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IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

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Monitorizacion por bioimpedancia en la industria alimentaria.Xavier Ferrando Martínez ................................................................................... 05

Transgénicos, Nutrigenética y Nutrigenómica en alimentación.Daniel Ramón Vidal .......................................................................................... 08

La polymerase chain reaction (PCR).Armand Sánchez Bonastre .................................................................................. 10

International harmonization of microbiological methods.Cécile Lahellec ............................................................................................... 14

La automatización total en un laboratorio de microbiología. Experiencia con técnicas rápidas en la industria alimentaria.Hilario Zapata Bozalongo .................................................................................... 20

Método para comprobar la limpiabilidad in situ de equipos para el procesado de los alimentos. EHEDG Documento nº2.Mª Irene Llorca Pellicer ..................................................................................... 22

Biosensores para bacterias patógenas en seguridad alimentaria.María Isabel Pividori ......................................................................................... 25

Detección de Vibrio Parahaemolyticus, Vibrio Cholerae y Vibrio Vulnificus por PCR a tiempo real.Verónica Blanco Abad y Jaime Martínez Urtaza .......................................................... 32

Sistemas BD para identificación.BD (Becton, Dickinson and Company) ...................................................................... 35

Sistema de Detección microbiológica BD MicroPro.(Becton, Dickinson and Company).......................................................................... 36

Validación del sistema de microbiología rápida Bactrac 4300 según ISO 16140:2003.Gomensoro.................................................................................................... 38

Introducing the new foodproof® RoboPrep+ Series for automated DNA extractionand PCR set-up.BIOTECON ..................................................................................................... 39

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Proteínas de trigo en el desarrollo de productos ricos en proteína Ejemplo aplicativo en galletas.Virginia Millán ................................................................................................ 40

Sensado con Micro Nano Sistemas en Aplicaciones Agroalimentarias: Perspectivas nacionales y europeas.Luis Fonseca y Carles Cané ................................................................................. 42

Innovations in carbohydrates – being “functional” with Palatinose™ . Antje Jungclaus .............................................................................................. 44

Sugar reduction in an intelligent way – how to improve the physiological quality of a product.Antje Jungclaus .............................................................................................. 46

Metabolo mica y Lipido mica redox aplicadas al estudio de ingredientes y alimentos funcionales.Manuel Portero-Oti n, Alberto Espinel, José Serrano, Mariona Jové, Jordi Boada, Hugo Gonzalo, Anna Cassañé, Marco Antonio Delgado y Reinald Pamplona ........................... 48

Sustainable Food processing, present and future opportunities.Friso van Assema and Peter de Jong....................................................................... 50

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

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Medida de la impedancia en uncultivo: Una herramienta preci-sa y potente como técnica enMicrobiología rápida.Las técnicas basadas en lo que deno-minamos Microbiología Clásica se ba-san en la proliferación de los micro-organismos en los diferentes mediosnutritivos de cultivo. Típicamente se basan en la observa-ción directa de colonias, que han deser visibles a simple vista, para corro-borar la presencia de un determina-do microorganismo y obtener el re-cuento del mismo en el alimento deorigen.Para conseguirlo existen diferentesmétodos siendo los más comunes lasiembra directa en placas estánda-res de medios nutritivos con agaressemisólidos (siembra directa en su-perficie, siembra por vertido en masay siembra espiral con dilución entreotras). Para obtener un resultado, esdecir las colonias visibles, requerire-mos de un tiempo y de una tempera-tura de incubación que haga óptimo elcrecimiento de los microorganismosque conformarán una colonia. Estacolonia suele estar formada por un to-tal de 10^8 – 10^9 células aproxima-damente y los tiempos de incubaciónoscilan, en los métodos más genera-les, entre las 24 y las 72 horas apro-ximadamente (con la excepción demicroorganismos esporulantes dondepueden ser más largos).Además en la mayoría de ocasionesvamos a requerir de diluciones delcontenido de la muestra para llegar aobservar colonias bien definidas y ais-ladas de forma que hagan posible elrecuento. Esto implica que el recuen-to estará en relación a un factor de di-lución de la muestra conocido y que

será utilizado para calcular el núme-ro total de microorganismos en el ali-mento en origen. La medida por bioimpedancia, de lamisma manera que en el anterior caso,se basa también en la capacidad proli-ferativa de los microorganismos en unmedio de cultivo. En esta ocasión semonitoriza la actividad metabólica enun caldo nutritivo. El metabolismo es elconjunto de reacciones bioquímicasque sustentan la vida y el crecimientomicrobiano asimilando los nutrientesdel medio.

La actividad metabólica de los microor-ganismos comporta la transformaciónde moléculas de nutrientes complejasy a menudo con poca polaridad en me-tabolitos más simples, de menor pesomolecular y mayor polaridad (ácidos or-gánicos). Estos actúan como electroli-tos en el caldo nutritivo mejor que losnutrientes (peptonas, polisacáridos).En el caldo de cultivo la presencia deestos nuevos electrolitos confierencambios en los parámetros electroquí-micos del medio líquido tales como laconductancia, la capacitancia y la im-

Xavier Ferrando Martínez Responsable Área MicrobiologíaClinical Nutrition, S.A.xavier.ferrando@clinicalnutrition.es

MMonitorizacion porbioimpedancia en la industria

alimentaria

Fig. 1.- Representación gráfica.

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pedancia. Concretamente este últimoes al cual nos referimos en relación ala técnica que describimos en este ar-tículo.Se trata de medir estos cambios elec-troquímicos en un caldo de cultivo yque son monitorizados continuamentedurante todo el periodo de incubación,en unas condiciones nutritivas especí-fico-selectivas para un microorganis-mo/s objeto del estudio y a una tem-peratura de incubación óptima para sucrecimiento. Quiere decirse con estoque al tratarse también de un cultivomicrobiano se requiere también untiempo total de incubación para el es-tudio, aunque generalmente en la ma-yoría de protocolos no será superior alas 24-48 horas.Los cambios registrados en la impe-dancia ofrecen resultados más rápidosen la detección y recuento de los micro-organismos de estudio. Esto se debea que los cultivos líquidos son másapropiados para las necesidades nu-tricionales y las tasas de crecimientoserán mayores. Así por ejemplo, gra-cias del sistema basado en laImpedancia de Corte (1) los resultadosse obtienen cuando la población delmicroorganismo en cuestión se en-cuentra en una tasa de 10^6 -10^7 cé-lulas en el medio de crecimiento. Estoes unos tres órdenes de magnitud de-cimal menos de lo que es necesariopara obtener una colonia visible, yasea recuento o investigación, en unaplaca estándar con agar nutritivo semi-sólido.La sencillez de la técnica reside tam-bién en que los medios nutritivos utili-zados son equivalentes a los utilizadosen Microbiología clásica. La especifici-dad de estos se debe, de la misma ma-nera que los medios clásicos, a suscomposiciones galénicas. La sensibi-lidad en esta técnica se considera des-de una unidad formadora de colonia(u.f.c.) por muestra puesto que, si tie-ne capacidad proliferativa, su actividadmetabólica aportará desde la primeracélula cambios en las propiedadeselectroquímicas del medio.

Desarrollo de la señal en un ins-trumento BacTrac 4300 de Sy-Lab: Impedancia directa delmedio, Impedancia directa delelectrodo, Impedancia indirec-ta y Análisis de la Impedanciade CorteEl aumento de metabolitos con cargapolar va a producir, en el transcurso dela incubación, una disminución de la re-sistencia (impedancia) que opone elmedio líquido cuando aplicamos unacorriente eléctrica. Esta puede ser me-dida por el instrumento mediante unoselectrodos inmersos en el medio de losque disponen unas celdillas especiales(Fot. 2). A través de estos electrodosel equipo registra cambios en la señaleléctrica del medio. Cuando los cam-bios registrados de la impedancia sonen la superficie del electrodo, inmersoen el medio, diremos que se trata deuna impedancia directa del electrodo ytiene un valor E. Cuando registramoscambios de la impedancia del medio(caldo de cultivo) se trata de una im-pedancia directa de valor M.Existe otra posibilidad que hace que loscambios del valor de la impedancia, devalor M, se realicen en un segundo es-pacio líquido que es diferente al mediode crecimiento. Se basa en la utiliza-ción de un medio valorable que, por ac-

ción también del metabolismo micro-biano, se va a ver modificado en suspropiedades electroquímicas. Se tratade la Impedancia Indirecta y el valor re-gistrado es la variación de la impedan-cia M medida normalmente en una so-lución de potasa llevada a saturación.Se fundamenta en la producción dedióxido de carbono como producto finalde la respiración microbiana en condi-ciones aeróbicas. El dióxido de carbo-no se disuelve en la solución de pota-sa formándose carbonato potásico,

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Fot. 1.- Equipos BacTrac 4300 Sy-Lab.

Fot. 2.- Celdillas impedancia.

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menos conductor que el hidróxido po-tásico, cosa que provocará un aumen-to de la impedancia M en este medio.

CO2 + 2 OH- → CO32- + H2O

Los resultados se representan comocambios relativos en porcentaje del va-lor de la impedancia (M y E) a lo largode la incubación respecto a un valorconocido inicial. En la representacióngráfica estos valores definen curvasdel tipo sigmoideo (Fig. 1) en la que sepueden observar tres fases que refle-jan a su vez también las tres etapas deuna curva típica de crecimiento pobla-cional de un microorganismo en un cul-tivo. Estas son: una fase inicial esta-cionaria donde los microorganismos seadaptan a las nuevas condiciones nu-tritivas del medio y sintetizan toda lamaquinaria metabólica necesaria pa-ra la proliferación celular, seguida deuna fase exponencial (correlacionadacon la fase de exponencial de creci-miento) y una fase estacionaria finalsin incrementos debido al agotamien-to de los recursos nutritivos, acumula-ción de metabolitos tóxicos y por fe-nómenos de exclusión in-tra/interespecífica.A partir de que la cantidad de célulasdel cultivo de impedancia sea aproxi-madamente de 10^6 – 10^7 u.f.c/ml elinstrumento, BacTrac 4300 (Fot. 1) deSy-Lab, será capaz de registrar unaseñal de impedancia que se encontra-rá, lógicamente, en fase exponencial.Tomando un valor umbral de variación

% de un valor definido, sea impedanciade M o de E, si esta variación supera-se dicho umbral se debería a un fenó-meno de proliferación celular. Este va-lor umbral excluye cualquier otra cau-sa que lo produzca de forma inespecí-fica. El sistema avisa al usuario que seha producido un corte que se registraen ese preciso momento debido a uncrecimiento en fase exponencial. Dada la relación existente entre un he-cho y el otro, la variación por encima deun umbral por un lado y el crecimientoactivo en fase exponencial por el otro,el BacTrac 4300 registra el momentodel corte con un valor de tiempo trans-currido hasta entonces denominado T.A cada valor en tiempo de corte le co-rresponderá una concentración u.f.c. /ml de caldo de cultivo. Si somos capa-ces de calibrar el sistema, es decir, co-nocer a diferentes tiempos T de cortela concentración microbiana del culti-vo en ese momento mediante un ban-co de diluciones y un posterior recuen-to de colonias, podremos correlacionarregresivamente y de forma automáticael recuento por impedancia. El softwa-re de monitorización interpola ese tiem-po de corte detectado en el cultivo conla ecuación de regresión (gráfica % deM o E respecto tiempo de corte duran-te el cultivo) de forma que encuentreel valor de la concentración de micro-organismos de la muestra a un tiempoinicial o To y conocer, por consiguiente,el recuento inicial en el alimento.Si por el contrario lo que nos interesano es el recuento sino una investiga-

ción, sólo requerimos que el sistemaregistre que se ha generado una señalde corte a un umbral establecido de% de variación de M o de E. El siste-ma se puede configurar para avisarmediante un señal gráfico o incluso porun código de colores (rojo= corte; ver-de = no corte) que se ha detectado uncrecimiento en el medio. Si este es es-pecífico y selectivo, como en un pro-tocolo de investigaciónAusencia/Presencia, el sistema nosestará avisando que se ha detectadoun presunto crecimiento del microorga-nismo objetivo de la investigación ynos avisará del resultado. Si no haycorte en toda la incubación el resulta-do será de ausencia para ese micro-organismo objeto del estudio.Si a todo esto consideramos que cuan-to mayor sea la concentración inicialde el/los microorganismo/s, ya sea unrecuento o una investigación (preenri-quecimiento), antes se alcanzará unaconcentración de 10^6 – 10^7 u.f.c./ mly el tiempo de corte será más corto.Esto propicia que para la mayoría deprotocolos de recuento o de investi-gaciones tengamos resultados muchoantes de que finalice el tiempo total delprotocolo de incubación dándose, co-mo encontramos en muchas ocasio-nes, cortes de presuntivos a las 4-11horas de incubación (E. coli , S. au-reus, Salmonella) o recuentos de mi-croorganismos totales en 8-11 horas,todos ellos muy por debajo de lostiempos necesarios por métodos clási-cos.En protocolos de esterilidad, realiza-dos mediante impedancia indirecta, sino se detecta ningún corte durante eltiempo total de la incubación el resul-tado será de ausencia de microorga-nismos.

Bibliografía1.- BacTrac 4000 Series Microbiological Operation

Manual V1.05e © 2002, SY-LAB Instruments

GmbH.

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En protocolos de esterilidad, realizadosmediante impedancia indirecta, si

no se detecta ningún corte durante eltiempo total de la incubación el

resultado será de ausencia demicroorganismos

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El empleo directo de la gené-tica en la agrolimentación:mejora genética de los ali-mentosLa comunidad científica entiende porbiotecnología el uso de un organis-mo vivo con un propósito industrial.Biotecnología de alimentos no esmás que el uso de seres vivos en laproducción de alimentos, lo que in-cluye toda la alimentación, porquetodo cuanto comemos son, o han si-do, seres vivos, ya sean animales,vegetales, o alimentos o bebidasfermentadas por un microorganis-mo. Pero el consumidor, sobre todoel europeo, tiene una percepcióndistinta de lo que es y entiende queéste término hace referencia a laaplicación de la genética en la ali-mentación. En otras palabras, losconsumidores europeos entiendenpor biotecnología de alimentos “po-ner genes en su sopa”. Hay que recordar a los consumido-res que la genética se ha aplicadoen la alimentación desde que co-menzó la agricultura y la ganade-ría. Desde entonces el hombre hamejorado empíricamente el genomade las variedades vegetales comes-tibles, las razas animales y los fer-mentos. Esta mejora se ha funda-mentado en la aparición de mutan-tes espontáneos, la variabilidad na-tural, y la aplicación del cruce se-xual o hibridación. De esta forma sehan obtenido variedades de trigocon espigas incapaces de disper-sar sus semillas en la naturaleza,pero capaces de generar unas ha-rinas panaderas con inmejorableaptitud tecnológica, o patatas co-mestibles al contener niveles míni-mos de alcaloides tóxicos. Desdehace treinta años los científicos aís-lan en el laboratorio fragmentosconcretos que portan genes deter-minados. Esos genes se pueden va-riar en el tubo de ensayo y se pue-den reintroducir en el organismo na-tural o en uno distinto generando untransgénico. Al global de estas téc-

nicas las llamamos ingeniería gené-tica y cuando se aplica en el diseñode un alimento surgen los llamadosalimentos transgénicos.Hoy se comercializan muchos ali-mentos transgénicos en todo elmundo, sobre todo en EstadosUnidos, Australia, Canadá y China.Los más conocidos son la soja re-sistente al herbicida glifosato y elmaíz Bt aunque existen muchosmás. Son de gran importancia losque hacen referencia a la mejoranutricional de los alimentos. Desdealgunas organizaciones ecologistasse acusa a los alimentos transgéni-cos de ser un veneno para la saludy el medioambiente. No es cierto.Desde hace más de quince años,FAO, OCDE y OMS han estableci-do grupos de trabajo para evaluar laseguridad para el consumidor de losalimentos transgénicos. Se ha lleva-do a cabo una evaluación de riesgossanitarios de todos los alimentostransgénicos comercializados aten-diendo al contenido nutricional, laposible presencia de alérgenos y elnivel de toxicidad. Son los alimentosmás evaluados de la historia de laalimentación y no disponemos de undato científico que indique que re-presenten un riesgo para la saluddel consumidor superior al que im-plica la ingestión del alimento con-vencional correspondiente. Este he-cho ha sido puesto de manifiestopor la OMS en su página de inter-net. Es interesante destacar quetras la publicación de esta decisióndichos grupos han variado su estra-tegia y apenas hablan de los riesgossanitarios de los transgénicos perosi de los riesgos ambientales. Ahílas cosas son menos claras porque

hay una falta de metodologías paraanalizar este tipo de riesgos queafectan tanto a las plantas transgé-nicas como a las convencionales.Aun así debemos afirmar con con-tundencia que existen tres posiblesriesgos: la transferencia de los ge-nes exógenos desde la variedadtransgénica a variedades silvestres,la pérdida de biodiversidad y losefectos dañinos que ciertas plantastransgénicas resistentes a insectospueden tener sobre poblaciones deinsectos distintos de aquellos con-tra los que protegen. Todos estosriesgos ya existen con las varieda-des convencionales. Por ello, lacuestión clave es conocer si el em-pleo de transgénicos acelerará laaparición de estos riesgos. Pareceque no, siempre que se mantengany mejoren las normas de evaluaciónque empleamos actualmente conlas plantas transgénicas.Finalmente debemos considerar losriesgos económicos. El 90% de losagricultores que utilizaron semillastransgénicas en el 2009 eran agri-cultores pobres de países en des-arrollo. Una realidad muy lejana delestereotipo que hace de lo transgé-nico un negocio en manos de pocascompañías multinacionales.Pero conviene debatir acerca de laopinión del consumidor sobre lostransgénicos. En general, y desta-cando la falta de formación e infor-mación en biotecnología de nuestrasociedad, así como la constante pre-sencia de los grupos en contra en losmedios de comunicación, los perci-ben como algo peligroso. Por ello re-sulta importante la divulgación de losdatos reales que desde la Ciencia te-nemos de estos productos.

