (NI) a diferenciarse con hemina (H) o butirato de sodio(B). El efecto del Al fue analizado en cultivos similares realizados en presencia de TfAl 10pM durante 3 ó 7 días (NI+Al, H+Al, B+Al). Paralelamente, células K562 fueroncultivadas en medio conteniendo desferrioxamina (Df) durante 24 h. Se extrajo el ARNtotal y, luego de efectuar la transcripción reversa del ARNm, los correspondientes al RTf yal estándar interno GAPDI-l fueron amplificados por PCR utilizando prime” específicos. LaFigura muestra los resultados representativos de 5 ensayos independientes, luego de 7 díasde tratamiento previo con Al.Líneas: a, NI; b, NI+Al; r, I-l; a’,H+Al; e, B; fi B+Al; g, Df; M, marcador de pares debases.
Los resultados presentados en la Figura IV.1 muestran que, independientemente
del estado de inducción celular, la exposición a Al durante 7 dias no produjo cambios
en los niveles del ARNm del RTf (líneas a vs. b, cvs. a',e vs. Tampoco se observaron
modificaciones al cabo de 3 días de tratamiento previo.
Sin embargo, se detectaron variaciones entre las diferentes condiciones de
inducción. El nivel de ARNm fue claramente menor en las células en que el butirato de
sodio fue utilizado como agente diferenciador que en las no inducidas o en las
estimuladas con hemina (línea e vs. a y t).
102
Con el objeto de verificar la respuesta de la expresión del RTf a los niveles de
Fe, fueron realizados cultivos en presencia de un compuesto quelante del metal, Df.
Pudo observarse claramente la modulación positiva de los niveles del ARNm del
receptor, de acuerdo al mecanismo descripto que regula la síntesis de RTf en función a
la disponibilidad de Fe (linea g vs. a).
IV.1.c)Análisis de Ios nívdes de RTfpot citometría de flujo
La expresión del RTf (antígeno CD71) fue analizada por citometría de flujo en
células previamente inducidas o no a diferenciación erittoide y cultivadas en presencia
de Al durante diferentes períodos. Por una parte, se estudiaron los niveles de expresión
en la membrana celular y, por otra, el contenido total de receptores.
2000
1500
1000
500
Intensidaddefluorescencia
(unidadesarbitrarias)
NI NI+AI NI+AI H H+Al H+Al B B+AI B+Al3d 7d 3d 7d 3d 7d
Figura IV.2: Efecto del Al sobre la expresión en membrana del RTfLas células fueron inducidas o no (NI) a diferenciarse con hemina (H) o butirato de sodio(B). Los cultivos se realizaron con células sin tratar o tratadas previamente con Tf-AJ 10pM (+Al)durante 3 (n=8) ó 7 días (n=4). Las células, suspendidas en PBS-BSA, fueronincubadas con anti-CD71 humano durante 30 min a 0°C. Luego de remover el anticuerpono unido, fueron incubadas durante 30 min adicionales a 0°C con anti-IgG de ratón-FITC.La intensidad de fluorescencia fue analizada por citometría de flujo y expresada en unidadesarbitrarias de fluorescencia.
103
Resultados y Discusión - Capítulo I V
No inducidas Inducidas con Inducidas conhemina butirato de sodio
Sin Al Con A1 Sin A1 Con A1 Sin Al Con A1
RTf ensuperficie 1649 1731 1742 1654 1389 1318
(*)
¡”fatales 2539 2437 2494 2484 2311 2356
Tabla IV.2: Efecto del A1sobre el nivel de RTf total (membrana + citoplasma)En un ensayo, las células cultivadas bajo las condiciones detalladas en la Figura IV.1durante 3 días, fueron divididas en dos alícuotas. La primera fue procesada para determinarla expresión de RTf en membrana. Las células de la segunda, fueron fijadas, lavadas ypermeabilizadas por tratamiento con saponina. Las incubaciones con el primer (anti-CD71)y el segundo anticuerpo (anti-IgG de ratón-FITC), fueron realizadas durante 30 min atemperatura ambiente. La intensidad de fluorescencia fue determinada por citometría deflujo y los niveles de RTf, expresados en unidades arbitrarias de fluorescencia (*).
Las reacciones inmunes realizadas a 0°C muestran que los niveles de expresión
en membrana del RTf no fueron afectados por el tratamiento previo de las células con
Al en ninguno de los tiempos ensayados. Sin embargo, se observaron variaciones entre
las diferentes condiciones de inducción. La expresión del RTf en la superficie fue
significativamente mayor en las células no inducidas y en las estimuladas con hemina
que en aquéllas en que fue utilizado el butirato de sodio (P<0,01; textde Kruskal-Wallis),
pero no se observaron cambios debido a la exposición a Al (Figura IV.2).
El nivel de expresión del RTf fue diferente bajo distintas condiciones de
inducción celular. Las células estimuladas a diferenciación eritroide con butirato de
sodio, exhibieron un número de receptores marcadamente inferior respecto al de las no
inducidas o de aquéllas estimuladas con hemina (Figura IV.2). El comportamiento
particular de las células inducidas con butirato de sodio podría tener relación directa
con otras características distintivas manifestadas por ellas: disminución de la tasa de
crecimiento celular, mayor inhibición de la síntesis de hemoglobina debida a la
presencia de Al (Capítulo I) e irreversibilidad del efecto del A1sobre la utilización de Fe
para la síntesis de hemo (Capítulo III).
104
Resultados y Discusión - Capítulo IV
Considerando en conjunto los resultados de las Figuras IV.1 y IV.2, puede
comprobarse que existe una relación directa entre los niveles de ARNm y de proteína
expresada en membrana.
Cuando las reacciones inmunes fueron desarrolladas a temperatura ambiente y la
entrada de los anticuerpos fue facilitada por la permeabilización celular, pudieron
evaluarse conjuntamente los RTf intracitoplasmáticos y los expresados en membrana.
En este caso, independientemente de las condiciones de inducción empleadas, los
niveles totales del receptor tampoco fueron afectados por la exposición a Al (Tabla
IV.2). En el mismo ensayo, pudo observarse que los RTf expresados en membrana
corresponden, aproximadamente, al 60-70% de los receptores totales, distribución que
no fue modificada por el tratamiento previo con Al.
IV.2 EXPRESIÓNDELRsz
No habiendo encontrado las variaciones en la expresión en membrana del RTf
que hubieran permitido explicar el aumento en la captación de Fe luego del tratamiento
con Al (Capítulo III) y dado que las células K562 expresan el RTf2, se planteó el
siguiente interrogante:
¿Es la expresión del RTfZregulada positivamente como consecuencia del
tratamiento previo con aluminio?
Debido a su reciente descripción, no se encuentra comercialmente disponible el
anticuerpo anti-RTfZ humano. Por lo tanto, el análisis de su expresión en células
inducidas o no a diferenciación eritroide y cultivadas durante diferentes períodos en
presencia de Al, fue realizado a través del estudio de los niveles de su ARNm por RT
PCR.
