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Fluoróforos y sus aplicaciones
Chris WoodOctubre 2015
Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada
Una breve historia de fluoróforos…
Coatli .....patli, yoan aqujxtiloni, matlatic iniayo axixpatli..
“it is a medicine, and makes the water of blue color, its
juice is medicinal for the urine”
Sahagún, Florentine Codex Vol. III f. 266; CM-RAH, f. 203v.
La primera reporte de fluorescencia se escribió en Mexico por el misionario franciscanoBernardo de Sahagún
Charles de L’Écluse (1526-1609) llamó el palo Ligno
Nephriticum por sus propiedades medicinales en
mejorar el funcionamiento del riñon en 1574
John Frampton escribió un poco más tarde sobre un “.. white woodde which
gives a blewe color” que es muy bueno “for them that doeth not pisse liberally
and for the pains of the Raines of the stone..”
Robert Boyle (1670) atribuyó el color a un “sal esencial” ya que con
tiempo inmerso la madera perdió su propiedad. También descubrió
que los ácidos destruyen el efecto y que se puede recuperar la
fluorescencia agregando sustancias alcalinas.
Es decir, inventó el primer sensor de pH!
La identidad exacta de L. nephriticum se perdió, y no se descubrió otra vez hasta el siglo pasado
Y no fue hasta 2009 hasta que se caracterizó el fluoróforo
Matlaline
Prof David Jameson
Fluorescencia
Un fenómeno asociado con moléculas policíclicasaromáticas altamente conjugadas
Transferencia de energía y transicioneselectrónicas representadas en
el “diagrama de Jablonski”
Cada fluoróforo tiene su espectro de excitación (absorción) y emisión
Cómo caracterizamos a los fluoróforos?
1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación
2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido
Cómo caracterizamos a los fluoróforos?
1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación
2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido
“Brightness” = Ɛɸ
Cómo caracterizamos a los fluoróforos?
1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación
2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido
“Brightness” = Ɛɸ
3. Vida media o “Lifetime” de la fluorescencia
Vida media de la fluorescenciaSi damos un pulso de luz de excitación a unapoblación de fluoróforos en un solvente unforme, la fluorescencia se decae exponentialmente.
La mayoría de los fluoróforos tienen una vida media (τ) en el rango de nansegundos
Vida media de la fluorescencia1. Independiente de la concentración de
fluoróforo, y fenómenos como fotoblanqueo.
2. Sensible a interacciones en el entornomolecular del fluoróforo – solventación, oxígeno, pH, proximidad a otros fluoróforos etc
3. Medir la vida media convierte algunosfluoróforos en sensores moleculares de temperatura, pH, iones, oxígeno etc
“Quenching” y fotoblanqueo
1. El quenching (cuencheo?) es la disminución enla emisión fluorescente por la actividad de mecanismos de regreso al estado energéticobasal no radiativos.
2. El fotoblanqueo es la destrucción permanentedel fluoróforo por modificación covalente de su estructura.
Propiedades idóneas de losfluoróforos
1. Buen coeficiente de absorción y de rendimiento cuántico
2. Resistencia a fotoblanqueo y entrar el estado triplete
Secundarias: Solubilidad, baja toxicidad (sistemas biológicas), un Stokes shift grande, estable, barato, espectros compatibles con líneas laser comunes, entre otras
2x Real Time
Alexa Fluor 488 vs Fluorescein fotoblanqueo
Cortesia invitrogen.com
Clases de fluoróforo
Fluoróforos intrínsecos naturales
1. Triptofano , tirosina y fenilalanina
Espectro se desplaza por grado de solventación, susceptible al quenchingpor aa ácidos como Asp y Gln en proximidadcercana
Utilizado para estudios estructurales sobre proteínas y péptidos, cambios conformacionales, seguimiento de plegamiento etc
Fluoróforos intrínsecos naturales
2. Metábolitos (NADH, FAD)
Varone et al CancRes 2014;74:3067-3075 midieron la variación en estado redox entre diferentes regions en tejidos.
