1990 thomas the splicesomal snrnas of c. elegans

8/6/2019 1990 Thomas the Splicesomal SnRNAs of C. Elegans

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 9 2 6 3 3

T h e s p l i c e o s o m a l snRNAs o f C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s

J e f f r e y T h o m a s , K r i s t i L e a , E r i n Z u c k e r - A p r i s o n a n d Thomas B l u m e n t h a l *

D e p a r t m e n t o f B i o l o g y a n d P r o g r a m i n M o l e c u l a r , C e l l u l a r a n d D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y , I n d i a n aU n i v e r s i t y , B l o o m i n g t o n , I N 4 7 4 0 5 , USA

R e c e i v e d F e b r u a r y 1 , 1 9 9 0 ; R e v i s e d a n d A c c e p t e d A p r i l 2 , 1 9 9 0 EMBL a c c e s s i o n n o s X 5 1 3 7 1 - X 5 1 3 8 8 ( i n c l . )

A B S T R A C T

N e m a t o d e s a r e t h e o n l y g r o u p o f o r g a n i s m s i n w h i c hb o t h c i s - a n d t r a n s - s p l i c i n g o f n u c l e a r m R N A s a r e

known t o o c c u r . M o s t C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s i n t r o n s

a r e e x c e p t i o n a l l y s h o r t , o f t e n o n l y 5 0 b a s e s l o n g . Thec o n s e n s u s d o n o r a n d a c c e p t o r s p l i c e s i t e s e q u e n c e sf o u n d i n o t h e r a n i m a l s a r e u s e d f o r b o t h c i s - a n d t r a n s -s p l i c i n g . I n o r d e r t o i d e n t i f y t h e m a c h i n e r y r e q u i r e d f o rt h e s e s p l i c i n g e v e n t s , w e h a v e c h a r a c t e r i z e d t h e C .

e l e g a n s s n R N A s . T h e y a r e s i m i l a r i n s e q u e n c e a n ds t r u c t u r e t o t h o s e c h a r a c t e r i z e d i n o t h e r o r g a n i s m s ,

a n d s e v e r a l s e q u e n c e v a r i a t i o n s d i s c o v e r e d i n t h en e m a t o d e s n R N A s p r o v i d e s u p p o r t f o r p r e v i o u s l y

p r o p o s e d s t r u c t u r e m o d e l s . T h e C . e l e g a n s s n R N A s a r e

e n c o d e d b y g e n e f a m i l i e s . We r e p o r t h e r e t h e

s e q u e n c e s o f m a n y o f t h e s e g e n e s . We f i n d a h i g h l y

c o n s e r v e d s e q u e n c e , t h e p r o x i m a l s e q u e n c e e l e m e n t( P S E ) , a b o u t 6 5 b p u p s t r e a m o f a l l 2 1 s n R N A g e n e st h u s f a r s e q u e n c e d , i n c l u d i n g t h e SL R N A g e n e s , w h i c hs p e c i f y t h e snRNAs t h a t p r o v i d e t h e 5 ' e x o n s i n t r a n s -s p l i c i n g . T h e s e q u e n c e o f t h e C . e l e g a n s PSE i s d i s t i n c tf r o m P S E ' s f r o m o t h e r o r g a n i s m s .

INTRODUCTION

T h e s p l i c i n g o f n u c l e a r m R N A s i s c a t a l y z e d b y s m a l l , n u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n s ( s n R N P s ) a n d a s s o c i a t e d p r o t e i n s - 3 . F o u r

s n R N P s h a v e b e e n s h o w n t o b e i n v o l v e d i n s p l i c i n g ; U l , U 2 ,

U 5 , a n d t h e c o m p l e x o f U4 a n d U 6 . T h e snRNAs U 1 , U 2 , U 4 ,

a n d U 5 , a l l p o s s e s s a s e q u e n c e o f t h e m o t i f 5 ' - p u r i n e - A -U 4 - 6 - G - p u r i n e - 3 ' , t o w h i c h a g r o u p o f p r o t e i n s k n o w n

c o l l e c t i v e l y a s ' S m ' , b i n d s 4 ' 5 . T h e s e R N A s a r e a l s o c a p p e d w i t h2 , 2 , 7 - t r i m e t h y l g u a n o s i n e ( T M G ) a t t h e i r 5 ' e n d s .