Daniel Ramón Vidal Biópolis, S.L.daniel.ramon@biopolis.es

Transgénicos, nutrigenética ynutrigenómica en alimentación

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Las nuevas aplicaciones dela genética en la agroalimen-tación: nutrigenética y nutri-genómicaEn el año 2003 se hizo pública la se-cuencia que conforma nuestro geno-ma, el genoma humano. Somos po-co más de 23.000 genes interaccio-nando con el ambiente. Pero lo quesomos no depende de nuestro colorde piel, ni de nuestro credo políticoo religioso; está escrito en ese alfa-beto molecular y se traduce en fun-ción de nuestro ambiente físico ocultural. Es evidente el impacto de lagenómica en nuestra vida cotidianay ello ha dado lugar a la aparición dedos nuevas disciplinas científicas: lanutrigenética y la nutrigenómica. Pornutrigenética entendemos la discipli-na científica que estudia el efecto delas variaciones genéticas entre indi-viduos en la interacción dieta y en-fermedad. Por nutrigenómica aque-lla que estudia el efecto de los nu-trientes de los alimentos sobre la ex-presión de nuestros genes. Con suempleo empezamos a entender co-mo se va a definir en el futuro unaalimentación a la carta en función delo que podríamos llamar “pasaportegenético”. Puede que a muchos lesaterre, pero quizás no lo vean tangrave si piensan en la ventaja quepara un recién nacido puede supo-ner que sus padres sean informadossobre una posible mutación en sugenoma que le predisponga a des-arrollar una enfermedad cardiovas-cular si su alimentación no es ade-cuada. Es claro el enorme potencial que elconocimiento del genoma humanopuede tener en las pautas de ali-mentación, pero no será menor elque tenga la secuenciación de losgenomas de otros organismos vivosde interés agroalimentario. Hastaahora se han secuenciado totalmen-te más de quinientos genomas dis-tintos y hay más de setecientos pro-yectos de secuenciación en marcha.Algunos de ellos se refieren a ani-

males, plantas o microorganismosde relevancia alimentaria, como porejemplo el arroz, la levadura pana-dera, la bacteria Bifidobacterium bi-fidum (usada en muchos productosprobióticos) o patógenos responsa-bles de toxiinfecciones alimentariascomo Escherichia coli. El conoci-miento de los genes que componenel genoma de estos organismos per-mite conocer sus genes clave paraasí definir estrategias de mejora porgenética clásica (la llamada mejoraasistida por marcadores) o por in-geniería genética, desarrollar meca-nismos de defensa frente a su pato-genicidad, o descubrir nuevas fun-ciones fisiológicas con impacto nu-tricional.La secuenciación de genomas ha si-do hasta ahora una técnica costosaen tiempo y dinero. Hace apenas unaño se describió una nueva técnicade secuenciación basada en el em-pleo de nanomateriales. Dicha técni-ca se denomina pirosecuenciación ypermite secuenciar genomas de for-ma masiva en mucho menos tiempoy a un menor costo. Por ejemplo, latecnología clásica de secuenciaciónaplicada en un laboratorio conven-cional tardaba en secuenciar el ge-noma de una bacteria láctica untiempo variable entre uno y tresaños. Con la tecnología de pirose-cunciación es posible hacerlo en tansólo ocho horas y por un precio encosto de materiales diez veces me-nor al de la tecnología convencional.Sin duda la pirosecuenciación va arevolucionar la secuenciación de ge-nomas y también de los llamadosmetagenomas. Con este último sus-tantivo se hace referencia a la se-cuenciación de DNA extraído de unecosistema, de forma que a partir delos datos de secuencia es posible in-ferir los organismos presentes en di-cho nicho ecológico. Su aplicaciónen alimentación y nutrición es máspróxima de lo que muchos imaginan.Por ejemplo, recientemente se hanllevado a cabo proyectos de secuen-

ciación masiva en voluntarios huma-nos, determinándose que más detrece mil cepas bacterianas distintaspueblan nuestro tracto digestivo.También mediante el empleo de me-tagenómica se han detectado dife-rencias en la composición de la flo-ra microbiana del tracto digestivo deindividuos obesos. Son los primerosresultados de una tecnología poten-te que permitirá conocer aspectosnuevos de nuestra fisiología y su re-lación con la alimentación.Podemos concluir por todo lo ex-puesto que el futuro de la genéticaen la alimentación es importante. Laépoca en que los tecnólogos de ali-mentos eran expertos en el manejode las tuberías de las instalacionesindustriales ha quedado lejos. Lanueva tecnología de alimentos pre-cisa de nuevos profesionales queentiendan la importancia de la bio-tecnología y la genética y tambiénpuedan discutir sobre conocimientosde otros campos del saber como lafarmacología, la nutrición, el controlautomático de sistemas o las nano-tecnologías.

Bibliografía1.- Fedoroff N. (2004). Mendel in the kitchen.

Joseph Henry Press, Washington.

2.- Pafundo S, Agrimonti C, Maestri E,

Marmiroli N. (2007). Applicability of SCAR mar-

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3.- Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA,

Magrini V, Mardis ER, Gordon JI.(2006). An

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4.- Withee J, Dearfield KL. (2007). Genomics-

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nostics: possibilities for the U.S. Department of

Agriculture's Food Safety and Inspection

Service. Environ. Mol. Mutagen. 48:363-368.

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IX WORKSHOP MRAMA

La reacción en cadena de la polime-rasa (conocida como PCR por sussiglas en inglés, Polymerase ChainReaction) es un método de análisisde ácidos nucleicos, desarrolladopor Kary Mullis a mediados de losaños 80, para producir grandes can-tidades de un fragmento específicode ADN de secuencia y longitud de-finida a partir de una pequeña can-tidad de material inicial.La técnica permite amplificar selec-tivamente una molécula de ADN oARN varios millones de veces en po-cas horas. Mediante la PCR pode-mos realizar la detección y análisisde secuencias específicas de un gensin necesidad de aislarlo previamen-te por técnicas de clonación de ADN.Los análisis pueden realizarse a par-tir de unas pocas células o de unamínima cantidad de muestra biológi-ca sin la necesidad de aislar previa-mente grandes cantidades de ácidosnucleicos.La PCR ha revolucionado el campodel diagnóstico molecular y se haconvertido en una técnica de rutinaen el ámbito de la genética, la micro-biología y la biotecnología.

Principios básicos de la PCRLa PCR se fundamenta en la ampli-ficación enzimática de un fragmen-to de ADN flanqueado por dos se-cuencias de oligonucleótidos que hi-bridan en la cadena complementariade la molécula molde que se va aamplificar (cebadores o “primers”) yque son utilizados por una ADN po-limerasa termoresistente (general-mente se emplea la de la bacteriatermófila Thermus Aquaticus, capazde crecer a elevadas temperaturas)para copiar la secuencia de la mis-ma. La reacción es un proceso que cons-ta de 3 etapas (repetidas unas 30-35veces): desnaturalización, hibrida-ción de los cebadores y extensión delos mismos.Desnaturalización: Para que puedainiciarse la reacción es preciso que

las moléculas de ADN molde se en-cuentren en forma de cadena sim-ple. Esto se consigue calentando atemperaturas de 90 a 95ºC para queproduzca la rotura de los enlacespuente de hidrógeno intercatenariosy la separación de ambas cadenas.Para asegurar la completa separa-ción de la doble cadena del ADN es-ta temperatura debe mantenerseunos minutos. Si el ADN solo se des-naturaliza parcialmente éste tende-rá a renaturalizarse muy rápidamen-te dificultándose una eficiente hibri-dación de los primers y la posteriorextensión de los mismos.Hibridación: Una vez que el ADNestá desnaturalizado se disminuyela temperatura de la reacción hastaun rango comprendido entre los 40 ylos 60ºC para que se pueda produ-cir la hibridación específica de loscebadores a las secuencias flan-queantes del fragmento que se de-sea amplificar. Esta etapa se deno-mina también fase de “annealing” yla temperatura a la que se realizadebe establecerse para cada reac-ción en función de la longitud de loscebadores y su secuencia (tempera-turas inferiores a la óptima nos pro-ducirán hibridaciones inespecíficasde los cebadores y temperaturas su-periores nos dificultarán la eficienciade la misma). Extensión: Durante esta etapa laADN polimerasa termoresistente in-corpora nucleótidos en el extremo3' del cebador utilizando como mol-de la cadena de ADN previamentedesnaturalizada. La temperatura a laque se realiza esta etapa de la reac-ción suele ser de 72ºC ya que es latemperatura a la que la Taq polime-

rasa alcanza su máxima actividad.Normalmente una extensión de 20segundos es suficiente para frag-mentos menores de 500 pares debases, y 40 segundos para fragmen-tos por encima de 1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos elnúmero de copias obtenidas se du-plica y después de 20 ciclos ya tene-mos aproximadamente 1 millón decopias de cada una de las molécu-las molde iniciales de ADN.La técnica puede usarse para la am-plificación de moléculas de ARN sipreviamente se realiza una copia delas mismas mediante la enzimatranscriptasa reversa. De este modopodemos realizar estudios sobremoléculas de ARNm o bien la pode-mos aplicar para la detección de vi-rus ARN.La elección de los cebadores y el ta-maño del fragmento amplificado esde gran importancia para el resulta-do final. En pruebas de diagnósticoel tamaño del fragmento amplificadono debe superar los 100-150 paresde bases de ADN si partimos demuestras que puedan haber sufridouna degradación de los ácidos nu-cleicos y la elección de los cebado-res debe realizarse para fragmen-tos específicos de la diana que que-ramos amplificar para evitar falsospositivos.Una vez realizada la amplificación,se procede a la identificación de lasecuencia obtenida mediante elec-troforesis, hibridación con sondascomplementarias o técnicas de aná-lisis de polimorfismos.El análisis por PCR puede ser dedos tipos: cualitativo (detección dela presencia o ausencia de un frag-

Dr. Armand Sánchez Bonastre Dep. de Ciencia Animal y de losAlimentos. Facultad de Veterinaria.Universidad Autónoma de Barcelona.armand.sanchez@uab.cat

La polymerase chain reaction(PCR)

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mento de ADN determinado) o cuan-titativo (detección de la cantidad deun fragmento de ADN determinado).

Análisis cualitativo de ADNmediante PCREste tipo de análisis se suele reali-zar cuando tan sólo es necesario co-nocer la presencia o ausencia de al-guna secuencia específica de ADN oARN, como por ejemplo la detecciónde la presencia de un patógeno enuna muestra. El análisis del produc-to amplificado suele realizarse me-diante electroforesis en gel o capi-lar y su visualización por tinción enbromuro de etidio o por detecciónfluorescente si previamente hemosutilizado uno de los cebadores mar-cado con algún tipo de fluorescen-cia.En algunos análisis resulta necesa-rio identificar la secuencia del pro-ducto amplificado y el producto de laPCR debe ser sometido a un análi-sis específico (secuenciación, diges-tión con enzimas de restricción...etc.).

Análisis cuantitativo de ADNmediante PCRLa PCR convencional no es una téc-nica cuantitativa ya que la amplifica-ción exponencial del ADN molde nose mantiene constante especialmen-te en los últimos ciclos de la reac-ción.Para poder realizar estimas cuanti-tativas se han desarrollado técnicasde PCR en “tiempo real” (PCR cuan-titativa) en las que es posible deter-minar la fase exponencial de la am-plificación y poder extrapolar de for-ma cuantitativa la cantidad de mol-de inicial que se esta amplificando.La metodología de PCR cuantitativa,facilita además la automatización yno suele requerir el procesamientoulterior del producto amplificado loque reduce el riesgo de contamina-ción. En la actualidad, existen en el mer-cado varios equipos y protocolos pa-

ra la realización de esta técnica.Desde el punto de vista de la detec-ción del producto amplificado en ca-da ciclo, existen tres métodos prin-cipales de análisis de PCR cuanti-tativa basados en técnicas de fluo-rescencia y que se diferencian en eltipo de detección de los productosde PCR. Estos métodos son: el queemplea una sonda con doble marca-do fluorescente (TaqMan ®) especí-fica de la secuencia amplificada, losbasados en el uso de dos sondasque hibridan de forma adyacente enel fragmento que amplificamos y, porúltimo, el que utiliza una sustanciaintercalante que se une a la doblecadena de ADN denominado SYBRGreen I y produce emisión de fluo-rescencia.El método más difundido, es el queemplea sondas TaqMan ®. Este mé-todo se basa en la actividad 5’-exo-nucleasa de la Taq polimerasa y enla amplificación mediante PCR deuna determinada secuencia diana enpresencia de una sonda fluorescen-te específica (sonda TaqMan ®) quehibrida con la secuencia diana queestamos amplificando. La sondaTaqMan®, de un tamaño aproxima-do de 20-30 bases, tiene unido unfluorocromo en posición 5’ y un se-gundo fluorocromo que actua por in-terferencia con el primero cómoamortiguador de fluorescencia enposición 3’. Además, esta sonda es-tá fosforilada en 3’ para evitar su ex-tensión durante la reacción de PCR.Si la secuencia diana está presenteen la muestra, la sonda TaqMan hi-bridará específicamente con ella, si-tuándose entre los dos cebadores.Cuando se produce la etapa de ex-tensión en la reacción de PCR, laactividad 5’-exonucleasa de la Taqpolimerasa degrada a la sondaTaqMan liberando el fluorocromo,que al quedar separado del amorti-guador emitirá una señal que puedeser captada por el sistema óptico delequipo. Este proceso de degrada-ción de la sonda tiene lugar en ca-

da uno de los ciclos y es directamen-te proporcional al número de molé-culas que están siendo extendidasen cada uno de ellos que podemosvisualizar por el incremento de la se-ñal de fluorescencia.Además, la Taq polimerasa no digie-re la sonda libre sino únicamente lahibridada, por lo que la cantidad deseñal fluorescente emitida es pro-porcional a la cantidad de productoacumulado. La medición de la inten-sidad de fluorescencia se realiza deforma continúa lo que nos proporcio-na una información dinámica entiempo real del proceso. El sistemade detección permite establecer elciclo umbral (Ct-cycle threshold), ci-clo de la PCR a partir del cual la can-tidad de fluorescencia emitida alcan-za el nivel de detección que haya-mos fijado, lo que a su vez se co-rrelaciona directamente con la can-tidad de ADN molde de la muestraanalizada. La cuantificación del nú-mero de copias de una muestra serealiza mediante la comparación dela Ct de la muestra problema con laCt de una serie de diluciones de unamuestra-control positiva. La cuanti-ficación de la muestra control posi-tiva permite establecer una curva es-tándar que refleja el número de co-pias y el número de ciclo en el queha sido realizada la detección de for-ma objetiva y reproducible.Cuando se realiza la cuantificaciónde una muestra problema, el cicloumbral de su detección se lleva a lacurva estándar lo que permite cono-cer el número de copias de la se-cuencia diana existente en la mues-tra analizada.El método de PCR cuantitativa basa-do en la química por hibridación desondas, emplea dos sondas secuen-cia-específicas que hibridan en re-giones adyacentes espaciadas entreuno y cinco nucleótidos. Una sondaestá marcada con un fluorocromoemisor en posición 3’ y la otra son-da está marcada con un fluorocromoaceptor en su extremo 5’. Esta son-

IX WORKSHOP MRAMA

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da además tiene bloqueado su extre-mo 3’ con un grupo fosfato para evi-tar su extensión. Sólo cuando las dossondas han hibridado y están próxi-mas se origina una emisión de fluo-rescencia por el fluorocromo acep-tor cuya intensidad aumenta propor-cionalmente a la cantidad de secuen-cia diana formada en la reacción dePCR. Esta metodología se diferenciade la química de sondas TaqMan ®en que no se requiere la hidrólisisde sonda para la emisión de fluores-cencia.El tercer tipo de detección de los pro-ductos específicos de PCR de la se-cuencia molde consiste en la utiliza-ción del agente intercalante SYBRGreen I. Esta sustancia se une espe-cíficamente a la doble hélice de lasmoléculas de ADN formadas en ca-da ciclo de la reacción de PCR pro-duciendo la emisión de fluorescen-cia. De esta forma, la señal fluores-cente se incrementa en función de lacantidad de producto amplificado. Laventaja de esta opción es que no seprecisa la síntesis de sondas fluores-centes específicas para cada tipo dedetección, aunque su inconvenientereside en su inespecificidad ya quese detecta fluorescencia para todoslos productos de ADN de doble cade-na presentes en la reacción (inclu-yendo los dímeros de cebador quesuelen producirse en la mayor partede reacciones de PCR).La realización de estas técnicas dePCR en tiempo real requiere dispo-ner de un equipo que disponga de unsistema de detección de fluorescen-cia. Existen actualmente en el mer-cado distintas alternativas cuyo cos-te suele estar relacionado con los ni-veles de sensibilidad y capacidad deanálisis de muestras de los mismos.Actualmente existen además plata-formas de alto rendimiento en for-ma de chip para la realización de unelevado número de reacciones deforma simultánea. Basadas en elmismo tipo de químicas que las em-pleadas en los equipos de PCR

cuantitativa convencionales estasplataformas utilizan volúmenes dereacción muy inferiores (en la esca-la de nanolitros), en forma de reac-tivos liofilizados o utilizando técnicasde microfluídica en el chip, con elconsiguiente ahorro de reactivos ydisminución del coste de los análi-sis.La utilización de este tipo de equiposjunto al incipiente desarrollo de téc-nicas que permiten amplificar selec-tivamente los ácidos nucleicos co-rrespondientes a células viables, có-mo el uso de EMA (ethidium bromi-de monoazide) o PMA (propidiummonoazide), permite pensar en unarápida expansión de protocolos ba-sados en PCR en los laboratorios demicrobiología de los alimentos.

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IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

It is my great honor and pleasure tobe here today and I would like tothank very warmly the organizers,Josep and Marta, for inviting me topresent the introductive paper of theIX Workshop on Rapid Methods andAutomation held in Barcelona. I must say that the world of rapid me-thods in which I have been submer-ged a very long time ago is really afascinating one,in terms of techni-ques but also of scientists: they areall so enthusiastic and eager to findnew ways of working in Food micro-biology in order to decrease the costof analysis while increasing the num-ber of samples! However, it took along time for those alternative me-thods to be officially accepted; oneof the reasons, of course, is that theresults have to be recognized by thescientific community as well by officialbodies; considering the fact that ha-monization of traditional methods wasand remains a difficult topic, it is veryeasy to understand that, when rapidmethods did appear on the market,other problems of acceptance had tobe faced: that was unavoidable In spite of their importance, espe-cially for international trade, differentaspects of harmonization of micro-biological methods are not widelyknown.and, even if my knowledge ofthe topic is far to be perfect, I thoughtit would be useful, as an introductivepresentation to that IX workshop heldin Barcelona, to share with you a fewdata and comments on that topic andI propose to divide my presentationinto four parts:• In a first time, I would like to pre-

sent some general considerationsand definitions.

• In a second time, if you allow me todo so, I will tell you a few wordsconcerning the reasons which ledme to be involved in the field ofHarmonization of MicrobiologicalMethods.

• Then, I will describe some of themain Standardization bodiesaround the world.

Finally and before my conclusion, Iwould like to focus on recent appro-aches which show the willingness ofinternational harmonization in Foodmicrobiology.

General considerations anddefinitionsHarmonization, in a first approach,relates to music, to equilibrium bet-ween different registers but it con-cerns different fields and we can findexamples of harmonization every-where. According to ISO (the InternationalStandards Organization about whichI will tell a few words very soon),standards are “documented agree-ments containing technical specifica-tions or other precise criteria to beused consistently as rules, guidelinesor definitions of characteristics to en-sure that materials, products, proces-ses and services are fit for their pur-pose”; Concerning Food microbiology har-monisation, we all know the neces-sary conditions to be filled for a com-parable evaluation of the food quality.The food samples examined have tobe representative of the food exami-ned, in fact, I should say “should be”,in terms of size of the samples,as itis really impossible, for practical re-asons, to analyse a sample of a suf-ficient size (with the help of statisti-cians we can only try to be close tothe reality). However, we can alwaysfollow the same rules in terms of typeof sample and also of methods ofanalysis, which is very important. Considering the type of sample, I will

explain from a simple example: if wewant to define the contamination of apoultry carcase, examining the skinor the muscle is not the same thingand results will surely be very diffe-rent.Considering the methods of analysis,harmonization is of upper importan-ce to obtain the same or, at least,equivalent results. In Europe, a spe-cial emphasis on those problems hasbeen given and can be seen whenreading the paper on microbiologicalcriteria for food published 15December 2005 in the OfficialJournal of European Communities;however, everybody knows that theharmonization of methods remainsa difficult task and we can remem-ber that, a few decades ago, therewere a lot of techniques used to de-tect or enumerate the same type ofmicroorganism and each microbiolo-gist wanted to keep his (her) own me-thod….

Entering in the field ofHarmonization ofMicrobiological Methods A long time ago, when I began towork, I was in Ploufragan (Brittany)where I have been working for 27 ye-ars.At that time, there was no labora-tory in the place, only a control lab,far from a few kilometers. My projectwas to improve the quality of poultryproducts, in order to help industrialsto improve their techniques and in-crease the shelflife of poultry meat(which was sold as refrigerated whi-le the conditions of processing werenot so good) and to improve the

Cécile Lahellec (cecile.lahellec@sfr.fr)Honorary Research Director, French FoodSafety Agency IX Workshop on Rapid Methods andAutomation in Food MicrobiologyBarcelona. 23 November 2010

International harmonization ofmicrobiological methods

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hygienic quality of their products. …Different options had to be takenconcerning - The types and size of the samples. - The types of microorganisms to be

studied and the methods of analy-sis.

