Revista Mexicana de Patología Clínica 1998; Volumen 45(3): 155-158

Carga viral en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Estudio comparativo de tres métodos

NOHEMI PATRICIA CASTILLO TORRES

GUSTAVO BARRIGA ANGULO

MARGARITA SOLIS TREJO

CARLOS ARUMIR ESCORZA

Hospital de Infectología. Centro Médico Nacional «La Raza», Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Laboratorio Clínico.

RESUMEN

Se evaluaron simultáneamente tres diferentes pruebas cuantitativas para determinar el ARN plasmático del VIH-1 en 129 pacientes adultos y pediátricos de SIDA (b DNA 1 Chiron Co), MR Digene Hybrid Capture Test (Digene Co) MR y NASBA VIH-1 ARN QT (Organon Teknika). MR Se efectuó análisis estadístico de varianza. La prueba más sensible de las evaluadas en términos de precisión y reproducibilidad fue la de NASBA. Esta prueba fue también apropiada para pacientes pediátricos dado los pequeños volúmenes de muestra necesarios para realizar el estudio (10 microlitros).

PALABRAS CLAVE: Arn VIH-1 plasmático célular TCD4 (+).

ABSTRACT

We evaluated simultaneously three different quantitative HIV-1 RNA plasmatic assays in

129 adult and pediatric AIDS patients: (B DNA 1 Chiron Co), TM Digene Hybrid Capture Test (Digene Co) TM and NASBA HIV-1 RNA QT (Organon Teknika) TM and analysis of variance was performed for statistical analysis. The most sensitive of the evaluates assays in therms of precision, reproducibility and accuracy was the NASBA HIV-1 test, this test was too appropriate for pediatric patients because the low volumes of sample (10 microliters) required.

KEY WORDS: Plasmatic RNA HIV-1 CD4-T cells (+).

Introducción

En la última década, el desarrollo de pruebas que detectan y cuantifican el ARN del VIH-1 en muestras clínicas ha permitido un mejor conocimiento de la dinámica viral de la infección y valorar nuevos enfoques y esquemas de tratamiento en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. 1-3

La utilidad de la determinación cuantitativa de los niveles plasmáticos de ARN del VIH-1 ha sido ampliamente documentada en numerosos estudios clínicos; sus niveles permiten predecir la progresión de la enfermedad, así como decidir cuándo iniciar o modificar un tratamiento, de ahí la importancia de la precisión, exactitud y reproducibilidad en las pruebas cuantitativas para determinar los niveles de ARN del VIH-1 plasmático. Las pruebas comerciales disponibles para este propósito difieren entre sí en numerosos aspectos. 4-6

El objetivo de este trabajo es presentar la experiencia obtenida con tres diferentes procedimientos de cuantificación de ARN del VIH-1 plasmático en el estudio inicial de 129 pacientes con diversos estadios de la infección con el VIH-1.

Material y métodos

Se obtuvieron muestras de plasma utilizando el sistema Vacutainer en 129 pacientes con diversos estadios de la infección por el VIH-I. Se prepararon alícuotas que se

colocaron en viales de plástico a -70°C hasta su procesamiento. En todas ellas se determinó carga viral a VIH-1 con tres diferentes equipos comerciales:

NASBA, VIH-1 RNA QT, de Organon Teknika: Esta prueba se basa en la coamplificación del ARN del VIH-1 presente en la muestra, con calibradores internos. El método consiste de cuatro fases: liberación de los ácidos nucleicos, aislamiento, amplificación y detección. Se presenta en equipo de 50 pruebas, con controles internos para cada prueba. Los reactivos de aislamiento y amplificación requieren de almacenamiento a -20°C y los de lisis y detección, refrigeración (2-8°C). Se puede utilizar cualquier tipo de muestra biológica, requiriendo de 200 mL (para detectar 400 copias (cp)/mL) a 2 mL de muestra (para detectar 40 cp/mL), dependiendo de la sensibilidad que se quiera detectar. Son necesarias tres áreas de laboratorio separadas. El límite de cuantificación es de 40 copias de ARN por mililitro.

B-DNA Chiron Quantiplex: Desarrolla un procedimiento de hibridización de ácidos nucleicos en sandwich y se basa en la amplificación de la señal de detección y no del ácido nucleico. Consiste en cinco fases: concentración por centrifugación; unión de sondas de captura a sondas blanco; agregado de sonda de preamplificación y del B DNA ramificado; agregado de sondas marcadas con fosfatasa alcalina; agregado del sustrato quimioluminiscente y medición de sondas marcadas. Se presenta en equipo de 96 pruebas y doce pozos control pero, como debe correrse por duplicado, rinde sólo 42 muestras problema, únicamente permite el empleo de muestras de plasma obtenidas con EDTA y utiliza 2 mililitros de plasma por prueba; su límite de cuantificación es de 500 copias de ARN por mililitro.