T h e R N A c o m p o n e n t o f U l ( t h e U l s n R N A ) h a s b e e n s h o w n

t o i n t e r a c t w i t h t h e 5 ' s p l i c e - s i t e b y W a t s o n - C r i c k b a s e p a i r i n g 6 .T h e U2 sn R N A i n t e r a c t s s i m i l a r l y w i t h t h e b r a n c h s i t e i nS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 7 . U5 snRNP a p p e a r s t o a c t a t t h e 3 's p l i c e a c c e p t o r 3 . U 4 / U 6 h a s b e e n s h o w n t o b e i n v o l v e d i n t h ea s s e m b l y o f t h e a c t i v e s p l i c i n g c o m p l e x 3 ' 8 . S e v e r a l i n v e s t i g a t o r sh a v e o b s e r v e d c o m p l e x e s c o n t a i n i n g b o t h U 4 / U 6 a n d U 5 9 ' 1 O .H o w e v e r , a t p r e s e n t , t h e r e i s n o i n d i c a t i o n o f a s p e c i f i c r o l e f o rU 4 / U 6 .

T h e U snRNAs a r e u b i q u i t o u s l y a n d a b u n d a n t l y e x p r e s s e d " .M o s t o r g a n i s m s s t u d i e d h a v e m u l t i p l e c o p i e s o f s n R N A g e n e s .

H o w e v e r , t h e n u m b e r o f g e n e s v a r i e s w i d e l y . T h e n u m b e r o f

U l g e n e s , f o r i n s t a n c e , i s o n l y a f e w i n p l a n t s a n d f r u i t f l i e s ,a n d a b o u t o n e - t h o u s a n d i n f r o g s . I n m a m m a l s , t h e r e a p p e a r s t ob e c l u s t e r i n g o f s n R N A g e n e l o c i . T h e h u m a n U l g e n e s ' 2 " 1 3 ,h u m a n U2 g e n e s ' 4 , a n d m o u s e U l g e n e s l ' h a v e b e e n l o c a l i z e dt o s i n g l e r e g i o n s o f t h e g e n o m e b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n . H o w e v e r ,

i n s i t u h y b r i d i z a t i o n t o D r o s o p h i l a p o l y t e n e c h r o m o s o m e s s h o w e d

t h a t t h e s n R N A g e n e s w e r e s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e g e n o m e ' 6 .T h e U 1 , U 2 , U 4 , a n d U5 s n R N A g e n e s a r e t r a n s c r i b e d b y

R N A p o l y m e r a s e I I ( p o l H ) , b a s e d o n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e i ra c t i v i t y t o a l p h a - a m a n i t i n 5 " ' . A n a l y s i s o f v e r t e b r a t e s n R N Ag e n e s h a s r e v e a l e d t h a t t h e i r p r o m o t e r s d i f f e r f r o m m o s t mRNA

p r o m o t e r s i n s e v e r a l r e s p e c t s . F i r s t , t h e s e p r o m o t e r s l a c k T A T Ae l e m e n t s . I n s t e a d , a n e l e m e n t k n o w n a s t h e ' P r o x i m a l S e q u e n c e

E l e m e n t ' ( P S E ) , w h i c h i s l o c a t e d a b o u t 4 0 t o 7 0 b p u p s t r e a m o f

t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e , s p e c i f i e s t h e s i t e o f t r a n s c r i p t i o ni n i t i a t i o n a n d i s e s s e n t i a l f o r t r a n s c r i p t i o n . T h e s e q u e n c e o f t h ePSE i s u n r e l a t e d t o t h e T A T A b o x f o u n d a b o u t 3 0 b p u p s t r e a m

o f m o s t n i R N A g e n e s . A s e c o n d i m p o r t a n t s e q u e n c e e l e m e n t ,k n o w n a s t h e ' D i s t a l S e q u e n c e E l e m e n t ' ( D S E ) , i s l o c a t e d a b o u t

2 0 0 b p u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e . T h e DS Ef u n c t i o n s a s a n e n h a n c e r .

I n c o n t r a s t , t h e U6 s n R N A g e n e i s t r a n s c r i b e d b y RNA

p o l y m e r a s e I I I 1 7 . H o w e v e r , i t s p r o m o t e r e x h i b i t s some

r e m a r k a b l e s i m i l a r i t i e s t o t h e o t h e r s n R N A p r o m o t e r s a n d t omRNA p r o m o t e r s . S p e c i f i c a l l y , i t c o n t a i n s a PSE w h i c h i s

r e q u i r e d f o r U6 t r a n s c r i p t i o n a n d a T A T A e l e m e n t t y p i c a l i ns e q u e n c e a n d p o s i t i o n t o t h e s t a n d a r d mRNA T A T A e l e m e n t .