Many years later, I can’t do otherwi-se than to observe that, without anynecessity or willingness of standardi-zation; from the beginnings, we hadprobably felt its necessity..We were also convinced of the ne-cessity of studying a high number ofsamples in order to avoid “precisionin error”; in fact, we had no idea ofthe poultry contamination and we hadin mind the objective to set up gene-ral laws which regulate the level ofcontaminations.. determine criticalpoints and try to improve the micro-biological quality. Later on, we deci-ded to try determining the origin ofcontaminations; then to look at pa-thogenic microorganisms along theproduction lines (“from farm to fork”)All that work was very expensive andthe necessity of using alternative me-thods became obvious from that pe-riod. In France, some scientists hadsimilar preoccupations and we beganto exchange with Prs C.Bourgeoisand P.Mafart in Quimper with PrH.Leclerc in Lille. but the most deci-sive for our future work was my par-ticipation in a symposium which washeld in Kiel(D) in 1974. I can’t forgetit...I did not present anything on thatday; I was just learning and listeningat the different papers when, sud-denly, we had a very interesting andunusual presentation: the speaker, ayoung American Chinese was quite“dancing”, showing beautiful slides:

the miniaturized methods used to de-tect or enumerate microorganismsfrom poultry was the subject of hispresentation: he was using micropla-tes instead of tubes and a micro-ino-culator instead of platina loops …Hehad a very simple principle“THINKSMALL”. As I was working on poultrymeat microbiology and was verymuch interested by rapid and econo-mic methods in order to study a lar-ge number of strains simultaneously,I met Dr Fung at the end of the ses-sion, asking for informations and re-prints; I must say it was the begin-ning of a long story.. first because hesent me reprints and even his thesisand, from that time we became verygood friends but I must say, too, thatit opened me new horizons, new con-tacts and a willingness to communi-cate about the possibilities which we-re offered to food microbiologists:they could use rapid method whichwere, till that period, used in the me-dical field only... for me, it was the be-ginning of a long story in science andfriendship …..Dr Fung visited ourInstitute in 1976 and, from that time,miniaturized methods were introdu-ced in our laboratory and used toidentify a lot of strains to traceSalmonella, then different types ofpathogenic microorganisms “fromfarm to fork”; we were so enthusias-tic with those methods that we pre-sented the technique as well as theresults during different meetings indifferent laboratories: we wanted tho-se methods be adopted by the scien-tific community … and were some-what successful.Here, I would like to tell you one shortstory:

I remember the visit of a politician inour lab: I was explaining him that witha low quantity of media, in a veryshort time, we could examine far mo-re strains than usual. He told me: inthat case, you will decrease yourstaff! And I answered: NO ! the sa-me technicians will study far morethan usual, that’all ! he said: OK…As you surely know, from the idea ofDr Fung (THINK SMALL !), a lot ofkits appeared on the market; you areaware of the present situation …butthe following is also a very beautifulstory, i.e the creation of courses sho-wing rapid methods in microbiologyall around the world. I want to re-member: once, I was in K.StateUniversity and, after my presenta-tion, I met a young Spanish scien-tist, eager of knowledge and new in-formations; that was just when Foodsafety Agencies in Europe werebeing organized; he told me: I wasvery interested in your talk but itwould have been interesting to saymore.. he looked somewhat disap-pointed.. Was it the reason why heinvited me different times inBarcelona to present the introductivepaper to the Spanish workshop ? Idon’t know but, anyway, I am veryhappy to be here today and I thinkthat what we are living is a perfectexample of a chain in Science.. However, the necessity of validatingthose methods in order to make themaccepted became obvious veryearly.and, for me, personally, it wasa big concern. In Afnor, the questionof rapid, alternative methods becameone branch of standardization in the1980’s. As I was concerned by harmoniza-tion, not only for traditional methodsbut also, and mainly for rapid me-thods, I was introduced, step by step,in that world of standardization: atthe time I was in charge of theCentral Food Hygiene Laboratory inParis, I was requested to be the con-venor of working group 6 of the tech-nical committee 275 of CEN (Comité

IX WORKSHOP MRAMA

Considering the methods of analysis,harmonization is of upper importance

to obtain the same or, at least,equivalent results

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Européen de Normalisation); at thattime, I also participated in some me-etings of Codex alimentarius (tomention those related to standardiza-tion)In 1995, that group of CEN becameconcerned by rapid methods.Personally, I retired from CEN in2005 but I remain in contact and, in2009, I had the great pleasure to joinmy previous colleagues for the joinedmeeting ISO/CEN in Valencia (Spain)

Short history and descriptionof some international organi-zations connected with Foodmicrobiology The first historic writings showthat governments took interest in co-difications of rules set up to protectthe consumer, but the first laws, con-cerning mainly the chemical purityappeared during the first part of the19th century. AOAC (created as theAssociation of Agricultural OfficialChemists) was created in 1884 butis more a validation than a standar-dization body; then, at the beginningof the 20th century, one can mentionthe existence of IDF (InternationalDairy Federation), of BSI (BritishStandards Institute), etc… but thefruitful period appeared just after thesecond World War and I shall focuson them a few minutes.

ISO (International StandardsOrganization)As you probably know, different offi-cial bodies are concerned by stan-dardization under different aspectsfor different types of production andeverybody knows ISO, i.e. theInternational StandardsOrganisation; this organization wascreated in October 1946; its seat islocated in Geneva (CH); the creationresults from the fusion of two orga-nizations: ISA which was the InternationalFederation of National Associationsof Standardization, founded in New-York in 1926 and

UNSC, i.e Committee for coordina-tion of standardization of UnitedNations, created in 1944.The first national Assembly was heldin 1949 in the great amphitheater inSorbonne (Paris)ISO is composed of 247 committees.All standards are obtained by con-sensus; however, they are not man-datory..The technical committee incharge of Food microbiology is TC34/ SC9; the actual president isBertrand Lombard (F); the meetingsare held in a different country eachyear; for example, in 2009, the mee-ting was held in Valencia (Spain); InMay 2010,so quite recently, the me-eting was held in Argentina; as usual,it was a joined ISO/CEN meeting

CEN, Comité Européen deNormalisation (in English“European Committee forStandardization “) has been createdin 1961 in order to harmonize thestandards elaborated in Europe; thatmeans that the standards are man-datory in all countries of EC (at thecontrary, the standards which areelaborated by ISO are facultative,which means a great difference … Allmembers are members of ISO aswell. The seat of CEN is located inBrussels (B).In the beginnings, it wascreated by the national organisms forstandardization from France,Germany and Benelux coun-tries.Nowadays, the full members arethe 27 countries of EU and the threecontries of AELE (AssociationEuropéenne de Libre Echange)which own such an organism

(Switzerland, Norway and Island).CEN elaborates technical standardsin favor of international trade.CEN/TC275/WG6 was created in1993 and I was nominated as theconvenor; nowadays, from July 2005,Alexandre Leclercq from InstitutPasteur in Paris, is in charge of thegroup. From the beginnings, one main prin-ciple has been followed during thework of this group, i.e the ViennaAgreement; this agreement requiresthat, as often as possible, ISO me-thods are taken into account.In order to avoid any overlap, thereis also an agreement between diffe-rent groups of CEN that only onegroup is in charge of a particular me-thod (the “Vienna agreement”). Forexample, TC302 in charge of milkand dairy products analysis may cho-ose one specific technique. In thiscase, it requests TC 275/WG6 to re-fer to this specific technique in thestandard method. The necessity oftaking into account the experience ofother groups around the world, forexample AOAC and IDF(International Dairy Federation), hasalso been emphasized from the be-ginning and, presently, the basis fora good cooperation has been set up. In order to maintain a good interna-tional cooperation, one part of themeeting concerns the liaison withother organizations, ie: InternationalDairy Federation (IDF) CodexCommittee on Food Hygiene, AOAC(Association of Official AnalyticalChemists), WHO (World’HealthOrganisation), IUMS (InternationalUnion of Microbiological Societies),

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AOAC was created in 1884 but is more a validation

than a standardization body

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OIE, (Office International desEpizooties) and also NMKL (coope-ration agreement between NMKL(Nordic Committee on Food Analysis)and ISO/TC34SC9)and ISO TC347and ISO TC147/SC4 Water microbio-logy.

Codex alimentarius Of couse, all of you have heard ofCodex alimentarius: the name meansa food code and is a compilation ofstandards for food, which can be ap-plied in all countries. Codex has be-en created in 1962 when the organi-zation of United Nations for Food andAgriculture (FAO) and the World’sHealth organization decided it wasnecessary to elaborate internationalstandards which may be used by theFood industry which was in full ex-pansion in order to protect consume-r’s health. in fact, in the first volume,it is said that the objectives of Codexalimentarius are: “to guide and pro-mote the elaboration and setting upof definitions and criteria for food, inorder to contribute to their harmoni-zation and facilitate international ex-changes. Codex alimentarius has a noticeableeffect on quality and safety of foodaround the world; it has allowed,everywhere, to improve the stan-dards which are applied at differentsteps of the food chain and to incre-ase a lot the international exchanges. In the Codex alimentarius, there ishigh number of committees, i.e twogroups of world committees, one on

general problems, the other on foodproducts. There are also some regio-nal committees. Food hygienists may be experts in

many of those groups; personally, Iparticipated different times in thecommittee “Food Hygiene“for whichUSA are the leader. All committees work in strong colla-boration with scientific organizationsin order to elaborate standards andrecommendations. As an example, I would like to re-member some sentences of one pa-per written in the “InternationalJournal of Food Microbiology“in1998: During the 21st session of CodexAlimentarius which was held inRome, Italy in July 1995, theCommission was invited to adapt asCodex general standards, a numberof draft texts submitted at step 8 ofthe Uniform Procedure for theLaboratory Codex Standards and re-lated texts – i.e.general standards forcontaminants and toxins in foods –methods of analysis and sampling “.Chemical contaminants were consi-dered first but, when, under CEN co-llaborative studies were carried outand that precision parameters wereintroduced into the ISO standards,they have been transmitted to CodexAlimentarius, so creating an interna-tional consensus.

Harmonisation of microbiolo-gical methods and of procedu-res for validation

The harmonization of methods isthe major task of the standardizationbodies. “Stricto sensu”, International stan-dards are axclusively elaborated byISO (the technical work of ISO ishighly decentralised and carried outin technical committees, subcommit-tees and working groups asTC34/SC9 for microbiological me-hods)Different national bodies: Afnor, BSI,DIN… in Europe, ANSI in USA (AN-SI is not an active member of ISO butclose relationships have been esta-blished in the Food microbiologicalsector. As an example, I’ll say a few wordsabout the elaboration of a ISO stan-dard: It always take into account the follo-wing principles: • The consensus: all points of view

are considered, whichever their ori-gin.

• At the industry scale, the solutionsmust aim to satisfy all concernedparties around the world.

• It depends on the willingness of thepartners

Three phases of elaboration can bedescribed:• The need of a standard is usually

submitted by a sector of the in-dustry which informs a nationalmember of that need; the nationalmember informs ISO. When theneed of a standard for a giventechnique, product … has been ap-proved and accepted, the followingtask is to define the technical sub-ject of the future standard. Thatphase is carried on within workinggroups composed of experts ofcountries interested in the ques-tion.

• When an agreement concerningthe technical aspects is obtained,a second phase begins: it is theconsensus phase

• The last part of the work concernsthe formal approval of the draft ofinternational standard (the criteria

IX WORKSHOP MRAMA

Codex has been created in 1962 when FAO and the World’s

Health organization decided it was necessary to elaborate

international standards

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are that two thirds of the ISOmembers who have participatedin the elaboration procedure mustapprove the draft; also 75% ofthe voting members must appro-ve it). Then, the draft is accep-ted as an International ISOStandard. It is also possible, pre-sently, to publish drafts at diffe-rent stages.

It seems important to know that so-me standards, obtained by consen-sus had not been validated by inter-laboratory tests; but the necessityof their validation appeared obviousespecially for the acceptance of al-ternative methods: as it is alwaysnecessary to compare a given me-thod with a reference one. This isthe reason why, under WG6 ofCEN/TC275 and quite a short timeafter the creation of the workinggroup, a proposal for a project en-titled “Evaluation of microbiologicalmethods for detection and/or enu-meration of microbiological conta-minants in foods “was presentedand then accepted as an EU project(SMT4/CT96-2098). The trials we-re carried on from 1996 to 2000; theresults for all types of contaminantsstudied have been accepted by theequivalent group of ISO and publis-hed in the “International Journal ofFood Microbiology“and later on,adapted as Codex standards. Theyhave become Reference methods,which was essential for the deve-lopment of alternative methods …From that time, we had referencemethods for Bacillus cereus,Staphylococcus aureus, Clostidiumperfringens, Listeria monocytoge-nes enumeration, for Salmonellaand Listeria monocytogenes detec-tion. The results obtained wouldmake possible the comparison of al-ternative methods with the referen-ce ones and, hopefully, their vali-dation. The results obtained duringthat SMT Project were published inthe International Journal of FoodMicrobiology.

At that time also, a close coope-ration began between CEN/ISOand AOAC and I’ll will always re-member one day in The Hague(NL) when we discussed around atable about the possible organiza-tion of common experiments con-cerning European and US labora-tories (that was a big concern asit was a European Project !)Finally some trials were organized byEuropean and US laboratories in or-der to compare the ISO method forthe detection of Salmonella (6579/2002)with the AOAC method. Finally, ISO 6579:2002 was recom-mended to be adopted as officialFirst Action for the analysis of freshcheese, fresh chilled and frozenpoultry and dried egg product.I shallgo back on that point in a few minu-tes. For the first time, one could re-ad “Hands touch over the sea “Another point has to be added. Howto introduce new technologies inthat world of traditional methods?;that was also the subject of many dis-cussions. Finally, An important resolution was takenduring the joined meeting ofISO/TC34/SC9 andCEN/TC275/WG6 held in Parma (It)in April 2004.“Each time a standard method isbeing revised, the possibility of usingnew technologies, including PCR,must be examined by comparing re-sults with those obtained when usingthe official conventional method”.For a given microorganism, in order

to complete the existing method, thedevelopment of standardised me-thods based on new technologiescan be proposed when the purposeto be obtained (for example pathoge-nicity level) makes it necessary.When new technologies, includingPCR, are used as alternative me-thods, they must be validated againstthe reference method.Those sentences look probably asquite simple,but I am sure youcannot imagine the number ofhours of discussions which werenecessary to obtain a consensus:that is “international cooperation“But the hours of discussions werevery fruitful..as, finally, rapid methodswere accepted according to the ECregulation 2073 15 December 2005concerning microbiological criteria:“Test results are dependent on theanalytical method used and, there-fore, a given reference methodshould be associated with each mi-crobiological criterion. However,Food business operators have thepossibility to use analytical methodsother than the reference method, inparticular more rapid methods, aslong as the use of these alternativemethods provide equivalent results “

So, alternative methods were fi-nally, officially accepted in the EC

Recent approaches in the har-monization of Food microbio-logical methods

IX WORKSHOP MRAMA

Finally, ISO 6579:2002 was recommendedto be adopted as official

First Action for the analysis of freshcheese, fresh chilled and frozen

poultry and dried egg product

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But, of course, difficulties we-re not over.. How to validatealternative methods was thefirst question. As we have said, a lot of alternativemethods can be found on the mar-ket and the present workshop is de-voted to those methods, but two mainsystems of validation do exist: - The AOAC Validation process.- The standard EN/ISO 16140.They both are composed of two pha-ses:• A method comparison (Pre-colla-

borative study).• An Interlaboratory Collaborative

Study. Of course there are some differencesbetween the two systems concerningespecially the number of matrices (6for AOAC, 1 for ISO/16140); the re-ference methods are also different(USDA, FDA, AOAC for AOAC, ISOfor EN/ISO/16140) but the principlesare similar, of course.Significant ef-forts have been realized for a mutualrecognition.I would also like to add a few wordsabout recent advances concerningMicroVal.- MicroVal is an “Eurekat“project (the

Eureka programme was set upon1985 to stimulate cross- bordertechnological cooperation and ad-vancement throughout Europe). itstarted in 1993 with the aim of set-ting up European validation proce-dure in four years time and further-more of creating such conditionsthat the results of the procedurewould be accepted as far as pos-sible by all interested parties inEurope Standardization and certi-fication play important roles in thisrespect.

MicroVal started as a Dutch-Frenchinitiative. The project was ended by21 full partners from 7 countries. Let’s me say a few words about thethree working groups which were setup: - Working group 1 studied informa-

tion on the validation used or pro-

posed by AFNOR (AssociationFrançaise de Normalisation), TheAOAC Research Institute, theEuropean Community (EC), theInternational Dairy Federation(IDF) and the International Unionof Pure and AppliedChemistry(IUPAC). The final reportof the first working group was pre-sented at the First Annual Meetingin Paris, 1994.

- Working group 2 drew up the ge-neral rules for the organization ofthe validation procedure and theValidation Certification Scheme.

-The third group started in parallelwith the second and focused ondrawing up the technical rules forvalidation, the test protocol andthe organization of the trial valida-tions in the second stage of theproject.

- The fourth working group lookedafter the financial aspects of theproject.

The General Rules describe the me-thods and the organization to beused for the European certification ofalternative methods for the food anddrink industry by an independent or-ganization: MicroVal certification. In the spring 1996, the MicroVal ste-ering committee started the procedu-re for European Standardization byforwarding to the EuropeanStandardization Committee (CEN), aproposal for a European Standardbased on criteria developed byMicroVal for the validation of alterna-tive microbiolgical methods. Thisproposal was accepted in June 1996by CEN /TC 275/WG6 as a new workitem for a European Standard“Protocol for the validation of alter-native microbiological me-thods“based on the two MicroVal do-cuments “General“and“Technical“rules for Validation crite-ria.. That was the beginning ofMicroVal..One really important event is the ac-ceptance of the results of combinedvalidations Microval / AOAC, last

November during the 2nd MicroValSymposium which was held in theHague (NL). What does it mean ? It means that (cf Michele Smoot):AOAC and MicroVal joined forces tocombine a MicroVal (basisEN/ISO/16140) certificate with AOACValidation (Official Methods ofAnalysis and/or Performance TestedMethods)Both organizations seek to fulfill theirown requirements with respect to theprocedures, rules, fees, etc, while de-signing a protocol that fits both AOACand MicroVal requirements Those two examples I just mentionedseem to me to be very promising ….

What to say as a conclusion ? Everybody knows that harmonizationof Food microbiological methods willsurely take a very long time even if oneknows that “a broad acceptance of mi-crobiological methods and associatedresults would facilitate knowledge ex-change and would speed up the imple-mentation of new methods / technolo-gies across appropriate food matrices“(Michele Smoot, IAAP Europe)However, I think we can be somewhatoptimistic: even if a recent observercould think that the progress is verylow, alternative methods seem to benow fully accepted quite everywhere;some good reference methods doexist, even if the work is not complete…, some approaches to harmonizethe systems of validation do exist andeven combined validations have be-en set up !And all that internationalHarmonization of MicrobiologicalMethods will take a growing importan-ce with the extension of FoodMicrobiolgy to the primary produc-tion..We may hope that, in the future,the situation will improve day by day…May we be allowed to considerInternational Harmonization ofMicrobiological Methods as a wonder-ful school to find the way of consen-sus in different situations of human li-ves ?

IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

En la sociedad actual el término se-guridad alimentaria supone un com-promiso muy serio de los producto-res con la sociedad, o mejor, de lasempresas elaboradoras o manipu-ladoras de alimentos con los consu-midores finales de éstos. Las exi-gencias del mercado son cada díamayores, se demandan productosseguros y competitivos, este hechocondiciona la forma de actuar de to-da la cadena alimentaria, principal-mente de la industria transformado-ra, que se ve obligada a buscar téc-nicas de análisis rápidas que le per-mitan poner en el mercado los pro-ductos en el menor tiempo posibley con todas las garantías sanitarias.Mahn Mac no es una excepción,nuestra principal actividad es la fa-bricación de ensaladas refrigeradas,un producto de difícil definición, yaque no encaja en los denominadosde cuarta gama, ni en los de quintagama. Se trata de una comida pre-parada terminada o lista para comer,envasada y conservada sin trata-miento térmico. Esta definición nospermite incluir a nuestros productosdentro del grupo A según describe elReal Decreto 3484/2000 sobre comi-das preparadas.La característica de nuestro produc-to es su corta vida, fijada en 90 dí-as desde su fabricación; esto nosobliga a fabricar prácticamente so-bre pedido, no es posible mantenerun stock ya que supondría consumirdías de su vida útil en nuestros al-macenes perdiéndolos de los linea-les del cliente. Para asegurar la calidad sanitaria denuestros productos durante toda sivida útil aplicamos una combinaciónde efectos barrera, es decir, aplica-mos barreras químicas y físicas a losmicroorganismos de forma que sola-mente puedan sobrevivir el menornúmero de microorganismos bana-les, y ningún patógeno. Para garan-tizar que esto se cumple aplicamosun protocolo de análisis microbioló-gicos en todas las etapas del pro-

ceso donde se incluyen microorga-nismos indicadores de higiene y al-gunos patógenos. Los microorganis-mos analizados son: microorganis-mos aerobios mesófilos, mohos y le-vaduras, enterobacterias, E. coli (co-liformes), Staphylococcus aureus,Salmonella y Listeria monocytoge-nes. Todos ellos incluidos en el RealDecreto 3484/2000 sobre comidaspreparadas. Actualmente seguimosempleando esta batería de microor-ganismos a pesar de la nueva direc-tiva comunitaria.La evolución del número de análisismicrobiológicos en los últimos ochoaños ha sido muy importante, pasa-mos de 4 análisis por día a los 40actuales. Esto supuso dos cosas: unmayor gasto en analítica y una ma-yor necesidad de recursos, tantotécnicos como humanos, para ges-tionar este volumen de trabajo. Porestas razones nos planteamos sus-tituir las técnicas tradicionales, algu-nas con más de 100 años de anti-güedad, por métodos alternativosmás rápidos. Los métodos conven-

cionales tienen la ventaja de su sen-sibilidad, su fácil interpretación y elbajo coste en equipamiento; por elcontrario necesitan mucho tiempopara la obtención de datos, son muylaboriosos y requieren un tamaño demuestra considerable. Cuando nosplanteamos automatizar el labora-torio de microbiología, nos pusimosunas exigencias mínimas que debe-rían cumplir los nuevos métodos al-ternativos, deberían tener precisióny resolución, deberían ser fáciles deusar por los analistas, deberían ge-nerar datos de forma rápida, debe-rían tener aceptabilidad y validacióninternacional, su coste analítico de-bería ser razonable, debería tenerun soporte técnico por parte del pro-veedor y no debería quedarse ob-soleto con el tiempo. Esto es, nues-tras necesidades se resumían en labúsqueda de un método fiable, efi-caz y de costes equilibrados. Todos las técnicas rápidas estudia-das presentaban las mismas venta-jas: permitían una reducción de ma-teriales y de tiempo, lo que se tradu-

Hilario Zapata Bozalongo Director Técnico Mahn Mac Delicatessen, S. L.hilario@mahnmac.com

La automatización total en unlaboratorio de microbiología.

Experiencia con tecnicas rápidasen la industria alimentaria

La evolución del número de análisismicrobiológicos en los últimos ocho

años ha sido muy importante, pasamosde 4 análisis por día a los 40 actuales

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cía en la posibilidad de realizar unnúmero mayor de análisis con elmismo personal y en el mismo tiem-po; pero como desventaja se obser-vó que algunas determinaciones noreducían considerablemente eltiempo de ensayo y que el coste dealguno de estos análisis no solo noera menor, sino que era muy supe-rior, y además, alguna técnica pre-cisaba de personal especializado. Estudiadas todas las posibilidades,nos decantamos por la opción pro-puesta por Biomerieux Industriescon sus equipos Mini Vidas yTempo, ya que con ambos se cum-plían los requisitos exigidos de rapi-dez, fiabilidad, validación internacio-nal y costes equilibrados. Tanto elequipo TEMPO para el recuento demicroorganismos indicadores de ca-lidad, como con el miniVidas para ladetección de patógenos, nos per-miten reducir los pasos necesariosque necesitaban las técnicas tradi-cionales empleadas hasta el mo-mento: ya no es necesario prepararel medio, ni hacer diluciones, ni ino-cular, ni leer placas y tampoco eranecesario hacer el informe final.Todas estas etapas se evitaban em-pleando los protocolo de trabajo deambos equipos.Podemos ver los ahorros de tiempoentre las técnicas convencionales ylas automatizadas en los siguientescuadros (Figura 1).Durante los primeros tres meses serealizaron ensayos por duplicado,empleando técnicas tradicionales(métodos ISO y/o oficiales) y técni-cas rápidas (Tempo y miniVidas),

para comprobar la correlación en-tre ambas, los resultados demostra-ron que ambos sistemas son fiablesy eficaces, el coeficiente de correla-ción fue superior a 0,98 en todos losparámetros testados.El siguiente estudio realizado sobrelas técnicas rápidas empleadas,Tempo y miniVidas, consistió en versu relación costo-beneficio, paraello se realizaron estudios de tiem-pos y de estructura del coste poranálisis. En estudio de tiempos podemos vercomo la microbiología tradicionalemplea para la preparación del en-sayo un 68 % del tiempo, mientrasque las técnicas rápidas emplean el80%; para la realización propiamen-te del ensayo las técnicas conven-cionales destinan un 20 % del tiem-po, y las técnicas automatizadasdestinan un 12%; para la lectura, in-terpretación y emisión del informeempleamos un 12% del tiempo enlas técnicas tradicionales, mientrasque con las técnicas rápidas emple-amos un 8 % del tiempo. Pero es-tos datos por si solos no nos dicennada si no los comparamos entreellos. Las técnicas convencionalesnecesitan, entre un 40 y un 60 %más de tiempo total que las técnicasautomáticas.Si estudiamos la estructura de loscostes por ensayo, podemos com-probar que la mano de obra en lastécnicas tradicionales absorbe un65% del coste, mientras que en lasrápidas solamente supone un 30%.En el caso de los materiales y re-activos empleados, las técnicas

convencionales consumen el 20%del coste, mientras las técnicas rá-pidas absorben el 52%; el concep-to de otros gastos supone en ambastécnicas un 15-18% del coste finaldel análisis.Estas han sido razones principalespor las que Mahn Mac ha automati-zado el análisis microbiológico y haadoptado métodos de ensayo rápi-dos. Es importante destacar algunade las ventajas encontradas en es-tas técnicas: a) la necesidad de li-berar lotes con mayor rapidez, b)ejercer una vigilancia rápida de to-das las etapas que componen elproceso de fabricación, c) la posi-bilidad de realizar un mayor núme-ro de controles que garanticen aúnmás nuestros productos, y c) unahorro de costes a medio plazo.Todas ellas contribuyen a la mayorsatisfacción de nuestros clientes.Podemos concluir diciendo que laautomatización de un laboratorio demicrobiología, así como el empleode técnicas rápidas nos ha contribu-ye a evitar errores humanos, hemosahorrado mucho trabajo manual, he-mos racionalizado los recursos hu-manos, ahorrado espacio, nos hafacilitado la eliminación de residuosy a medio plazo hemos conseguidoun ahorro en los costos. Además, noprecisamos de personal altamentecualificado, solamente con nuestropersonal bien formado y adiestradoen la ejecución de las nuevas tare-as es suficiente para garantizar lacorrecta realización de los análisismicrobiológicos con técnicas rápi-das como Tempo y miniVidas.

IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

La inocuidad alimentaria es un objeti-vo común al sector agroalimentario, yuna clara exigencia y preocupación delos consumidores. Del mismo asegu-rar la inocuidad de sus productos, esobjetivo primordial para el sector far-macéutico y cosmético. Para conse-guirlo la industria debe cumplir conuna seria de medidas y controles quegaranticen la obtención de productosinocuos. El mantenimiento de un elevado nivelde limpieza de los equipos y de las ins-talaciones y del entorno de trabajo,afecta de forma directa sobre la inocui-dad del producto final. Para conseguir-lo no solo deben ser regularmente lim-piados y desinfectados sino que su di-seño inicial debe facilitar la realizaciónde estas operaciones eficazmente asicomo garantizar que tanto las instala-ciones como los equipos por su dise-ño no se convierten en foco de conta-minación de los alimentos.El diseño de un equipo o instalaciónse considera “higiénico” si incorpora,con carácter preventivo, característi-cas que reducen o eliminan el riesgode constituir una fuente de contamina-ción para los alimentos, tanto de for-ma directa como indirecta. Por ejemplo, gracias a un adecuadodiseño higiénico es posible garantizarque un equipo o instalación determi-nada no transfiere ningún cuerpo ex-traño, sustancia química, ni microor-ganismo. Para ello, en el ámbito del di-seño higiénico de equipos e instalacio-nes se consideran factores tales comolos materiales de construcción, super-ficies de contacto, drenabilidad, her-meticidad, accesibilidad entre otrosmuchos. Errores o deficiencias en el diseño hi-giénico de instalaciones y de equipospueden hacer fracasar o dificultar laobtención de alimentos inocuos, au-mentando y/o dificultando las tareasde mantenimiento, limpieza, desinfec-ción, control de plagas y control delproceso fundamentalmente necesa-rias para asegurar unas condicionesde producción adecuadas.

Por lo tanto para conseguir equipos einstalaciones higiénicas estas debendiseñarse y construirse cumpliendo re-quisitos higiénicos. Pero aún así en al-gunos casos por razones funcionalesno es posible cumplir totalmente conestos requisitos y se hace necesariodisponer de métodos o ensayos quenos permitan comprobar que aún asíel equipo o instalación es limpiable oesterilizable , según exigencias de uso.

EHEDGEHEDG (European HygienicEngineering and Design Group) es unconsorcio europeo de fabricantes deequipos, industrias alimentarias, insti-tutos de investigación y autoridadespúblicas, fundado en 1989 con el ob-jeto de promover la higiene durante elprocesado y envasado de alimentos.EHEDG tiene vínculos fuertes con va-rias organizaciones internacionales ytiene entre sus planes buscar relacio-nes globales adicionales.Como la Seguridad Alimentaria no ter-mina en los límites de Europa, EHEDGpromueve activamente la armoniza-ción de las diferentes guías y normas.Las organizaciones americanas NSF y3-A, están de acuerdo en cooperar conEHEDG en el desarrollo de sus guíasy, por su parte, EHEDG colabora enel desarrollo de las normas 3-A y NSF.EHEDG proporciona asesoramientoen aspectos de ingeniería higiénica pa-ra la elaboración de alimentos inocuos.A continuación se indican los princi-pales objetivos de EHEDG • Proporcionar asesoramiento en as-

pectos de ingeniería higiénica para

la elaboración de alimentos inocuos.• Ofrecer un forum o punto de encuen-

tro a los fabricantes de equipos, laindustria alimentaria, usuarios y re-guladores para tratar aspectos de di-seño higiénico y fomentar la obten-ción de alimentos seguros.

• Proporcionar documentos guía so-bre las prácticas y normas esencia-les de diseño higiénico, basadas enciencia y tecnología, y revisarlas pe-riódicamente. Estas guías ofrecenasesoramiento a fabricantes deequipos y usuarios sobre cómo cum-plir con la legislación nacional e inter-nacional.

• Desarrollar métodos de comproba-ción que puedan ser utilizados porterceras partes para la evaluación deldiseño higiénico conforme a la legis-lación.

• Asegurar que el uso del nombre y lo-go de EHEDG se controlan conve-nientemente.

• Identificar áreas donde el conoci-miento del diseño higiénico es insu-ficiente y fomentar la investigación yel desarrollo en estas áreas.

EHEDG dispone de un esquema decertificación del diseño higiénico deequipos que en el caso de equipos ce-rrados cuando existan dudas o no pue-da demostrarse el cumplimiento totalde los requisitos de higiene por un ex-perto autorizado se debe someter a di-cho ensayo de comprobación de la lim-piabilidad. En la actualidad existen tipos de certi-ficados de diseño higiénico de equipos• EL Class I. equipos cerrados que se

limpian con sistema CIP

Mª Irene Llorca Pellicer Dpto Calidad y Medio Ambienteainia, centro tecnológicoillorca@ainia.es

Método para comprobar lalimpiabilidad in situ de

equipos para el procesado de losalimentos. EHEDG Documento nº2

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• EL Class II. Equipos semiabiertos ocerrados que requieren limpiezashúmedas.

• EL Aseptic. Equipos cerrados que selimpian con CIP, y son esterilizablescon vapor y herméticas o imperme-ables a las bacterias.

• ED. Equipos cerrados o semi abier-tos con limpieza en seco.

Método de evaluación de la lim-piabilidadEn el presente apartado se describe elmétodo de EHEDG para comprobar lalimpiabilidad CIP de equipos moderada-mente pequeños descrito en el docu-mento o guía nº2 de EHEDG. Se entiende por limpiabilidad in situ, laadecuación de un equipo para ser lim-piado fácilmente sin desmontarse. Laevaluación de la limpiabilidad in situ serealiza por comparación con la limpia-bilidad de una tubería referencia. El mé-todo consiste en someter el equipo aevaluar y la tubería de referencia al mis-mo proceso de ensuciamiento y de lim-pieza CIP (Clean In Place).El procedimiento de ensayo está dise-ñado para indicar las zonas con un di-seño higiénico deficiente en los equiposy está basado en una comparación, dela limpiabilidad de un elemento someti-do a ensayo con la de un trozo de tu-bería recto, o tubo de referencia. El gra-do de limpieza se basa en la eliminaciónde una solución ensuciadora que con-tiene bacterias y se valora evaluando elcrecimiento de las bacterias que que-dan después de la limpieza. El ensayo está pensado, por lo tanto,como ensayo básico de comprobación

del diseño de equipos higiénicos y noes indicativo del comportamiento en si-tuaciones de limpieza industrial.

Método de ensayoEl equipo o elemento que se va a en-sayar con objeto de comprobar su lim-piabilidad y por tanto su diseño higié-nico, junto con la tubería de referen-cia se someten a un proceso de ensu-ciamiento y posteriormente a su limpie-za.Para su ensuciamiento se utiliza lecheagria inoculada con GeoBacillus stea-rothermophilus ya que es de creci-miento rápido, tiene esporas que sonresistentes a la solución detergenteque se usa en el procedimiento de en-sayo y produce reacciones de colorbien definidas en el medio de creci-miento utilizado El agar utilizado es MSHA Shapton yHindes modificado, que con la presen-cia del Geobacillus provoca un cambioen el pH y el agar vira de color mora-do a color amarillo siendo muy fácil sudetección.El equipo a ensayar, se llena con la so-lución ensuciadora y se presuriza 3 ve-ces a 5 bares durante 2 minutos. A

continuación se vacía y se seca conaire seco filtrado.La sección de ensayo ensuciada semonta en un banco de pruebas CIP:a. Aclarar con agua fría (10-20ºC)

durante un tiempo igual al tiem-po medio de residencia (t) y noinferior a 1 minuto.

b. Hacer circular una solución deter-gente al 1,0% (p/v) a 63ºC 2ºCdurante 10 minutos (el volumende solución detergente usado de-be ser al menos 20 veces el vo-lumen interior del elemento so-metido a ensayo).

c. Aclarar con agua fría (10-20ºC)durante un tiempo igual al tiem-po medio de residencia (t) y noinferior a 1 minuto.

Tras el proceso de limpieza se reti-ra el equipo y la tubería de referen-cia del banco de pruebas y se pro-cede a la evaluación de su limpiabi-lidad para ello se procede a rellaratanto el equipo como la tubería conagar MSHA Después de que el agarse haya solidificado completamente,se coloca casi vertical en una estu-fa de cultivo a 58ºC durante 16-24horas.

IX WORKSHOP MRAMA

Aspecto superficies interna

del equipo tras haber finalizado

el ensuciamiento.

Banco de pruebas CIP

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Evaluación de resultados Después de la incubación, el equipo deensayo y del tubo de referencia se exa-minan para buscar la presencia de zo-nas de coloración amarilla en el MSHApúrpura. El tubo de referencia se abre y se ex-trae el agar solidificado para ello conuna herramienta epecial, se extrae elnúcleo central del agar. Luego se abreel tubo de agar que se ha formado con-virtiéndolo en una lámina plana y secoloca sobre una cuadrícula de re-cuento transparente. Por lo general, y asumiendo que exis-te una pequeña cantidad de coloramarillo en el tubo de referencia, sonposibles tres resultados para el equipoo elemento sometido a ensayo:a. Presencia de zonas y/o colonias

amarillas: se debe repetir el proce-dimiento de ensayo hasta un máxi-mo de cinco veces. La presenciade suciedad retenida en la mismazona del elemento sometido a en-sayo en tres ocasiones distintas esindicativa de zonas que son de di-fícil limpieza y, por consiguiente,zonas en las que se deben consi-derar mejoras en el diseño higiéni-co.

La limpiabilidad del elemento so-metido a ensayo se compara conla del tubo de referencia evaluan-do las superficies porcentualescorrespondientes de zonas ama-rillas:• Si la superficie porcentual dezonas amarillas en el elementosometido a ensayo es similar a ladel tubo de referencia, el grado delimpiabilidad es, por consiguiente,similar. • Si la superficie porcentual dezonas amarillas en el elementosometido a ensayo es inferior osuperior a la del tubo de referen-cia, el elemento sometido a en-sayo es, respectivamente, más omenos fácil de limpiar. En el ca-so de que sea igual o más limpia-ble que la tubería de referencia, elequipo sometido a ensayo es ap-to para certificar su diseño hi-giénico

b. Sin zonas / colonias amarillas: Siestas condiciones se dan en tresocasiones sucesivas, no es nece-sario repetir más el ensayo y elelemento sometido a ensayo sepuede describir como especial-mente fácil de limpiar o limpiable.

En ocasiones algunos materiales em-pleados en juntas de estanquidad pue-den tener propiedades antibacterianasque impidan que las esporas presen-tes en su superficie germinen y/o crez-can. Así, zonas con diseño higiénicodeficiente pueden no aparecer comozonas amarillas, lo que da lugar a re-sultados falsamente negativos.Para conocerlo, se deben comprobarlas propiedades antibacterianas de to-das las juntas tóricas y juntas de es-tanquidad, para ello se inocula con es-poras un volumen adecuado de MSHA(aproximadamente 102 ml-1 de agar)A continuación se colocan las juntas deestanquidad / juntas tóricas estérilesen placas petri adecuadas, se cubrencon el MSHA fundido y se incuban a58ºC durante 16-24 horas. Si las jun-tas de estanquidad / juntas tóricas tie-nen propiedades antibacterianas, seve una zona púrpura a su alrededor.

