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INFORMES ESTANCIAS CORTAS DE

INVESTIGACIÓN 2016

Entregable D7

Red CYTED 316RT0508

Informes estancias cortas de investigación 2016

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ESTANCIA CORTA DE INVESTIGACIÓN 2016

DATOS DE LA ESTANCIA CORTA DE INVESTIGACIÓN

Investigadora: Clara Reino

Grupo: GENOCOV (Grupo de Investigación en Tratamiento Biológico y Valorización de

Efluentes Líquidos y Gaseosos

Institución: Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra (España)

Grupo responsable de la acogida: Grupo de Ecología Microbiana del Instituto de

Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

Lugar de realización de la estancia: Montevideo, Uruguay

Duración de la estancia: 2 meses (Nov-Dic 2016)


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1. TEMÁTICA Y MOTIVACIÓN DE LA ESTANCIA

El grupo de investigación GENOCOV está especializado en el tratamiento y valorización de

aguas residuales urbanas e industriales y de efluentes gaseosos. Así, la tesis doctoral de la

investigadora Clara Reino está enmarcada en la línea de tratamiento biológico de aguas residuales

de dicho grupo, y más concretamente se basa en la implementación de la eliminación biológica

autotrófica de nitrógeno en la línea principal de aguas de una Estación Depuradora de Aguas

Residuales (EDAR) urbana, para reducir así los costes de operación e incluso conseguir que el

proceso sea productor neto de energía. Durante la tesis doctoral de la investigadora Clara Reino se

operaron distintos reactores biológicos, para los cuales la caracterización microbiológica de los

lodos generados fue imprescindible. Dicha caracterización se realizó mediante la técnica de

hibridación fluorescente in situ (FISH) y mediante técnicas de secuenciación masiva. Sin embargo,

hoy en día la biología molecular ofrece un gran abanico de posibilidades para la caracterización de

microorganismos, y la formación en nuevas técnicas es fundamental para el progreso a nivel

científico. El Grupo de Ecología Microbiana del IIBCE es experto en el estudio y caracterización de

microorganismos presentes en ecosistemas complejos tales como los sistemas de tratamiento de

aguas residuales. Para ello utilizan disciplinas como la biología molecular y la genómica, entre

otras. Por tanto, la principal motivación de la estancia corta de investigación fue el potencial

aprendizaje por parte de Clara Reino de nuevas técnicas de biología molecular aplicadas a la

caracterización de lodos de depuradora en un grupo con gran experiencia en las mismas.

Así, la colaboración entre GENOCOV y el Grupo de Ecología Microbiana del IIBCE surge

con el principal objetivo de complementar la formación de Clara Reino en distintas técnicas de

biología molecular para la caracterización de los microorganismos presentes en el tratamiento

biológico de aguas residuales, y un segundo objetivo de impulsar el intercambio científico y las

futuras colaboraciones entre los dos grupos implicados en la estancia.


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2. ACTIVIDADES REALIZADAS

Actividades de formación en el laboratorio

Durante la estancia se colaboró en la operación de un reactor de producción de hidrógeno a

partir de la fermentación microbiana de un glicerol industrial obtenido como subproducto en la

producción de biodiesel. Una de las principales fuentes de inestabilidad de este proceso es la

homoacetogénesis, mediante la cual algunos microorganismos consumen hidrógeno y CO2. Uno de

los objetivos a alcanzar con la operación de este reactor era conocer y estudiar la relevancia de la

homoacetogénesis en el mismo. Así, la caracterización microbiológica de los lodos producidos fue

esencial, centrada principalmente en el estudio de los microorganismos homoacetógenos.

Para realizar la caracterización de los lodos procedentes del reactor de producción de

hidrógeno se utilizaron distintas técnicas de biología molecular: T-RFLP (del inglés Terminal

Restriction Fragment Lenght Polimorfism), PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), real-time

PCR o qPCR (del inglés re quantitative Polymerase Chain Reaction) y secuenciación masiva.

