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DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
UNA MEZCLA DE SUSTANCIAS
Práctica 1
Universidad de GranadaFacultad de Farmacia.
Departamento de Química Física.
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Objetivo de la práctica:
Determinar las concentraciones de vitamina B2 y B12
en una mezcla de ambas, utilizando un método
espectrofotométrico.
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Fundamentos teóricos
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Siendo:
P0= Potencia de la radiación incidente
Ps= Potencia de la radiación a la salida
b= espesor de la cubeta que contiene a
la muestra
Ps Ps / P0 = Transmitancia- log — = - log T = A = a b c A = Absorbancia (adimensional)
P0 a = absortividad molar (L . mol-1. cm-1 )c = concentración molar (moles/L)
A = - log T = - log ( T.100/100) = - log T% + 2 ; A = 2 – log T%
La ley más importante sobre la absorción de radiación electromagnética
en disoluciones, es la de Beer : A = a b c
b
P0 Ps
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Determinación de a:
1.- Registro del espectro de la sustancia ( A frente a la longitud de onda, λ )
Longitud de onda λ (nm)
2.- Selección de la longitud de onda máxima ( λmax) en el espectrofotómetro
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3.- Preparación de disoluciones patrón de concentraciones conocidas.
4.- Medida de la Absorbancia (A) de cada disolución de concentración conocida a la longitud de onda seleccionada ( λmax)
Concentración Absorbancia (A)C1 A1
C2 A2
C2 A3
C3 A4
C4 A5
C5 A6
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5.- Representación de A (absorbancia) frente a C (concentración).
A
C
6.- Trazar la recta que mejor se ajuste
a los datos experimentales. Si pasa
por el origen se cumple la ley de Beer
y la pendiente será a.b
(absortividad . espesor de la cubeta).
y2
y1
x2x1
Nota: Para determinar la pendiente por el método gráfico, se toman dos puntos dela recta (no experimentales): (y2 ,x2) e (y1 , x1) y se plantea la siguiente expresión
12
12
xxyyPendiente
−−
=
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Análisis de mezclas
Amezcla = Acomponente 1 + Acomponente 2+ Acomponente 3+ ....
1.- Se escogen tantas λmax como componentes tenga la mezcla.
A
Longitud de onda (nm)
445 nm550 nm
En nuestro caso serán dos: 445 nm (máximo de la vitamina B2) y 550 nm(máximo de la vitamina B12)
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2.- Se determinan las absortividades molares de cada vitamina mediante la ley de Beer, a las 2 λmaxseleccionadas:
12445
122445
2445
12550
1212550
122550
2550
BBBBmezcla
BBBBBBmezcla
cbacbaA
cbacbacbaA
⋅⋅+⋅⋅=
⋅⋅=⋅⋅+⋅⋅=
Calculamos cB2 y cB12
Se establece el sistema de ecuaciones:
) esa a absorbe (No 0
; ; 550
2
55012
44512
4452
λ=B
BBB
a
aaa
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Método experimental
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Esquema de un espectrofotómetro de haz simple.
Lámpara W Rendijas
Red
Muestra
Detector
Indicador
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Espectrofotómetros:
El manejo de cada uno de ellos se indica a continuación.
Spectro 23
SP-2100P+
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Manejo del SP-2100P+
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Encender el espectrofotómetro pulsando el botón rojo.
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Seleccionar la longitud de onda mediante las flechas.El modo de medida (transmitancia o absorbancia) con el botón MODE.
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ReferenciaMuestra
Abrir la tapa del portamuestras
Colocar las cubetasde la referencia y la muestra en los lugares señalados.
Entre R y S1 se encuentrael obturador (en esa posición intermedia, latransmitancia debe ser0%)
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Cuando la radiación atraviesa la referencia, debemos ajustar al 100 %T.
Para ello, pulsar el botón que indica 100%T.
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Tirar suavemente del mando externo
Cuando la radiación incida sobre el obturador,la transmitancia debe ser del 0 %. De no ser así,la fijaremos pulsando el botón 0%T
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Si seguimos tirando del mando externo, la radiación incide sobre la muestra y podremos leer el valor de transmitancia.
Si deseamos el valor de absorbancia,pulsaremos el botón MODE
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Manejo del Spectro 23
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Encender el espectrofotómetro
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Seleccionar Absorbance pulsando A T / C F,
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Ajustar la longitud de onda mediante el mando adecuado.
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Abrir la tapa del receptáculo que contiene los portacubetas.
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Colocar la referencia en
el camino de la radiación.
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Introducimos la muestra en el portacubetas adecuado.
Cerrar la tapa.
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Pulsar en 0 de A, 100% T (corresponde a la referencia)
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Cuando la referencia es atravesada por la radiación,
el valor de Absorbancia debe ser 0.000
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Con la tapa cerrada y tirando del mando suavemente, la muestra queda
colocada en la trayectoria de la radiación.
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Efectuar la medida de absorbancia
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Método experimental
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Partiremos de dos disoluciones de las vitaminas B2 y B12:
1º) Disolución madre (DM) de vitamina B2
que contiene 0’030 g disueltos en 1 L de agua
(peso molecular de la vitamina B2 = 376’4 g/mol).
2º) Disolución madre de vitamina B12
que contiene 0’150 g disueltos en 1 L de agua
(peso molecular de la vitamina B12 = 1355’4 g/mol).