Centros autorizados porEHEDG para la realización delTest de limpiablidadEn la actualidad EHEDG dispone deun total de 6 centros autorizados pa-ra la realización de las pruebas delimpiabilidad y para la emisión de in-formes favorables necesarios para lacertificación del diseño higiénico deequipos:

Alemania : Universidad de MunichDinamarca: DTIEspaña: ainiaHolanda: TNOReino Unido: Campden BRI.USA: Universidad de Purdue

IX WORKSHOP MRAMA

Banco de pruebas CIP: conexión sección de ensayo

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IX WORKSHOP MRAMA

Las agencias reguladoras de la UniónEuropea reconocen la necesidad dedesarrollo e implementación de siste-mas de control dirigidos al incremen-to de la seguridad y la calidad de losalimentos y a la mejora de los siste-mas de trazabilidad, definidos por sucapacidad de rastreo de un alimentodesde sus orígenes hasta los consu-midores. Para conseguir el cumpli-miento de estos programas preventi-vos, ha sido establecida como priori-dad el desarrollo de métodos de de-tección, de análisis y de diagnósticoque sean rápidos, sensibles y auto-matizables de un amplio espectro deagentes que amenazan la salud hu-mana. Los biosensores se presentancomo los mejores candidatos porconseguir este nuevo reto.

Los agentes que afectan la se-guridad alimentariaLa contaminación alimentaria repre-senta uno de los problemas de saludpública más extendidos del mundocontemporáneo y es una importantecausa de mortalidad [1]. En los últi-mos años han existido numerososcasos de emergencias relacionadoscon la seguridad alimentaria que hanprovocado la desconfianza del con-sumidor en las distintas etapas deproducción de alimento, procesa-miento, y comercialización. Comoconsecuencia, la Comisión Europeaha establecido la seguridad alimenta-ria como una de sus principales prio-ridades temáticas, impulsando unanueva política activa en alimentos, re-lacionadas con la modernización delegislación, el refuerzo de los contro-les «de la granja a la mesa» y el au-mento del asesoramiento científico,para garantizar un nivel alto de sa-lud humana y protección al consumi-dor. Una política de seguridad ali-mentaria eficaz requiere la evalua-ción y la supervisión de los riesgospara la salud del consumidor asocia-das con las materias primas, las prác-ticas agrícolas y el procesamiento delalimento.

De entre los agentes que puedenamenazar la seguridad alimentaria,el término 'contaminante' se refierea sustancias peligrosas o microorga-nismos que no son añadidos inten-cionadamente, mientras que un'aditivo' representa un producto quí-mico añadido durante la produccióndel alimento [2]. Los contaminantespueden entrar en el alimento de for-ma accidental durante el crecimien-to, cultivo, o preparación del mismo,o bien acumularse en el alimento du-rante su almacenamiento, o formar-se in situ en el alimento por la inter-acción de componentes químicos, oconcentrarse desde sus componen-tes naturales. Los aditivos fueroncon anterioridad la principal preocu-pación de los consumidores, perohoy por hoy, existe mayor preocupa-

ción por las contaminaciones, enconcreto por las microbiológicas, se-guidas por la de los pesticidas y re-siduos de fármacos que pueden pro-ducir resistencia al tratamiento mé-dico [3].Las agencias reguladoras han esta-blecido programas de control paraevitar que los contaminantes entrenen la cadena alimentaria. La calidady la seguridad de los alimentos sólopueden asegurarse mediante el usode sistemas de control de calidad alo largo de toda la cadena alimenta-ria. Una de las formas más eficacespara proteger la salud pública en elsector de la alimentación consiste enbasar sus programas de producciónde alimentos en el Análisis deRiesgo y Puntos Críticos de Control(HACCP, del inglés Hazard Analysis

María Isabel Pividori Grup de Sensors i Biosensors (GSB),Departament de Química, UniversitatAutònoma de Barcelona, 08193, Bellaterrae-mail: Isabel.Pividori@uab.cat Fax: +34 581 2379; Tel: +34 93 581 4937http://webs2002.uab.es/ipividori/

Biosensores para bacteriaspatógenas en seguridad

alimentariaLas agencias reguladoras, los laboratorios de

control de calidad y los propios consumidores

podrán disponer en un futuro de dispositivos

biosensores capaces de realizar análisis de

manera más rápida, descentralizada y

económica en muestras alimentarias

complejas, tanto a pie de proceso en la

industria como en los establecimientos de

venta.

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Critical Control Point). Las prácticasbasadas en HACCP consisten en unproceso sistemático preventivo pa-ra garantizar la seguridad alimenta-ria, asociado al control de riesgos ypeligros potenciales durante la ope-ración y manipulación de alimentos[4].

Métodos analíticos de van-guardia y retaguardia para ladetección de bacterias pató-genas en alimentosUna aproximación realista y aplica-ble a programas HACCP para con-seguir la seguridad alimentaria con-templa la explotación de las caracte-rísticas particulares de los métodosanalíticos existentes para la detec-ción de patógenos mediante la jerar-quización de los mismos en un mo-delo de vanguardia-retaguardia, talcomo se muestra en la Figura 1 [5],siendo los métodos de vanguardia(o screening) aquellos utilizados pa-ra tomar decisiones rápidas, normal-mente fuera del ámbito del labora-torio analítico mientras que los deretaguardia se realizan en el labo-ratorio, y están basados en los mé-todos de referencia microbiológicosclásicos. En un modelo de este ti-po, cientos de muestras pueden so-meterse en un tiempo reducido a unsistema de screening, el cual propor-ciona de forma simple, rápida y eco-nómica información analítica de ti-po si/no, índices totales, o de alar-ma, que sirven para tomar decisio-nes rápidas. Sólo un escaso núme-ro de las muestras que han ofrecidouna respuesta positiva son someti-

das a un proceso analítico tradicio-nal en el laboratorio: en el caso debacterias patógenas, mediante mé-todos microbiológicos clásicos (quepueden tardar hasta una semana omás en dar un resultado confirma-torio).Los sistemas analíticos de scree-ning, proporcionan información ana-lítica de un modo simple y rápido.Son diseñados para procesar un al-to número de muestras por día,cuando se requiere una decisión rá-pida, y cuando el sistema analíticodebe funcionar fuera del ámbito dellaboratorio. O bien, cuando la infor-mación analítica cuantitativa no inte-

resa. Son características fundamen-tales de estos sistemas propiedadestales como simplicidad, rapidez de larespuesta analítica y bajo coste. Nose debe cometer el error de pensarque la información analítica que danestos métodos de screening es depeor calidad. Más bien, los paráme-tros tradicionales de un resultadoanalítico en términos de calidad pa-ra estos métodos de vanguardia o descreening deben ser redefinidos. Porejemplo, los conceptos de sensibili-dad y especificidad de estos méto-dos aparecen reciclados desde laepidemiología. Así, en un método descreening, la sensibilidad se definecomo el % de muestras positivas co-rrectamente identificadas como tal,mientras que la especificidad se de-fine como el % de muestras negati-vas correctamente identificadas [6].La especificidad y la sensibilidad secontrolan mediante la definición deun valor de corte o cut-off. Por lo ge-neral, un sistema analítico de van-guardia se asocia a un método con-firmatorio, que actúa como un siste-

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Figura 1.- Modelo de jerarquización de métodos analíticos para la seguridad alimentaria.

Sistemas analíticos de vanguardia-retaguardia. Adaptado de Ref [5].

Los sistemas analíticos de screening,proporcionan información analítica

de un modo simple y rápido

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ma analítico de retaguardia (Figura1), por lo que, en la mayoría de loscasos un falso positivo no es tan pro-blemático como un falso negativo,debido a que posteriormente se vaa investigar. Pueden incluirse dentro de los mé-todos de vanguardia o de screeningtodos aquellos métodos rápidos pa-ra la detección de bacterias patóge-nas, incluyendo los ensayos inmuno-lógicos tales como los ELISA (del in-glés enzyme linked immunosorbentassays), aquellos basados en la de-tección de ácido nucleicos tales co-mo las técnicas de amplificación invitro del DNA basadas en la PCR (delinglés polymerase chain reaction),así como los dispositivos biosenso-res, que se tratarán a continuación.

Sensores químicos y biosen-soresLos sensores químicos existen des-de hace mucho tiempo. Se han es-tudiado en profundidad y han encon-trado en todo este tiempo un grancampo de aplicación. Se conocenmuy bien por su uso cotidiano en ellaboratorio los electrodos selectivosa iones, especialmente el de pH. Losbiosensores, de aparición más re-

ciente, constituyen un campo multi-disciplinar de I +D y un mercado muyatractivo. Originariamente la investi-gación en este campo provenía prin-cipalmente del sector clínico y bio-médico. Actualmente los biosenso-res no son patrimonio exclusivo dela investigación biomédica. A la in-dustria en general, y a la alimentariaen particular, le es necesario contro-lar de manera fiable parámetrosanalíticos en matrices muy comple-jas. Un sensor está formado por dos par-tes. Una de estas partes es el de-nominado «elemento de reconoci-miento molecular» o «receptor» queinteracciona con un determinadocomponente de la muestra, de ma-nera específica, es decir, el resto dela muestra no interfiere en la medi-

ción. La otra parte se conoce como«transductor». Cuando el compo-nente que se busca determinar en lamuestra compleja interacciona conel «receptor» del sensor, se produceun cambio que es detectado por el«transductor» y transformado en unaseñal eléctrica mensurable por uninstrumento. Esta configuración tan simple de re-conocimiento y transducción es laque ha permitido el diseño de unainstrumentación con característicasprácticas e innovadoras en el cam-po del análisis. Mediante este es-quema analítico tan simple es posi-ble eliminar varias etapas conven-cionales del proceso analítico, comoson el tratamiento de la muestra o laseparación del resto de la muestradel componente que se quiere deter-minar, los cuales complican un pro-cedimiento clásico de análisis cuan-do se usa equipamiento analíticocomplejo. Un biosensor es un sensor químicocon un receptor constituido por ma-terial biológico para el reconocimien-to molecular del analito. El reconoci-miento molecular biológico es la cla-ve de la vida celular, de su organiza-ción y mantenimiento. Este tipo dereconocimiento, optimizado por laevolución biológica, se usa para eldesarrollo de los biosensores.Efectivamente, las interacciones en-tre enzimas y sustratos o inhibido-res, entre anticuerpos y antígenos ohaptenos, entre diversos receptoresy hormonas, fármacos y neurotrans-misores y entre fragmentos de DNAhan servido de modelo a varios sis-

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Figura 2.- Izq. Diagrama esquemático de la inmunoseparación magnética (IMS) de

Salmonella en muestras de leche. Der. Imágenes de la microscopía electrónica de barri-

do, luego de la inmunoseparación magnética de Salmonella (104 CFU/ml). Voltaje de ace-

leración 15 kV.

Pueden incluirse dentro de los métodosde vanguardia o de screening

todos aquellos métodos rápidos parala detección de bacterias patógenas

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temas biosensores, algunos ya co-mercializados.Debido a sus características, los bio-sensores representan unas herra-mientas de análisis con numerosasaplicaciones en la industria agroali-mentaria. Las características másdestacadas de estos dispositivosque los convierten en opciones al-tamente atractivas son: y) su espe-cificidad, ii) alta sensibilidad, iii) cor-to tiempo de análisis, iv) capacidadde inclusión en sistemas integrados,v) facilidad de automatización, vi)capacidad de trabajar en tiempo re-al, vii) versatilidad, que permite el di-seño de dispositivos «a la carta»,viii) su bajo coste, ix) no destructi-vos, lo que permite el control de pro-

cesos in situ, x) no contaminantes,amigables con el medio ambiente.[7] Los biosensores son, por lo tan-to, ideales para su implementaciónen protocolos de Análisis de Riesgosy Puntos Críticos de Control para elestablecimiento, implementación y

mantenimiento de un plan de calidaden toda la cadena alimentaria. La separación magnética ylos magneto sensoresUno de los materiales más prome-tedores en bioanálisis son las partí-culas paramagnéticas modificadasbiológicamente, que se basan en elconcepto de bioseparación magnéti-ca. Las partículas magnéticas (MPs)o sus contrapartes nanoestructura-das (MNPs) ofrecen nuevas y atrac-tivas posibilidades en biomedicina ybioanálisis debido a que se puedenrecubrir de biomoléculas y puedenmanipularse mediante la aplicaciónde un campo magnético externo. Asíla molécula biológica analito (célu-las, proteínas, DNA, pequeñas mo-léculas orgánicas) puede unirse se-lectivamente a las MPs y luego re-moverse de matrices biológicascomplejas tan sólo mediante la apli-cación de un campo magnético. Lafigura 2 muestra como ejemplo la in-munoseparación magnética deSalmonella en una muestra alimen-taria como es la leche, mediante lareacción de la bacteria con partícu-las magnéticas modificadas con elanticuerpo específico. Además, lasMPs, constituidas por un núcleo deferrita de propiedades paramagnéti-cas y recubiertas por un polímeroinerte, se ofrecen comercialmentede una variedad de materiales y ta-maños, y modificadas con una granvariedad de grupos funcionales, loque les otorga una gran flexibilidadanalítica [8]. Así, pueden ser modifi-cadas con diferentes grupos orgáni-

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Figura 3.- Representación esquemática de los procedimientos basados en magneto

electrodos m-GECs, incluyendo la i) modificación de las MPs, ii) la captura magnética de

las MPs con el magneto electrodo y, finalmente, iii) la detección electroquímica del even-

to de reconocimiento biológico. También se muestra el aspecto macroscópico del mag-

neto electrodo desarrollado en el GSB comparativamente con una moneda de un euro.

Debido a sus características, losbiosensores representan unas

herramientas de análisis con numerosasaplicaciones en la industria

agroalimentaria

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cos para acoplarse covalentementea biomoléculas (enzimas, DNA o an-ticuerpos), o ser modificadas direc-tamente con biomoléculas como es-treptavidina, Proteína A o poli(dT). El GSB diseñó una estrategia bio-sensora que se basa en la integra-ción de MPs a magneto electrodoscon detección electroquímica queofrece características analíticas me-joradas, y que se muestra esquemá-ticamente en la Figura 3. En lugar dela modificación directa de la super-ficie del electrodo, las reaccionesbiológicas (tales como la inmoviliza-ción, la hibridación, la marcación en-zimática o las reacciones de afini-dad, entre otras), así como los pa-sos de lavado, pueden realizarse demanera óptima en la superficie delas MPs. Luego de las modificacio-nes, las MPs pueden capturarse enla superficie de un magneto electro-

do basado en compósitos grafito-epoxi que tienen un pequeño imánen el interior (m-GEC), diseñado ennuestros laboratorios (Figura 3).

Este procedimiento constituye unaplataforma muy versátil para biosen-sores electroquímicos (tanto geno-sensores como inmunosensores) enmatrices alimentarias complejas.El Grupo de Sensores y Biosensores(GSB), en colaboración con elDepartament de Genètica iMicrobiologia, de la UniversitatAutònoma de Barcelona dirige sus lí-neas de investigación en este senti-do. A continuación se explican losprincipales avances conseguidos enel campo de la determinación debacterias patógenas por este grupo.

Magneto genosensor electro-químico En nuestro laboratorio se ha diseña-do un método ultrasensible de de-tección de bacterias patógenas ba-sado en la amplificación del genomapor PCR utilizando cebadores mar-cados de forma que el producto am-plificado esté doblemente marcado,tal como se muestra en la Figura 4.Una de las marcas se utiliza para lainmovilización del amplicón, mien-tras que la otra, para acoplarse a unmarcador enzimático para la detec-ción electroquímica. Esta estrategiaha demostrado aumentar la sensibi-lidad de dispositivos genosensorescon diferentes pares de cebadores

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Figura 4.- (A) Estrategia genosensora del producto doblemente marcado con –BIO y

–DIG basadas en estrept(avidina)-MPs integradas a un magneto sensor m-GEC. (B)

Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de doble marcación, en la

que se utilizan cebadores marcados en 5’ para obtener un producto doblemente marca-

do. En el caso de la figura se muestran cebadores biotinilados y modificados con digoxi-

genina. Otros datos experimentales en detalle en Ref [9].

Figura 5.- Representación esquemática de la estrategia de determinación de Salmonella

basada en un magneto electrodo. (i) Luego de la captación de las bacterias de la mues-

tra alimentaria, y la reacción con un segundo anticuerpo marcado con la peroxidasa, las

partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico son captadas por el elec-

trodo magnético. (ii) El electrodo se polariza a -0,1 V (vs. Ag/AgCl) y se detecta electro-

químicamente la señal tras la adición de los reactivos necesarios.

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para diferentes pares de transducto-res/marcadores. Se ha demostrado lautilidad de este sistema con el par decebadores –BIO (para la inmoviliza-ción del amplicón en partículas mag-néticas modificadas con es-trept(avidina) (estrept(avidina)-MPs)y su posterior integración a un mag-neto electrodo m-GEC) y –DIG (parala marcación enzimática con el mar-cador antiDIG-HRP). Con esta estra-tegia rápida y sensible se pueden de-tectar escasas fmoles de productoamplificado y doblemente marcado(amplicón) del elemento IS200 espe-cífico de la Salmonella [9], así comodel del gen eaeA, relacionado a la pa-togenicidad de la E. coli O157:H7[10]. Además, hemos propuesto unmétodo screening de la tuberculosis(TB) en ganado mediante la determi-nación a partir de la amplificación porPCR y doble marca del fragmento deinserción IS6110 específico de M. bo-vis, en tanques de leche de estable-cimientos lecheros [11]. El magnetogenosensor mostró característicasprometedoras para la detección detuberculosis en granjas de ganado le-chero a través de la determinacióndel DNA de M. bovis en muestras deleche procedentes del mismo, com-parándolas con pruebas de PCR deinterlaboratorio así como con la reac-ción cutánea de tuberculina.

Magneto inmunosensor elec-troquímico El GSB ha diseñado un sistema elec-troquímico para la detección rápida ysencilla de Salmonella en leche, basa-do en la captura inmunomagnética deSalmonella y en una reacción inmuno-

lógica de tipo sándwich [12]. Para talfin, se utilizaron partículas magnéticasrecubiertas por anticuerpos específi-cos anti-Salmonella y un segundo an-ticuerpo anti-Salmonella marcado conla enzima peroxidada (Figura 5). Entre procedimientos diferentes, losmejores resultados se obtuvieroncon las reacciones inmunológicasllevadas a cabo en un paso, hechoque trae asociado el acortamiento yla simplificación del proceso. El pro-

cedimiento IMS/m-GEC/inmunosensor fue utilizado porprimera vez para la detección deSalmonella inoculada artificialmenteen muestras de leche. Se obtienecon esta estrategia un límite de de-tección de 5 103 cfu mL-1 y de 7,5103 cfu mL-1 en LB y en leche dilu-ída 1/10 en caldo LB, respectiva-mente, en 50 min sin ningún pretra-tamiento. Si la leche se preenrique-ce durante 6 horas, el método pue-de detectar tan sólo 1,4 cfu mL-1,mientras que si se preenriquece du-rante 8 horas, se pueden detectartan sólo 0,108 cfu mL-1 (2,7 cfu en25 g de leche, en 5 muestras de 5mL, según el Real Decreto1679/1994, BOE 24-09-94).Además, el método puede distinguirentre bacterias patógenas alimenti-cias como Salmonella y E. coli.

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Figura 6.- (A) Representación esquemática de la estrategia de determinación de

Salmonella basada en la captura inmunomagnética (A), la lisis de la bacteria (B), libera-

ción del DNA genómico y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de doble marca-

ción de 0.04 CFU mL-1 (o 1 CFU en 25 g) de Salmonella en leche luego de un paso de

preenriquecimiento de 6 h en medio LB. (D) Gel de agarosa obtenido del amplicón doble-

mente marcado (calle Nº 3), del control negativo (0 CFU mL-1, calle 2), así como el mar-

cador de tamaño (genoma ΦX174-Hinf I, calle 1). (E) Señal electroquímica obtenida con

el magneto genosensor del producto doblemente marcado (barra gris) y del control nega-

tivo (barra negra). En todos los casos, n = 4.

