Técnicas de Ingeniería Genética

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR

Kary Mullis de Cetus Corporation……….1985

Video PCR

pcr video1.exe

Termociclador

Tapa que calienta

Tubos de pared delgada

Taq polimerasa

Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable aislada de la bacteria termofílica Thermus acuaticus por Thomas Brock en 1965

Características:

Temperatura óptima 75-80 ºC., vida media 9 min. a 97,5 ºC.

No tiene actividad 3´a 5´exonucleasa baja fidelidad

Deja A en extremos 3´

Otras ADN polimerasas termoestables:

Pfu ADN polimerasa, aislada la bacteria termofílica Pyrococcus furiosus .Tiene actividad 3´a 5´exonucleasa alta fidelidad

Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase

Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase

Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done using lac I-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.

FIDELIDAD

A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier's recommendations using varying extension times.

PROCESSIVITY

Extreme processivity: The Phusion polymerase has the highest processivity of all thermostable DNA polymerases tested

Templado 1 μg ADN humano, copia simple ADN: 105-106 moléculas blanco 10 ng ADN de levadura 1 ng ADN E. coli

Taq: 1-2,5 u

dNTPs : 20- 200 μM

Mg++ : 0.5-2.5 mM

Primers: 0.1-0.5 μM

Diseño de primers

Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG)

Evitar fragmentos largos de Gs (problema en síntesis)

Largo 18-30 nuc.

El largo de los primers no debe diferir en más de 3 nuc.

Extremo 3´: G o C, pero evitar 3 o más Gs o Cs seguidas

Tm 50-60 ºC

Contenido de GC: 40 -60 %

Evitar palindromos y repeticiones invertidas

Evitar complementariedad entre los pares de primers

Controlar la formación de dímeros y horquillas : evitar estructuras con ΔG<-5kcal/mol

Primers muy largos, > 50 b deben, ser purificados

Verificar que los primers estén diseñados y encargados en la orientación correcta

Sitios de corte en extremos, agregar bases extra.

Amplificación de un mismo gen de distinto organismo

Primers degenerados Diseño de primers basado en la sec. de aa. de la proteína

Buscar zonas conservadas para ubicar los primers

Largo de primers 6 a 7 aa, (agregar colas)

Buscar el primer menos degenerado

Fragmento de PCR: alrededor de 400 pb

Desventaja: baja especificidad

Touchdown PCR: gradual de la temperatura

1 opción M W2 opciones F Y H Q N K D E C3 opciones I4 opciones V P T A G6 opciones L S R

Cálculo de “degeneración”

DEWVP: 2x2x1x4x4= 64

Condiciones de reacción

Temperatura de Annealing /hibridación: 5ºC por debajo de la Tm

Elongación: 0,5-3 min (2 min para 1 kb), 68-72 ºC

Ciclos: el número depende de la cc. del ADN blanco

Causas del plateau: degradación de dNTPs y enzima, depleción de primers y dNTPs, inhibición por formación de producto (pirofosfato), competición por reactivos por productos inespecíficos,

Impureza Concentración inhibitoria

SDS > 0.005 % (p/v)Fenol > 0.2 % (p/v)Etanol > 1 % (v/v)Isopropanol > 1 % (v/v) Acetato de sodio > 5 mM Cloruro de sodio > 25mM EDTA > 0.5 mMHemoglobina > 1 mg/ml Heparina > 0.15 UI/mlUrea > 20 mMMezcla de reacción de RT > 15 % (p/v)

IMPUREZAS QUE INHIBEN LA PCR

Aditivos

Condiciones de desnaturalización del ADN más fuertes: para ADN con alto contenido de G+C

DMSODMF hasta 10 % (V o P/P)UREAFORMAMIDA

Para amplificar secuencias muy largas:

DMSO ………….ayuda en productos >1 kbFORMAMIDA …… mejora especificidadGLICEROL ………templados con alto contenido de G+CPEG ………………cc. de templado muy baja

ALGUNOS TIPOS DE PCR

PCR ANIDADA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLEX

RT-PCR

PCR EN TIEMPO REAL= PCR cuantitativa (qPCR)

PCR DIGITAL

PCR ANIDADA = NESTED PCR

Especificidad

1º: amplificación del ADN blanco. 2º: hibridación in situ con sonda

PCR in situ

PCR multiplex

Uso de varios primers al mismo tiempo

RT PCR

PCR en tiempo real

• Amplificación y detección simultánea, en el mismo vial cerrado

• Se puede medir en cada momento la cantidad de ADN sintetizado, por lo tanto permite conocer la cinética de la reacción de amplificación

• Se mide la fluorescencia emitida por colorantes que se unen al ADN o por sondas específicas marcadas con fluorocromos

FASES DE LA PCR

Nº DE CICLO

Log [ADN]

3 replicados de una misma muestra

Curva de amplificación

El programa calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo con respecto a la señal de base : ciclo umbral (CT: threshold cycle)

El punto en donde se acumula fluorescencia en la muestra y cruza el umbral se llama ciclo umbral: Ct

El Ct es inversamente proporcional al número de copias del molde, a mayor concentración del ADN molde menor Ct

PCR EN TIEMPO REAL

Los valores de Ct son inversos a la cantidad de ADN en la muestra y se correlacionan con el número de copias. Valores bajos de Ct indican grandes cantidades de ácido nucleico mientras que Ct altos lo opuesto

Distintas curvas de disociación de varios productos de PCR (en colores distintos). Se observan reacciones con amplificación de un producto específico (rosa, azul) y otras con resultado negativo (verde, naranja); se señala con una flecha el pico de fusión dado para los dímeros de los cebadores, diferente al esperado para el producto de amplificación en cuestión.