105
Resultados y Discusión - Capítulo I V
abcdeng
GAPDH 240 pb
Figura IV.3: Efecto del Al sobre los niveles de ARNm del RTf2Las células fueron inducidas o no (NI) a diferenciarse con hemina (H) o butirato de sodio(B). El efecto del Al fue analizado en cultivos realizados en presencia de TfAl 10 pMdurante 3 ó 7 días (NI+Al, H+Al, B+Al). Paralelamente, fueron procesadas célulascultivadas durante 24 h con Df. Se extrajo el ARN total y, luego de efectuar la transcripciónreversa del ARNm, los correspondientes al RTf2 y al estándar interno GAPDH, fueronamplificados por PCR utilizando primer: específicos. La Figura muestra los resultadosrepresentativos de 5 ensayos independientes luego de 7 días de tratamiento previo con Al.Líneas: a, NI; b, NI+Al; c, H; a', H+Al; e, B; j; B+Al; g, Df; M, marcador de pares debases.
El análisis de los resultados presentados en la Figura IV.3, demuestra que los
niveles de ARNm del RTf2 no fueron modificados como consecuencia del cultivo de
las células en presencia de Al. Este comportamiento fue independiente de las
condiciones de inducción celular así como también, de la duración del período de
exposición a Al (líneas a vs. b, avs. a',evs.
Al igual que lo observado con el RTf, los niveles de ARNm del RTf2 son
menores en las células inducidas a diferenciación eritroide con butirato de sodio
respecto de aquéllas no inducidas o estimuladas con hemina (línea e vs. a y c). Sin
embargo, a diferencia del RTf, el cultivo celular en condiciones de depleción de Fe no
provocó incremento alguno en los niveles de ARNm del RTf2 (líneag vs. a).
106
CONCLUSIONES
Í Los análisis basados en ensayos cinéticos sugieren un aumento del número de
receptores en membrana como consecuencia de la exposición celular a Al.
v/ Independientemente de la condición de inducción celular, el tratamiento previo
con Al no provoca modificaciones en los niveles antigénicos totales del RTf ni
en el de aquéllos que son expresados en membrana.
Í Los niveles de expresión del ARNm del RTf y del RTf2 no son modulados por
la presencia de Al en el entorno celular.
La disminución de la incorporación de Fe debida a Iapresencia de A!
en e! medio no produce regulación positiva de Ia expresión de los receptores
para Tf,‘ya sea a nivel de proteina (RT!) como de ARNm (RTi'y RTE). La
discrepancia observada entre estos resultados y los obtenidos en 1a
determinación cuantitativa del número de receptores mediante ensayos
cinéticos,permite sugerir que el tratamiento previo con Alpodria aumentar
1aafinidad del RTi'por Ti:
DISCUSIÓN
Los resultados presentados en el Capítulo III condujeron a postular que la
presencia de Al en el medio actuaría de alguna manera sobre los mecanismos que
regulan la homeostasis celular de Fe. Se supuso que la disminución en la captación de
este metal esencial, inducida por Al, podría desencadenar una adaptación de las células
con el objeto de compensar la carencia de Fe. La hipótesis más probable para explicar el
comportamiento observado era la de una regulación positiva del número de sitios de
unión para Tf expresados en membrana.
Sin embargo, a partir de los resultados presentados en este capítulo, esta
hipótesis debió ser rechazada. A pesar de que la depleción del metal esencial por
tratamiento con desferrioxamina provocó el incremento esperado en la expresión del
RTf, el cultivo celular en presencia de Al por períodos de hasta siete días, no indujo
modificaciones significativas de los niveles de ARNm del receptor (Figura IV.1).
107
Resultados y Discusión - Capítulo IV
Concordantemente, la cantidad de sitios antigénicos de la proteína tampoco mostró
variaciones significativas por la exposición a Al (Figura IV.2 y Tabla IV.2).
Dado que las células de la línea K562 expresan RTfZ (Kawabata et a/., 2000),
consideramos también la posibilidad de que el Al pudiera interferir con la expresión de
este nuevo sistema de incorporación de Fe transportado por Tf. El análisis de los
niveles del ARNm de este receptor, nuevamente arrojó resultados negativos. No se
encontraron diferencias significativas en células cultivadas en presencia de Al durante
diferentes períodos, respecto de las controles desarrolladas en ausencia del metal no
esencial (Figura IV.3).
La modificación del número de RTf, como consecuencia de la exposición a Al,
detectada mediante ensayos cinéticos (Tabla IV.1) no sería consistente con los
resultados obtenidos al estimar los receptores de membrana a través de un método
inmunológico (Figura IV.2). En el primer caso, el número de sitios de unión para Tf fue
calculado empleando una ecuación matemática que incluye como dato la constante de
afinidad (Ka) del RTf por Tf-Fe. Los resultados presentados en la Tabla IV.1 fueron
obtenidos utilizando el valor de Ka determinado en el Capítulo II, considerándolo
invariable para ambos cálculos. A partir de la discrepancia observada se puede sugerir
que el tratamiento previo con Al incrementa la afinidad del receptor por su unión a Tf.
Por lo tanto, el número de RTf calculado para las células expuestas al metal no esencial,
podría haber sido sobrestimado.
Otros trabajos han sido realizados para evaluar la posible modificación de la
expresión del RTf por efecto del Al, aunque los resultados son dispersos y, en algunos
casos, contradictorios (Abreo et a/., 1990; McGregor et a/., 1990; Cochran ef al, 1991;
Golub et a/., 1996). Respecto a1 RTf2, sólo ha sido reportado que su afinidad es
veinticinco veces menor que la del RTf (West et a/., 2000), pero no hay antecedentes de
factores que pudieran modificarla.
Considerando en conjunto los resultados obtenidos a1estudiar la expresión de
ambos receptores: RTf y RTf2, podemos descartar que el efecto producido por Al
sobre la captación de Fe (Capítulo III) sea consecuencia de una regulación positiva de la
expresión de los sistemas de incorporación del metal esencia] dependientes de Tf. La
respuesta celular podría ser, al menos en parte, atribuida a un incremento en la afinidad
de alguno de los receptores de Tf.
108
Resultados y Discusión - Capítulo V
CAPÍTULO V
EFECTO DEL ALUMINIO SOBRE LA INCORPORACIÓN DE
HIERRO INDEPENDIENTE DE TRANSFERRINA
V.1 REGULACION POSITIVA DE LAVÍA ALTERNATIVA DE INCORPORACIÓN
DE Fe DEBIDO ALTRATAMIENTO PREVIO CON Al
A pesar de que aún existe controversia acerca de la función biológica y la
regulación de los mecanismos involucrados en la captación de Fe independiente de Tf,
se conoce su existencia en la línea celular K562 (Inman 8a Wessling-Resnick, 1993;
Conrad et a/., 1994).
Dado que el aumento en la intemalización de Fe, producido como consecuencia
de la exposición a Al, no pudo ser explicado por una adaptación celular que condujera a
la modulación de la expresión de los receptores de Tf, surgió como interrogante:
¿Es posible que el aluminio regule positivamente la incorporación de hierro por
la vía independiente de T1?
Para analizar si la exposición a Al afecta esta ruta de captación de Fe, fueron
utilizados cultivos de células tratadas previamente con Al bajo diferentes condiciones de
inducción. El pulso de incorporación de 59Fefue realizado una vez removido el metal
no esencial, en un medio en el cual el suero fetal bovino fue reemplazado por albúmina,
con el Objeto de garantizar la ausencia de Tf. De esta manera, el metal trazador sólo
puede ingresar a las células a través de la/ las proteínas transportadoras que median la
vía alternativa de captación de Fe.