Vida media de NADH cambia siestá libre en solución o unido a proteínas, y la proporciónlibre:unido es relacionado al equilibrio entre glicólisis y OXPHOS en los tejidos
En este estudio, midieron y mapearon los cambios en estaproporción (y por ende la transición en su estadometabólico) durante la diferenciación de célulastroncales germinales a gamétos en C. elegans
Stringari et al (2011) PNAS 108 (33) 13582–13587
Fluoróforos intrínsecos naturales
3. Clorofila
www.nasa.gov
Fluoróforos intrínsecos naturales
4. Proteínas fluorescentes
Shimomura, Johnson and Saiga (1962)
discovered Green Fluorescent Protein in
the Aequorea victoria jellyfish
Purificaron 70 mgs de GFP de unas 30,000
Medusas con un peso total de 1.5 toneladas
Aislaron los “anillos exteriores”
de las medusas. Empezaron con
tijeras, pero al final diseñaron y
construyeron un equipo “corta-
anillos” para aumentar el
rendimiento
En.wikipedia.org/wiki/fluorescence
Múltiples colores
Marcar organelos subcelulares
Fusionarla con otrasproteínas
Convertirlo en un sensor
Medir la expresión de genes
Generar organismostransgénicos
Actina-GFP en las raíces de Arabidopsis
noble.org
Múltiples colores
Marcar organelos subcelulares
Fusionarla con otrasproteínas
Convertirlo en un sensor
Medir la expresión de genes
Generar organismostransgénicos
Microscopyu.com
Múltiples colores
Marcar organelos subcelulares
Fusionarla con otrasproteínas
Convertirlo en un sensor
Medir la expresión de genes
Generar organismostransgénicos
Visualización de procesos dinámicos in vivo
Epithelial cell migration and interchangeduring angiogenesis in the retina of zebrafish embryo (48hpf) depends on VEGF signalling
Jakobsson et al Nature Cell Biology 12, 943–953 (2010)
Proteínas fluorescentes como sensores de parámetros intracelulares
Algunas FPs son intrínsecamente sensiblesal estado de su entorno, e.g. pH, cloro
La proteína se fusiona con un dominiosensor. Cambios conformacionalesprovocados por unión de ligando o modificación del dominio sensor se trasmiteal dominio FP y la fluorescencia aumenta o disminuye.
Cambios de Ca2+ intracelular en subdominios de células de astrocito, medido a través de los cambios de intensidad de fluorescencia en el sensor genético CGamP2
Shigetomi et al J Gen Phys (2011) 141, 633-647
Transferencia de energía por resonancia
1 – Sobrelape entre los espectros de emisión del donador y de excitación del aceptor2 – una proximidad en el rango de 2 – 10 nm
CFP YFP
A B
CFPYFP
A B
CFP-NIPP1(proteína de
andamio nuclear)
YFP-IPP1(proteína fosfatasa)
CFP-NIPP1-MUTANTE
YFP-IPP1
Eficiencia FRET
Cortesía www.olympusamerica.com
1 -10nm
Truong et al. Nat Struct Biol, 8: 1069
FRET Intramolecular
Existen sensores para Ca2+, actividad de cinasas, proteasas, nucleótidos cíclicos, el cociente ATP/ADP, superóxido, peróxido, potencial de membrana etc etcc
Proteínas fluorescentes fotoactivables
Fotoactivación paGFP-Actina 5 minutos después 60 minutos después
J. Cell Science 2007,120, 4257
Proteínas fluorescentes reversibles
DRONPA-actina
J. Cell Science 2007,120, 4257
Proteínas fluorescentes fotocrómicas
Dendra2-actina
Fotoconversión 20 minutos después 40 minutos después
J. Cell Science 2007,120, 4257
Fluoróforos extrínsecos
1. Fluoróforos orgánicos
¿Como generamos especificidad molecular en las tinciones?
Algunos fluoróforos como DAPI tiñen moléculas blancos específicas (el ADN en este caso)
Otros no tienen ningún especificidad intrínseca, pero se puede acoplar a otros moléculas que si tienen esta característica.
Marcaje directo con fluoróforos químicos
• Life Technologies, Thermo, Pierce y otros venden kits para marcar y purificar casi cualquier proteína
• Conjugan el fluoróforo con lisinas y cisteínas
• Requiere proteínas recombinantes• Requiere lisinas o cisteínas reactivos
expuestos• Puede interferir con función• Difícil controlar la estequiometria
Marcaje indirecto con fluoróforos químicos(vía anticuerpos)
• No requiere proteínas recombinantes (pero si un anticuerpo primario)• Puede interferir con función• Puede generar puentes (aglomeraciones) en proteínas membranales• En células fijadas para proteínas intracelulares
Afinidad directa Indirecta
DAPI marca ADN Anticuerpos fluorescentes
Múltiples colores
Azul – citoesqueleto Rojo – mitocondria Verde - núcleo
Microscopyu.com
Sensores
Ca2+
pH
Calcium Green
BCECF
Proteínas marcados con fluoróforos compatibles pueden reportar
cambios conformacionales
www.olympusmicro.com
“Quantum dots” – fluoróforos inorgánicos
Cristales semiconductores de dimension nanométrica, clásicamente con composición de un centro de CdSe envuelta enuna cápsula de ZnS y una capa externa polimérico
La supercicie se funcionaliza uniendo anticuerpos, péptidos, lípidos etc
Las longitudes de emisión dependen del tamaño del nanocristal: mientras más grande, el espectro recorre hacía el rojo.
