Acta Bioquím Clín Latinoam 2007; 41 (3): 395-8

Micología Comunicación breve

Comparación de las coloraciones de Giemsa y Grocott en el diagnóstico dela histoplasmosisComparison of Giemsa and Grocott stains in thediagnosis of histoplasmosis

Amadeo Javier Bava1*, María Fernanda Zuiani2**

1. Doctor en Medicina.2. Bioquímica.

* Sección Parasitología. Hospital de Infeccio-sas “Francisco J. Muñiz”. Uspallata 2272.Buenos Aires. Argentina.

**Cátedra de Micología y Parasitología. Facul-tad de Ciencias Exactas. Universidad Nacio-nal de La Plata. Calle 1 y 47. La Plata. Ar-gentina.

Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana

Incorporada al Chemical Abstract Service.

Código bibliográfico: ABCLDL.

ISSN 0325-2957

Resumen

El diagnóstico de histoplasmosis se realiza tradicionalmente mediante elreconocimiento de típicas levaduras intracelulares de Histoplasma capsu-latum en preparaciones microscópicas teñidas con Giemsa. Se comparó laeficacia de una modificación rápida de la técnica de Grocott (MRG) y la tra-dicional de Giemsa para el diagnóstico de la histoplasmosis, a partir de laaplicación de ambas a 10 secreciones respiratorias, 8 escarificaciones delesiones cutáneas y una biopsia ganglionar, pertenecientes todas a pacien-tes con sospecha clínica de esta micosis. En 15 de las 19 muestras no seencontraron diferencias significativas en la capacidad y rapidez para arri-bar al diagnóstico, mientras que en las 4 restantes, fueron reconocidas conla MRG estructuras que pasaron desapercibidas con la coloración de Giem-sa. La modificación rápida permitió un reconocimiento más rápido del H.capsulatum en materiales donde este hongo se observó en escaso númeroy permitió además identificar con seguridad otros patógenos fúngicos dife-rentes de H. capsulatum, como Pneumocystis jiroveci, Paracoccidioidesbrasiliensis y Cryptococcus neoformans, difíciles de observar con la colora-ción de Giemsa. Se propone la técnica de Grocott o su modificación rápi-da para el diagnóstico de la histoplasmosis, especialmente cuando el em-pleo de la coloración de Giemsa da lugar a resultados negativos o dudosos.

Palabras clave: coloración de Giemsa * coloración de Grocott * histoplas-mosis * diagnóstico micológico

Summary

The diagnosis of histoplasmosis is traditionally achieved by recognizing thetypical intracellular yeasts of Histoplasma capsulatum, in smears stainedwith Giemsa stain. The usefulness of a rapid modification of Grocott and oftraditional Giemsa stains for the diagnosis of histoplasmosis was comparedapplying both techniques in 10 respiratory secretions, 8 cutaneous lesionsscrapings and 1 adenomegaly biopsy, all of them belonging to patients with

Reconocimiento a la trayectoria de la Prof. Dra. Regina L. W. de Wikinski

Introducción

La histoplasmosis es una micosis sistémica endémi-ca de la Pampa húmeda y aquella que se asocia en es-te medio con mayor frecuencia al SIDA (1). Habitual-mente, el diagnóstico se realiza por la visualizaciónmicroscópica de la fase levaduriforme de su agentecausal, Histoplasma capsulatum, en preparaciones teñi-das con Giemsa, su aislamiento por cultivo o la deter-minación de anticuerpos específicos en sangre (2)(3).

En las preparaciones microscópicas teñidas conGiemsa, las levaduras se observan en número variabledentro del citoplasma de las células fagocitarias, teñi-das parcialmente, con una disposición denominada“en casquete” y rodeadas de un pequeño halo, erró-neamente considerado una cápsula (3).

La coloración de Grocott (4), empleada de rutinapara la búsqueda de hongos en cortes histopatológi-cos, no es usada en los laboratorios de diagnóstico mi-cológico, debido a la necesidad de un elevado núme-ro de reactivos y al prolongado tiempo requerido parasu realización.

Para obviar las dificultades antes mencionadas sehan desarrollado modificaciones rápidas, las cuales, apesar de su efectividad, no han ganado aceptación enlos laboratorios de diagnóstico (5-7). En este laborato-rio se emplea una modificación rápida (MRG), senci-lla y adaptable sin dificultades a laboratorios de bajacomplejidad (8).