I t w a s r e c e n t l y d i s c o v e r e d t h a t i n a d d i t i o n t o s t a n d a r d ( c i s - )s p l i c i n g , n e m a t o d e s c o n d u c t a t r a n s - s p l i c i n g r e a c t i o n i n w h i c h

a s h o r t , n o n - t r a n s l a t e d l e a d e r ( c a l l e d ' S L ' ) i s j o i n e d t o t h e 5 ' e n d s

o f a s u b s e t o f t h e i r m R N A s ' 8 " 9 . 5 ' a n d 3 ' s p l i c e s i t e s , t y p i c a li n s e q u e n c e o f t h o s e f o u n d i n s t a n d a r d C . e l e g a n s i n t r o n s , a r e

p r e s e n t a t t h e j o i n i n g s i t e s o f t h e s e t r a n s - s p l i c e d RNAs. H e n c e ,i t i s p o s s i b l e t h a t s n R N P s w h i c h a r e k n o w n t o c a t a l y z e c i s - s p l i c i n ga l s o p a r t i c i p a t e i n t r a n s - s p l i c i n g .

S i n c e n o n e m a t o d e s n R N P s h a d b e e n c h a r a c t e r i z e d , w e

u n d e r t o o k t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e C . e l e g a n s s n R N P s . Weh a v e s h o w n t h a t a l l o f t h e C . e l e g a n s s p l i c e o s o m a l s n R N P s a r e

S m - b o u n d a n d T M G - c a p p e d 2 0 . We r e p o r t h e r e t h e s e q u e n c e s

a n d s t r u c t u r e s o f t h e C . e l e g a n s s n R N A s . T h e snRNAs a r e

s p e c i f i e d b y s m a l l , d i s p e r s e d g e n e f a m i l i e s , some m e m b e r s o f

w h i c h we h a v e c l o n e d a n d l o c a l i z e d o n t h e n e m a t o d e g e n o m e .

* To w h o m c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d

k . ) 1 9 9 0 O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s



2 6 3 4 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 9

* * * *

U l - 1 5 ' - T T T T T T C G T G C C T G C A C A T C

- 1 6 0 A A A G G T T A C T G T A C C T G C A A T T G C T A G T A A A C T T A A A T G T A A A A T A C G C A A A T T G C C A T C A C G T C A A A A T C C G C C T C A T A

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+ 8 1 C G G G C T GA C C T G T G T G GC A G T C T C G A G T T G A G A T T C G C C A A C A G C T T A A T T T T T GC G T A T C G G G GC T G C G T GC G C G C G G C

+ 1 6 1 C C T G A A A A G T G G G T C T A T A T G T A A C A C C T A G C C G A T G T T C T T T T A C G A T A T T T G G G A G A T T T G A A A G T T C A C T G A A G G A T

+ 2 4 1 G G A A A A G A C G C T A A T A T A A A T T T A T G A A A A T T A A A C G T C T C G A A C T G G A T G T G T C G T T T G C A T A G C C T T T T C A T T T G A T C

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U 2 - 1 5 ' - A A T C G T T C G C C G T C C A C C C T T G A A T T T A C C C T C C T T C G T T T G T A A A A C C

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+ 8 1 A G T GT A A T A A A G G T T A T A T G A T T T T T G G A A C C T A G G G A A G A C T C G G G G C T T G C T C C G A C T T C C C A A G G GT C G T C C T G G C G

+ 1 6 1 T T G C A C T GC T G C C G GG C T C GG C C C A G T C C C C G A G GG GA C A A A A A A A C - 3 '* * * *

U 2 - 2 5 ' - T C A T G C T C C C A A C T A C A A G T C C A C T G G A G C C A T C C A G G C G G T G

- 2 4 0 A T G A T C C A T A G C G T G A T A T A GG G A C A C T G A A A T T A A T C G G G T A C T A T A G GG A T A C T GT A G GA T T A C G GT A G C T T A A A A A A

- 1 6 0 A T T G A G T T T T G A G C C A A G G G T G T G C G G T A A T T T T G G C G A A T T T G C C G T T T G C C G A G C C T G G C A A T T T T G C C G A A T A T C T G