Las tareas específicas realizadas durante la estancia fueron:

- Operación de un reactor anaerobio de producción de hidrógeno a partir de glicerol

- Extracción y fijación de muestras periódicamente para posterior análisis microbiológico

- Extracción de ADN y ARN a partir de las muestras de biomasa mediante kits comerciales

- PCR de muestras de ADN y ARN

- T-RFLP de muestras de ARN

- qPCR de muestras de ADN y ARN

- Preparación de muestras para posterior secuenciación masiva en un servicio externo


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Actividades de intercambio científico

Durante la estancia se realizaron distintas actividades de intercambio científico entre el

investigador visitante y el grupo de acogida, tales como:

- Presentación del Grupo de Ecología Microbiana del Instituto de Investigaciones Biológicas

Clemente Estable (IIBCE): se realizó un seminario en el cual los miembros del grupo

presentaron sus proyectos actuales

- Presentación proyectos de investigación de GENOCOV: se realizó una presentación sobre el

grupo GENOCOV y sobre el trabajo de tesis doctoral de Clara Reino

- Seminario sobre técnicas de biología molecular: el grupo de acogida realizó una

presentación sobre cada una de las técnicas que la investigadora visitante utilizaría durante

la estancia

- Seminario sobre análisis de resultados de técnicas de biología molecular: se realizó un

workshop sobre cómo analizar los resultados obtenidos con las técnicas de biología

molecular que se utilizarían durante la estancia.

3. RESULTADOS

No se presentará ningún resultado experimental obtenido en la caracterización de los lodos

del reactor de producción de hidrógeno ya que el objetivo de la estancia era el aprendizaje de las

distintas técnicas de biología molecular, independientemente de las muestras sobre las que se

realizaran dichas técnicas. La operación del reactor en este caso no fue más que un modelo sobre el

cual trabajar. El esquema de trabajo realizado fue el indicado en la Figura 1.


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Figura 1. Esquema de trabajo realizado durante la estancia de investigación.

Durante la estancia la investigadora visitante se formó desde cero en:

- Realizar extracciones de RNA y efectuar la retrotranscripción a cDNA,

mediante el uso de kits comerciales.

- Realizar la técnica PCR así como ejecutar la electroforesis en geles de

agarosa para visualizar el amplicon de DNA

- Preparar los productos de PCR para realizar la técnica de T-RFLP mediante el

corte con las enzimas de restricción pertinentes

- Realizar la técnica de amplificación por qPCR así como manipular los

equipos necesarios para realizarla.

- Analizar los resultados obtenidos por T-RFLP y secuenciación masiva


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4. CONCLUSIONES

Además de cumplir con las expectativas de que la investigadora visitante aprendiese nuevas

técnicas de biología molecular para la caracterización microbiológica de muestras de biomasa en

aguas residuales y adquirir total autonomía en la realización de las mismas, se afianzaron los lazos

entre el Grupo de Ecología Microbiana del IIBCE y GENOCOV, abriendo el camino a futuras

colaboraciones entre ambos grupos de investigación.


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Investigadora: Claudia Méndez Lazcano

Grupo: Núcleo Biotecnología Curauma (NBC)

Institución: Pontificia Universidad Católica de Valparaíso (PUCV), Valparaíso (Chile).

Grupo responsable de la acogida: GENOCOV (Grupo de Investigación en Tratamiento

Biológico y Valorización de Efluentes Líquidos y Gaseosos)

Lugar de realización de la estancia: Bellaterra, España

Duración de la estancia: 3 meses (Oct-Dic 2016)


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1. INTRODUCCIÓN

El presente informe se detalla las actividades de la estancia corta de investigación realizada en el

proyecto europeo SAVING-E. Se pretende la puesta en marcha de la planta piloto de eliminación

de materia orgánica y eliminación autotrófica de nitrógeno mediante un sistema de nitrificación

parcial y anammox.

2. TEMATICA Y MOTIVACIÓN DE LA ESTANCIA

En la actualidad las EDAR urbanas aplican sistemas de tratamientos biológicos y se han

repostado trabajos donde se realiza proceso de nitrificación seguido de desnitrificación

heterótrofas, este proceso tiene un alto consumo de energía y emisiones de gases efecto

invernadero. En este caso se deben buscar nuevas alternativas al tratamiento de eliminación de

nitrógeno.