Para evaluar la efectividad de la coloración deGiemsa y una MRG en la visualización de H. capsula-tum, se aplicaron ambas a preparaciones microscópi-cas de materiales provenientes de pacientes con diag-nóstico clínico presuntivo de histoplasmosis.

Materiales y Métodos

Se investigó mediante microscopía la presencia deH. capsulatum en 10 secreciones respiratorias obteni-das por lavado broncoalveolar (LBA), 8 raspados de le-

siones cutáneas y un material obtenido por punciónde un ganglio cervical. Los materiales pertenecían apacientes con SIDA y diagnóstico clínico presuntivo dehistoplasmosis, asistidos en diferentes Salas y Serviciosdel Hospital de Infecciosas “Francisco Javier Muñiz”de la ciudad de Buenos Aires.

En ellos, la sospecha clínica fue confirmada por larecuperación de H. capsulatum a partir de muestras dehemocultivos y/o su visualización microscópica enmuestras obtenidas por escarificación o punción.

Los extendidos realizados con los materiales clínicosluego de centrifugarlo durante 5 min a 1.500 rpm. en elcaso de las secreciones respiratorias obtenidas por LBA,fueron fijados a la llama del mechero o cubiertos con al-cohol metílico durante 5 min previo a la realización delas tinciones de Grocott y Giemsa, respectivamente.

Se cubrieron las preparaciones con una solución se-gún Giemsa (Merck) 1:10 en agua destilada durante20 min, mientras que el procedimiento completo de laMRG, que empleó un tiempo similar, se describe condetalle en un trabajo anterior (8). Brevemente, este úl-timo consistió en cubrir la preparación con una solu-ción acuosa de ácido crómico durante 10 min y luegodel lavado con agua se procedió de igual forma, du-rante 1 min, con una solución acuosa de bisulfito desodio al 1%. Tras un nuevo lavado se cubrió la prepa-ración con la solución de metenamina-plata, la cual secalentó suavemente con la llama de un hisopo de algo-dón embebido en alcohol, hasta que el material fijadoadquiriera color pardo oscuro.

Se procedió luego al secado de los extendidos al airey a la observación al microscopio con 100, 400 y 1.000aumentos por el mismo observador, en primer términoel teñido con Giemsa y luego el teñido con la MRG.

Resultados

En 15 (79%) de los materiales no hubo dificultadpara detectar las levaduras de H. capsulatum con ambascoloraciones y llegar al diagnóstico a partir de hallaz-

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clinically suspected histoplasmosis. In 15 out of the 19 evaluated samples, no significant dif-ferences were found in the ability or speed to reach the diagnosis with the applied techniques;while in the remaining 4 samples, structures that had not been observed with Giemsa stainwere recognized with the rapid modification. The modification enabled quicker recognition ofH. capsulatum than Giemsa stain in those clinical samples where the number of these fun-gal pathogens was scant. Additionally, the rapid modification also enabled the recognition offungal pathogens other than H. capsulatum, as Pneumocystis jiroveci, Paracoccidioidesbrasiliensis and Cryptococcus neoformans, difficult to observe with the Giemsa stain. Use ofGrocott technique or rapid modification stain is proposed for the diagnosis of histoplasmosis,when the result obtained with the Giemsa stain is doubtful or negative.

Keywords: Giemsa stain * Grocott stain * histoplasmosis * mycologic diagnosis

gos microscópicos habituales. En los 4 restantes (2LBA, una escarificación cutánea y una punción gan-glionar) hubo diferencias entre los hallazgos obteni-dos con una y otra tinción.

Las diferencias observadas en los resultados obteni-dos con la coloración de Giemsa y la MRG en la bús-queda de H. capsulatum en 4 de las 15 preparacionesmicroscópicas correspondientes a los materiales estu-diados se resumen en la Tabla I.

En un LBA sólo la MRG reveló escasas levaduras depequeño tamaño, ubicadas dentro de elementos celu-lares. Días después, en hemocultivos de este pacienterealizados con la técnica de lisis-centrifugación, desa-rrolló H. capsulatum.

