fast versus slow microbiology : come e quando · coltura test molecolare campione per sorveglianza...
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Fast versus slow microbiology:
come e quando
P.Pecile
AOU CAREGGI, Firenze
La diagnostica “ molecolare “ in microbiologia clinicaLa diagnostica “ molecolare “ in microbiologia clinica
o Indipendente dalla necessità di
isolare il patogeno in coltura /
visualizzarlo al microscopio
o Possibile automazione
- Sensibilità (patogeni non/
difficilmente coltivabili/
visualizzabili, patogeni non vitali)
- Rapidità
polisaccaridi,proteine, acidi nucleici
microbiologia fast
o Maggiore rapidità
o Maggiore sensibilità
o Maggiore accuratezza
o Aumento dei costi diretti
o Impatto organizzativo
Targets and technologies in diagnostic molecular microbiologyTargets and technologies in diagnostic molecular microbiology
Immunoassays
Mass spectrometry
Filter/liquid hybrid., FISH, Microarrays
NAATs (+microarrays; +ESI-MS)
NGS
Immunoassays
LFIA
Informazioni diverse/complementari vs. altre diagnostiche
o GI
o STD
oMDRO
oMeningite
o Sepsi
o LRT: CAP - HAP/VAP
Possibili applicazioniPossibili applicazioni
sorveglianza
Ricerca della colonizzazione da batteri MDR
Vie respiratorie
Intestino
Cute
Informazioni per infection prevention and control
Informazioni per stewardship antibiotica
MRSA ESBL CRE
CRE: forte raccomandazione a fare sorveglianza pro-attiva
Ricerca della colonizzazione da batteri MDR
Coltura Test molecolare
Campione per sorveglianza (e. g. tampone nasale, rettale …)
Terreni selettivi
cromogeni
RT-PCR da
campione
Risultato in
24-48 h
Risultato in
1-4 h
Fast Microbiology per
screening portatori di
MDRO (MRSA, VRE, CRE)
System Producer ARD TTR
(in ore) Samples
Xpert MDRO Cepheid blaKPC, blaVIM, blaNDM,
blaOXA 1 Rectal swab
Hyplex SuperBug ID Amplex
Biosystems
blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM
<2 Rectal swab
Check-MDR Carba
(con BD-MAX) Check-point
blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM
<2 Rectal swab
CRE ELITe MGB Kit su ELITe InGenius
Elitech blaKPC, blaOXA, blaNDM,
blaVIM, blaIMP <3 Rectal swab
ESBL ELITe MGB Kit su ELITe InGenius
Elitech blaCTX-M-1, blaCTX-M-9,
blaCTX-M-14, blaCTX-M-15, <3 Rectal swab
Eazyplex SuperBug CRE
Amplex
Biosystems
blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM, blaCTX-M
15 minuti Rectal swab (dopo
trattaemento campione)
ARD= antimicrobial resistant determinants
Metodi molecolari per screening enterobatteri MDRMetodi molecolari per screening enterobatteri MDR
ISOLAMENTO25-40 €/giorno
• guanti• camici
• gel alcolico• tempo staff
Sorveglianza pro-attiva su patogeni Gram-negativi MDR
Sorveglianza pro-attiva su patogeni Gram-negativi MDR
WHO, novembre 2017
……there is no one single best approach, but instead the decision should be guided by the local epidemiology, resource availability and the likely clinical impact of a CRE
outbreak…
…this guidance document offers suggestions forbest practices, but is in no way prescriptive for all
healthcare settings and all countries…… The optionsfor intervention can be adopted or adapted to localneeds, depending on the availability of financial and
structural resources….
oDiagnosi agente eziologico infezioneoDiagnosi agente eziologico infezione
Identificazione (ID)Antibiogramma (AB)
Gram ID BIOCHIM
1-2 h
Tempi di risposta (TTR) teorici dalla
positivizzazione
IncubazioneCheck-in
AB
Positivizzazione
AB
preliminare
ID BIOCHIM
preliminare
16 -24 h >= 40 h
Aggiustamento
ter. empirica
Aggiustamento
ter. empirica
Ter.