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+ 3 2 1 G C A G T GG T TC T G T A G T A T T A C T T C A G G A T C A C T A G T GT C C A T G A A A A A T T A T A A A T T A G A T T T C C A A T T T T T C C C A A - 3 '

* * * *

U 2 - 3 5 ' - G G T G G A A A T T A A A T T T C G C T G A A C A A T A T A A T T A C T T T C A G G G C A A G G A C T C C G G C T T C A G C A C G A C T

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+ 8 1 A G T G T A A T A A A G G T T A T A T G A T T T T T G G A A C C T A G G G A A G A C T C G G G G C T T G C T C C G A n T T C C C A A G G G T C G T C C T G G C G

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U 2 - 4 5 ' - A A A A G A A G G G T G A G T C A C G A A A T A G T G A G A G G G T T A G A G A A A C A G A T A G G T C A G G G A A C A T G A C A T A

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- 1 6 0

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- 2 4 0

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+ 3 2 1

IUMII 1 M M t A A UUMUMULAAAUULULAUAMI U I I U A A U I I L A A I U I L I U L U L LI I .I L I L A L I L I L I A M A L M L I L . L U

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T T G C A C T G C T G C C G G n n T C G n n C C A G T C C C G A G G G - 3 '

* * * *

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U 2 - 6 5 ' - A A A A A T T T C A A T A A

- 3 2 0 T T GC A G A C T G G A G TT T GG A G C A G C GT C A C A A A A A T T GA T T T T C T G T T T GC T T T T T A G A G A A A A A A A A C C A A A G T T C T GA A

- 2 4 0 T C T T C T A A A G T A T A T A G T C A A C T A T A A G A G G A G A A G G C A C A G A G G T T T T G A T T A T T T A A A A A A A A G C A C A T T T T T G C A G C

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- 1 6 0 T G A A T T T C A G G C A A C T T T G C T A T C C C C G A C T G A C A A A A A G C G C G T A A T T G G T A C G C C A A T G C A C C A T A T C T T A C G T G C A A

- 8 0 T G T T A C T C T G C G A C A G T A C G C G C A C C C C T G A T T T G T C G G T A C A C C C G T C C G C A C T A C T C C T G C C A C C T C C T C T A T T C A G T


+ 8 1 A G T G T A A T A A A G G T T A T A T G A T T T T T G GA A C C T A G G G A A G A C T C G G G G C T T G C T C C G A C T T C C C A A G G G T C G T C C T G GC G

+ 1 6 1 T T G C A C T G C T G C C G G G C T C G G C C C A G T G C C C G C G G G G A C A A A A T T A A G G G A T A G T T G C A T A A T A A A A C G T A A T G G A C A A A

+ 2 4 1 C G T T T T T T G A A A A A T T A T T G T T G A G T G T T C G C G C T T T G T T T T T T T T T A T T G T A A T A A T T A T T A T A A T A A C A A G T T A A A A A

+ 3 2 1 A A A A G A G T T A A G T A A T A C C G A C A T C A G T T T T T C A G T C A C G A G C - 3 '* * * *

U 2 - 7 5 ' - T G T A T T T G G A G T T

- 2 4 0 G G A T G T A A T T C A A G A G G T G C C A G A A G A C T T C C C A G A T G C T C A A G T T T G A A T T T T T T G T T T T G T A A T T G T T T T T T T T T A A A

- 1 6 0 T T T C A T T T T T T G T T T T A T A A A T T C A T G T A C G C C T G G C A A C C A G T C T C T G T C T G C G C C T C C A C C T T C T C C C C A C A C C T C T G

- 8 0 T C A T T T C A T A G TG A C A C A C G C G C GC C C C T G A T T T GT C G GT A C A C A G C T C C C G A C T A G C C C T G C C G C C T C A T C C A T T C A G T


+ 8 1 A G T G T A A T A A A G G T T A T A T G A T T T T T G G A T C C T A G G A A A G A C T C G G G G C T T G C T C C G A C T T T C C G C G G G T C G T A C T G G C G

+ 1 6 1 T T G C A C T G C T GC C G G GC T C G G C C C A G T C C C C G A G GG GA C A A A T A A G C T T - 3 '* * * *

U 2 - 8 5 ' - T G T A G A G G C A T A C C T T G C T A A T T T T T A T T T T G G A A A C T A T A T A T A C A T A T A C A T A T A T A T A T

- 2 4 0 A T A T A T A T A T A T A T A T G A T G C G G C A T G A T G C G G C A A A T T T G C C A A A T T T G C C G T T T G C C G A A T G A C G T T T G T A A A A C C G A