El GSB ha diseñado un sistemaelectroquímico para la

detección rápida y sencilla de Salmonella en leche

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Magneto genosensor electro-químico combinado con PCR ycon separación inmunomagné-tica En el GSB se ha desarrollado un mé-todo sensible de detección de bacte-rias que combina la separación inmu-nomagnética (IMS), la PCR con doblemarcación y la detección electroquí-mica mediante un magneto sensor[13]. La bacteria se captura desde lamuestra alimentaria mediante partícu-las magnéticas modificadas con el an-ticuerpo específico. Luego de la sepa-ración, y de la ruptura de la membra-na celular, el genoma de la bacteriase amplifica y se marca por PCR.Luego de la amplificación, se consi-gue la inmovilización de la secuenciaamplificada a partículas magnéticasrecubiertas de estreptavidina, me-diante la reacción con la biotina, y lamarca enzimática mediante el otro ex-tremo modificado con digoxigenina.Posteriormente, las partículas magné-ticas modificadas son captadas por elmagneto electrodo y se realiza la de-tección electroquímica basada en laactividad enzimática (Figura 6). Esta estrategia puede detectar tan só-lo 1 CFU mL-1 de bacterias en LB asícomo en leche diluida 1/10 en LB, sinmostrar ningún efecto de matriz, acausa del uso de partículas magnéti-cas. El inmunoseparación magnéticapermite reemplazar el cultivo selecti-vo mientras que la PCR de doble mar-ca y detección electroquímica basadaen el magneto sensor reemplaza lasetapas de pruebas bioquímicas y con-firmación serológica del método de re-ferencia. El tiempo del ensayo se con-sigue reducir considerablemente des-de 3-5 días a 3.5 h. Es importantedestacar que esta estrategia puededar resultados positivos con célulasbacterianas dañadas o muertas, pe-ro sin embargo, y a diferencia de laPCR convencional, no da resultadospositivos con DNA liberado durante elprocesamiento del alimento. Además,los inhibidores de la PCR se evitan enesta estrategia al extraer el DNA en el

interior de la célula bacteriana y libe-rarlo una vez eliminada la muestra (ylos posibles inhibidores que conten-ga). Si la muestra se preenriquece por6 h en LB, se pueden detectar tan só-lo 0.04 CFUs mL-1 de Salmonella conuna señal/ruido de 20 (Figura 5). Esteprocedimiento es adecuado por elanálisis in situ rápido y sensible deSalmonella en HACCP.La especificidad de esta estrategiaestá dada tanto por el reconocimien-to inmunológico del anticuerpo duran-te la separación inmunomagnética asícomo por el set de primers durante elPCR, mientras que la sensibilidad vie-ne dada por el magneto genosensorelectroquímico. El GSB está trabajando en la actuali-dad en el desarrollo de sistemas mul-tiplexados de screening de microorga-nismos patógenos viables enteros, taly como Salmonella, Listeria yEscherichia coli, para la detección rá-pida de estos patógenos en muestrasalimentarias complejas. Asimismo,también estamos trabajando en el di-seño de biosensores para otro tipo decontaminantes alimentarios no micro-biológicos, tales como residuos ali-mentarios (antibióticos, pesticidas,alergenos, aditivos alimentarios).

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IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

El género Vibrio está compuesto pormás de 35 especies cuyo hábitat pri-mario es el medio acuático, tantoaguas saladas como dulces. Algunaspoblaciones de estas especies pue-den producir infecciones en huma-nos a través de la ingesta de aguacontaminada o de alimentos marinoscrudos o mal cocinados. Las tres es-pecies con mayor relevancia clínicason Vibrio vulnificus, Vibrio parahae-molyticus y Vibrio cholerae.Hasta la fecha no se ha establecidoun marcador de virulencia universalpara V. vulnificus, aunque se cono-cen muchos de los factores implica-dos en su patogenicidad, como porejemplo el lipopolisacárido capsular(CPS), los pili, hemolisinas, metalo-proteasas y enterotoxinas. El poten-cial patogénico de V. parahaemoly-ticus ha sido asociado con la pre-sencia de la hemolisina TDH codifi-cada por el gen tdh que está presen-te en cerca del 95% de las cepasaisladas de casos clínicos. El prin-cipal marcador de virulencia paradetección de V. cholerae es el genctx, que codifica para la enterotoxi-na colérica. Las infecciones causadas por Vibriohan sufrido una imparable expansióndurante los últimos años, afectandoa zonas del mundo en las que nun-ca se había detectado este patóge-no, lo que ha obligado a activar me-canismos de control para controlar elriesgo de infección por este organis-mo. Este fenómeno ha sido asocia-do a factores de origen antropogéni-co, como el transporte marítimo, asícomo factores oceanográficos, comoel movimiento de masas de agua,que podrían estar influenciadas porel cambio climático. España no seha quedado ajena de la expansiónde estas enfermedades y se ha no-tado un incremento en el número decasos a partir de los años 90.

Identificación y detecciónLa identificación de estos microorga-nismos por métodos convencionales

de cultivo en placa y confirmaciónbioquímica es larga y está sujeta adiferentes inconvenientes como elsobrecrecimiento en las placas deflora acompañante, al estado de via-ble pero no cultivable de los micro-organismos y sobre todo a la impo-sibilidad de discriminar aquellos es-pecímenes potencialmente patóge-nos. Una solución rápida y sencilla aestos inconvenientes es el empleode técnicas basadas en la reacciónen cadena de la polimerasa (PCR),preferiblemente la PCR a tiempo re-al, más rápida, específica y sensi-ble que la PCR convencional porqueañade a la reacción una sonda es-pecífica. Estas sondas son oligonu-cleótidos complementarios a la re-gión diana, situadas entre los ceba-dores, que están marcados en suextremo 5´por un fluorocromo queemite fluorescencia en el momentoen el que la Taq polimerasa, al am-plificar la secuencia, lo separa de lasonda. Además, la PCR a tiempo re-al permite el uso de un control posi-tivo interno (IPC) evitando así resul-tados falso-negativos debido a lapresencia de inhibidores, por otraparte tan frecuentes en los produc-tos alimentarios. Finalmente, pres-

cinde de la utilización de electrofo-resis en gel para la resolución delproducto amplificado, se reduce laposibilidad de contaminación y todoslos resultados se analizan y archivande forma automática por un softwa-re.Hasta la fecha no existía en el mer-cado un kit o test comercial que per-mitiese la detección y cuantificaciónde V. parahaemolyticus, V. vulnificusy V. cholerae, incluyendo sus varian-tes potencialmente patógenas.Analizando las carencias en la de-tección de estos tres microorganis-mos y en colaboración con la empre-sa Applied Biosystems, se ha dise-ñado y optimizado un kit, en forma-to liofilizado, de detección de estosmicroorganismos empleando la téc-nica de PCR multiplex a tiempo real,incluyendo un control positivo inter-no (IPC) y realizándose la detecciónde todas las secuencias diana deforma simultánea en la misma reac-ción de PCR. Un aspecto importan-te de estos nuevos productos es quese distribuyen en formato liofilizado,por lo que solo es necesario añadiruna solución acuosa con el ADN delorganismo a detectar, lo que evitalos numerosos problemas asociados

Verónica Blanco Abad y Jaime Martínez Urtaza

Instituto de Acuicultura, Universidad deSantiago de CompostelaE-mail: veronica.blanco.abad@usc.es

Detección de vibrioparahaemolyticus, vibrio

cholerae y vibrio vulnificus porpcr a tiempo real

La identificación de microorganismospor métodos convencionales

es larga y tiene inconvenientes

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con la manipulación de los reactivosy con la contaminación cruzada.

DiseñoComo dianas de detección de V. para-haemolyticus se ha seleccionado elgen regulatorio toxR y el gen tdh co-mo diana de detección de los especí-menes patógenos. V. cholerae se de-tecta por amplificación del gen ompWque codifica una proteína de membra-na, y los especímenes patógenos sereconocen por amplificación del gende la enterotoxina colérica. La presen-cia de V. vulnificus se determina por lapresencia de un gen de regulación es-pecífico de este microorganismo. Enaquellas muestras en las que esté pre-sente alguno de estos genes, habráuna emisión de fluorescencia quesupere un valor límite o línea umbral.El IPC ha de emitir fluorescencia y su-perar la línea umbral en todas lasmuestras negativas para los genesdiana (Figura 1). El protocolo de ci-clos-temperaturas es idéntico para las6 sondas incluidas en el diseño.Las sondas se han diseñado con tec-nología TaqMan MGB (AppliedBiosystems). En las Sondas TaqManse une un fluorocromo al extremo 5’de la sonda y un quencher al 3’.Cuando el fluorocromo es excitado,transfiere su energía al quencher.Cuando la Taq empieza amplificar elADN diana, el extremo 5’ de la son-da es degradado por la actividad exo-nucleasa 5’-3’ de la Taq. Este proce-so libera el fluorocromo al medio se-parándolo del quencher, lo que oca-siona un aumento de la fluorescen-cia. Un MGB es una pequeña molé-cula unida al extremo 3' de la sonday que encaja en el surco menor delADN bicatenario. Cuando la sondaTaqMan se hibrida, el MGB estabilizael apareamiento. La mayor estabili-dad hace que las sondas TaqManMGB sean más cortas que las son-das TaqMan estándar. El mejor rendi-miento espectral mejora la precisióny permite coherencia superiores en-tre los distintos ensayos, y la mayor

especificidad de la hibridación permi-te una discriminación más precisa delas dianas. Además, al ser la sondamás pequeña se facilita el diseño delos ensayos, pues las sondas se pue-den encajar en regiones diana máscortas.

Flujo de TrabajoDesde la llegada de la muestra al la-boratorio, hasta la lectura de los re-sultados, el proceso de detección seresume en 5 pasos con una dura-ción total máxima de 24 horas(Figura 2):

IX WORKSHOP MRAMA

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a) Día 1. Preparación de la mues-tra y pre-enriquecimiento en cal-do de peptona alcalina (APW) a37º durante 16-18 horas.

b) Día 2. Extracción de ADN me-diante el método de hervido y eli-minando los posibles inhibidoresque puedan interferir en el funcio-namiento óptimo de la PCR. En elcaso de cultivos puros, donde lapresencia de inhibidores es prác-

ticamente inexistente, se propo-ne el uso de PrepMan® Ultra(Applied Biosystems). En el casode extracciones de ADN a partirde caldos de cultivo, con alta pre-sencia de posibles inhibidores, sepropone un protocolo de extrac-ción que incluye un lavado conChelex 100 al 5% (BioRad).

c) Día 2. Preparación del test, queconsiste únicamente en añadir el

ADN al ensayo en formato liofili-zado.

d) Día 2. Correr el test en un equi-po de PCR a tiempo real.

e) Día 2. Visualizar los resultados.Siguiendo el flujo de trabajo propues-to y usando el kit de detección deVibrio parahaemolyticus, Vibrio cho-lerae y Vibrio vulnificus por PCR atiempo real (Applied Biosystems) esposible tener los resultados de pre-sencia o ausencia de estos microor-ganismos y de sus especímenes pa-tógenos en la muestra en menos de24 horas. El desarrollo y optimiza-ción de este kit se ha realizado conreactivos de Applied Biosystems, y elensayo final se ofrece en formato lio-filizado, aportando al kit mayor faci-lidad de uso, menor tiempo de ma-nipulación, reducción del riesgo decometer errores y del riesgo de con-taminación y mayor precisión y con-sistencia a los resultados obtenidos.La PCR a tiempo real también apor-ta rapidez al flujo de trabajo, permi-tiendo mayor flujo de muestras y en-sayos. Con las reacciones múltiplesse ahorra tiempo y reactivos (ya quees posible analizar más de una dia-na en un único experimento) siendoposible gracias al diseño con tecno-logía TaqMan MGB (AppliedBiosystems), que aporta estabilidad,eficacia y sensibilidad sobre todo enel caso de PCR múltiple.Debido a la sencillez de uso, estosensayos analíticos pueden efectuar-se por personal técnico no especia-lizado, lo que permite generalizar loscontroles analíticos de Vibrio. La ex-tensión de estas técnicas a laborato-rios oficiales y a empresas del sectorpesquero y acuícola redundará en uncontrol más efectivo de estos pató-genos y permitirá centrar el esfuer-zo analítico de los laboratorios en ladetección de las variantes patógenasde estos organismos y no en pobla-ciones totales no patógenas, permi-tiendo emitir resultados y tomar de-cisiones sobre productos retenidosen menos de 24 horas.

IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

• Sistemas rápidos (4-48 horas), se-guros y con resultados fiables.

• Sistemas herméticos de fácil mani-pulación, < 1 minuto por test.

• Gran número de sustratos bioquími-cos (15-30) para realizar una iden-tificación más precisa.

• No necesita de muchas pruebasprevias. Deben usarse con aisla-dos puros.

• No necesita revelado de los resul-tados.

• La mayor base de datos de iden-tificación de microorganismos, in-cluyendo gran cantidad de bacte-rias ambientales.

BD BBL ™ ENTEROTUBE II• Es un método para la identificación

que utiliza15 substratos bioquími-cos para la identificación presun-tiva de bacteriasentéricas. Más de80 especies con el BD EnterotubeII por medio de 3 Bases de Datos.

• Selección del sistema usar:Enterotube II para colonias oxida-sa negativas o Oxi/FermTube II pa-ra colonias oxidasa positivas.

BD BBL ™ CRYSTAL

• Sistema de identificación manual osemiautomático (Autoreader) parala identificación de Bacterias emple-ando 29 ó 30 sustratos fluorogéni-cos, cromogénicos y azucares.

• ID de 370 especies con 4 pane-les de BD Crystal (Entéricos/NoFermentadores (E/NF) y GramPositivos (GP), Gram PositivoRápidos (RGP),Neisseria/Haemophilus (N/H) yAnaerobios (ANR).

Becton Dickinson and Company

Sistemas BD paraidentificación

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IX WORKSHOP MRAMA

Las industrias alimentarías requierenanalizar un elevado número demuestras y obtener rápidos resulta-dos que permitan aplicar accionescorrectoras inmediatas en sus proce-sos de fabricación. Cada vez es ma-yor la demanda de métodos rápidosy automatizados que permitan garan-tizar la seguridad y calidad micro-biológica de los alimentos comercia-lizados, sin que supongan un riesgopara la salud. La citometría de flu-jo ha cobrado gran importancia a ni-vel mundial debido a la versatilidadde la técnica y a la amplia gama desectores para su aplicación:Biotecnología, Industria de las bebi-das y alimentos, cosmético y farma-céutico. En BD somos conscientesde esta necesidad y es por ello queahora lanzamos al mercado un nue-vo sistema rápido basado en la ci-tometría de flujo, el sistema BDMicro PRO™. El sistema BD MicroPRO™ es un equipo rápido, automa-tizado, sensible y de máximo rendi-

miento diseñado para la detección demicroorganismos mediante citome-tría de flujo, con aplicación enMicrobiología Industrial.

Características técnicas delsistema- Capacidad de 47 muestras por tan-

da y rendimiento de 20 muestras /hora, pudiendo destinar el tiempoíntegro de duración del análisis aotras tareas.

- Sistema totalmente automatizado.El sistema añade reactivos, mezclay limpieza automática dentro delsistema y eliminación de burbujas.

- Límite de detección: Rango deconcentración 101 a 106 UFC/mL

- Tamaño celular: El Sistema BDMicro PRO™ permite detectar par-tículas de hasta 0,1 µm, detectan-do el número específico mediantefluorescencia.

- El sistema BD Micro PRO™ per-mite un análisis en tiempo real,permitiendo la diferenciación de

células vivas y muertas, graciasa distintos protocolos de marcaje,con colorante permeables e imper-meables a membrana.

- Todos los reactivos son estables atemperatura durante 7 días.

- Software sencillo proporciona re-sultados objetivos de fácil interpre-tación en cumplimento con la nor-ma 21 CFR.

AplicacionesAnálisis cualitativo – Test deAusencia / PresenciaScreening de para contaminación mi-crobiana con resultados al día si-guiente para la mayoría de análisis

Análisis cuantitativo– Enumeración- Control microbiológico de agua pu-

rificada y de proceso en tan sólo 4minutos, no días.

- Control de calidad en stock de cul-tivos. Cuantifica de una forma pre-cisa los cultivos puros, reducien-do trabajo en el laboratorio.

Sistema de Detecciónmicrobiológica BD MicroPro™ Becton Dickinson and Company

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- Detección contaminación de su-perficies. Análisis de hisopos desuperficie para contaminación mi-crobiana y de productos residualessin necesidad de realizar cultivo,directamente de la torunda.Resultados en 5 minutos.

- Monitorización de fermentación mi-crobiológica.

Beneficios del sistema en laMicrobiología rápida y auto-matizadaResultados rápidos, precisos y re-producibles mediante una solu-ción rentable. El sistema BD MicroPRO ™ proporciona resultadoscuantitativos, rápidos, precisos y re-producibles en el formato cuen-tas/mL, con una óptima correlacióncon los obtenidos por métodos tra-dicionales. El sistema BD Micro ™PRO puede generar resultados enmenos de 5 minutos por muestra,donde con los métodos tradiciona-les pueden llegar a tardar hasta 21días.El sistema implica un ahorro de cos-tes, minimizando los medios y per-dida de productos y mejoras los pro-cesos mediante una monitorizaciónconstante. La mayor rapidez en elanálisis en comparación con los mé-todos tradicionales permite liberar in-ventario antes, disminuyendo mate-rial en stock y disminuyendo los cos-tes y riesgos asociados, así comodetectar antes posibles contamina-ciones, tanto en la materia prima, enel producto terminado, como enmuestras tomadas de cualquier par-te del proceso.Solución única. Detección de bac-terias, mohos y levaduras en UN úni-co test. Un test – Una solución.Permite el “screening” de bacterias,levaduras y mohos en un mismo en-sayo y a partir de una única muestra,con la mayoría de resultados obte-nidos en un día.

IX WORKSHOP MRAMA

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IX WORKSHOP MRAMA

Esta validación acredita el uso delsistema BacTrac 4300 como métodocualitativo alternativo de análisis deenterobacterias en productos lácteos.El estudio interlaboratorio se realizóen 2007 con la colaboración de 14 la-boratorios que analizaron las mues-tras mediante el sistema BacTrac. Se utilizaron muestras de leche pas-teurizada contaminadas aritificial-

mente con E. coli a tres niveles queoscilaban entre 0 células/10ml y 300células/10ml. Para la siembra se utilizó el medioselectivo de SyLab BiMedia 144A es-pecífico para Enterobacterias, conespecial sensiblidad para la detec-ción de E. sakazakiiLos resultados obtenidos con el sis-tema BacTrac 4300 respecto al mé-

todo de referencia fueron los siguien-tes:Exactitud: 98%Especificidad: 97%Sensibilidad 98%Estos datos permiten la conclu-sión que la variabilidad del métodoalternativo (BacTrac 4300) es equi-valente al método de referencia desiembra en placa.

Validación del sistema demicrobiología rápida

Bactrac 4300 según iso 16140:2003

El sistema de microbiología rápida BacTrac

4300 de la firma SyLab ha alcanzado la

validación AFNOR del método de impedancia

según la ISO16140 para la detección de

Enterobacterias.

