técnicas de secuenciación de dna dante travisany f

Técnicas de Secuenciación de DNA

Dante Travisany F.

Tópicos• Objetivos

• Avances

• Sanger:– Chain Terminator– Shotgun Sequencing

• EST

• Next Generation Sequencing NGS:– Sequencing By Synthesis

• Illumina – SBS.• Roche 454 – Pyrosequencing• SOLiD – Ligation Sequencing

– Semiconduction Sequencing – Ion Torrent.

Objetivo

ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCGATCGATCGATCGATCGATCAGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGTACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCGATCGACTACATATCGATCGATCGACGATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCGAGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGTAGTATATATGCAGCGATCGATGATCGAGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGAGTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCTACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGTCGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC

Objetivos

• Conocer:

– Las bases de la secuenciación de ADN

– Principales tecnologías de Secuenciación

– Aplicaciones de la secuenciación de ADN

Actualmente

Presente / Futuro cercano

•Costos:

• Dinero

• Computacionales

• Tiempo

Sanger

• 1977: F. Sanger y W. Gilbert - DNA Sequencing

dTTP

dCTP

dATP

dGTPExtremo 3’

ACTGXXXXXXXXXXTGAC

G-XX

X

X

X

TGACXXGTGACXXXXXXXXGTGACXG

TGACXXGTGACXXXXXXXXGTGACXG

TGACATGACXXXXXXXA

TGACXXXXXXCTGACXXXC

TGACXXXXXTTGACXTTGACXXXXT

G ACT T C G T A3’ 5’

Sanger

• 1982: F. Sanger – Shotgun Sequencing

• 48.502 Nucleótidos - Primer Fago Secuenciado

• Se agrega un nuevo protocolo.

Shotgun Sequencing

1987 - Primera Secuenciadora

• ABI 370

Phred Quality Values

• Phred : Software que realiza el basecalling.

Q = -10 log(Pe)

Phred quality score

Probability that the base is called wrong

Accuracy of the base call

10 1 in 10 90%20 1 in 100 99%30 1 in 1,000 99.9%40 1 in 10,000 99.99%50 1 in 100,000 99.999%

Ejemplo Output Phred

ESTs

• Se capturan los mRNA

• mRNA -> cDNA

• Se ensamblan los transcritos

• Transcriptoma

Next Generation Sequencing

Introducción a la SBS

• Secuenciación por Síntesis• Enzimas:

– Ligasa– Polimerasa

• Tipo:– Single Molecule– Basada en ensamble

• Ejecución:– Tiempo Real– Controlada Sincrónicamente

Secuenciación Por Síntesis

• Solexa/Illumina:– Polimerasa, Sincrónica, Basada en Ensamble

• Se fragmenta el DNA

• Se reparan los extremos

• Se agregan los adaptadores

Illumina - SBS

• Se agrega el DNA a la placa

• Se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa

Illumina - SBS

• Se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa.

• Comienza la amplificación

Illumina - SBS

• Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente.

• Se han generado millones de Clústers en la placa.

Illumina - SBS

• Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular:– G - Amarillo.– C – Azul– A – Rojo– T - Verde

• Se excita con un laser y se captura una imagen.

Illumina - SBS

• Se excita con un laser y se captura una imagen.

• La imagen capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.

Illumina - SBS

Illumina - SBS

• Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado. Una base a la vez.

Illumina - SBS

Secuenciación Por Síntesis

• Roche 454 - Pirosecuenciación:– Polimerasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

• El DNA es Nebulizado

• Se fragmenta en tamaños aleatorios

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

• Se agregan adaptadores universales (Adaptador A’ y B’) a los Extremos

• Se denatura

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

• Cada Perla ‘bead’ contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiereun fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsión que contiene en su interior los elementos para una PCR.

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

• El DNA se amplifica en esta emulsión Generando cientos de copias en cada perla

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

• Estas son puestas en la PicoTiter Plate (PTP). El diseño de esta permite una bead por orificio.

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

454 summary Run time: 8 Hrs Produce 100's Mb of seq Read length: 300bp – 400bp 2011 → 740bp!!!

Applications and Challenges De novo sequencing Metagenomics Gene expression Variation detection Homopolymers problem

Secuenciación Por Síntesis

• ABI - Secuenciación por Ligación:• Ligasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

Sequenciación por Ligación - SBS

Secuenciación por Semiconducción

• Ion Torrent

Secuenciación por Semiconducción

• Al incorporarse un núcleotido a la hebra de ADN, la polimerasa libera un ion Hidrógeno.

Secuenciación por Semiconducción

• Matriz de alta densidad de pozos que permiten generar este proceso paralelamente

• Cada pozo secuencia una hebra.

Secuenciación por Semiconducción

Secuenciación por Semiconducción

Secuenciación por Semiconducción

Comparación Métodos

454 Vibrio parahaemolyticus

Phre

d Q

ual

Phre

d Q

ual

Ion Torrent - Vibrio parahaemolyticus

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

• De novo Genome Assembly

• Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

• De novo Genome Assembly (454 o Illumina)

• Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.

• Tamaño del Genoma• Coverage esperado• Coverage real• Complejidad del Genoma• Capacidad de Cómputo

Panda Genome

• 2.25 Gigabases -> 2.250.000.000 de núcleotidos cubrieron el 94% del genoma.

• Sólo se utilizo Illumina.

• Se utilizaron especies de referencia para formar los cromosomas.

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

• Metagenómica (454)

• Estudio de los metagenomas, secuenciación del material genetico obtenido desde el ambiente / organismo.

• Clasificación Taxonómica• Perfil Metabólico

Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

• Metagenómica

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación

• Genome Mapping (Illumina / SOLiD)

• Secuenciación con referencia, permite identificar variantes inter/intra especies. Variaciones estructurales, cambios en los genomas.

• SNPs• Variantes estructurales

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación

• RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD)

• Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones

• Expresión Diferencial• SNPs• Isoformas

Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación

• RNA –Seq De novo (Illumina)

• Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones, reconstrucción del transcriptoma en un organismo, condición específico

• Obtención transcriptoma• Expresión Diferencial• SNPs

Gracias

Illumina –Fluorescent Reverse Terminator