SAVING-E es un proyecto europeo, coordinado por el grupo de investigación en tratamiento

biológico y valorización de efluentes líquidos y gaseosos (GENOCOV) del departamento de

ingeniería Química, Biológica y Ambiental de la Universidad Autónoma de Barcelona. El proyecto

SAVING.E pretende rediseñar las actuales estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR)

urbanas en sistemas autosuficientes energéticamente o, incluso, en productores de energía. Para

lograr este objetivo se debe utilizar toda la materia orgánica para producción de biogás gracias a

la implementación de la eliminación biológica de nitrógeno de forma autotrófica en dos etapas

(nitrificación y anammox), utilizarlo en la línea principal de agua.

La planta piloto consiste en dos etapas: la primera etapa consiste en la eliminación de la materia

orgánica, operando con un reactor de lodos de alta velocidad y un sedimentador, el principal

objetivo es tener un bajo consumo de oxígeno y tener una alta producción de biomasa, es decir,

con un bajo tiempo de residencia celular y por ende la biomasa producida tendrá mayor potencial

de producción de metano. La segunda etapa consiste en la eliminación autotrófica (sin materia

orgánica) del nitrógenos en dos reactores. El primer reactor airlift (reactor aerobio) es para el

proceso de nitrificación parcial que consiste en la oxidación del 50% de amonio a nitrito, reducción

el consumo de oxígeno en un 75%. Con los productos obtenidos del reactor airlift (amonio y nitrito)


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es alimentado el reactor anammox (reactor anaerobio). En la Figura 1 se presenta el esquema de

la tecnología SAVING-E.

Figura 1: Esquema de la tecnología SAVING-E. CSTR: Sistema de lodos activos de alta

velocidad, Reactor, UAnSB: reactor anammox de flujo ascendente de manto de lodos.

El reto fundamental para el proyecto SAVING-E es rediseñar las actuales EDAR urbanas para

mejorar su funcionamiento tanto energético como de masa, trabajando a bajas temperaturas.

El proyecto SAVING-E está compuesto por 5 objetivos que son:

1- Diseño de la planta piloto

2- Construcción de la planta piloto

3- Puesta en marcha de la planta piloto

4- Operación de la planta piloto de SAVING-E

5- Análisis técnico y económico de la modernización de las EDAR urbana con el proceso

SAVING-E.

La planta piloto de SAVING-E se encuentra en las instalaciones en la EDAR de Rubí (España).

Actualmente se encuentran en la etapa de puesta en marcha en donde parte mi estancia de

investigación. La estancia de investigación es una oportunidad de aprenden y conocer nuevas

tecnologías en procesos de tratamiento de aguas urbanas que se están realizando en otros

lugares.


10

3. ACTIVIDADES

Durante la puesta en marcha de la planta piloto, se realizó caracterización físico-química de

muestras tomadas a la entrada y salida de los reactores (reactor de lodos activos de alta velocidad

y reactor Airlift) para ver la evolución del proceso en cada reactor. Los parámetros y metodologías

utilizadas corresponden a lo descrito en la Tabla 1.

Tabla 1: Metodologías analíticas para la caracteriz ación de las muestras.

Método Tipo de metodología

Conductividad Conductímetro.

DQO total Medición por fotómetro

SST Peso seco (filtración y secado de muestra en estufa a 103-105°C)

SSV Pesos seco (filtración y calcinación de la muestra a 550°C)

ST Peso seco (secado de muestra en estufa de 103-105°C)

SV Pesos seco (Calcinación de la muestra a 550°C)

IVL Sedimentación del lodo

pH Medición por pHmetro

Nitrito Cromatografía iónica

Nitrato Cromatografía iónica

Nitrógeno

amoniacal Medición por equipo Amtax

Las actividades realizadas se describen en la Tabla 2, donde describe las muestras tomadas, los

procedimientos de limpieza de la planta piloto y además la preparación del alimento y análisis del

reactor de anammox (inóculo para la planta piloto).