109
NOO
A UIo l
ElAI 3dIAI 7d
Incorporaciónde59Fe
(%delcontrol)UI3 oo
NI+AIINI H+A|IH B+AIIB
Figura V.1: Regulación positiva de la incorporación de Fe independiente de Tfpor A1Las células fueron inducidas o no a diferenciarse con hemina o butirato de sodio. Los
cultivos fueron realizados empleando células cultivadas previamente en medio conteniendoAl y Tf durante 3 ó 7 días.Luego del período de inducción, el medio de cultivo original (RPMI-SFB-PE), fuereemplazado por RPMI-BSA. Las células fueron incubadas en presencia de 59Fe-citrato 0,5pM durante 2 h a 37°C. Posteriormente, el trazador libre fue removido y se midió laactividad de 59Fepresente en los paquetes celulares. Los resultados (MediaiSEM, n=6) seexpresan como porcentaje de S"Feincorporado por las células expuestas previamente a Al(NI+Al, H+Al, B+Al) con respecto a controles cultivadas en ausencia del metal (NI, H, B).Se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre I-I+Al/ H (3 dias) y NI+Al/ NI(7 días), con respecto al 100% de la actividad incorporada en los controles (P<0,01; lei! deWilcoxon, agria! rank text).
Los resultados presentados en la Figura V.1 muestran que el contacto previo
con Al afectó la incorporación de Fe por la vía independiente de Tf. Este efecto fue
diferente dependiendo del estado de diferenciación celular y de la duración del período
de exposición al metal no esencial.
Las células no inducidas a maduración eritroide (NI+Al/NI) evidenciaron un
aumento significativo en la captación de Fe luego de ser expuestas a Al por períodos
prolongados. La velocidad media de incorporación del trazador a través de esta vía fue
de 56,5i8,1 pg Fe/ 10" células/ h. Luego de 7 días de tratamiento previo con Al, se
observó un aumento significativo de 30,0i7,2 pg Fe/ 10“células/ h.
llO
Un efecto más pronunciado y de aparición más temprana, se manifestó en las
células estimuladas con hemina (H+Al/ H). En la Figura V.1 puede observarse un
incremento significativo en la incorporación de Fe independiente de Tf ya a los 3 dias
de contacto previo con Al. En estas células, la velocidad media de incorporación fue de
58,9i9,7 pg Fe/106 células/h, la cual se incrementó en 21,0i3,6 pg Fe/ 106 células/ h
transcurridos 3 dias de exposición a Al.
Las células inducidas a diferenciación eritroide con butirato de sodio (B+Al/ B),
mostraron un comportamiento totalmente diferente al de las anteriores.
Independientemente de la duración del período de tratamiento previo con Al, la
cantidad de Fe incorporado por estas células a través de la vía alternativa no fue
modificada significativamente con respecto a aquéllas cultivadas en ausencia del metal
no esencial.
V.2 ESTUDIO DE LA REGULACIÓN DE LA VÍA ALTERNATIVA DE
CAPTACIÓNDE Fe
El efecto producido por el tratamiento previo con Al sobre la captación de Fe
independiente de Tf, podría ser el resultado de un mecanismo utilizado por las células
para compensar la menor incorporación del metal esencial a través de la vía clásica
mediada por receptores. Por lo tanto, la pregunta que surgió a continuación fue:
¿La captación de hierro independiente de Tf es regulada por la disponibilidaddel catión?
Para poder responder a este interrogante, la incorporación de 59Fepor la vía
alternativa fue analizada empleando células cultivadas previamente bajo diferentes
condiciones de disponibilidad del metal esencial. Por un lado, fueron utilizadas células
crecidas en medio rico en Fe y, por otro, células desarrolladas bajo condiciones de
depleción del metal (por tratamiento con un compuesto quelante de Fe, Df).
lll
. . Inco oración de 59FeTratamiento prevro rP
(cpm)
Sin tratamiento 2110/1610-2830
Df 100 pM 1780/1730-2250
Fe3+ 100 HM 37000/30500-44100 a
Tabla V.1: Incorporación de Fe independiente de Tf en células tratadaspreviamente con Df o FeLas células fueron cultivadas durante 24 h en RPMI-SFB-PE, en presencia de FeCl3 100pM o Df 100 uM. Posteriormente, fueron lavadas y resuspendidas en medio libre de Tf(RPMI-BSA). La incorporación de Fe fue determinada incubando 5x10ó célulascorrespondientes a cada tratamiento, con 59Fe-citrato 1 pM durante 2 h a 37°C. Lassuspensiones celulares fueron lavadas y se midió la actividad de 59Fe presente en lospaquetes celulares. Los resultados se expresan como Mediana/ Rango de 3 ensayosindependientes.
a Diferencias significativas con respecto a la actividad de 5"Feincorporada por las célulassin tratamiento o tratadas con Df (P<0,01; textde Mann-Whitney).
La Tabla V.1 muestra la cantidad del trazador 59Feque fue incorporado durante
un pulso de 2 h, a través de la via independiente de Tf, por células cultivadas
previamente bajo diferentes condiciones de disponibilidad de Fe.
Los resultados obtenidos demuestran que los cultivos realizados en medio con
elevada concentración de Fe incorporaron una cantidad significativamente mayor del
trazador con respecto a los controles cultivados en medio estándar (Sin tratamiento).
Cuando las células fueron desarrolladas bajo condiciones de depleción de Fe,
por adición del compuesto quelante del metal Df, la captación del trazador no
disminuyó significativamente con respecto a la de las cultivadas en condiciones de
aporte normal del metal esencial.
Estos resultados sugieren que condiciones de carencia de Fe no regulan
positivamente su tasa de incorporación a través de la vía independiente de Tf mientras
que, niveles elevados del metal, inducen un aumento significativo de la actividad de esta
ruta de transporte.
Distintos autores concuerdan en atribuir al mecanismo de incorporación de Fe
independiente de Tf la función primaria de remover del medio las moléculas del metal
potencialmente tóxicas (Kaplan et al, 1991; Randell el 41,1994, Conrad et 41., 1994,
112
Olakanmi et al, 1997). Con el objeto de analizar si este mecanismo cumple una función
biológica similar en nuestra línea celular, se realizaron ensayos de captación de 59Feen
los cuales el trazador se hallaba presente simultáneamente con diferentes
concentraciones de Fe no marcado en el medio.
Incorporación de “Fe(ng Fe/ 106células/ h)
C l
(Sanïgregado) 0,049/0,035-0,058 a
F 3+
23 ILM 0,112/0,070-O,160 “7b
Fe3+ a b
200 “M 2,836/1,742-4,016 ’
Tabla V.2: Efecto de la concentración de Fe3+ sobre la vía de captaciónindependiente de TfLas células fueron lavadas para remover el SFB del medio de cultivo y resuspendidas enRPMI-BSA, sin agregado de apon. Alícuotas conteniendo 5x106 células fueron incubadascon 5gFe-citrato 0,5 ¡1Mdurante 2 h a 37°C en presencia de: FeCl3 20 uM ó 200 pM. Luegodel pulso de incorporación, las suspensiones celulares fueron lavadas, centrifugadas y semidió la actividad de 5l’Fe presente en los paquetes celulares. Los resultados(Mediana/ Rango de 4 ensayos independientes), expresan la velocidad de incorporación deltrazador.
a’b Diferencias significativas (P<0,05; textde Kruskal-Wallis).
