![Page 1: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/1.jpg)
Técnicas de Ingeniería Genética
![Page 2: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/2.jpg)
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
Kary Mullis de Cetus Corporation……….1985
![Page 3: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/3.jpg)
![Page 4: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/4.jpg)
Video PCR
pcr video1.exe
![Page 5: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/5.jpg)
![Page 6: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/6.jpg)
Termociclador
Tapa que calienta
![Page 8: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/8.jpg)
Taq polimerasa
![Page 9: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/9.jpg)
Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable aislada de la bacteria termofílica Thermus acuaticus por Thomas Brock en 1965
Características:
Temperatura óptima 75-80 ºC., vida media 9 min. a 97,5 ºC.
No tiene actividad 3´a 5´exonucleasa baja fidelidad
Deja A en extremos 3´
Otras ADN polimerasas termoestables:
Pfu ADN polimerasa, aislada la bacteria termofílica Pyrococcus furiosus .Tiene actividad 3´a 5´exonucleasa alta fidelidad
![Page 10: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/10.jpg)
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
![Page 11: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/11.jpg)
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done using lac I-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.
FIDELIDAD
![Page 12: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/12.jpg)
A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier's recommendations using varying extension times.
PROCESSIVITY
Extreme processivity: The Phusion polymerase has the highest processivity of all thermostable DNA polymerases tested
![Page 13: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/14.jpg)
Templado 1 μg ADN humano, copia simple ADN: 105-106 moléculas blanco 10 ng ADN de levadura 1 ng ADN E. coli
Taq: 1-2,5 u
dNTPs : 20- 200 μM
Mg++ : 0.5-2.5 mM
Primers: 0.1-0.5 μM
![Page 15: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/15.jpg)
Diseño de primers
Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG)
Evitar fragmentos largos de Gs (problema en síntesis)
Largo 18-30 nuc.
El largo de los primers no debe diferir en más de 3 nuc.
Extremo 3´: G o C, pero evitar 3 o más Gs o Cs seguidas
Tm 50-60 ºC
Contenido de GC: 40 -60 %
Evitar palindromos y repeticiones invertidas
![Page 16: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/16.jpg)
Evitar complementariedad entre los pares de primers
Controlar la formación de dímeros y horquillas : evitar estructuras con ΔG<-5kcal/mol
Primers muy largos, > 50 b deben, ser purificados
Verificar que los primers estén diseñados y encargados en la orientación correcta
Sitios de corte en extremos, agregar bases extra.
![Page 17: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/17.jpg)
Amplificación de un mismo gen de distinto organismo
Primers degenerados Diseño de primers basado en la sec. de aa. de la proteína
Buscar zonas conservadas para ubicar los primers
Largo de primers 6 a 7 aa, (agregar colas)
Buscar el primer menos degenerado
Fragmento de PCR: alrededor de 400 pb
Desventaja: baja especificidad
Touchdown PCR: gradual de la temperatura
![Page 18: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/18.jpg)
1 opción M W2 opciones F Y H Q N K D E C3 opciones I4 opciones V P T A G6 opciones L S R
Cálculo de “degeneración”
DEWVP: 2x2x1x4x4= 64
![Page 19: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/19.jpg)
Condiciones de reacción
Temperatura de Annealing /hibridación: 5ºC por debajo de la Tm
Elongación: 0,5-3 min (2 min para 1 kb), 68-72 ºC
Ciclos: el número depende de la cc. del ADN blanco
![Page 20: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/20.jpg)
Causas del plateau: degradación de dNTPs y enzima, depleción de primers y dNTPs, inhibición por formación de producto (pirofosfato), competición por reactivos por productos inespecíficos,
![Page 21: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/21.jpg)
Impureza Concentración inhibitoria
SDS > 0.005 % (p/v)Fenol > 0.2 % (p/v)Etanol > 1 % (v/v)Isopropanol > 1 % (v/v) Acetato de sodio > 5 mM Cloruro de sodio > 25mM EDTA > 0.5 mMHemoglobina > 1 mg/ml Heparina > 0.15 UI/mlUrea > 20 mMMezcla de reacción de RT > 15 % (p/v)
IMPUREZAS QUE INHIBEN LA PCR
![Page 22: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/22.jpg)
Aditivos
Condiciones de desnaturalización del ADN más fuertes: para ADN con alto contenido de G+C
DMSODMF hasta 10 % (V o P/P)UREAFORMAMIDA
Para amplificar secuencias muy largas:
DMSO ………….ayuda en productos >1 kbFORMAMIDA …… mejora especificidadGLICEROL ………templados con alto contenido de G+CPEG ………………cc. de templado muy baja
![Page 23: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/23.jpg)
ALGUNOS TIPOS DE PCR
PCR ANIDADA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLEX
RT-PCR
PCR EN TIEMPO REAL= PCR cuantitativa (qPCR)
PCR DIGITAL
![Page 24: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/24.jpg)
PCR ANIDADA = NESTED PCR
Especificidad
![Page 25: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/25.jpg)
1º: amplificación del ADN blanco. 2º: hibridación in situ con sonda
PCR in situ
![Page 26: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/26.jpg)
PCR multiplex