Otro LBA mostró con la MRG abundantes levadu-ras deterioradas, sólo teñidas a nivel de la pared y es-casas levaduras teñidas totalmente. Estas fueron ob-servadas posteriormente, tras una nueva revisión ycon suma dificultad, con la coloración de Giemsa. Lapaciente se encontraba tratada con itraconazol desdetiempo atrás, lo que podría haber afectado la tinciónde las levaduras. Idénticos hallazgos a los antes des-criptos se obtuvieron con el material de punción gan-glionar de un paciente que recibía tratamiento anti-fúngico sistémico.

Finalmente, en una escarificación de una lesión cu-tánea, tratada localmente con una crema que conteníacorticoides, antibacterianos y antifúngicos, la MRG pe-ro no la coloración de Giemsa, reveló formas “aberran-tes” de H. capsulatum (levaduras de mayor tamaño,seudomicelios y formas netamente pleomorfas).

Discusión y Conclusiones

Los resultados obtenidos sugieren una mayor sensi-bilidad de la MRG respecto de la coloración de Giem-sa para el diagnóstico de la histoplasmosis, la cual hasido evidenciada por estudios anteriores, respecto dela técnica original de Grocott (9).

La fase levaduriforme de H. capsulatum se tiñó biencon la MRG, con una tonalidad variable, desde el par-do claro a negro, según el caso, y fue fácilmente reco-nocible sobre el fondo amarillento, aún con el menoraumento. Sin embargo, puede ser difícil para observa-dores poco entrenados, establecer su ubicación intra-citoplasmástica, tarea que, por el contrario, es sencillacon la coloración de Giemsa (4).

La MRG resultó más efectiva para revelar la presen-cia de H. capsulatum en preparaciones de materiales

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Tabla I. Diferencias observadas en los resultados obtenidos con la coloración de Giemsa y la modificación rápi-da de Grocott (MRG) en la búsqueda de H. capsulatum en 4 de las 15 preparaciones microscópicas correspon-dientes a los materiales estudiados.

Preparaciones microscópicas

Lavado broncoalveolar

Lavado broncoalveolar

Escarificación de lesióncutánea

Punción ganglionar

Coloración de Giemsa

Negativo

En principio fuenegativa, luego de loshallazgos en la MRG seobservaron levadurascon dificultad

Sólo formas habitualesde H. capsulatum

En principio fuenegativa, luego de loshallazgos en la MRG seobservaron levadurascon dificultad

Modificación rápida deGrocott

Escasas levaduras depequeño tamaño,dentro de elementoscelulares

Levadurasdeterioradas, algunasteñidas sólo en la pared

Formas aberrantes deH. capsulatum

Levaduras

Observaciones

Días después,desarrolló H.capsulatum en loshemocultivos delpaciente.

La paciente estaba entratamiento conitraconazol desdetiempo atrás

El paciente fue tratadolocalmente con unacrema con corticoides,antifúngicos yantibacterianos

El paciente estaba entratamiento conitraconazol desdetiempo atrás

pertenecientes a pacientes con tratamiento antifúngi-co sistémico, así como para evidenciar las formas “abe-rrantes” de H. capsulatum.

A diferencia de la coloración de Giemsa, la MRGpermitió visualizar otros elementos fúngicos de valordiagnóstico: quistes de Pneumocystis jiroveci, levadurasde Paracoccidioides brasiliensis y Cryptococcus neoformansy filamentos de Aspergillus sp., eventualmente presen-tes en materiales respiratorios (8). En la neumocisto-sis, si bien la técnica de Giemsa evidencia los mayori-tarios trofozoítos, posee una sensibilidad yespecificidad menores a la de Grocott en el diagnós-tico de esta enfermedad (9).

A pesar del número elevado de casos de histoplas-mosis diagnosticados en el Hospital Muñiz, la mayoríase realiza mediante el aislamiento del agente causalen hemocultivos o su visualización en preparacionesmicroscópicas de material obtenido por escarifica-ción de lesiones cutáneas o mucosas (10).

Los diagnósticos logrados en ellos a partir de ma-teriales respiratorios son proporcionalmente escasos,teniendo en cuenta que los pulmones son el sitio delocalización primaria, punto de partida de la disemi-nación sanguínea y que en muchos casos las imáge-nes radiológicas revelan el compromiso pulmonar.