Los resultados presentados en la Tabla V.2 muestran claramente la existencia de
una relación directa entre la concentración de Fe extracelular y la tasa de incorporación
del trazador a través de la vía no mediada por Tf.
El análisis estadístico de los datos evidenció que la captación de 5‘7Feen las
células control difiere significativamente de la de aquéllas en las que el pulso de
incorporación fue realizado en presencia de Fe, sin marca radioactíva, en concentración
final 20 ó 200 uM. Por otra parte, la comparación de los resultados obtenidos con las
dos concentraciones de iones férricos ensayadas, también arrojó diferencias
significativas entre ellos.
Por lo tanto, puede concluirse que la incorporación del trazador se incrementa
con concentraciones crecientes de Fe en el medio de cultivo.
113
Resultados yDt'scusión - Capítulo V
V.3 INCORPORACIÓN DE Fe A TRAVÉS DE LA VÍA ALTERNATIVA EN
PRESENCIA DE Al
Trabajos realizados en distintas líneas celulares han reportado que la captación
de Fe independiente de Tf puede ser parcialmente bloqueada por algunos metales de
transición di o trivalentes (Sturrock el al, 1990; lnman & \\’"'cssling-Rcsnick, 1993;
Conrad ('l z//., 1994; Atrieh r/ (l/., [999).
Considerando además nuestra observación de que el Al, cuando es transportado
por Tf, compite con el Fe por el acceso a las células a través de la ruta de
internalización mediada por RTf, cabe preguntarse entonces:
¿El aluminio bloquea la incorporación de hierro a través de la vía no mediada
por receptores?
Con el objeto de analizar el efecto del Al sobre este mecanismo, se realizaron
ensayos en los cuales se determinó la captación celular de 5"Fe independiente de Tf,
realizando un pulso de incorporación del trazador con la presencia simultánea de citrato
de Al, en concentración 40 veces mayor que la de Fe.
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0su. 1500«0'U
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SÍHAI conAl
Figura V.2: Captación de Fe por la vía independiente de Tf en presencia de A1Células K562, mantenidas en fase logaritmica de crecimiento, fueron lavadas yresuspendidas en RPMI-BSA, sin agregado de apon. Alícuotas conteniendo 5><10úcélulas,fueron sometidas a un pulso de incorporación de 5"Fedurante 2h a 37°C con 5"Fe-citrato0,5 ¡.LM(JinA1). El efecto del Al fue analizado en ensayos paralelos realizados en presenciade citrato de Al 20 ¡1M (mn Al). Luego del pulso de incorporación, las suspensionescelulares fueron lavadas y se midió la actividad de nge presente en los paquetes celulares.Los resultados se expresan como MediaiSEM de 7 ensayos independientes.
114
ResultadosyDiscusíón - Capítqu V
Los datos presentados en la Figura V.2 demuestran que la presencia de Al
durante el pulso de 59Fe,aún en concentración 40 veces superior a la del trazador, no
produjo variaciones significativas sobre los niveles de captación del radioligando a
través de la vía alternativa.
Estos resultados sugieren que este mecanismo de internalización de Fe no sería
compartido con el Al. Por lo tanto, la presencia simultánea de los dos metales en el
medio, no generaría una competencia entre ambos por su incorporación a las células
K562.
V.4 INCORPORACIÓNCELULARDE A1No MEDIADAPOR Tf
Si bien el Al parece no compartir la vía de captación de Fe no mediada por Tf,
existe la posibilidad de que, de la misma manera que diversos mecanismos median la
internalización celular de Fe, el Al pueda también ser incorporado a través de alguna
ruta no mediada por Tf.
Por lo tanto, se planteó la siguiente pregunta:
¿Puede el aluminio ingresar a las células K562por alguna
vía independiente de Tí?
Para analizar este interrogante, fue evaluado el contenido celular de Al en células
cultivadas bajo condiciones en las cuales no existe Tf disponible para vehiculizar al
metal.
AlIncorporado(ng/107células)
NUOO
.n O
C AI Al * Tf
Figura V.3: Incorporación celular de A1no mediada por TfLas células fueron cultivadas durante 96 h en RPMI-BSA conteniendo citrato de Al 100
uM, sin agregado de apon Ml). Paralelamente, fueron procesadas células desarrolladas enausencia de Al (C) y células cultivadas en RPMI-SFB-PE, con agregado de citrato de Al 100¡1M y apon humana (A/+Tj). Posteriormente, las células fueron lavadas y lisadas. Elcontenido de Al fue determinado en los sobrenadantes por espectrometría de absorciónatómica. Los resultados se expresan como MediaiSEM de 4 ensayos independientes.Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (P<0,05; test de Kruskal-Wallis)entre el grupo Al y los grupos C y Al+Tf.
Los resultados presentados en la Figura V.3 demuestran que las células K562
pueden incorporar Al aún en ausencia de Tf, cuando éste se halla presente en el medio
de cultivo en la forma de un complejo soluble, de bajo peso molecular. El contenido de
Al fue significativamente mayor en las células desarrolladas en presencia de citrato de Al
(Al), respecto del de las controles (C). Debido a que bajo estas condiciones no existe Tf
disponible para realizar la vehiculización del metal, es evidente que otro mecanismo de
transporte, no mediado por RTf, estaría interviniendo para facilitar la internalización de
Al. Cuando los cultivos fueron realizados en RPMI-SFB-PE, con agregado de citrato de
Al y apon (AMM, la incorporación del metal fue aún mucho mayor. Bajo estas
condiciones, el Al podría unirse a la proteína transportadora y, tal como lo hemos
demostrado en el Capítulo II, ingresar a las células a través de los receptores específicos
de membrana. Simultáneamente, el metal no unido a Tf, podría ser incorporado por
otra ruta. La marcada diferencia en el contenido celular de Al entre los cultivos
desarrollados en presencia (AND) o ausencia de apon (Al), demuestra la
preponderancia de la vía mediada por Tf para efectuar la captación de Al.
116
CONCLUSIONES
J La vía alternativa de incorporación de Fe en células K562 no es regulada por
condiciones de depleción del metal esencial. Sin embargo, la actividad de este
mecanismo aumenta en función directa con la concentración extracelular del
catión. El cultivo celular en medio enriquecido en Fe regula positivamente la
captación del metal por la ruta alternativa.
Í La exposición celular a Al induce regulación positiva de la vía de incorporación
de Fe independiente de Tf. El efecto producido varía dependiendo de las
condiciones de inducción celular y de la duración del período de contacto previo
con el metal.
Í La captación de Fe por la vía alternativa no es bloqueada por la presencia de Al.
Esta ruta de transporte no sería compartida por ambos metales.
/ El Al es capaz de ingresar a las células K562 a pesar de no ser transportado por
Tf.
E1 cultivo de células K562en presencia de Al induce alteraciones en 1a
captación de Fe a través de 1a via independiente de Tf.’A pesar de que este
mecanismo de incorporación no es compartido por los dos metales y no
parece ser regulado por condiciones de depleción de Fe, e]Al inducida una
regulaciónpositiva del mismo.