definitiva
Emocoltura: lo standard-of-care per la diagnostica microbiologica della sepsiEmocoltura: lo standard-of-care per la diagnostica microbiologica della sepsi
2 – 110 h
mediana 21 h
Empirica
- 1 giorno
Gram
72h
ID BIOCHIM
IncubazioneCheck-in IdentificazioneAntibiogramma
ID MALDI
Gram
Incubazione
fast track
2h
ID MALDI
Check-in
T e r a p i a a n t i b i o t i c a
Il flusso di lavoro dell’emocoltura: impatto della spettrometria di massa MALDI-ToFIl flusso di lavoro dell’emocoltura: impatto della spettrometria di massa MALDI-ToF
Definitiva
Empirica
Revisione
più precisa
Dipende orario apertura Lab
subcoltura rapida
6h + atb
24h24h
ID rapida ( 1-2 h / 5-6 h
Costo ridotto grossi carichi di lavoro
NO campioni polimicrobici
NO dati sensibilità
1 - 2 h
MOLECULAR ID
MOLECULAR ANTIBIOGRAM
+2 daysIncubationCheck-in
IdentificationAntibiogram
ID MALDI
+1 day
Gram
Riduzione TTR : NAATRiduzione TTR : NAAT
ID specie/genere ( Si polimicrobiche)
Geni di resistenza
Escherichia coli,
Enterobacter spp.
Klebsiella oxytoca,
Klebsiella pneumoniae
Serratia marcescens
Proteus spp.
Citrobacter spp.
Acinetobacter spp.
Pseudomonas aeruginosa
CTX-M (ESBL)
KPC
OXA
VIM
NDM
IMP
Costi elevati (4 – 5 x)
Empiric
Antimicrobial
chemotherapy
Definitive
Gram
Incubation2 h
ID
AB
7 h
Ibridazione in situ + analisi
morfocinetica cellulare
valori di MIC
- 2 days
Gram
+ 2 giorni
ID BIOCHEM
Incubation IdentificationAntibiogram
ID MALDIE. coli isolate
Riduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse MicroscopyRiduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse Microscopy
Dipende orario apertura Lab
SCATMSCATM
Costi elevati (5 – 10 x)
Neely et al - Sci Trasl Med 2013
Ricerca diretta su sangueRicerca diretta su sangue
Increases 100-1000 fold
the detection sensitivity
in 4-5 hrs
Direttamente da sangue
T2 Magnetic Resonance (T2MR)risonanza magnetica miniaturizzata
• C. albicans e C. tropicalis (A / T)
• C. krusei e C. glabrata (K / G)
• C. parapsilosis (P)
I raggruppamenti di specie sono quelli raccomandati dalla Società Malattie Infettive dell'America per essere utilizzati come
surrogati per i test di sensibilità antifungina per la selezione della terapia antifungina empirica ( 2016)
E. coli
K. pneumoniae
P. aeruginosa
A. baumannii
S. aureus
E. faecium
For target pathogens:
Sensitivity 89.5%
Specificity 98.4%
T2 bacteria
4-5 hrs – from blood
Costi elevati (10 – 20 x)
+2 giorniIncubazioneCheck-in
IdentificazioneAntibiogramma
Riduzione TTR : LFIA per carbapenemasiRiduzione TTR : LFIA per carbapenemasi
ID MALDI
+1 giorno
15 min
da subcoltura rapida
LFIA
+MALDI ID
+ ATBInformazioni: 10/15’
- produzione enzima
- tipo di carbapenemasi
Empirica
Revisione più accurata
T e r a p i a a n t i b i o t i c a
Da sangue4 ore
NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship
Emocoltura positiva dopo 12 ore
Sepsi in paziente post-cardiochirurgico
Empirica: MEROPENEM + VANCOMICINA
Revisione anticipabile di 1-2 giorni
Cocchi Gram-positivi
++
-----------
------
-----
---
emocultura: positiva dopo 11 hrs
Gram-negativi bacilli
Sepsi in pz con chirurgia addominale
Empirico: Pip/Tazo + Vancomicina Escherichia coli,
Enterobacter spp.