Curvas de disociación

Colorantes que se unen a ADN ds:

SYBR Green, fluoresce al unirse al ADN

BaratoSe une a productos inespecíficos como dímeros de primers

Sondas de hibridación

CarasEspecíficasSe puede usar en PCR multiplex

PCR EN TIEMPO REAL sondas de hibridación específicas

Sondas de hidrólisis Molecular beacons Sondas FRET

PCR DIGITAL

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

VECTOR CON ORI DE BACTERIÓFAGO

Preparar DNA del fago e hibridar con oligoMutagénico (dot blot) para identificar positivos

+ -+ + -

Vectores con ori de fago: se coinfectan con fago helper para generar viriones simple cadena

MUTAGÉNESIS POR PCR

Phusion™ Site-Directed Mutagenesis Kit Thermo Fisher

Because minute amounts of template DNA are exponentially amplified in this method, the fraction of non-mutated template is minimal. Thus there is no need to destroy it in a separate step. Phusion Hot Start II DNA Polymerase ensures high fidelity for the exponential amplification, thus reducing unwanted secondary mutations and enabling

amplification of large plasmids up to 10 kb

DpnI

Primers mutagénicos

Stratagene

CASSETTE MUTAGÉNESIS

SECUENCIACIÓN DE ADN

SECUENCIACIÓN DE ADN

Degradación química: Maxam y Gilbert

Terminación de cadena: Sanger didesoxi

SECUENCIACIÓN DE ADN

POR DEGRADACIÓN QUÍMICA- MAXAM Y GILBERT

Corte específico de bases por reactivos químicos de una molécula de ADN marcada en el extremo y posterior electroforesis1º se modifican las bases (G, G+A, C+T, C) y luego se incuban con piperidina caliente que rompe el enlace azúcar fosfato

Ventajas.La secuencia se obtiene de la molécula originalSe puede determinar la sec. muy cerca del extremo marcado (2 o 3 bases)Se puede determinar la sec. de ADN totalmente desconocido

DesventajasDiferentes condiciones para cada reacción….+ lento y menos reproducibleSec. Más cortas

MÉTODO DE TERMINACIÓN DE LA CADENA: SANGER DIDESOXI

Emplea a la ADN polimerasa para extender la hebra de ADN hasta que se termina por incorporación de un 2´,3´-didesoxinucleótido (ddNTP)

Marcación de la hebra de ADN

☻Extremo 5´: primer marcado con [γ-32P]ATP por T4 polinucleótido quinasa ☻Hebra sintetizada: se usa un dNTP radiactivo (en general 35S)

☻Extremo didesoxi. Cada didesoxi está marcado con un colorante fluorescente distinto. Para sec. automático.

AZT

Gel de secuencia

Video secuenciación

sec. ADN Sanger video.exe

Secuenciación de ADN (automática en gel)

a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción

dena

tura

lizat

ion

Secuenciación de ADN (automática en capilar)

Video sec. automática

secuenciación automática ADN video.exe

Electroferograma: gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis.

Alineamiento de secuencias

https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html

>secuenciaAatgggtttaaacccgaaacgg

>secuenciaBatgggtttaaacccgaaacgg

A. global se intenta que el alineamiento cubra las dos secuencias completamente introduciendo los gaps que sean necesarios.A. local se alinean sólo las zonas más parecidas

Cuando falta una base decimos que hay un gap.Un gap puede corresponder tanto a una deleción

como a una inserción.

gaps

En el alineamiento de secuencias de proteínas, la identidad de secuencias se refiere al porcentaje de coincidencias de los mismos residuos de aminoácidos entre las dos secuencias alineadas.

Por su parte la similitud de secuencias se refiere al porcentaje de residuos alineados que tienen características fisicoquímicas similares y que pueden ser substituídos entre sí

Similitud e identidad de secuencias

Cuando se trata de secuencias de nucleótidos estos dos términos son sinónimos

Sin embargo, para secuencias de proteínas los dos conceptos son muy diferentes

PRIMER WALKING

SHOT GUN

Método para determinar secuencias de fragmentos de ADN muy grandes

Strand Sequence

Origin AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

First shotgun sequence AGCATGCTGCAGTCATGCT----------------------------------------------------TAGGCTA

Second shotgun sequence

AGCATG----------------------------------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA

Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/291/5507/1218/F7

Principio general de los diferentes sistemas de pirosecuenciación

Ronaghi M Genome Res. 2001;11:3-11

©2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

APS: adenosina fosfo sulfato

PIROSECUENCIACIÓN

Library Preparation Sample Input and Fragmentation

PCR

One Fragment = One Bead emPCR (Emulsion PCR) Amplification

PIROSECUENCIACIÓN

APS:Adenosina fosfo sulfato

Se agregan los dNTPs secuencialmente. Después de cada agregado se lava

Data Analysis

SECUENCIACIÓN ION TORRENT

Se determina el cambio de pH

SECUENCIACIÓN POR NANOPOROS