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Tabla 2: Tablas de actividades realizadas en EDAR y UAB

EDAR RUBÍ UAB EDAR RUBí UAB EDAR RUBÍ

LUNES MARTES MIERCOLES JUEVES VIERNES

Purga manómetros

Preparación kits

alimento Anammox

Muestreo:

�R1

�R2

Muestreo SBR

Anammox

Purga manómetros

Limpieza sondas pH,

DO y NH4+/NO3

-

Limpieza:

� Tubería entrada reactor lodos activos

� Tubería salidas reactor lodos activos

� General planta piloto

� Mantención bombas

Muestreo:

�R1

�R2

Muestreo SBR

Anammox

Calibración sondas pH

(cada 2 semanas)

SAVING-E R1:

Afluente (agua residual urbana): DQO, NH4+ y conductividad. ST y SV cada 2 semanas.

Efluente (superficie sedimentador): DQO, SST, SSV, NH4+ y conductividad.

Reactor: SST, SSV y IVL

Purga: SST y SSV

SAVING-E R2:

Afluente (rechazo digestión anaerobia): NH4+, NO2

- y NO3-. ST y SV cada 2 semanas.

Reactor (durante etapa de reacción): SST, SSV y IVL

Efluente (durante etapa de sedimentación): NH4+, NO2

- y NO3-

SBR Anammox:

Afluente: NH4+, NO2

-, NO3- y pH

Efluente (recolectar efluente): NH4+, NO2

-, NO3- y pH

4. RESULTADOS

Se presentan a continuación los resultados obtenidos de la caracterización y las condiciones de

operación de los reactores de la planta piloto.


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Reactor de lodos activo de alta velocidad

En la Tabla 3 se muestran las condiciones operaciones que se utilizaron el reactor de eliminación

de materia orgánica.

Tabla 3: Condicones operacionales del reactor de lo dos activos de alta velocidad.

El reactor tiene un porcentaje de remoción de 80% de DQO, se observó que el IVL30 min aumento

desde 100 a 500 mL/gSST. Para aumentar la sedimentación se propuso adicionar polielectrolito

(floculante) comenzando con una dosis de 200 mL/d.

Reactor Airlift

El propósito de este reactor es trabajar en sistema continuo con biomasa granular, utilizando como

inóculo el agua de rechazo de la digestión anaerobia. Para conseguir que la biomasa flocúlenta

forme gránulos y estén conformados por las bacterias AOB, debemos trabajar en modalidad SBR

y utilizando una estrategia de control (duración de los ciclos). La estrategia de control se consigue

fijando una consiga de concentración de amonio que se pueda controlar dentro del reactor,

considerando una relación de OD/N-NH4+ menor a 0,25 para el crecimiento de las bacterias AOB y

bajando los tiempos de sedimentación. En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos de

bajar el tiempo de sedimentación, IVL30 min, tamaño de partículas y concentración de nitrógeno la

salida y entrada del reactor airlif.

Parámetro Valor

TRH (hora) 3,5

TRS (d) 4

Temperatura (°C) 20-25°C

pH 7,6-7,8

OD (mg/O2/L) 1-1,5

Remoción DQO (%) 80

Volumen de reacción (L) 250


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a) b)

c) d)

Figura 2: Condiciones operacionales y resultados ob tenidos en el reactor Airlift. a) Tiempo de sedimen tación, b) IVL a los 30 min, c)

tamaños de partículas y d) concentración de nitróge no en la entrada y salida.

0 10 20 30 40 50 60 70

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tiempo sedimentaciónvolumen intermcabio

0 10 20 30 40 50 60 70

IVL 30

min (m

L g-1

TSS)

0

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SVI30min

Tiempo (d)

0 10 20 30 40 50 60 70

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año

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año

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(%)

0

20

40

60

80

100

Tamaño de partículaTamaño de partícula < 200 µm (%) Tamaño de partícula > 200 µm (%)

Tiempo (d)

0 10 20 30 40 50 60 70

Con

cent

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ón N

(m

g N L

-1)

0

100

200

300

400

500

600

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N-NH4+ afluenteN-NH4+ EfluenteN-NO2- EfluenteN-NO3- Efluente


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Investigadora: Patricia Bovio

Grupo: Ecología Microbiana

Institución: Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Montevideo

(Uruguay).