Klebsiella oxytoca,
Klebsiella pneumoniae
Serratia marcescens
Proteus spp.
Citrobacter spp.
Acinetobacter spp.
Pseudomonas aeruginosa
CTX-M (ESBL)
KPC
OXA
VIM
NDM
---+-----
-+---
NAAT + microarray
Verigene® GN
1.5 hrs
AST molecolare
ID molecolare
Upgrade terapia anti-CRE con anticipo 24/48 ore
NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship
Dopo 22 h: emocoltura positiva per bacilli Gram-
Considera downgrade a Pip/Tazo (anticipato di 24-48 h)
Empirico: Imipenem/Cilastatin
ID molecolare = E. coli;
AB molecolare: negativo per CTX-M (la più
comune ESBL) e carbapenemasi (KPC, OXA-48,
VIM, NDM)
1.5 hrs
Paziente settico proveniente da casa di riposo (storia
pregressa di UTI)
NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship
Film Array BCID system – studi cliniciFilm Array BCID system – studi clinici
Study designNo.
patientsCountry/ setting Patients Outcomes
Effect on time
to appropiate
therapy
Overall
study
quality
Reference
Single center,
Pre/post68
USA, medical
center
Adults with
VRE BSI
No differences in:
- 30-day mortality
- readmission rate
- ICU LOS
Yes Good
MacVane et
al. Infectious
diseases 2016
Single center,
Pre/post100
UK, Tertiary
Children's
Hospital
Children with
BSI
Several cases
conducted to early
discharge
Yes LowRay et al. –
PIDJ 2016
Prospective
randomized
controlled
617USA, Tertiary care
hospital
Adults and
children with
BSI
No differences in:
- 30-day mortality
- LOS
- Total cost per
patient
Yes HighBanerjee et
al. CID 2015
- No differenze in mortalità e durata degenza
- terapia appropriata in tempi ridotti
Standard interno ad una concentrazione nota
di 10^6 copie/ml La differenza tra
l’amplificazione del QSM e l’amplificazione di un target viene usata per estrapolare la concentrazione in copie/mL del target
USO DI UN MATERIALE STANDARD INTERNO CERTIFICATO A CONCENTRAZIONE NOTA (QSM: Quantified Standard Material)Riferimento interno per determinare le copie/ml
I risultati relativi ai batteri comuni sono di tipo semi-quantitativo, conrefertazione in «bin»: 104, 105,106, >107 copie genomiche/ml di campione
Le copie/mL NON sono CFU.
I risultati vanno sempre interpretati tenendo in considerazione la presentazione clinica (sintomatologia), la storia clinica e gli altri dati diagnostici disponibili.Non dovrebbe impiegato come unico strumento per la gestione del paziente, la diagnosi ed il trattamento.