Los QDs contienen desde 100 hasta 100,000 átomos y tienen un diámetro de ~ 10 a 50 átomos equivalente a 2 a 10 nanómetros, hasta 15nm con sus grupos funcionales, el tamaño de una proteína grande
Sus picos de emisión son simétricos y estrechos, y por la relación tamaño-longitud, es fácil generar uno con las características exactas de espectro deseadas
Altamente resistente al fotoblanqueo, con coefficientes de absorción grandes
Químicamente estables
Emisión discontinua (alta taza de parpadeo)
Toxicidad por contener cadmio o otros metales pesados
Biocompatibilidad celular – permeabilidad de membranas y secuestro en organelos
“Quantum dots” 650nm
Franziska Curdt, LNMA
• Nuevas materiales libres de metales pesados
• Nuevas formulaciones con tazas de parpadeo reducidas
• Capas poliméricas más delgadas (20 -> 9nm)
BMC Biotechnology 2007, 7:67
Nature Communications 5,Article number: 3796
Los vicios de ayer son las virtudesde hoy…
Nuevos paradigmas en microscopía han cambiado nuestra visión sobre lo que constituye un “buen fluoróforo”
Microscopía de súper-resolución
Haydee Hernández, Adan Guerrero, LNMA, datos no publicados
Ensayo bi-colorAnálisis 3B
Mandy Juarez, Mario Zurita, Adán Guerrero, unpublished
Verde: p52 -YFPRojo: Histone H2av-RFP
En ciertas implementaciones, la súper-resolución se genera a través del análisis estadístico de la emisión discontinua de fluoróforos adyacentes, para determinar la posición del fluoróforo con mayor precisión (mayor resolución espacial)
¡VIVA EL PARPADEO!
Fluoróforos para microscopíamultifotónica
Parece que los espectros de absorpción en modalidad de dos fotones deben estar alrededor del doble de λ
En realidad tienden ser espectros más anchos y corridos hacía el azul
Two-photon cross section (GM)
• Por lo general empleamos los mismos fluoróforos para estudios en 2 fotón que en 1 fotón.
• Estos fluoróforos tiene valores de GM en el rango de 1 a 10 hasta 100.
• Fluoróforos desarrollados y optimizados específicamente para uso en estudios de multifotóndesde hace 20 años
• Tienden tener sistemas conjugados grandes, y los valores de GM alcanzan hasta dos órdenes de magnitud mayor
Algunos ejemplos
200 m2 purpose-built facility with 6 dark rooms
Microscopes & Imaging Equipment
• 3 confocal microscopes (2 equipped for multiphoton excitation)
• Spinning disk confocal microscope (with FLIM module)
• Total Internal Reflection Microscope (TIRF)
• Macroscope
• Bioluminescence microscope
• Imaging citometer (flow microscope)
• Bioimager (whole-organism)
• 2 Epifluorescence microscopes
• Oportunidades de ser anfitrión a estudiantes de posgrado y investigadores pos-doctorales
• Posgrado de Ciencias Bioquimicas (PNPC – Internacional)
• Ciencias Biomédicas, Ciencias Computacionales, Disciplinas enÓptica
• Cursos de entrenamiento y capacitación.
• Colaboraciones en proyectos de investigación
Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada
www.lnma.unam.mxwww.facebook.com/lnma.mexico
Técnicas disponibles y en desarrollo
• Rastreo de partículas/moléculas individuales
• FRET y Complementación Bimolecular
• Fluorescence Correlation Spectroscopy /FCCS/ Number&Brightness
• Bioluminiscencia
• TIRF
• Macroscopía
• Imagenología in vivo
• Súper-resolución
• FLIM
• Microscopía de flujo
• Análisis de imágenes
16/10/2015
www.lnma.unam.mx
Adán Guerrero
Haydee HernándezFranziska Curdt
Arturo Pimentel
XochitlAlvarado
Andrés Saralegui
Alberto Darszon
Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada
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Daniel Fuentes
Aimée Bastidas
Rodrigo Migueles
Maria Cruz
LNMA
CONACyT & CIC UNAM
Instituto de Biotecnología, UNAM
Red Temática en Biofotónica
Fisicos Ópticos
Médicos
Biólogos
Gracias por su atención!
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Dr. Rachel O. Wong and Philip Williams,
Department of Biological Structure,
University of Washington