Grupo responsable de la acogida: NBC, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

(PUCV)

Lugar de realización de la estancia: Valparaíso, Chile

Duración de la estancia: 3 meses (10 Oct- 20 Dic 2016)


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Temática y motivación de la estancia . La estancia de investigación se enmarcó en el proyecto titulado: “Desarrollo de una metodología operacional para determinar la factibilidad de tratamiento anaerobio de compuestos de difícil degradación mediante genómica funcional”, llevado a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Ambiental (LBA). Previo a la estancia, en este laboratorio se habían realizado ensayos de digestión anaerobia de compuestos comúnmente encontrados en aguas residuales de la industria petroquímica. Identificándose microorganismos claves en el proceso, los cuales podrían ser utilizados como marcadores de desempeño en digestores anaerobios que tratan este tipo de residuos. Con el objetivo de obtener una comunidad microbiana seleccionada capaz de degradar compuestos inhibitorios de la digestión anaeróbia y monitorear la abundancia de los microorganismos claves en este proceso previamente detectados, se realizaron sucesivas operaciones de reactores en batch alimentados con compuestos fenólicos que están presentes en Riles de refinería.

Actividades desarrolladas . El monitoreo de la degradación de fenol y p-cresol se realizó a través de la medición de la producción de metano (CH4) por desplazamiento de NaOH, medición de la producción de ácidos grasos volátiles (AGVs) y degradación de estos compuestos fenólicos por HPLC-UV. Se realizó extracción de ADN y ARN, y transcripción reversa de este último. Finalmente, se realizó real time PCR (qPCR) a partir de ADN copia para poblaciones específicas involucradas en este proceso, como lo son: Syntrophorhabdus aromaticivorans, Kosmotoga spp, y Exilispira thermophila. A partir del ADN genómico se realizó cuantificación de organismos pertenecientes al filo Chloroflexi, los cuales están siendo estudiados en mi trabajo de doctorado. Estos organismos en particular son frecuentemente reportados en reactores anaerobios de tratamiento aguas residuales municipales e industriales. Materiales y métodos Medio de cultivo y reactores alimentados con sustratos inhibitorios. El inóculo utilizado al inicio de la primera operación de los 6 reactores (réplicas) fue lodo proveniente de un reactor UASB que trata efluentes de la industria del tabaco. En el segundo periodo de operación, fue utilizado el lodo proveniente de la primera operación, y para la tercer operación fue utilizado el lodo de la segunda operación. En cada una de las etapas los reactores fueron alimentados con un único pulso de alimentación inicial compuesto de sustratos inhibitorios como fenol y p-cresol, en una concentración de 278 mg/l de fenol y 109 mg/l de p-cresol en la segunda etapa, y en la tercera etapa con 223 mg/l de fenol y 99 mg/l de p-cresol. Los experimentos se realizaron en botellas de 5 lt, y el volumen total utilizado fue de 4 lt. La composición del medio de cultivo es la utilizada en ensayos de actividad metanogénica. Una vez realizada la alimentación, se cambió la atmosfera de los reactores mediante desplazamiento del aire con una corriente de nitrógeno gaseoso de alta pureza. Los reactores se operaron como batch anaerobios a temperatura de 37°C y con agitación mecánica a 70-80 rpm.