Uso de varios primers al mismo tiempo
![Page 27: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/27.jpg)
RT PCR
![Page 28: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/29.jpg)
PCR en tiempo real
• Amplificación y detección simultánea, en el mismo vial cerrado
• Se puede medir en cada momento la cantidad de ADN sintetizado, por lo tanto permite conocer la cinética de la reacción de amplificación
• Se mide la fluorescencia emitida por colorantes que se unen al ADN o por sondas específicas marcadas con fluorocromos
![Page 30: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/30.jpg)
FASES DE LA PCR
Nº DE CICLO
Log [ADN]
3 replicados de una misma muestra
![Page 31: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/33.jpg)
Curva de amplificación
El programa calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo con respecto a la señal de base : ciclo umbral (CT: threshold cycle)
![Page 34: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/34.jpg)
El punto en donde se acumula fluorescencia en la muestra y cruza el umbral se llama ciclo umbral: Ct
El Ct es inversamente proporcional al número de copias del molde, a mayor concentración del ADN molde menor Ct
![Page 35: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/35.jpg)
PCR EN TIEMPO REAL
Los valores de Ct son inversos a la cantidad de ADN en la muestra y se correlacionan con el número de copias. Valores bajos de Ct indican grandes cantidades de ácido nucleico mientras que Ct altos lo opuesto
![Page 36: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/36.jpg)
![Page 37: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/37.jpg)
Distintas curvas de disociación de varios productos de PCR (en colores distintos). Se observan reacciones con amplificación de un producto específico (rosa, azul) y otras con resultado negativo (verde, naranja); se señala con una flecha el pico de fusión dado para los dímeros de los cebadores, diferente al esperado para el producto de amplificación en cuestión.
Curvas de disociación
![Page 38: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/38.jpg)
Colorantes que se unen a ADN ds:
SYBR Green, fluoresce al unirse al ADN
BaratoSe une a productos inespecíficos como dímeros de primers
Sondas de hibridación
CarasEspecíficasSe puede usar en PCR multiplex
![Page 39: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/39.jpg)
PCR EN TIEMPO REAL sondas de hibridación específicas
Sondas de hidrólisis Molecular beacons Sondas FRET
![Page 40: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/40.jpg)
PCR DIGITAL
![Page 41: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/41.jpg)
![Page 42: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/42.jpg)
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
![Page 43: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/43.jpg)
VECTOR CON ORI DE BACTERIÓFAGO
Preparar DNA del fago e hibridar con oligoMutagénico (dot blot) para identificar positivos
+ -+ + -
Vectores con ori de fago: se coinfectan con fago helper para generar viriones simple cadena
![Page 44: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/44.jpg)
MUTAGÉNESIS POR PCR
![Page 45: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/45.jpg)
Phusion™ Site-Directed Mutagenesis Kit Thermo Fisher
Because minute amounts of template DNA are exponentially amplified in this method, the fraction of non-mutated template is minimal. Thus there is no need to destroy it in a separate step. Phusion Hot Start II DNA Polymerase ensures high fidelity for the exponential amplification, thus reducing unwanted secondary mutations and enabling
amplification of large plasmids up to 10 kb
![Page 46: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/46.jpg)
DpnI
Primers mutagénicos
Stratagene
![Page 47: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/47.jpg)
CASSETTE MUTAGÉNESIS
![Page 48: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/48.jpg)
![Page 49: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/49.jpg)
![Page 50: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/50.jpg)
SECUENCIACIÓN DE ADN
![Page 51: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/51.jpg)
SECUENCIACIÓN DE ADN
Degradación química: Maxam y Gilbert
Terminación de cadena: Sanger didesoxi
![Page 52: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/52.jpg)
SECUENCIACIÓN DE ADN
POR DEGRADACIÓN QUÍMICA- MAXAM Y GILBERT
Corte específico de bases por reactivos químicos de una molécula de ADN marcada en el extremo y posterior electroforesis1º se modifican las bases (G, G+A, C+T, C) y luego se incuban con piperidina caliente que rompe el enlace azúcar fosfato
Ventajas.La secuencia se obtiene de la molécula originalSe puede determinar la sec. muy cerca del extremo marcado (2 o 3 bases)Se puede determinar la sec. de ADN totalmente desconocido
DesventajasDiferentes condiciones para cada reacción….+ lento y menos reproducibleSec. Más cortas
![Page 53: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/53.jpg)
MÉTODO DE TERMINACIÓN DE LA CADENA: SANGER DIDESOXI
Emplea a la ADN polimerasa para extender la hebra de ADN hasta que se termina por incorporación de un 2´,3´-didesoxinucleótido (ddNTP)
Marcación de la hebra de ADN
☻Extremo 5´: primer marcado con [γ-32P]ATP por T4 polinucleótido quinasa ☻Hebra sintetizada: se usa un dNTP radiactivo (en general 35S)
☻Extremo didesoxi. Cada didesoxi está marcado con un colorante fluorescente distinto. Para sec. automático.
