técnicas de secuenciación de dna dante travisany f
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Técnicas de Secuenciación de DNA
Dante Travisany F.
Tópicos• Objetivos
• Avances
• Sanger:– Chain Terminator– Shotgun Sequencing
• EST
• Next Generation Sequencing NGS:– Sequencing By Synthesis
• Illumina – SBS.• Roche 454 – Pyrosequencing• SOLiD – Ligation Sequencing
– Semiconduction Sequencing – Ion Torrent.
Objetivo
ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCGATCGATCGATCGATCGATCAGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGTACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCGATCGACTACATATCGATCGATCGACGATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCGAGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGTAGTATATATGCAGCGATCGATGATCGAGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGAGTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCTACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGTCGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC
Objetivos
• Conocer:
– Las bases de la secuenciación de ADN
– Principales tecnologías de Secuenciación
– Aplicaciones de la secuenciación de ADN
Actualmente
Presente / Futuro cercano
•Costos:
• Dinero
• Computacionales
• Tiempo
Sanger
• 1977: F. Sanger y W. Gilbert - DNA Sequencing
dTTP
dCTP
dATP
dGTPExtremo 3’
ACTGXXXXXXXXXXTGAC
G-XX
X
X
X
TGACXXGTGACXXXXXXXXGTGACXG
TGACXXGTGACXXXXXXXXGTGACXG
TGACATGACXXXXXXXA
TGACXXXXXXCTGACXXXC
TGACXXXXXTTGACXTTGACXXXXT
G ACT T C G T A3’ 5’
Sanger
• 1982: F. Sanger – Shotgun Sequencing
• 48.502 Nucleótidos - Primer Fago Secuenciado
• Se agrega un nuevo protocolo.
Shotgun Sequencing
1987 - Primera Secuenciadora
• ABI 370
Phred Quality Values
• Phred : Software que realiza el basecalling.
Q = -10 log(Pe)
Phred quality score
Probability that the base is called wrong
Accuracy of the base call
10 1 in 10 90%20 1 in 100 99%30 1 in 1,000 99.9%40 1 in 10,000 99.99%50 1 in 100,000 99.999%
Ejemplo Output Phred
ESTs
• Se capturan los mRNA
• mRNA -> cDNA
• Se ensamblan los transcritos
• Transcriptoma
Next Generation Sequencing
Introducción a la SBS
• Secuenciación por Síntesis• Enzimas:
– Ligasa– Polimerasa
• Tipo:– Single Molecule– Basada en ensamble
• Ejecución:– Tiempo Real– Controlada Sincrónicamente
Secuenciación Por Síntesis
• Solexa/Illumina:– Polimerasa, Sincrónica, Basada en Ensamble
• Se fragmenta el DNA
• Se reparan los extremos
• Se agregan los adaptadores
Illumina - SBS
• Se agrega el DNA a la placa
• Se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa
Illumina - SBS
• Se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa.
• Comienza la amplificación
Illumina - SBS
• Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente.
• Se han generado millones de Clústers en la placa.
Illumina - SBS
• Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular:– G - Amarillo.– C – Azul– A – Rojo– T - Verde
• Se excita con un laser y se captura una imagen.
Illumina - SBS
• Se excita con un laser y se captura una imagen.
• La imagen capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.
Illumina - SBS
Illumina - SBS
• Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado. Una base a la vez.
Illumina - SBS
Secuenciación Por Síntesis
• Roche 454 - Pirosecuenciación:– Polimerasa, Sincrónica, Basada en ensamble.
• El DNA es Nebulizado
• Se fragmenta en tamaños aleatorios
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
• Se agregan adaptadores universales (Adaptador A’ y B’) a los Extremos
• Se denatura
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
• Cada Perla ‘bead’ contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiereun fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsión que contiene en su interior los elementos para una PCR.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
• El DNA se amplifica en esta emulsión Generando cientos de copias en cada perla
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
• Estas son puestas en la PicoTiter Plate (PTP). El diseño de esta permite una bead por orificio.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
454 summary Run time: 8 Hrs Produce 100's Mb of seq Read length: 300bp – 400bp 2011 → 740bp!!!
Applications and Challenges De novo sequencing Metagenomics Gene expression Variation detection Homopolymers problem
Secuenciación Por Síntesis
• ABI - Secuenciación por Ligación:• Ligasa, Sincrónica, Basada en ensamble.
Sequenciación por Ligación - SBS
Secuenciación por Semiconducción
• Ion Torrent
Secuenciación por Semiconducción
• Al incorporarse un núcleotido a la hebra de ADN, la polimerasa libera un ion Hidrógeno.
Secuenciación por Semiconducción
• Matriz de alta densidad de pozos que permiten generar este proceso paralelamente
• Cada pozo secuencia una hebra.
Secuenciación por Semiconducción
Secuenciación por Semiconducción
Secuenciación por Semiconducción
Comparación Métodos
454 Vibrio parahaemolyticus
Phre
d Q
ual
Phre
d Q
ual
Ion Torrent - Vibrio parahaemolyticus
Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
• De novo Genome Assembly
• Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.
Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
• De novo Genome Assembly (454 o Illumina)
• Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.
• Tamaño del Genoma• Coverage esperado• Coverage real• Complejidad del Genoma• Capacidad de Cómputo
Panda Genome
• 2.25 Gigabases -> 2.250.000.000 de núcleotidos cubrieron el 94% del genoma.
• Sólo se utilizo Illumina.
• Se utilizaron especies de referencia para formar los cromosomas.
Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
• Metagenómica (454)
• Estudio de los metagenomas, secuenciación del material genetico obtenido desde el ambiente / organismo.
• Clasificación Taxonómica• Perfil Metabólico
Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
• Metagenómica
Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
• Genome Mapping (Illumina / SOLiD)
• Secuenciación con referencia, permite identificar variantes inter/intra especies. Variaciones estructurales, cambios en los genomas.
• SNPs• Variantes estructurales
Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
• RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD)
• Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones
• Expresión Diferencial• SNPs• Isoformas
Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
• RNA –Seq De novo (Illumina)
• Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones, reconstrucción del transcriptoma en un organismo, condición específico
• Obtención transcriptoma• Expresión Diferencial• SNPs
Gracias
Illumina –Fluorescent Reverse Terminator