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Toma de muestra, medida de metano por desplazamiento de NaOH, cuantificación AGVs y compuestos fenólicos. Toma de muestra. El muestreo fue realizado cada 2 días centrifugando 5 ml de muestra a a 10.000 g por 10 min. a 4°C, posteriormente se filtró el sobrenadante (filtros de 0,45 µm) para su posterior análisis. Se almacenó el pellet a – 80 °C para extracción de ADN y ARN. La manipulación de gas y toma de muestra se realizó preservando el medio anaerobio. Medida de Metano. Fue cuantificado mediante la técnica por desplazamiento de líquido con una solución de NaOH 40 g/L, la cual disuelve el CO2 contenido en el biogás producido y permite la medida directa del metano generado. Medida de compuestos fenólicos. La cinética de degradación de los compuestos se determinó mediante la cuantificación de fenol y p-cresol por HPLC-UV (280 nm). La fase móvil fue una solución de Acetonitrilo (450 ml) y agua miliq (550 ml). La curva de calibración se preparó en la siguiente proporción: fenol 0,05 gr (500 ppm) y p-cresol 0,05 gr (500 ppm) en 100 ml de agua destilada. Medida de AGVs. Fueron cuantificados por HPLC-UV. La fase móvil utilizada fue una solución de ácido sulfúrico 5 mM. Extracción de ADN, ARN y q-PCR. Para la extracción de ADN y ARN, se utilizaron los kit Power Soil DNA isolation kit (MoBio) y el kit PowerSoil Total RNA Isolation (MoBio). La concentración de ADN genómico y ADN copia se cuantificó por nanodrop. Se realizó qPCR con el siguiente protocolo para 20 µl de reacción: Mix Sybrgreen 10 µl, H2O 4,38 µl, Primer A 3,6 µl, Primer B 3,6 µl, ADN 2 µl. El programa de qPCR utilizado para todos los set de primers fue: 44 ciclos de 95°C por 3 minutos, 95°C por 3 segundos y 60 °C por 40 segundos. Se realizó qPCR utilizando los primers específicos para: Syntrophorhabdus aromaticivorans, Kosmotoga spp, Exilispira thermophila. La especificidad de la reacción se evaluó realizando curvas de melting. RESULTADOS En el siguiente apartado se presentan los resultados obtenidos en la estadía. El conocimiento de las técnicas utilizadas para obtención de parámetros operacionales de reactores se vio profundizado en esta instancia, así como el aprendizaje sobre comunidades microbianas presentes en la digestión anaerobia que degradan sustratos provenientes de industrias petroquímicas. Por lo cual, la estadía fue una oportunidad de intercambio de conocimiento y brindó herramientas para el desarrollo como investigador. Además se generaron colaboraciones entre ambos grupos de investigación que ya se han puesto en marcha. Entre ellas se destaca el envío de un resumen de los resultados al AD15, y una colaboración en el estudio de las muestras mediante secuenciación masiva.


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SEGUNDO Y TERCER PERÍODO DE OPERACIÓN Producción acumulada de metano. El volumen teórico acumulado de CH4 calculado en estas condiciones de operación fue de 1500 ml aproximadamente.

Figura 1. Volumen de metano acumulado en los 6 reactores medido por desplazamiento de NaOH. a)

Segunda etapa operacional, b) Tercer etapa operacional. El volumen acumulado de metano experimental obtenido para los 6 reactores en la segunda operación (Figura 1a ) varió entre 1234 y 1496 ml, alcanzado el volumen máximo acumulado entre los días 26 y 39 de operación. Para la tercer operación (Fig. 1b ), se produjeron entre 890 y 1054 ml de metano, y el máximo de producción fue alcanzado entre los días 22 y 31. Degradación de fenol y p-cresol. En la Figura 2a y b , se presenta la degradación de fenol y p-cresol medido por HPLC-UV para los 6 reactores en la segunda etapa operación.

Figura 2 . Segunda etapa operacional. a) Concentración de fenol (mg/l) medida por HPLC-UV. b) Concentración de p-cresol (mg/l) medida por HPLC-UV.

El fenol fue degradado totalmente entre los días 17 y 23, mientras que la degradación de p-cresol llevo entre 23 y 41 días, por lo tanto, el fenol fue degradado más rápido que el p-cresol. En la tercera etapa (Figura 3a ), el fenol fue consumido entre los 11 y 16 días y el p-cresol entre los 20 y 28 días.

0

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tiempo (días)Batch 1 Batch 2 Batch 3


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a) b)

a)


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Figura 3. Tercer etapa operacional. a) Concentración de fenol (mg/l) medida por HPLC-UV. b) Concentración de p-cresol (mg/l) medida por HPLC-UV.

En esta tercera etapa la degradación de estos sustratos fue más rápida que en la segunda etapa. La producción de AGVs fue determinada mediante HPLC-UV. Se detectó ácido butírico en la segunda operación, y en promedio varió en el rango de 59 a 80 mg/l a lo largo de toda la etapa en los 6 reactores. En la tercer operación, solo fue detectado el acetato pero a concentraciones bajo el límite de cuantificación. En la Figura 4a y b, se muestran los promedios de los 6 reactores de los datos de concentraciones de fenol y p-cresol, metano producido y AGVs en la segunda y tercer etapa, respectivamente.