Gomensoro

AFNOR

Achieving accurate and precise resultsis necessary for food labortories.Faster results through automation arekey to efficiency. After an intensive andhighly successful validation programperformed at BIOTECON Diagnosticslaboratories, the foodproof®

RoboPrep+ Series is now commerciallyavailable. This is the first validated au-tomated solution for DNA extractionand PCR-based microbial testing spe-cifically designed for the food industry. Six different versions of the foodproof®

RoboPrep+ robotic workstation areavailable with up to 96 samples beingprocessed at one time.A technician need only load the sam-ples, reagents and consumables priorto starting the run. This automated tech-nology frees laboratory personnel fromroutine work, allowing time to devoteto other necessary laboratory activities,and thus increasing a laboratory’sthroughput ability.The foodproof® RoboPrep+ Seriesuses the foodproof® MagneticPreparation Kit I for effective DNA ex-

traction as well as foodproof® real-ti-me PCR-based detection kits, such asthe foodproof® Salmonella DetectionKit. The foodproof® product line offersflexible proven solutions for the detec-tion of pathogens, spoilage organismsand GMOs for the food and beverageindustry as well as for pharmaceuticaland cosmetic manufacturers.Foodproof® products offer the freedomof using hybridization or hydrolysis pro-bes on most open-platform PCR instru-ments.To see the foodproof® RoboPrep+workstation in action, watch our videoon YouTube (search term BIOTECON)or visit our website at: www.bc-diagnos-tics.com.

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

Control del peso y proteínasUna parte de la población debe perderpeso para alcanzar un peso adecuadoy de este modo contribuir a la preven-ción de enfermedades crónicas comola diabetes o los problemas coronarios.Para perder peso y mantenerlo, lo quellamamos control del peso, se reco-miendan varias estrategias: rebalance-ar la dieta, disminuir el aporte calórico,practicar ejercicio físico regularmente yaumentar la regularidad de las comi-das.Las proteínas son bien conocidas porsu poder saciante, que es superior alde los carbohidratos y la grasa [1]. Sesabe que hay un efecto a corto plazoinducido por una ingesta rica en prote-ína: 50 gramos de proteína son capa-ces de reducir la cantidad de ingeridade alimento en humanos [2]. Hay tam-bién un efecto continuo en la saciedaddurante el día cuando la dieta es ge-neralmente rica en proteínas, es decir,con un contenido en proteína mayor al20% [3]. Este aumento de la sensaciónde saciedad es la clave del éxito de es-tos programas de pérdida de peso, yaque la ingesta diaria de calorías se vereducida.La proteína de trigo, presente en la gra-no del cereal en cantidad considerable(11% como valor medio), se componeen un 80% de gluten, que a su vez es-tá compuesto en un 55% de gluteni-nas y un 45% de gliadinas. Ambos ti-pos de molécula se diferencian tanto ensu peso molecular como en su estruc-tura terciaria y cuaternaria, lo que lesconfiere distintas propiedades. El glu-ten vital de trigo se obtiene industrial-mente por extracción física de la hari-na. La compañía SYRAL, líder en la pro-ducción de gluten de trigo, ha desarro-

llado una familia de proteínas hidroliza-das de trigo. Estas proteínas, de nom-bre comercial MERIPROTM, son solu-bles en determinados rangos de pH,actuando como emulsionantes, texturi-zantes, estabilizadores de espuma ofuente soluble y no funcional de prote-ína. Por otra parte, la proteína de trigotiene una alta digestibilidad (90,3% di-gestibilidad real ileal en humanos),comparable a otras fuentes de proteí-na vegetal.

Contexto regulatorioEl REGLAMENTO (CE) No 1924/2006DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DELCONSEJO de 20 de diciembre de 2006relativo a las declaraciones nutriciona-les y de propiedades saludables en losalimentos, establece las declaracionesnutricionales de “fuente de proteínas” y“alto contenido en proteínas”, que sonaplicables a alimentos en los que lasproteínas aportan como mínimo el 12% o el 20%del valorenergét icodel alimentorespectiva-mente.Respecto alas declara-ciones depropiedadessaludables

(art. 13), las siguientes alegaciones hansido presentadas y se espera que EF-SA publique su opinión en septiembre:“Mantenimiento muscular”,“Mantenimiento de la masa muscularen atletas”, “Mantenimiento de la masamuscular en personas mayores”,“Saciedad / Control del peso” y “Saludde los huesos”.Cabe destacar que el Reglamento (CE)Nº 983/2009 de la Comisión recoge laopinión positiva de EFSA referente alArtículo 14, apartado 1, letra b) delReglamento 1924 (declaración de pro-piedades saludables relativa al des-arrollo y la salud de los niños), y per-mite la siguiente alegación: “Las pro-teínas son necesarias para el creci-miento y el desarrollo normales de loshuesos en los niños”. Esta declaraciónsolo puede utilizarse en relación conalimentos que son, como mínimo, fuen-te de proteínas (12% del valor energé-tico del alimento proveniente de prote-

Virginia Millán virginia.millan@syral.com

Proteínas de trigo en eldesarrollo de productos ricos

en proteína Ejemplo aplicativo engalletas

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ínas) y que cumplen con el perfil nutri-cional de su categoría.

Desarrollo de galletas con altocontenido en proteínaCon las premisas anteriormente ex-puestas, las galletas se presentan co-mo un interesante producto susceptiblede ser enriquecido en proteínas paraaportar un efecto saciante.Las galletas son ampliamente consu-midas en España (alrededor de 8 Kghab/año), principalmente en el desayu-no. El periodo de tiempo que transcu-rre entre el desayuno y la comida es unbuen objetivo para aumentar la sacie-dad, entendida como la inhibición deldeseo y/o la necesidad de comer des-crita en la “Cascada de la Saciedad” deBlundell [4]. Un desayuno rico en pro-

teínas puede ayudar a eliminar el pi-coteo entre horas.En el presente desarrollo, realizado enel Centro de Aplicaciones de SYRAL si-tuado en Marckolsheim, Francia, sehan observado los requerimientos nu-tricionales de las galletas en cuanto alo límites de grasas saturadas(8g/100g), azúcares (25g/100g) y sal(500mg/100g), según los PerfilesNutricionales definidos en el borradorde 17 de marzo de 2009 de laComisión.MERIPROTM es una proteína de trigo desabor neutro y alto contenido en pro-teína (>78.5% en sustancia seca). Seobtiene por hidrólisis enzimática de glu-ten y es altamente soluble (>85%) entodo el rango de pH. Su composiciónen aminoácidos es rica en acido glutá-mico (42%) y prolina (15%) y deficita-ria en algunos AA esenciales como li-sina dado su origen de cereal.La combinación de varias fuentes deproteína puede aportar un mayor valornutricional para equilibrar la composi-ción de aminoácidos. Adicionalmente,se obtienen mejoras tecnológicas. Eneste desarrollo MERIPROTM ha sidocombinado con un aislado de proteínaláctea.Finalmente, dado que una dieta rica enproteína puede tener posibles repercu-siones negativas de sobre la flora intes-tinal [5], se ha incorporado a la recetauna fibra prebiótica (Fructo-oligosacá-ridos Actilight®).La galleta obtenida enriquecida en pro-teína ha sido comparada con una re-ferencia sin proteínas añadidas. Enambas se han analizado la reología dela masa, cohesividad, dureza y resis-tencia a la rotura de las galletas, así co-mo las pruebas organolépticas (colour,análisis sensorial).La fórmula de la galleta contiene un13% de MERIPROTM y un 4% de pro-teína láctea. Esto permite alcanzar unporcentaje del 22,5% de proteína enel producto final, permitiendo las decla-raciones nutricionales: “alto contenidoen proteína” y “rico en fibra”.Tanto la viscoelasticidad de la masa co-

mo el laminado no se ven afectadospor la adición de proteína. La dureza yla cohesividad no son significativamen-te diferentes. Sin embargo, los análi-sis efectuados con el texturómetro in-dican que las galletas ricas en proteínatienen mayor resistencia a la rotura quela referencia.Los análisis sensoriales (test deFriedman) no encuentran diferenciassignificativas en los parámetros anali-zados ni en la apreciación global.En conclusión, es posible elaborar ga-lletas con alto contenido en proteínacon la proteína de trigo MERIPROTM sinimpacto significativo en sus propieda-des físicas u organolépticas. Las ga-lletas cumplen con el Perfil Nutricionalde su categoría y permiten la declara-ción de “alto contenido en proteínas” y“rico en fibras”Otras posibles alegaciones de saludcomo “las proteínas tiene efecto sa-ciante” están pendientes de aprobaciónpor la Unión Europea. La combinación de bajas grasas satu-radas, alto contenido en proteína y al-to contenido en fibra dietética confor-man una galleta con una equilibradacomposición nutricional.

Bibliografía1.- Shai, I., et al., Weight loss with a low-carbohy-

drate, Mediterranean, or low-fat diet. The New

England Journal of Medicine, 2008. 359(3): p. 229-

41.

2.- Harvey Anderson, G. and S.E. Moore, Dietary

proteins in the regulation of food intake and body

weight in humans. J Nutr, 2004. 134: p. 974S-

979S.

3.- Veldhorst, M., et al., Protein-induced satiety:

effects and mechanisms of different proteins.

Physiology & behavior, 2008. 94(2): p. 300-307.

4.- Blundell JE., The control of appetite: basic con-

cepts and practical implications. Schweiz Med

Wochenschr. 1999 Feb 6;129(5):182-8. Review.

5.- Duncan, S.H., et al., Reduced Dietary Intake of

Carbohydrates by Obese Subjects Results in

Decreased Concentrations of Butyrate and

Butyrate-Producing Bacteria in Feces. Appl.

Environ. Microbiol., 2007. 73(4): p. 1073-1078.

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Los Sistemas MiniaturizadosInteligentes basados en Micro NanoTecnologías (MNT) son importanteavances tecnológicos que se están in-troduciendo rápidamente en todos lossectores industriales como tecnolo-gías horizontales habilitadoras denuevas soluciones y productos. LasMNT, como ya ocurrió con laMicroelectrónica en décadas anterio-res, aportan ventajas de bajo coste,pequeño tamaño, reproducibilidad,bajo consumo y altas prestacionesque son hoy en día vitales en las áre-as de la Electrónica,Telecomunicaciones, Transporte,Energía, Medio Ambiente y más re-cientemente en el de la Salud. A ni-vel mundial se observa que el sectorde las Micro Nano Tecnologías estácreciendo de forma mucho más ace-lerada que otros sectores más tradi-cionales. La consecución de una ‘in-teligencia distribuida’ basada en unared sistemas de medida multifuncio-nales, autónomos y miniaturizados esel objetivo último de las MNT desde elpunto de vista aplicativo.Por otro lado, el sector alimentario, degran valor estratégico para España ytambién a nivel europeo, precisa decontinua innovación debido a los cam-bios en los hábitos de los consumi-dores y a la necesidad de crear nue-vos y mejores productos alimentariosde forma segura y eficiente. Sin em-bargo, se trata en general de un sec-tor muy tradicional en cuanto a susprocesos de fabricación y especial-mente a nivel nacional requiere de unimportante apoyo para no perdercompetitividad respecto a otros paí-ses emergentes con menores costesde producción. La mejora de la cali-dad y de la seguridad es vital paramantener cuotas de mercado, y la op-timización de los procesos es necesa-ria para aumentar la competitividad delos productos españoles. Se pretende por tanto, implementaruna nueva generación de solucionesanalíticas y de sensado en las cua-les se incorporen aportaciones impor-

tantes gracias a que los materiales ylos dispositivos sean de dimensionesmicro o nanométricas, o se fabriquen,mediante micro y nanotecnologías.Esta aproximación “Nano around fo-od” en la que los micro y nano ele-mentos están incorporados a los sis-temas sensores pero no forman par-te de los propios alimentos, proporcio-na todas las ventajas deseadas, sinadolecer de las problemáticas emer-gentes de la aproximación “Nano inFood” en cuanto a determinados in-terrogantes sobre su toxicidad y otraspreocupaciones sociales. Con ella sepersigue:- Un mejor control y caracterización

de la materias primas, ingredientesy productos finales.

- Un incremento de productividad yun mejor control de la calidad y se-guridad durante el procesado.

- Un mejor seguimiento de la evolu-ción y trazabilidad de la calidad deproducto a lo largo de la cadena ali-mentaria.

- La optimización de recursos y ma-terias primas debido a un mejorcontrol de procesos.

El reto consiste en ser capaces deproporcionar la tecnología y las meto-dologías necesarias para ofrecer sis-temas de detección eficaces y conventajas de aplicación o de valor aña-dido con respecto a los sistemas ac-tuales. La temática alimentaria se ci-ta frecuentemente entre los objetivosprioritarios de investigación del prin-cipal programa de investigación euro-peo en micro y nanotecnologías (elTema ICT del Programa Marco), pero

rara vez resulta exitosa. El paso quese dio con el primer proyecto integra-do europeo en esa temática (el pro-yecto GoodFood (2004-2007), coordi-nado por el CNM-CSIC, y con abun-dante presencia española) no ha teni-do continuidad a pesar de que el mis-mo equipo investigador ha presenta-do varias propuestas desde entonces.La realidad es que las aplicacionesalimentarias se han visto tradicional-mente ensombrecidas en este terre-no por el gran peso de las aplicacio-nes biomédicas, y de las medioam-bientales en la actualidad. Aun así,puede haber nuevas oportunidadespues el tema se mantiene en el pro-grama de trabajo de las próximasconvocatorias (2011-2012). En cualquier caso, el potencial de unproyecto europeo para dinamizar latemática desde una perspectiva na-cional es limitado, pues por su propianaturaleza europea, el número de so-cios españoles es igualmente limita-do. Por otro lado, los proyectos están-dar del Plan Nacional son de unacuantía económica y una duracióntemporal demasiado modestas paracumplir esa función. Por ese motivo,una serie de instituciones de investi-gación ha hecho la apuesta ambicio-sa de solicitar el proyectoSENS4FOOD dentro del programaCONSOLIDER para crear por prime-ra vez un núcleo español de inves-tigación multidisciplinar formadopor grupos de los campos de lasTecnologías Micro-Nano-Bio, lasTecnologías de la Información yComunicación y las Tecnologías de

Luis Fonseca, Carles Cané IMB-CNM (CSIC)Luis.fonseca@imb-cnm.csic.es,carles.cane@imb-cnm.csic.es

Sensado con Micro NanoSistemas en Aplicaciones

Agroalimentarias: Perspectivasnacionales y europeas

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los Alimentos, para afrontar los retoscientíficos del desarrollo y demostra-ción de nuevos sistemas de deteccióny sensado para aplicaciones agroali-mentarias, en reconocimiento de lasingular relevancia económica enEspaña de este sector productivo.SENS4FOOD, actualmente en la se-gunda fase de evaluación, pretendepromover acciones estratégicas capa-ces de marcar un punto de inflexióny propiciar un salto de calidad en la in-vestigación conjunta de las MNT y lastecnologías alimentarias, así como lageneración de estructuras establesde colaboración multidisciplinar. Los objetivos de SENS4FOOD se re-sumen en:- Promover investigación de excelen-

cia, más allá del estado del arte, enel campo MNT y de tecnologías dealimentos mediante la creación deun grupo estable de alto nivel quesirva de semilla de futuras accionesintegradas a Nivel Nacional para to-do el sector.

- Demostrar la viabilidad y las venta-jas de las soluciones basadas enMNT para el campo alimentario, co-mo contrapartida a las técnicas tra-dicionales habitualmente utilizadasen el sector, a través de la investi-gación en escenarios de mejora deseguridad y calidad alimentaria enun conjunto de productos (vino, car-ne y pescado) que son vitales enla dieta mediterránea (y por tantopara la salud del consumidor), yademás son estratégicos para elsector alimentario nacional.

- Atraer a nuevos grupos de investi-gación en el campo de las MNT yalimentario a esta nueva línea deinvestigación multidisciplinar.

- Promover y fortalecer la interacciónentre ciencia básica y aplicada, asícomo las relaciones con la industriaespañola del sector, generando co-nocimiento innovador a nivel denuevos (nano)materiales, nuevosdispositivos, sistemas y métodos dedetección asegurando la adecuadatransferencia de conocimiento y de

tecnología al sector académico e in-dustrial.

- Formar a jóvenes investigadores enun amplio abanico de metodologíasy técnicas tanto del campo de lasMicro y Nano Tecnologías como delalimentario, para el futuro benefi-cio de la industria alimentaria nacio-nal que los vaya a incorporar.

La actividad de SENS4FOOD está or-ganizada en torno a tres líneas princi-pales de investigación (LIs). Muy bre-vemente: se avanzará con ayuda delas MNT en la optimización de nanomateriales y microdispositivos ca-paces de sensar en los dominios físi-co, químico, bioquímico y biológico(LI-1), para desarrollar sistemas mi-niaturizados inteligentes (LI-2) queayuden a definir nuevas metodologí-as que puedan solventar necesidadesreales de detección en el campo ali-mentario (LI-3).Como muestra del interés del temaentre la comunidad micro-nanotecno-lógica nacional esta propuesta reúnepor primera vez a los principales ac-tores de la I+D españoles con capaci-dad de fabricación de micro y nano-sistemas, habiendo todos ellos dedi-cado parte de sus esfuerzos al cam-po de la alimentación en alguna oca-sión. Dichos grupos están comple-mentados por socios investigadoresen el campo de la tecnología de losalimentos que a su vez han mostra-do inquietudes previas en el potencialde las micro y nanotecnologías

(MNT). Así mismo, entre varios delos miembros del consorcio existe unhistorial previo de colaboración cien-tífica, tanto en proyectos naciona-les como europeos, que aseguranuna armonía de intereses desde elprimer momento y una coordinacióneficaz (Ver figura 1). Más allá deldestino final de SENS4FOOD cual-quier interesado en la aplicación deeste tipo de nuevas tecnologías enel campo alimentario puede ponerseen contacto con los firmantes parafuturas colaboraciones en este ám-bito.En resumen, el desarrollo de micro-nanosistemas para el campo alimen-tario es un tema ideal para promoverinvestigación de excelencia en tec-nologías disruptivas que den lugaren el futuro a productos explotablescon unos inherentes beneficios eco-nómicos y sociales a nivel nacionaly europeo. Este objetivo está ade-más en plena concordancia con laEstrategia Europa 2020 para uncrecimiento inteligente, sosteni-ble e inclusivo: la aproximaciónpropuesta contribuirá ciertamente adesarrollar una economía basada enel conocimiento, a la optimización derecursos y a actividades ‘más ver-des’, y también a la cohesión socialy territorial al proporcionar nuevastecnologías a un sector productivode máxima relevancia en países delarco mediterráneo, así como en lasáreas rurales de cualquier país.

Figura 1.- Relaciones previas entre los integrantes del consorcio SENS4FOOD.

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

Carbohydrates represent a largepart in our diet and are present in ne-arly all foods we consume. In view ofthis it is surprising that they still re-ceive comparably little attention withrespect to their nutritional benefits.Apart from the distinction betweennutritive carbohydrates (e.g. starch,maltodextrins and sugars) and non-nutritive carbohydrates like polyols(sugar replacers) or dietary fibers,carbohydrates are largely classifiedaccording to their degree of polyme-risation in mono- and disaccharides(sugars), oligosaccharides, andpolysaccharides. This, however, do-es not say much about their physio-logical properties, which may be verydifferent even within each group. Moreover, the diversity of food car-bohydrates has increased over thelast years and there are a numberof carbohydrates available todaywhich provide functional benefits be-yond their nutritional value.Therefore, it is worth to take a moredifferentiated look at carbohydratesand to look out for those with physio-logical benefits and a potential roleto promote a healthy diet. In view ofthis, Palatinose™ is introduced asan example for a novel carbohydra-te with unique functionality.