DISCUSIÓN
Las células de la línea eritroleucémica K562 poseen capacidad para incorporar
Fe a través de dos tipos de mecanismos. Por un lado, expresan receptores específicos
para Tf, los cuales participan en la vía clásica considerada, durante mucho tiempo,
como la única que permitía a las células satisfacer sus requerimientos metabólicos del
metal. Por otro lado, poseen otra ruta que media la captación de Fe no unido a Tf
(Inman & W’essling-Resnick, 1993; Conrad e!a/., 2000).
ll7
Resultados y Discusión - Capítulo V
Tal como se discutió en el Capítulo IV, el aumento en la captación de Fe
ocasionado por la exposición a Al, puesto de manifiesto recién después de la remoción
de este metal, no pudo ser completamente explicado por cambios en la vía de
transporte de Fe mediada por receptores para Tf.
Los resultados de los ensayos presentados en este capítulo sí permitieron
completar esa explicación, ya que la exposición de las células K562 a Al provocó una
modulación positiva de la vía alternativa de captación de Fe. Esta respuesta fue
dependiente de la duración del tratamiento y del estado de diferenciación celular (Figura
V.1), ya que la tasa de adquisición de Fe se vio incrementada sólo en las células no
inducidas y en las estimuladas con hemina. El hecho de que la acción del Al se pusiera
de manifiesto más rápidamente en estas últimas, podría deberse a la condición
particular que presentan las células que están sufriendo maduración eritroide. Sin
embargo, en los cultivos inducidos con butirato de sodio la captación de Fe no unido a
Tf no fue modificada por el contacto previo con Al. Este resultado refuerza la hipótesis
planteada en el Capítulo III acerca del efecto irreversible que ejercer-íael Al sobre las
células estimuladas con butirato de sodio. Como consecuencia del arresto en el
crecimiento celular que se produce por efecto de este inductor, las células serían
incapaces de compensar la disminución en la captación de Fe (Figura V.1). Además, por
ser el butirato de sodio un compuesto lipofílico, podría interactuar con la bicapa de la
membrana plasmática (Hoffman et 01., 1979) e impedir a las células modular la
expresión de las proteínas involucradas en la captación de Fe.
La adaptación celular, reflejada en la modulación de la vía alternativa de
transporte de Fe, fue también observada en otros tipos celulares. Metales trivalentes
como Al y Ga estimularon marcadamente la tasa de captación de Fe por esta vía en
células de la línea prornielocítica humana HL-óO (Olakanmi et a/., 1997). Asimismo, esta
ruta de entrada de Fe fue regulada positivamente por el tratamiento previo de cultivos
primarios de células de corteza cerebral de rata con nitriloacetato de Al (Oshiro et al,
1998).
Estos antecedentes y nuestros resultados demuestran que la vía de captación
independiente de Tf está presente tanto en células eritroides como en no eritroides y
permiten sugerir que las respuestas a la exposición a un metal no esencial como el Al,
serían similares.
118
A pesar de la evidencia de la regulación positiva de la adquisición de Fe no
unido a Tf inducida por el contacto previo con Al, no han sido descriptos los
mecanismos responsables de este efecto. Nuestra hipótesis de que la disminución de los
niveles intracelulares de Fe, debida a la interferencia competitiva de Tf-Al a nivel de la
membrana, desencadenara esta respuesta celular de adaptación, fue rechazada en base a
los resultados obtenidos bajo condiciones de depleción de Fe (Tabla V.1). Cuando las
células fueron tratadas con desferrioxarnina, la captación del metal no unido a Tf no
diflrió significativamente de la de las células desarrolladas con suplemento normal de
Fe. Estos resultados, obtenidos también en células HeLa y fibroblastos humanos
(Kaplan et al, 1991), demuestran que, a diferencia del mecanismo que regula la
expresión del RTf (Capítulo IV), una importante depleción de Fe no desencadenaría la
regulación positiva de la via independiente de Tf. Por el contrario, cuando las células
fueron desarrolladas en un medio rico en Fe, la cantidad de trazador incorporada
aumentó significativamente (Tabla V.1). Estos resultados indican que el exceso de Fe,
pero no su carencia, regularía la funcionalidad de esta via. Nuevamente, este mecanismo
difiere del que modula la captación de Fe mediada por RTf, el cual, bajo condiciones de
niveles elevados del metal esencial, es regulado negativamente.
Comparando los resultados presentados en la Figura V.1 (NI y H) y en la Tabla
V.1, puede comprobarse que la respuesta celular al tratamiento previo con Al o Fe
procede en un mismo sentido, es decir, la regulación positiva de la vía alternativa de
captación de Fe. Sin embargo, el efecto producido por el propio Fe posee una magnitud
mayor y parece desencadenarse más rápidamente. En nuestros ensayos pudo ser
detectada ya a las dos horas del agregado de concentraciones suprafisiológicas del metal
(Tabla V.2). Esta modulación tan rápida sugiere un mecanismo independiente de la
síntesis de proteínas, por lo que se trataría de una regulación a nivel post-traduccional.
Se ha postulado que la presencia de Fe extracelular induciria la aparición en membrana
de transportadores presentes en un pool críptico y, de esta manera, se acelerar-ía la
remoción del medio de moléculas del metal potencialmente tóxicas (Kaplan eta/., 1991).
A diferencia de la modulación ejercida por el propio Fe, la inducida por Al
requiere de mayor tiempo para ponerse en evidencia (Figura V.1). Además, el agregado
del metal no esencial durante el pulso de captación de Fe no afecta la vía de
incorporación independiente de Tf (Figura V.2). Este resultado discrepa con otros
119
Resultados y Discusión - Capítulo V
antecedentes que informan que la adquisición de Fe por la vía alternativa puede ser
parcialmente bloqueada por otros cationes, aunque los resultados son contradictorios.
Metales de transición tales como Cu“, Zn“, Cd2+ y Mn2+ ejercieron este efecto en
células HeLa y K562 (Sturrock et al, 1990; Conrad et al, 1994). Sin embargo, en otro
trabajo, los metales trivalentes Al“, Ga3+y Cr”, pero no cationes divalentes, fueron los
capaces de bloquear la captación de Fe por la via alternativa en células K562 (Inman &
Wessling-Resnick, 1993; Attich et a/., 1999).
A partir de los resultados presentados en este capítulo, es posible concluir que
los sitios involucrados en este mecanismo alternativo de captación de Fe no serían
accesibles para el ingreso de Al en células K562. Este metal no compartiría con el Fe
la/s proteínas involucradas en la vía de incorporación independiente de Tf (Figura V.2).