![Page 54: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/54.jpg)
AZT
![Page 55: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/55.jpg)
![Page 56: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/56.jpg)
![Page 57: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/57.jpg)
Gel de secuencia
![Page 58: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/58.jpg)
Video secuenciación
sec. ADN Sanger video.exe
![Page 59: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/59.jpg)
Secuenciación de ADN (automática en gel)
a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción
![Page 60: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/60.jpg)
![Page 61: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/61.jpg)
dena
tura
lizat
ion
Secuenciación de ADN (automática en capilar)
![Page 62: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/62.jpg)
![Page 63: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/63.jpg)
Video sec. automática
secuenciación automática ADN video.exe
![Page 64: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/64.jpg)
Electroferograma: gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis.
![Page 65: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/65.jpg)
Alineamiento de secuencias
![Page 66: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/66.jpg)
https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html
![Page 67: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/67.jpg)
>secuenciaAatgggtttaaacccgaaacgg
>secuenciaBatgggtttaaacccgaaacgg
A. global se intenta que el alineamiento cubra las dos secuencias completamente introduciendo los gaps que sean necesarios.A. local se alinean sólo las zonas más parecidas
![Page 68: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/68.jpg)
Cuando falta una base decimos que hay un gap.Un gap puede corresponder tanto a una deleción
como a una inserción.
![Page 69: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/69.jpg)
gaps
![Page 70: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/70.jpg)
En el alineamiento de secuencias de proteínas, la identidad de secuencias se refiere al porcentaje de coincidencias de los mismos residuos de aminoácidos entre las dos secuencias alineadas.
Por su parte la similitud de secuencias se refiere al porcentaje de residuos alineados que tienen características fisicoquímicas similares y que pueden ser substituídos entre sí
Similitud e identidad de secuencias
Cuando se trata de secuencias de nucleótidos estos dos términos son sinónimos
Sin embargo, para secuencias de proteínas los dos conceptos son muy diferentes
![Page 71: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/71.jpg)
![Page 72: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/72.jpg)
![Page 73: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/73.jpg)
![Page 74: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/74.jpg)
![Page 75: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/75.jpg)
PRIMER WALKING
![Page 76: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/76.jpg)
SHOT GUN
Método para determinar secuencias de fragmentos de ADN muy grandes
![Page 77: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/77.jpg)
Strand Sequence
Origin AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
First shotgun sequence AGCATGCTGCAGTCATGCT----------------------------------------------------TAGGCTA
Second shotgun sequence
AGCATG----------------------------------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
![Page 79: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/79.jpg)
![Page 80: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/80.jpg)
Principio general de los diferentes sistemas de pirosecuenciación
Ronaghi M Genome Res. 2001;11:3-11
©2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
APS: adenosina fosfo sulfato
![Page 81: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/81.jpg)
![Page 82: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/82.jpg)
![Page 83: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/83.jpg)
PIROSECUENCIACIÓN
Library Preparation Sample Input and Fragmentation
![Page 84: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/84.jpg)
PCR
One Fragment = One Bead emPCR (Emulsion PCR) Amplification
![Page 85: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/85.jpg)
PIROSECUENCIACIÓN
APS:Adenosina fosfo sulfato
Se agregan los dNTPs secuencialmente. Después de cada agregado se lava
![Page 86: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/86.jpg)
Data Analysis
![Page 87: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/87.jpg)
SECUENCIACIÓN ION TORRENT
Se determina el cambio de pH
![Page 88: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/88.jpg)
![Page 89: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/89.jpg)
SECUENCIACIÓN POR NANOPOROS
![Page 90: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/90.jpg)
![Page 91: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/91.jpg)
![Page 92: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/92.jpg)
![Page 93: Técnicas de Ingeniería Genéticabiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/... · Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar](https://reader034.vdocuments.us/reader034/viewer/2022042121/5e9b91b3c1d42e70fb021f9f/html5/thumbnails/93.jpg)