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Disoluciones de Vitamina B2 y B12
Células de vidrio de 1 cm de espesor Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 10 ml
Material
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1.- Registrar los espectros visibles de cada una de las
disoluciones anteriores (vitamina B2 y vitamina B12) y
calcular la longitud de onda a la cual presentan el máximo
de absorción.
λmax B2 = 445 nm
λmax B12 = 550 nm
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2 - Preparar 9 disoluciones de vitamina B2, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml
de la disolución madre de vitamina B2 (0,030 g/L)
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completando hasta 10 ml con agua destilada.
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Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B2 : 0,030 g/L
Expresada en molaridad sería: ( 0,030 g/L) / (376,4 g/mol) = 7.97 10-5 M
donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B2 .
Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal
Tubo 1 (1 mL) 1. 7,97 .10-5 = 10 . C1 C1 = 7,97 .10-6 M
Tubo 1 (2 mL) 2. 7,97 .10-5 = 10 . C2 C2 = 1,59 .10-5 M
Tubo 1 (3 mL) 3. 7,97 .10-5 = 10 . C3 C3 = 2,39 .10-5 M
Tubo 1 (4 mL) 4. 7,97 .10-5 = 10 . C4 C4 = 3,19 .10-5 M
Tubo 1 (5 mL) 5. 7,97 .10-5 = 10 . C5 C5 = 3,99 .10-5 M
Tubo 1 (6 mL) 6. 7,97 .10-5 = 10 . C6 C6 = 4,78 .10-5 M
Tubo 1 (7 mL) 7. 7,97 .10-5 = 10 . C7 C7 = 5,58 .10-5 M
Tubo 1 (8 mL) 8. 7,97 .10-5 = 10 . C8 C8 = 6,38 .10-5 M
Tubo 1 (9 mL) 9. 7,97 .10-5 = 10 . C9 C9 = 7,17 .10-5 M
Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.
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4.- Medir la absorbancia de cada uno de estos tubos a la longitud
de onda del máximo: 445 nm. La vitamina B2 no absorbe a 550 nm.
Vitamina B2
c (mol/L) A(λ=445 nm)7,97E-061,59E-052,39E-053,19E-053,99E-054,78E-055,58E-056,38E-057,17E-05
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5.- Construir una curva de calibrado para la longitud de onda de 445 nm,
representando A (absorbancia) en ordenadas frente a concentración
en moles/L , en abscisas .
0,0000,2000,4000,6000,8001,0001,2001,4001,600
0,00E + 00 2,00E -05 4,00E -05 6,00E -05 8,00E -05
c (m o l/L )
A
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6.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la
absortividad molar de la vitamina B2 , por el método gráfico y por
el método de los mínimos cuadrados, a dicha longitud de onda.
a445B2 = ……….. L. mol-1.cm-1
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7.- Preparar 9 disoluciones de vitamina B12, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml
de la disolución madre (DM) de vitamina B12 (0,150 g/l)
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completando hasta 10 ml con agua destilada.
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Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B12 : 0,150 g/L
Expresada en molaridad sería: ( 0,150 g/L) / (1355,4 g/mol) = 1,107 10-4 M
donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B12 .
Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal
Tubo 1 (1 mL) 1. 1,107 .10-4 = 10 . C1 C1 = 1,11 .10-5 M
Tubo 1 (2 mL) 2. 1,107 .10-4 = 10 . C2 C2 = 2,21 .10-5 M
Tubo 1 (3 mL) 3. 1,107 .10-4 = 10 . C3 C3 = 3,32 .10-5 M
Tubo 1 (4 mL) 4. 1,107 .10-4 = 10 . C4 C4 = 4,43 .10-5 M
Tubo 1 (5 mL) 5. 1,107 .10-4 = 10 . C5 C5 = 5,54 .10-5 M
Tubo 1 (6 mL) 6. 1,107 .10-4 = 10 . C6 C6 = 6,64 .10-5 M
Tubo 1 (7 mL) 7. 1,107 .10-4 = 10 . C7 C7 = 7,75 .10-5 M
Tubo 1 (8 mL) 8. 1,107 .10-4 = 10 . C8 C8 = 8,86 .10-5 M
Tubo 1 (9 mL) 9. 1,107 .10-4 = 10 . C9 C9 = 9,96 .10-5 M
Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.
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Vitamina B12
c (mol/L) A(λ=445 nm) A(λ = 550 nm)1,11 .10-5
2,21 .10-5
3,32 .10-5
4,43 .10-5
5,54 .10-5
6,64 .10-5
7,75 .10-5
8,86 .10-5
9,96 .10-5
8.- Mediremos las absorbancias a 445 y 550 nm de las disoluciones de B12.
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9.- Construir las curvas de calibrado para la longitudes de onda de
445 y 550 nm, representando A (absorbancia) en ordenadas frente a
concentración en moles/L , en abscisas .
VitaminaB12
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10.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la
absortividad molar de la vitamina B12 , por el método gráfico y por
el método de los mínimos cuadrados, a las dos longitudes de onda
(445 y 550 nm).
a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1
a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1
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Mezclar x ml de vitamina B2 con y ml de vitamina B12 .
Medir la absorbancia de la mezcla a las longitudes de onda
de 445 nm y 550 nm.
Plantear el sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, indicado
en los fundamentos teóricos.
Calcular las concentraciones de ambas vitaminas en la mezcla problema.
Valoración simultánea de una mezcla de vitaminas B2 y B12