En estas células, han sido descriptos dos mecanismos para la captación de Fe no unido
a Tf. Los iones férricos ingresan a través de la proteína de membrana B3-integrina;
mientras que los ferrosos, lo hacen mediante la transportadora de metales divalentes,
DMT1. Esta proteína se encuentra presente también en la membrana del endosoma
donde, dependiendo de una actividad reductasa acoplada, es responsable del pasaje del
Fe3+ liberado de la Tf como Fe2+ al citoplasma (Conrad et a/., 2000). Si la DMI'I
presente en la membrana plasmática requiere también de la actividad reductasa
acoplada, es aún motivo de controversia. El Al, por ser un metal que no puede ser
reducido, no podría ser incorporado por las células a través de la proteína DMT 1. Por
otra parte, el Al tampoco sería transportado por Bg-integnna, ya que no fue capaz de
inhibir la captación de Feï’+(Figura V.2). Sin embargo, teniendo en cuenta que el Al fue
hallado en el citosol de células cultivadas en medio carente de Tf, es posible postular
que existe un mecanismo alternativo para su captación, aunque de magnitud
marcadamente inferior a la de la vía mediada por RTf (Figura V.3). Esta ruta de
incorporación celular de Al fue también detectada en otras células. En linfocitos
humanos, la acumulación de Al fue menor en cultivos realizados en presencia de citrato
de Al con respecto a su incorporación a partir de Tf-Al (McGrcgor e! a/., 1991). En
células de neuroblastoma cultivadas en medio conteniendo Tf-Al o citrato de Al, la
concentración intracelular del catión se incrementó linealmente con el tiempo, siendo el
ingreso por la via dependiente de Tf dos veces mayor que por la alternativa (Abteo et
120
41., 1999). La acumulación de Al fue también detectada en eritrocitos humanos
cultivados en presencia de cloruro de Al (Vittori el a/., 2002).
El mecanismo de captación de Fe independiente de Tf es considerado por
muchos autores como un sistema importante en aquellos estados donde se produce
acumulación masiva del metal (Sturrock et a/., 1990; Kaplan ef a/., 1991; Randell e! a/.,
1994; Olakanmi et al, 1997). Esta situación se presenta en patologías tales como
hipotransferrinemia y hemocromatosis hereditaria. En ambos casos, ya sea por carencia
o saturación de Tf respectivamente, la cantidad de Fe absorbido por el organismo
excede la capacidad de transporte de la proteína. Por esta razón, el metal circularía en
plasma en la forma de complejos de bajo peso molecular y sería removido del mismo
mediante la vía alternativa de captación de Fe. Los resultados presentados en la Tabla
V.2 demuestran claramente que a medida que aumenta la concentración de iones Fe3+
en el medio, la captación del trazador por la vía alternativa se incrementa. Por lo tanto,
teniendo en cuenta en conjunto los datos de las Tablas V.1 y V.2, se podría adjudicar a
esta vía un rol importante en el proceso de detoxificación de Fe en células K562. Las
moléculas del metal, presentes en el medio en la forma de compuestos de bajo peso
molecular, serían captadas por la/las proteínas involucradas en este mecanismo
alternativo y, por lo tanto, removidas del entorno celular.
Sin embargo, estas condiciones no estuvieron presentes en los ensayos en los
que se estudió el efecto del Al (Figura V.1). Las concentraciones de citrato férrico
presentes en el medio de las células expuestas a Al, no difen'an de las de los controles.
De modo que puede descartarse que la regulación positiva observada sea debida a un
efecto directo por exceso de Fe.
Como se indicó al principio de esta discusión, los resultados de este capítulo
permitirían explicar el incremento de la incorporación de Fe puesto en evidencia luego
de la remoción de Al en los ensayos del Capítulo III, modificación que no pudo ser
adjudicada a un aumento en la expresión de los receptores para Tf (Capítulo IV). Tanto
en los ensayos del Capítulo III como en los del presente, la adaptación celular a la
exposición al metal no esencial fue detectada a través de la captación de Fe.
Comparando la Figura V.1 con las Figuras III.2-III.4, puede comprobarse que los
patrones de variación en la captación del metal trazador al analizar ambos mecanismos,
dependiente e independiente de Tf, son muy similares.
121
ResultadosyDiscusión - Capítqu V
La 59Fe-Tfutilizada en los ensayos descriptos en el Capítulo III, fue preparada
por adición de citrato-59Fe a apon, de acuerdo a las relaciones molares de equilibrio
establecidas previamente (Materiales y Métodos). Es evidente que, bajo estas
condiciones, parte del radionucleído agregado se encontraría en la forma de un
complejo de bajo peso molecular, citrato férrico. Por lo tanto, el catión no unido a Tf
podría haber estado disponible para ser incorporado por las células K562 a través de un
mecanismo no mediado por RTf. En esos ensayos, las células no inducidas a
diferenciación evidenciaron, luego de 7 días de tratamiento con Al, un aumento en la
velocidad de captación de Fe de 47,3i11,2 pg Fe/ 106células/ h (Capítulo III). En los
ensayos diseñados para estudiar los efectos del Al sobre la vía no mediada por Tf, la
incorporación del trazador experimentó, bajo las mismas condiciones previas de
cultivo, un incremento de 30,0i7,2 pg Pie/106células/ h (Capítulo V). Es decir, que este
mecanismo alternativo de captación de Fe podría dar cuenta de, aproximadamente, un
63% del aumento observado en las experiencias del Capítulo III. En células inducidas a
diferenciación con hemina, el mecanismo independiente de Tf sería responsable del
70% del efecto observado en presencia de Tf.
Tanto en las células no inducidas como en aquéllas estimuladas con hemina, el
incremento en la velocidad de captación de Fe a través de la vía alternativa no puede
explicar completamente el aumento en la incorporación del trazador en presencia de Tf.
Los resultados presentados en el Capítulo IV condujeron a descartar la posibilidad de
una regulación positiva del Al sobre la expresión de los receptores en membrana. Por lo
tanto, como ha sido postulado en la discusión de dicho capítulo, un aumento de la
afinidad de los receptores para Tf podría ser el mecanismo que permitiría completar la
explicación de los resultados observados.
122
CONSIQEMCITIML
Consideracionesfinales
La presencia de Al, vehiculizado por Tf, provoca inhibición de la síntesis de
hemoglobina en células de la línea K562 inducidas a diferenciación eritroide. Este
efecto constituye una evidencia de la interferencia del metal no esencial en alguna de las
etapas involucradas en el metabolismo del Fe.
El complejo Tf-Al posee capacidad para restringir la unión de Tf-Fe a sitios
específicos de la membrana celular. Más aún, las constantes de disociación que
caracterizan la unión del RTf de las células K562 con ambos complejos, son del mismo
orden de magnitud. Esta afinidad similar es responsable de una relación competitiva
que se establece entre Tf-Fe y Tf-Al por la interacción con el RTf cuando ambos
ligandos se hallan simultáneamente presentes en el entorno celular. Asimismo, el
complejo Tf-Al es capaz de ser internalizado por estas células a través de un mecanismo
de endocitosis similar al realizado por Tf-Fe, lo cual conducin'a a la acumulación
intracelular del metal no esencial.
Como resultado de la interferencia producida a nivel de la membrana, mientras
el Al permanece en el medio de cultivo, tanto la captación total de Fe como su
utilización para la síntesis de hemo se ven disminuidas. La remoción del metal
competidor permite poner en evidencia un mecanismo de regulación positiva de la
incorporación de Fe destinado, probablemente, a alcanzar los niveles del metal esencial
requeridos para un metabolismo normal. Este mecanismo adaptativo sólo se manifiesta
en las células no inducidas y en las estimuladas con hemina y, a su vez, su aparición es
más temprana en éstas últimas, probablemente debido a su condición de maduración
eritroide. Las células inducidas a diferenciación con butirato de sodio son incapaces de
compensar la menor incorporación del metal esencial. El efecto de Al en estas células
parece ser irreversible, ya que a pesar de la eliminación del metal, la síntesis de hemo
continúa estando inhibida. La respuesta diferencial observada bajo estas condiciones
podría ser el resultado del arresto del crecimiento celular que se produce en forma
colateral a la inducción de la síntesis de hemoglobina.