the FilmArray RP is essential for the administration of appropriate antiviral therapy, which dramatically shortens hands-on time (62.7 hours versus 1.2 hours); the reduction in average time to discontinuation of oseltamivir resulted in cost savings of approximately US$34.16 per patient . In addition, FilmArray RP results in overall decreased duration of antibiotic use of half a day, a shorter stay (a quarter of a day less)
The Clinical Significance of FilmArray Respiratory Panel in Diagnosing Community-Acquired PneumoniaHuanzhu Chen, 1 Huilan Weng, 2 Meirui Lin, 2 Ping He, 1 Yazhen Li, 1 Qingdong Xie, 1 Changwen Ke, 1 and Xiaoyang Jiao 1
Diagnostica microbiologica fast: limiti
Arena et al – Fut Microbiol 2017
o NAAT : ricerca solo alcuni patogeni / meccanismi di R
o NAAT : possibile sovrastima resistenze (geni non espressi)
o Informa prevalentemente su resistenze
o No informazioni sulla MIC
o Informazioni di tipo diverso / non sostitutivo
Antibiogramma molecolare
• si presume un fenotipo di resistenza
- presenza di un gene di resistenza non necessariamente correla con sua espressione
- assenza di un gene di resistenza non necessariamente correla con la sensibilità a un farmaco che non è interessato da quel meccanismo di resistenza se non si possono escludere altri meccanismi di resistenza
AntibioticMIC mg/L
(S/I/R)
Amoxi/Clav >16 R
Pip/Tazo >128 R
Ceftriaxone >4 R
Ceftazidime >128 R
Cefepime >32 R
Ertapenem >1 R
Imipenem >16 R
Meropenem >64 R
Fosfomycin >128 R
Amikacin >16 R
Gentamicin 1 S
Ciprofloxacin >4 R
Tigecycline 1 S
Colistin >8 R
CAZ-AVI 4 S
antibiogramma fenotipico
Antibiogramma molecolare
Genii resistenza:
CTX-M negativo
KPC positivo
VIM negativo
OXA-48 negativo
NDM negativo
- Presunta resistanza ai beta-
lattamici, inclusi
carbapenemi
- Probabile sensibilità a CAZ-
AVI
- Nessuna informazione sulla
sensibilità a altre molecole
- No MIC
Antibiotic
Amoxi/Clav R
Pip/Tazo R
Ceftriaxone R
Ceftazidime R
Cefepime R
Ertapenem R
Imipenem R
Meropenem R
Fosfomycin ?
Amikacin ?
Gentamicin ?
Ciprofloxacin ?
Tigecycline ?
Colistin ?
CAZ-AVI S
Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico
Klebsiella pneumoniae
AntibioticMIC mg/L
(S/I/R)
Amoxi/Clav 8 S
Pip/Tazo 4 S
Ceftriaxone 0.12 S
Ceftazidime 0.25 S
Cefepime <0.12 S
Ertapenem 0.12 S
Imipenem <0.50 S
Meropenem <0.12 S
Fosfomycin 8 S
Amikacin 4 S
Gentamicin 1 S
Ciprofloxacin >4 R
Tigecycline 0.5 S
Colistin 0.5 S
- Probabile sensibilità ai
carbapenemi; possibile
sensibilità cefalosporine
e BLICs
- Nessuna informazione sulla
sensibilità a altre molecole
- No MIC
Antibiotic
Amoxi/Clav S?
Pip/Tazo S?
Ceftriaxone S?
Ceftazidime S?
Cefepime S?
Ertapenem S
Imipenem S
Meropenem S
Fosfomycin ?
Amikacin ?
Gentamicin ?
Ciprofloxacin ?
Tigecycline ?
Colistin ?
antibiogramma fenotipico
E. coli
Geni resistenza
CTX-M negative
KPC negative
VIM negative
OXA-48 negative
NDM negative
Antibiogramma molecolare
Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico
NOTA : Assenza dei più comuni geni codificantiper carbapenemasi: l’informazione non consente dipredire il profilo di resistenza ai ß-lattamici.Probabile sensibilità a ceftalozano/tazobactam
Maggiore rapidità, ma anche limiti che
devono essere conosciuti, e diversità nel
significato delle informazioni
Fast versus slow microbiology
Quando ????
Diagnostic stewardship: prioritizing patients for access to fast-track Micro Labs
Microbiologia fast: conclusioniMicrobiologia fast: conclusioni
o Nuove tecnologie diagnostiche consentono di
accorciare significativamente i tempi di risposta ( non
dipendono solo dalla scelta del test, ma anche dalla
organizzazione del laboratorio)
o Evidenze per impatto clinico: presenti ma ancora
limitate (complessità degli studi di validazione)
o Impatto economico ed organizzativo: necessità di
posizionarle correttamente nel percorso diagnostico
(stewardship diagnostica)
o Verso la differenziazione dei processi diagnostici per
“intensità di cura”