What is Palatinose™?Palatinose™ is a toothfriendly andslowly released carbohydrate whichsupplies the body the full carbohy-drate energy in a slower, more ba-lanced way and for longer time thanconventional carbohydrates. Isomaltulose, as Palatinose™ is ca-lled by its generic name, occurs na-turally in honey and sugar can jui-ce. It is a disaccharide, which – likesucrose – is composed of glucoseand fructose. It is obtained from su-crose by enzymatic rearrangementof the α-1,2 linkage in sucrose intoan α-1,6 linkage in Palatinose™.The different linkage givesPalatinose™ a unique set of physio-logical properties which largely dif-

fers from those of sucrose and othercommon sugars: 1. Palatinose™ is kind to teeth:

Palatinose™ is more resistant tothe use by the oral flora as subs-trate for bacterial fermentation.As result of this, no significantamounts of acids are producedand therefore demineralisation ofteeth, as known from nutritivecarbohydrates, does not occurwith Palatinose™. While up toknow the only toothfriendly alter-natives to sugars have been pol-yols, Palatinose™ is the first fullydigestible sugar with toothfriendlyproperties and allows an exten-sion of the toothfriendly conceptto new product categories like, forinstance, beverages.

2. Palatinose™ is a slow releasecarbohydrate: In the small intes-tine, Palatinose™ is digested be-fore it can be absorbed by thebody. Its hydrolysis takes placeby a traditional enzyme called

isomaltase, which is also involvedin the digestion of starch. The ra-te of hydrolysis is thereby muchslower in comparison to commonreadily available sugars like su-crose (factor of about 4 to 5) ormaltose (factor of about 10 to 12).Palatinose™ is nevertheless fullydigested and absorbed by theend of the small intestine, whichmeans that Palatinose™ providesthe full carbohydrate energy (4kcal/g), while it enables a slowglucose release into the body withall the benefits associated withthis.

3. Palatinose™ is a low glycemiccarbohydrate: The slow yet com-plete intestinal release ofPalatinose™ is reflected in itsblood glucose response, wherePalatinose™ shows a lower, mo-re balanced blood glucose riseover longer time. Its low effect onblood glucose and insulin levelsis expressed in the Glycemic and

Antje Jungclaus PhD Manager Nutrition Communication, BENEO GroupGottlieb-Daimler-Str. 12, 68165Mannheim, Germany, www.beneo.com, info@beneo.com

Innovations in carbohydrates –being “functional” with

Palatinose™

Figure 1.- origin and structure of Palatinose(TM).

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Insulimic Indices: Palatinose™has a GI of 32 and an II of 30.While most sugars and sweete-ning carbohydrates have a me-dium to high GI, Palatinose™ isone of the very few carbohydra-tes with a low GI. A carbohydrate-based low-glyce-mic diet is discussed to be bene-ficial with respect to a healthy dietand the prevention and manage-ment of overweight, diabetes andcoronary heart disease. The long-term maintenance of normal blo-od glucose concentrations is se-en as a beneficial physiologicaleffect in this respect.Palatinose™ can beneficially in-fluence carbohydrate metabolismmarkers as result of its low glyce-mic properties: A 4-week inter-vention study in people with im-paired fat metabolism (hyperlipi-demia) found a significant reduc-tion of fasting blood glucose andinsulin resistance after 4 weeks ofdaily Palatinose™ intake (50 g/d)as part of a controlled diet, whileno significant differences wereseen with sucrose. 4. Palatinose™ is the carbohy-drate for balanced and prolon-ged energy supply: The exam-

ple of Palatinose™ shows thatnot only the calorie intake mattersbut also the way the energy is de-livered to the body. Glucose me-ans energy; and the way of gluco-se supply reflects the supply ofenergy to the body. Palatinose™provides the same amount of car-bohydrate energy but in a morebalanced way and over longer ti-me - a unique property ofPalatinose™ as result of its slowintestinal release. This offers awhole bunch of physiological ad-vantages as e.g. continuousenergy availability with less seve-re insulin reactions and a higherlevel of fat oxidation, as well asan optimum energy supply for

physical activity with the potentialto enhance endurance-typephysical performance and sustai-ned mental performance.

Palatinose™ is different from sugarswith respect to its physiological pro-perties and thus needs thinking be-yond the classical boundaries of car-bohydrates. On the other hand,Palatinose™ fits very well into futu-re trends in functional sweeteningcarbohydrates: In an omnibus survey(published in the Mintel Sugar andSweetener Report in November2007) on the question, which of thesugars and sweeteners was most in-teresting, most respondents were in-terested in sugar alternatives withadditional health benefits like prolon-ged energy or in a type of real sugaralternative with a low GI. Palatinose™ is used as functionalcarbohydrate in a wide range of fo-od products. It has a natural sugar-li-ke taste with a mild sweetness (about50% that of sucrose). Its low hygros-copicity and good flowability make itinteresting for powder applications(e.g. instant drink applications). Itshigh stability under acidic conditionsis important in liquid applications andbrings a further advantage for appli-cations in sports drinks and isotonicdrinks. Other product applications in-clude functional beverages, sportsnutrition, dairy products, meal repla-cements, chocolate and bars, cere-als, confectionery, baked goods andmany more.

Figure 2.- Characterisation of the blood glucose response of Palatinose(TM) in compari-

son to sucrose.

A carbohydrate-based low-glycemicdiet is discussed

to be beneficialwith respect to a healthy diet

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Predictions by the World HealthOrganisation say that by 2015, over2.3 billion of the adult population willbe overweight and more than 700million will be obese. In contrast tothis over-all trend, there is a growingproportion of the population who arebecoming more health consciousand concerned about their weight, soare demanding alternative food pro-ducts that will help them lead a he-althier lifestyle. A number of initiati-ves have been set up to combat theobesity rise and as a result, the ne-ed is for manufacturers to improvethe physiological quality of consumerfood products with particular focuson the salt, sugars and fat contents. With respect to sugar reduction, the-re are many ways to reformulate fo-od. Most of them can be attributed tothe following three types of approa-ches: (1) The “food chemist’s approach”

with focus on carbohydratechain length: e.g. replacing su-gars (mono- and disaccharides)by higher molecular weight car-bohydrates like e.g. maltodex-trin.

(2) The “technologist’s approach”with focus on portion size andsugar percentage: e.g. addingwater or air to a product on orderto reduce the energy density; re-ducing the amount of sugar wi-thout replacement, or simply re-ducing the portion size.

(3) The “nutritionist’s approach” withfocus on the nutritional andphysiological properties of a pro-duct: e.g. replacing sugars by in-gredients which bring additionalnutritional value to the product(e.g. polyols, dietary fibers).

The demand for products reduced insugar have become even more po-pular and as such, familiar consumerproducts are now appearing on shel-ves with new, “improved” recipes butnot all have necessarily led to impro-ved quality products. The physiologi-cal advantages of ‘reduced sugar’

products come into question wherefat content is increased or if longermolecular-weight carbohydrates areused. BENEO has its heart and ex-pertise based on the third approachand can achieve sugar reduction aswell as provide further health bene-fits with its ingredients, as describedin the following.

Traditional sugar replace-ment with polyols and/or in-tense sweetenersPolyols are commonly used to fullyreplace sugar 1:1 in foods and con-fectionery like candies, chewing

gum, chocolate, baked foods, mar-malade and others that are energyreduced or with no added sugars.The bulk sweeteners (polyols) arethereby often combined with inten-se sweetness to adjust for their lo-wer sweetness level. Isomalt is the only sugar replacer de-rived from pure beet sugar yet withonly half the calories. When isomaltis used in food products, consumerscan be sure that they are consumingfewer calories. Isomalt also allowspromoting dental health and has avery low effect on blood glucose andinsulin levels.

Antje Jungclaus PhD Manager Nutrition Communication, BENEOGroup Gottlieb-Daimler-Str. 12, 68165Mannheim, Germany, www.beneo.com, info@beneo.com

Sugar reduction in anintelligent way – how to

improve the physiologicalquality of a product

Predictions by the World HealthOrganisation say that by 2015, over

2.3 billion of the adult population willbe overweight and more than 700

million will be obese

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Critical voices may ask: Half the ca-lories and mainly used in confectio-nery – does this have any physiolo-gical benefits? The answer is “yes”:Goran and colleagues demonstratedin 19991 that even small imbalancedin energy intake and output make adifference. According to their calcu-lation, only 30 kcal per day excessenergy intake can lead to childhoodobesity. This is equivalent to 5 minplaying instead of watching TV. Or itis equivalent to eating five sugar-freeisomalt candies instead of five regu-lar candies of 3g each. Every caloriecounts!

Sugar and fat reduction withfunctional fibersBoth oligofructose and inulin are die-tary fibers derived from chicory.Oligofructose can be used to par-tially replace sugar in a wide rangeof food products because of its su-gar-like physical properties with si-milar structure and a similar visco-sity, a high solubility and a sugar-li-ke sensorial profile. Inulin can function as fat replace-ment by partially or completely repla-cing fat in a range of food product wi-thout sensorial and textural compro-mises. This is because inulin andwater form a particle gel with creamyconsistency and a fat-like mouthfeeland structure, which is neutral in tas-te and colour. These fibers can reduce the sugar orfat content in a product, respectively,and bring additional nutritional valueto the product at the same time. Withmaximum 2 kcal/g, they have fewercalories, and they provide fibre en-richment. Their fiber-like propertiesare beneficial for stool regulation,gut transit time and short chain fattyacid production. Being prebiotic theystimulate gut health and have shownto enhance mineral absorption and

bone mineral density as well as to af-fect energy intake.

Thinking outside the box”:Modifying the sugar qualitywith the novel sugarPalatinose™As well as ingredients enabling highquality sugar reduced recipes, newfunctional carbohydrates such asPalatinose™ (isomaltulose) givenew possibilities for healthy nutrition,and given that it is a disaccharidecarbohydrate, it poses the questionof whether the focus should be onsugar reduction or carbohydrate mo-dification. From a physiological point

of view, Palatinose™ is not a sugarat all. Differing from sucrose solelyin the linkage between the glucoseand the fructose moieties, this newlinkage turns Palatinose™ into a car-bohydrate with a unique combinationof physiological properties: It allowsa slow yet full release of glucose tothe body (slow calories). Being low-glycaemic as well, it provides balan-ced and sustained energy to thebody and contributes to modernenergy management characterisedby a more steady carbohydrateenergy supply and a higher contribu-tion of fat oxidation. Apart from that,Palatinose™ is kind to teeth.

1 Goran et al 1999 Am J Clin Nutr cited in Faith MS 2003 Balancing energy intake and output in children. CCC Proceedings.

Critical voices may ask: Half the caloriesand mainly used in confectionery– does this have any physiological

benefits? The answer is “yes”

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IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

ObjetivosLa protección del consumidor así co-mo el diseño y producción industrialde alimentos funcionales se debe ba-sar en la mejor investigación y des-arrollo racional de la mejor evidenciacientífica. En este contexto, el objeti-vo de este trabajo es evaluar la efica-cia de una nueva vía multidisciplinarpara el establecimiento de propieda-des nutricionales de un alimento pre-sente en el mercado, englobando elmáximo de indicadores disponibles enmodelos experimentales relevantes.Se aplicó esta vía al estudio de losefectos de este alimento sobre uno delos mecanismos fisiopatológicos bá-sicos, el estrés oxidativo y su implica-ción en enfermedad cardiometabólica.

MetodologíaPara el objetivo propuesto, se plan-teó el estudio del efecto del alimento,una bebida de soja, desde una pers-

pectiva tecnológica, nutricional, fisio-lógica y médica orientada al serviciode la I+D+i. Así, tras el análisis biblio-gráfico, se plantearon de forma suce-siva tres modelos experimentales decomplejidad creciente: i) el de cultivocelular en diversas variantes para elesclarecimiento de posibles vías deseñalización implicadas en los efectosbiológicos del alimento o sus nutrien-

tes; Ii) un modelo experimental de en-fermedad cardiometabólica y iii) un es-tudio de intervención aleatorizado envoluntarios sanos.En los tres modelos se utilizó una delas herramientas de implantación másreciente que permiten la consecucióndel objetivo, la biología de sistemas otambién conocida como disciplinas "-ómicas". Asimismo, como validaciónde los resultados obtenidos se estu-diaron parámetros fisiológicos relacio-nados mediante herramientas comoinmunohistoquímica, inmunodeteccióny respirometría de alta resolución.

ResultadosLa metodología propuesta permite darrespuesta a ¿con qué se está alimen-tando? mediante el análisis bromato-lógico de trazabilidad y comparacióncon mercado; a ¿estamos alimentan-do?, estudiando marcadores de bio-disponiblidad y/o adherencia; ¿es es-ta alimentación útil para el propósitoinicial?, analizando el efecto sobremarcadores de función biológica; ¿có-mo puede funcionar este alimento?,generando hipótesis sobre cambiosen el metaboloma y en la expresióndel genoma y finalmente, ¿puede fun-cionar en todas las personas de igualmanera?, mediante el análisis de lainteracción entre el nutrigenoma y loscambios fisiológicos. El sistema pro-puesto es suficientemente flexible yadaptable a las circunstancias en con-creto, pudiendose establecer módulosde análisis de alimentos, de modelos

Manuel Portero-Oti n, Alberto Espinel1, José Serrano,

Mariona Jové, Jordi Boada, HugoGonzalo, Anna Cassañé, Marco

Antonio Delgado1 y Reinald Pamplona

Nutren-Nutrigenomics, UdL-IRBLLEIDA-PCITAL, Lleida y 1I+D+i Grupo LechePascual, Aranda de Duero

Metabolomica y Lipidomicaredox aplicadas al estudio de

ingredientes y alimentosfuncionales

Figura 1.- Perfil metabolómico completo del plasma de modelos experimentales de

enfermedad cardiometabólica. Tras la obtención del plasma, 5 microlitros fueron someti-

dos al análisis mediante la plataforma basada en LC/Q-TOF y posteriormente fue anali-

zada mediante el software Genespringr. Se muestran en columnas los perfiles de10

muestras y cada segmento de colores corresponde a un ion compatible con un metabo-

lito, generándose en este caso un total de 1883 características moleculares diferentes.

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IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

preclínicos, de estudios de interven-ción y en todos ellos restringiendoseal análisis ómico o siendo ampliablesa comprobación de los mecanismosimplicados. En el caso concreto de la bebida desoja, la utilización simultánea de lipi-dómica y metabolómica redox en lasmuestras generadas, permite perfilarcual puede ser el mecanismo que per-mite esta mejora en el estado metabó-lico, más allá de indicar si aumenta odisminuyen indicadores relativamenteinespecíficos de estrés oxidativo, queno siempre definen mecanismos niconstituyen evidencia científica inter-nacionalmente reconocida. Así, como se muestra en la Figura 1,el perfil metabolómico del plasma delmodelo experimental murino de enfer-medad cardiometabólic,a obtenido

mediante la utilización de estas he-rramientas, evidencia una alta comple-jidad de moléculas circulantes. Entreéstas, tras el análisis bioinformáticopertinente (Figura 2), se separanaquellas que son sensibles a la inges-ta de la bebida de soja. Esta aproxi-mación permite no sólo establecer bio-marcadores de ingesta, sino tambiénindicar cuáles pueden ser las vías me-tabólicas que están afectadas, produ-ciendo nuevas evidencias científicas oincluso contribuyendo al estableci-miento de nuevas propiedades funcio-nales. En este ejemplo en concreto,algunos de los marcadores apuntan auna actuación de la bebida de soja so-bre la función de las mitocondrias, elsistema de producción energético ce-lular, en músculo esquelético, sugi-riendo que, en el modelo experimen-

tal, se puede mejorar el metabolismogracias a una adaptación mitocondrial,que se ha comprobado mediante he-rramientas como el western-blot o larespirometría de alta resolución. La utilización simultánea de cultivo ce-lular llevó a esclarecer que las isofla-vonas presentes en la bebida condu-cen a una mejora de la respuesta a in-sulina del músculo esquelético y deladipocito parcialmente gracias al mis-mo mecanismo. Con estas evidencias sobre mecanis-mo funcional, se ha procedido al es-tudio del efecto de la bebida de sojaen un grupo de voluntarios sanos du-rante 2 meses. El estudio de las varia-bles relacionadas con el enfermeda-des metabólicas, guiado por los da-tos obtenidos in vitro e in vivo con mo-delos experimentales, ha llevado a laconfirmación de que la bebida de so-ja mejora, de forma dependiente conla cantidad ingerida, marcadores re-lacionados con el metabolismo de car-bohidratos y lípidos, siendo beneficio-so en aquellos casos donde exista unapredisposición, sea genética o debi-da al estilo de vida, a una alteraciónen el metabolismo energético.

ConclusionesLa incorporación e integración guiadade técnicas ómicas, con experimen-tación animal y en humanos, permiteapoyar el desarrollo de alimentos e in-gredientes funcionales basado en laevidencia, mejorando el conocimien-to del proceso nutricional y aportandovalor añadido al alimento, a través denuevas propiedades y/o confirmaciónde las conocidas.Apoyado por el Grupo Leche Pascual,a través del programa CENIT delMinisterio de Industria (CDTI) y por unconsorcio de compañias liderada porLa Morella Nuts con la participación deKRAFT, BTSA (BiotecnologíasAplicadas), Selecció Batallé, IndustrialTécnica Pecuaria, Neuron BioPharma,Shirota Functional Foods e Innaves.Agradecemos el soporte del programaTecnio, Generalitat de Catalunya.

Figura 2.- Perfil metabolómico diferencial del plasma de modelos experimentales de

enfermedad cardiometabólica. Tras la obtención del plasma, 5 microlitros fueron someti-

dos al análisis mediante la plataforma basada en LC/Q-TOF y posteriormente fue anali-

zada mediante el software Genespringr. Se muestran en columnas los perfiles de10

muestras y cada segmento de colores corresponde a un ion compatible con un metabo-

lito, indicando en este caso las masas diferenciales en respuesta a la bebida de soja

(n=157).

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Nowadays, and even more in the futu-re, the world of food processing chan-ges by factors that were not foreseen30 years ago.At present, sustainability is a target inall (food) processing companies.However, although the term “sustaina-ble development” has celebrated its20th anniversary in 2007, most proces-sing equipment that is presently usedin many of the production plants wasdeveloped a long time ago. Clearexamples of these are dewatering pro-cesses, such as evaporation and spraydrying. These processes are responsi-ble for a major part of the total energyconsumption of the food industry butstill look like 30 years ago.To meet the today and future require-ments on sustainable food production,it is necessary to come up with newequipment designs that reduce the car-bon foot print by more than 50%. Thisis a challenging task. Not only to designa process with diminished energy con-

sumption but also to keep the productquality according to competitive specs.In other words, what is the impact ofnew process technology on different in-terfaces such as consumer perception,logistics, process safety, etc.In the presentation, a number of “lowhanging fruit” technologies and me-thods will be given that can help the in-dustry to reduce their energy consump-tion and meet the present and near fu-ture criteria in sustainable food proces-sing. Examples are optimization of cle-aning procedures and the prevention offouling by optimizing equipment set-tings. A view towards sustainable pro-cessing methods for the long term futu-re will also be given. Examples of the-se methods are self cleaning equip-ment; high solids processing and ad-vanced process control. Finally, anoverview will be given of recent projectsNIZO has initiated to develop technolo-gies enabling to shape our view for fu-ture sustainable food processing.

Friso van Assema and Peter de Jong NIZO food research Kernhemseweg 2 6718 ZB EDEThe NetherlandsFriso.vanassema@nizo.nl

Sustainable Food processing,present and future

opportunities