La expresión del RTf es regulada post-transcripcionalmente por los niveles
intracelulares de Fe. Sin embargo, a pesar de la insuficiente captación del metal esencial
resultante del cultivo en presencia de Al, no se evidencia modulación positiva de la
síntesis del receptor. Aparentemente, la disminución del pool intracitoplasmáu'co de Fe
que se produce como consecuencia de la exposición a Al, no es tan abrupta como la
124
resultante del tratamiento con el quelante desferr'ioxamina. Por lo tanto, podría ser
insuficiente para desencadenar un aumento en la expresión del RTf a través de la
interacción IRE-IRP.
La adaptación celular inducida por la exposición a Al se manifiesta por la
regulación positiva de la vía alternativa de captación de Fe en la forma de compuestos
de bajo peso molecular. El patrón a través del cual dicho incremento se pone en
evidencia, es similar al observado al analizar la captación de Fe en presencia de Tf. Este
último puede ser explicado en, aproximadamente, un 60-70% por el aumento en la
velocidad de captación a través de 1avía alternativa. Considerando los resultados de este
trabajo, es posible postular que la exposición a Al también modifica la afinidad del RTf
por Tf.
El análisis de los resultados de este trabajo de investigación a la luz de hallazgos
de otros autores, nos permiten sugerir posibles mecanismos a través de los cuales se
produciría la inducción de la vía alternativa de captación de Fe y la modificación de la
- afinidad del RTf, como consecuencia de la exposición a Al.
Fisiológicamente, la afinidad del RTf es modulada a través de la interacción con
otra proteína de membrana, el producto del gen HFE, relacionado con el complejo
mayor de histocompatibilidad de clase I. La interacción del heterodímero formado
entre HFE y Bz-rnicroglobulina con el RTf, resulta en un cambio conformacional del
receptor que provoca modificación de su afinidad por Tf (Roy et a/., 1999). La
alteración de este mecanismo desempeña un rol fundamental en la patogénesis de la
hemocromatosis hereditaria. Han sido descriptas diversas mutaciones en el gen HFE
que, al eliminar o modificar la habilidad de la proteína de formar un complejo estable
con el RTf, producen acumulación masiva de Fe en distintos órganos (Andrews, 2002).
La modificación de la afinidad del RTf provocada por la exposición a Al, podría
entonces ser el resultado de una alteración en la interacción entre HFE y el receptor
debida a un cambio conformacional en alguna de las proteínas. De hecho, la unión de
Al a la proteína de membrana calmodulina induce alteraciones estructurales en la
molécula que afectan su actividad biológica (Solomon, 2001). El efecto del Al también
podría ser indirecto. Importantes cambios en la morfología celular y en la organización
de proteínas estructurales, así como también, modificación de propiedades físicas de la
membrana, son producidos como consecuencia de la pre5encia de Al en el entorno
125
Consideracionesfinales
celular (van Rensburg et al, 1992; Suwalsky et al, 2001; Vittori et a/., 2002). Estos
desórdenes podrían alterar la regulación dinámica de los eventos descriptos que ocurren
a nivel de la membrana plasmática.
El efecto del Al sobre la vía alternativa de incorporación de Fe procede en el
mismo sentido que el ejercido por el propio Fe: una regulación positiva del mecanismo.
Sin embargo, la respuesta celular a la exposición a Al es más lenta y de menor magnitud,
poniéndose en evidencia sólo luego de un tratamiento prolongado, de carácter crónico.
El Al podn’a actuar a nivel de la transcripción de alguno de los genes que
codifican a proteínas que participan en la vía de captación de Fe no mediada por Tf, ya
que ha sido demostrada su capacidad de interactuar con las moléculas de ADN (Zhang,
2002).
La región regulatoria del gen de la DMT 1 presenta cinco elementos de respuesta
a metales (MRE, metal-repomz'veelementr)similares a los encontrados en el gen de la
metalotioneína (proteína que controla el contenido de metales libres en los tejidos) (Lee
et a/., 1998). De hecho, el Al induce la regulación positiva de la transcripción de este gen
en ratas (Zhang elal, 1998). A través del mismo mecanismo, la exposición de las células
K562 a este metal no esencial podría inducir elevación de los niveles de transcripción
del gen de la DMTl, aumentando, por lo tanto, su expresión en membrana y la
captación de Fe a través de la vía alternativa.
El hecho de que la exposición a Al traiga como consecuencia la modulación de
la captación de Fe independiente de RTf, parece ser una respuesta celular «lógica»
tendiente a compensar la menor incorporación del metal esencial. El aumento en la
expresión de los receptores para Tf hubiera conducido a un mayor ingreso de Al, ya
que la vía mediada por RTf es compartida por ambos metales. La regulación positiva de
la captación de Fe independiente de Tf, al ser un mecanismo no común entre ambos
cationes, permitiría a las células aumentar selectivamente los niveles de incorporación
del metal esencial.
Sin embargo, la magnitud de esta modulación, junto con el aparente incremento
de la afinidad del RTf por Tf, hacen que la respuesta no sea suficiente ya que, mientras
el Al permanece en el medio, la captación y utilización celular de Fe continúan estando
afectadas.
126
Consideracionesfinales
Prácticamente, todas las células del organismo requieren de adecuados niveles de
Fe para llevar a cabo sus funciones. Por lo tanto, en la evolución se han desarrollado los
mecanismos que regulan estrictamente la homeostasis del metal esencial. Desequilibrios
metabólicos de este delicado balance, contribuyen al desarrollo de numerosos
trastornos, teniendo particular importancia los neurológicos.
La vinculación, cada día en aumento, entre la acumulación de Al y diversas
enfermedades neurodegenerativas, permite enfatizar que una interferencia de este metal
no esencial en el metabolismo del Fe, como la demostrada en esta investigación, no
estaría limitada a células eritroides.
¿"3443*P34} Alarq, Messe
(DIFUSIÓNGE LO
Difusión de los resultados
Resultados parciales del presente trabajo de investigación han sido incluidos
en las siguientes publicaciones:
¿o Interference of aluminium on iron metabolism in etythtoleukaemia K562cells
Pérez G, Garbossa G, Sassetti B, Di Risio C, Nesse A
JOURNAL OF INORGANIC BIOCHEMISTRY76:105-112, 1999
¿o Distutbance ofcellulat iron uptake and utilisation by aluminiumPérez G, Garbossa G, Di Risio C, Vittori D, Nesse A
JOURNAL OF INORGANIC BIOCHEMISTRY87:21-27, 2001
go Toxicidad del aluminio sobre el sistema etittopoyético. Mecanismosinvolucrados
Pérez G, Vittori D, Garbossa G, Nesse A
ACTA BIOQUÍMICA CLÍNICA LATINOAMERICANA36:41-50, 2002
Por otra parte, los resultados fueron incorporados en una revisión realizada por
las Dras. Alcira Nesse y Graciela Garbossa:
¿o «Aluminium Toxicity in Erytlu'opoiesis. Mechanisms Related to CellularDysfunction in Alzheimet’s Disease»Nesse A, Garbossa GEn: ALUMINIUM AND ALZHEIMER’S DISEASE. THE SCIENCE THAT DESCRJBES THE
LINK.