Figura 4. Promedio de los valores de fenol y p-cresol, metano producido y AGVs de los 6 reactores.

Estos resultados mostraron que en ambas etapas la degradación de fenol fue más rápida que la degradación de p-cresol. Y que ambos compuestos se degradaron más rápidamente en la tercera etapa de operación. Estudio de la abundancia de microorganismos clave e n el proceso.

0

50

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Promedio: Fenoles, p-cresol, Butírico y CH4

Fenol (mg/L)

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Promedio: Fenoles, p-cresol, Butírico y CH4

Fenol (mg/L)

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Butírico (mg/L)

a) b)

a) b)


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Se lograron cuantificar microorganismos claves del proceso que fueron previamente detectados en estos sistemas de tratamientos (Fig. 5 ). Estos son: Syntrophorhabdus aromaticivorans, Kosmotoga spp, y Exilispira thermophila.

Figura 5 . qPCR con genes específicos para Syntrophorhabdus aromaticivorans, Kosmotoga spp, y Exilispira thermophila.

El estudio se realizó en la tercera operación abarcando el periodo completo, los días seleccionados fueron: 0, 9, 17, 23, 26 y 29. En los reactores 1, 3 y 5 que fueron los seleccionados para realizar extracción de ARN y transcripción reversa. Los compuestos fenolicos se degradaron en su totalidad en los primeros 11 días de operación. Por lo tanto, las muestras 0 y 9 estudiadas por qPCR son en presencia de estos compuestos. Kosmotoga spp en todos los reactores disminuye su abundancia entre el día 0 y el día 9, lo que podría indicar que su actividad se vio inhibida en presencia de fenol y p-cresol. Después de consumidos los sustratos vuelve a aumentar su abundancia. Exilispira thermophila tiene un comportamiento similar, disminuyendo su abundancia entre los días 0 y 9, y luego de consumidos los sustratos vuelve a aumentar su abundancia. Y por último, Syntrophorhabdus aromaticivorans mostró un aumento entre el dia 0 y 9 de operación, por lo tanto su crecimiento se vio favorecido en presencia de fenol y p-cresol. Estudio de la abundancia de Organismos del Filo Chl oroflexi (OFC) mediante qPCR Complementado el plan de trabajo inicial planteado, se estudió la abundancia del filo Chloroflexi a partir de ADN genómico para el reactor 1 por qPCR con primers específicos (Figura 6 ).

1,0E+011,0E+021,0E+031,0E+041,0E+051,0E+06

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R1 R3 R5

n° de copias del gen/ng de ADN

día 0 día 9 día 17 día 23 día 26 día 29


20

Figura 6 . N° de copias de OFC/ng de ADN promedio obtenidos mediante cuantificación por qPCR con primers específicos para el filo Chloroflexi.

Se estudiaron 6 puntos de muestreo abarcando la tercera operación completa. La abundancia mínima de Chloroflexi fue de 2.32E+06 ± 2.55E+05 (día 16) y la máxima de 5.45E+06 ± 7.47E+05 (día 22) número de copias de OFC por ng de ADN. No se observaron variaciones significativas en la abundancia de este grupo de bacterias entre la muestra del inicio (día 0) y la del final de esta etapa. La mayor abundancia de este grupo (día 22) se correspondió con el momento de ausencia de compuestos fenólicos en el medio (degradación total), esto podría indicar que el filo Chloroflexi no es capaz de degradar estos compuestos. Conclusiones Entre la segunda y tercer etapa de operación de los reactores se logró disminuir el tiempo de degradación de fenol y p-cresol, observándose un incremento de la abundancia de S. aromaticivorans, un conocido degradador de aromáticos. Esto indicaría que hubo una selección de la comunidad microbiana con los microorganismos que mejor degradan estos compuestos inhibitorios de la digestión anaerobia, y que además, la presencia de S. aromaticivorans es clave para biodegradar fenólicos. En cuanto al filo Chloroflexi, se observó un aumento de su abundancia en ausencia de estos sustratos, lo que sugiere una posible inhibición de su crecimiento en presencia de compuestos fenólicos.

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

0 8 16 22 25 28n°

cop

ias

OF

C/n

g d

e A

DN

Tiempo (días)

Tercer operación- Reactor 1

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