Esto sugeriría un diagnóstico tardío, cuando la en-fermedad se ha diseminado por vía sanguínea, locali-zado en múltiples tejidos y existen menores posibili-dades de éxito terapéutico. El deterioro de estospacientes se evidencia desde el punto de vista inmu-nológico por recuentos de linfocitos T CD4+ meno-res a 100 células/µL (11).

El empleo de la MRG mejoró las posibilidades devisualizar las levaduras de H. capsulatum y de otros pa-tógenos fúngicos en los materiales investigados res-pecto de la coloración de Giemsa, sobre todo cuandoestuvieron presentes en número escaso. Esto últimoocurrió en secreciones respiratorias y en la biopsiaganglionar, mientras que en las escarificaciones de le-siones cutáneas, tal cual es común en los pacientescon SIDA, el número de levaduras fue elevado y la co-loración de Giemsa fue muy efectiva.

Lamentablemente, no fue posible la comparaciónde ambas coloraciones en escarificaciones cutáneasde pacientes con histoplasmosis no asociada al SIDA,en las cuales la cantidad de levaduras debería ser sig-nificativamente menor.

Debe destacarse la asociación observada entre lafalta de visualización óptima de las levaduras intrace-lulares con la técnica de Giemsa, pero no con laMRG, en los materiales de pacientes que al momen-to del diagnóstico habían recibido tratamiento anti-fúngico durante lapsos prolongados.

Por las razones antes mencionadas, y no obstantela utilidad y fácil disponibilidad de la coloración de

Giemsa en la mayor parte de los laboratorios, los au-tores creen que la técnica de Grocott o su modifica-ción rápida, debería emplearse en los laboratorios deMicología para la identificación H. capsulatum y even-tualmente otros patógenos fúngicos, sobre todocuando los resultados de la coloración de Giemsa sonnegativos o dudosos.

CORRESPONDENCIA

DR. AMADEO JAVIER BAVADarregueyra 2470. 7º “C”.1425 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, ArgentinaTel.: 4773-6458E-mail: javibava@biol.unlp.edu.ar

Referencias bibliográficas

1. Rippon JW. Histoplasmosis. Mexico DF: Interamerica-na, Mc Graw-Hill; 1990. p. 410-66.

2. Arechavala A, Robles AM, Negroni R, Bianchi M, Ta-borda A. Valor de los métodos directos e indirectos dediagnóstico en las micosis asociadas al SIDA. Rev InstMed Trop Sao Paulo 1993; 35: 163-9.

3. Hendrickson DA, Krenz MD. Reagents and stains. En:A. Ballows, Hausler WJ, Herrman KL, Isenberg HD,Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbiology. 5th Edi-tion. Washington DC: ASM Press; 1992. p. 1289-314.

4. Grocott RG. A stain for fungi in tissue and smears. AmJ Clin Pathol 1955; 25: 975-9.

5. Brinn NT. Rapid metallic histological staining usingthe microwave oven. J Histotechnol 1983; 6: 125-9.

6. Pintozzi RL. Modified Grocott’s methenamine silver ni-trate method for quick staining of Pneumocystis cari-nii. J Clin Pathol 1978; 31: 803-5.

7. Musto L, Flanigan M, Elbadawi A. Ten minute silverstain for Pneumocystis carinii and fungi in tissue sec-tions. Arch Pathol Lab Med 1982; 106: 292-4.

8. Bava AJ. Coloración rápida para la identificación dequistes de Pneumocystis carinii en materiales respira-torios. Acta Bioquím Clín Latinoam 2003; 37: 189-92.

9. Procop GW, Hadad S, Quinn J, Wilson ML, HenshawNG, Reller LB, et al. Detection of Pneumocystis jirove-ci in respiratory specimens by four staining methods.J Clin Microbiol 2004; 42: 3333-5.

10. Bava AJ. Histoplasmosis in the Muñiz Hospital of Bue-nos Aires. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1995; 37:531-5.

11. Trombetta L, Bava AJ. Laboratorio clínico y micológicoen pacientes con histoplasmosis y síndrome de inmu-nodeficiencia adquirida. Acta Bioquím Clín Latinoam2005; 39: 471-6.

Aceptado para su publicación el 11 de septiembre de 2006

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