Exley C (Ed), Elsevier Science, Amsterdam. Cap.13, p.261-291, 2001
Además, han sido incluidos en el siguiente artículo de divulgación científica:
¿o Aluminio: ¿culpable o inocente?Nesse A, Garbossa G, Pérez G, Vittori D, Pregi N
QUÍMICAVIVA. Año 1, número 2. Revista oir-linedel Departamento de Química
Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.
(www.quimicaviva.fcen.uba.ar)
129
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Resumen
INTERFERENCIA DEL ALUMNIO CON EL METABOLISMODEL HIERRO
Autora: GladysMabel Pérez Directora: Dra. Alcira Nesse
El aluminio (A1)es un elemento ampliamente distribuido en la Naturaleza, de hecho, eltercero en abundancia. A pesar de su ubicuidad, no posee una función biológica conocida,por lo tanto, su incorporación a los seres vivos puede provocar signos de toxicidad. Lasobrecarga con Al ha sido asociada con la aparición de diferentes desórdenes, tales como:defectos óseos, encefalopatía y alteraciones hematológicas. Estos sig-nosde toxicidad, aunquefueron inicialmente detectados en pacientes con insuficiencia renal crónica, puedenpresentarse también en individuos con función renal intacta. El extenso uso de este elementoen la vida cotidiana lo convierte en un riesgo potencial para la población en general.
Una vez ingresado al organismo, el Al es conducido a través del torrente sanguíneo porla misma proteína que transporta hierro (Fe), la transferrina (Tf) y acumulado en distintosórganos y tejidos. Diversos antecedentes permitieron relacionar la acumulación de Al con eldesarrollo de anemia. Por lo tanto, el objetivo planteado para desarrollar este trabajo deinvestigación fue estudiar la interferencia del Al con el metabolismo normal de Fe. Para ello,se emplearon células de la línea eritroleucémica K562, las cuales expresan receptoresespecíficos para Tf (RTf y RTf2) en su membrana y experimentan maduración eritroide porla acción de inductores, tales como hemina y butirato de sodio.
Los resultados demostraron que el Al interfiere con el proceso de diferenciacióncelular, ya que provoca disminución del número de células hemoglobinizadas. El cálculo delas Kd correspondientes mostró que el RTf posee afinidad similar por los complejos Tf-Fe yTf-Al, lo cual conlleva al establecimiento de una relación competitiva cuando ambos estánpresentes simultáneamente en el entorno celular. Esta situación trae como consecuencia ladisminución de la incorporación total de Fe y, por lo tanto, de su utilización en la síntesis dehemo. Sin embargo, cuando el Al es removido, dependiendo de la duración de la exposición aeste metal y de las condiciones de inducción, la captación de Fe excede a la de las células queno fueron expuestas previamente a Al. Esta observación sugiere la activación de algúnmecanismo destinado a compensar la menor incorporación del metal esencial por efecto delAl. La posibilidad de que la expresión del RTf o RTf2 fuera regulada positivamente fuedescartada, ya que los niveles de ARNm y de proteína no fueron modificados comoconsecuencia de la exposición a Al.
Además de las vias que median la incorporación de Fe unido a Tf, existenmecanismos alternativos para la captación del metal esencial cuando está presente en la formade compuestos de bajo peso molecular. La remoción de Al, después de un tratamientoprevio, indujo una regulación positiva de estos sistemas de transporte de Fe independientesde Tf.
Puede concluirse que la presencia de Al en el entorno celular interfiere la normalincorporación y utilización de Fe. Ello induce una adaptación celular tendiente a alcanzar losniveles del metal esencial requeridos para el metabolismo. La regulación positiva de las víasalternativas de captación de Fe, las cuales no participan en la incorporación de Al, da cuentade parte de esta respuesta, aunque no puede ser descartada la posibilidad de que la afinidad delos receptores para Tf pueda ser modificada. Sin embargo, a pesar de estas adaptaciones, lapresencia continua de Al en el medio impide a las células lograr la utilización adecuada de Feen la síntesis de hemoglobina.
Palabras clave: ablrm'rlz'o—metabo/¿rma del hierro —células K562 —receptor de trarzfim'rla - síntesisde beM@lobina—trampofle de bierro no unido a tramflm'na
Abstract
ALUMINUM INTERFERENCE IN IRON METABOLISM
Author: GladysMabel Pérez Director: Dra. Alcira Nesse
Aluminum (Al) is wider distributed in Nature and, in fact, it is the third element moreabundant. In spite of this, its biological function is not known, and its incorporation to livingbeings proved to have toxic effects. The exposure to Al has been associated to differentdisorders, such as: bone defects, encephalopathy, and hematologic alterations. Even thoughthese toxicity signs were first detected in patients with chronic renal deficiency, they may bealso observed in people with intact renal functions. The wide use of this metal in everyday lifeturns it into a potential hazard to the population in general.
Once it enters the organism, Al is transported through the bloodstrearn by transferrin(Tf), the same protein that transports iron (Fe), and it is accumulated in different organs andtissues. Several facts related Al accumulation to the development of anemia. Therefore, theaim of this work was to study Al interference with normal Fe metabolism. Assays werecarried out using cells from the erythroleukemic line K562, which express specific receptorsfor Tf (TfR and TfRZ) in their membranes and experienced erythroid maturity due to theaction of inducers such as hernin and sodium butyrate.
Results showed that Al interferes with the cellular differentiation process causing adecrease in the number of hemoglobinized cells.The determination of the corresponding Kdshowed that TfR has similar affinity for complexes Tf-Fe and Tf-Al, thus establishing acompetitive relation between them when they are simultaneously present in the cellularenvironment. This situation triggers a reduction in the total incorporation of Fe and, thus, inits utilization in the synthesis of heme. However, when Al is removed, depending on thelength of the exposure and on the induction conditions, Fe incorporation is higher than incells not previously exposed to Al. This suggests the existence of a certain mechanismdeveloped to compensate the lower essential metal incorporation caused by Al. Positiveregulation of TfR or TfR2 expression was discarded since RNAm and protein levels were notmodified by Al exposure.
Apart from the pathways that mediate Tf-Fe incorporation, there are alternativemechanisms for essential metal uptake when it is in the form of low molecular weightcompounds. The removal of Al after a previous treatment induced the positive regulation ofthese transport systems of Tf-independent Fe.
We may conclude that the presence of Al in the cellular environment interferes withnormal Fe incorporation and utilization. This induces a cellular adaptation intended to reachthe essential metal levels necessary for metabolism. The positive regulation of the alternativeFe uptake pathways, which do not participate in Al incorporation, partly explains thisresponse, but the possibility that the affinity of Tf receptors may be modified should not bediscarded. However, in spite of these adaptations, the continuous presence of Al in cellularenvironment prevents the adequate utilization of Fe in hemoglobin synthesis.
Key words: aluminum —iron metabolzkm—K5 62 cell; —transfem'n receptor —bem%labin gntbeJiJ —transport ¡{iron not bound to tramfem'n