Dygene, Hybrid: Es un procedimiento de hibridización por captura que utiliza una amplificación de la señal de detección; el ARN de la muestra hibridiza con una sonda específica de ADN biotinilada, los híbridos ARN-ADN-Biotina se capturan en la superficie de una microplaca cubierta con estreptavidina; los híbridos inmovilizados se hacen reaccionar con fosfatasa alcalina conjugada a anticuerpos específicos para los híbridos ARN-ADN y se detectan con un sustrato quimio-luminescente. Se presenta en equipo de 96 pruebas, menos 13 controles. Utiliza sólo muestras de plasma obtenidas con EDTA o ACD, requiriendo 1.2 mililitros de volumen por prueba. Su límite de cuantificación es de 500 copias de ARN por mililitro. En todos las casos se siguieron las instrucciones de los fabricantes para el procesamiento. Se llenó un formulario estadístico demográfico de los pacientes estudiados. A todos los pacientes se les determinaron simultáneamente sus niveles de células CD4 T (+) utilizando la técnica citometría de flujo (Coulter Electronics). Para el análisis estadístico se utilizó análisis de varianza y logarítmico punto a punto en los resultados de las tres pruebas.

Resultados

Veinticuatro de los pacientes estudiados correspondieron al sexo femenino y 105 al masculino; 122 adultos y siete niños con un rango de edad de 67 años a un mes, con promedio de 34.5 años; la mayoría de ellos había adquirido la infección sexualmente (85.4%); transfusionalmente (8.5%); perinatalmente el (5.4%) y ocupacionalmente el (0.7%).

El análisis de varianza mostró que la F calculada de los resultados de las tres pruebas fue mayor que la F teórica, mostrando una diferencia estadística significativa entre las tres pruebas (cuadro I). Lo mismo se observó en la comparación analítica entre las tres pruebas; la prueba más sensible en términos de precisión, reproducibilidad y sensibilidad fue la de NASBA (figuras 1 y 2).

Cuadro I. Tabla de Andeva para un factor utilizando todos los resultados en todas las pruebas.

Fuente de variación

Grados de Suma de Varianza o F. Calculada F. Teórica

calculada libertad cuadrados cuadrados F0.05,2,180

medios (CM)

Entre tratamientos 2 4.97 2.49 5.66 2.05

Dentro de tratamientos o

180 79.82 0.44

error residual

Dado que F caiculada es mayor que F, teórica se concluye que hay diíerencia significativa entre las tres pruebas.

Figura 1. Comparación logarítmica de la carga viral punto por punto.

Figura 2. Análisis comparativo de niveles de carga viral con las tres marcas.

COMENTARIOS

La disponibilidad comercial de los ensayos cuantitativos de ARN del VIH-1 y su aplicación clínica han dado lugar a una mejor comprensión de la historia natural de la infección con este virus, su evolución y los efectos del tratamiento antirretroviral, permitiendo el empleo de esquemas más eficaces y un mejor manejo clínico de estos pacientes. Sin embargo, su elevado costo y complejidad técnica, la necesidad de contar con áreas, equipo y personal altamente especializado y las características particulares de las mismas hacen difícil para el laboratorio clínico decidir cuál técnica utilizar.

En este estudio una de las técnicas (NASBA) mostró numerosas ventajas sobre las otras dos evaluadas, como fueron: requerir un menor volumen de muestra para estudio (10-2,000 microlitros) lo que la hace ideal para pacientes pediátricos o con venas

difíciles; poder utilizar cualquier tipo de muestra biológica: sangre total, suero, líquido cefalorraquídeo, semen, saliva, secreciones cervicovaginales, orina, tejidos, etc., y no únicamente plasma, permitiendo así evaluar a pacientes con cargas virales no detectables en plasma en estudios de tratamiento a largo plazo; así como una mayor sensibilidad en términos de precisión y reproducibilidad, como se puede inferir del análisis estadístico de los resultados obtenidos.

Conclusiones

1) Las tres pruebas evaluadas no son comparables en sus resultados entre sí, sobre todo en los valores altos y bajos, por lo que se recomienda utilizar una misma técnica en el análisis seriado de pacientes.

2) Las desventajas actuales de estas pruebas son su complejidad técnica, elevado costo y la necesidad de contar con áreas, equipo y personal especializado para su realización.

3) La prueba NASBA mostró numerosas ventajas sobre las dos otras pruebas evaluadas como fueron: requerir de un menor volumen de muestras, utilizar cualquier tipo de muestras y mayor sensibilidad en términos de precisión y reproducibilidad.

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