- 1 6 0 A T T T C T T T C G A A T C G A A T G C A T G C A C G T C T T G C A A C C A T C C T C T G T C T G C G C C T C C A C C C T C T T C C C A C T T A C A C T C C G T

- 8 0 T A T T T C A T A G T A G C A C A C G C G C G C C C C C T G A T T T G T C T G T A C A C C A C T C C C C A C T A G C C C T G G C A C C T C G G T C G T T C A G T+ 1 A T C G C T T C T T C G G C T T A T T A G C T A A G A T C A A A G T G T A G T A T C T G T T C T T A T C G T A T T A A C C T A C G G T A T A C A C T C G A A T G

+ 8 1 A G T G TA A T A A A G G T T A T A T G A T TT T T GG A A C C C A G G GA A G A C T C G GG G C T TG C T C C G A C T T C C C A A G G GT C G T C C T GG C G

+ 1 6 1 T T GC A C T G C T GC C G GG C T C GG C C C A G TC C C C A A G G GG A C A A A C A A A A A A A A A T T G A A A G TG A A T A T T GA A A A A A C A G A T T

+ 2 4 1 T G C T G A G C T C - 3 '* * * *

U 2 - 9 5 ' - C G T T C G A A A T A G C T A T C A A T G T T A C G G A A G A C T G G C T C G G A G A G C A A T T C C A A C A C T T C T G A T G G C G A G A A A C A T T T

- 1 6 0 G A G G T A T A C T A G G C C T G A A A C T T C T G A T A T T A G T T A A G A T G C G C C T T T A A G A A G T A C A G T A C T T C T G T C G C T T A T T A C A G

- 8 0 T C A A C T T A T A G T G C T C C A C G C G C G C C C T G T A T T T G T C G G T A C A C T G C C C C A A A C C A C A C T A G C C A C G A A A G T T T T T C A G T


+ 8 1 A G T G T A A T A A A G G T T A T A T G A T T T T T G G A A A C T A G G G A A G A C T C G G G G C T T G C T C C G T C T T T C C A A G G G T C G T C C C G G C G

+ 1 6 1 T T G C A C T G C T G C C G G G C T C G G C C C A G T C C C C G A G G G G G G T C A A A A A A G A A A T A C A G G C T G A T T T A A A A A A G C A A A G A A T T

+ 2 4 1 T C A T T A G G A G C C A A A G T A A T C G C T A G A A A A C G G A T G A A A A T G T A G T T T T C A G A T G G A C C A C C G C C T G T C T C A C C A C A A C G

+ 3 2 1 T G C C C C A T A T T C T C G A G - 3 '* * * *

U 4 - 1 5 ' - T A C T C G C T A C A T A A G T T C A C T T

- 1 6 0 A A A T A T G A A G T C T C A T A T A T A C A G T T A C A G A A G A A C G A C G T C A C T A G T A A T A A T A T T G A T T C T A C T C C G C C C A T G T T T A C

- 8 0 A C T A T T T A T G G C A A n G C G C G G A A A C C G T C A A G T G C C C G T T C A T T C A G T A A A T G G T G C A A A C T C G A G T G T A C T C T A T C T T T

+ 1 A G C T T T G C G C T GG G GC G A T A A C G T GA C C A A T G A G G C T T T GC C G A G G T GC G T T T A T T G C T GG T T GA A A A C T T T T C C C A A T T

+ 8 1 G C C C G C G A T G T C C C C T G A A A C A T G G G T G G C A T A C G C A A T T T T T G A A C n n C T C T A G G A G G C A G A A A A T C T T A T T A T A A G A T

+ 1 6 1 C G GC T C T C A T A A T A A A C T T GA C A T A A A A T A T G A T A T A A A C A T A G A C G GA G GA T A T T A T C A T T T TC A A C G TA G C T T A T C A C

+ 2 4 1 A T C T T A A C C G A A T G T T C T C G A A A T C T T A T T T A T T T A T C G C A A C C T T A C T T C C C T T C C C T C T G T A A T C C C A T C G C A G T A T T

+ 3 2 1 A T T T T C T C T C G T A C A G G C C T T G T T G A G C A A A T C A T T G C C A A T G T T G A T A C A G T T C C A T G A T A C G G G A T C A A T A T A T A T A C

+ 4 0 1 G A A T G C GA A T T T A T C T G A A A T C G A G C A T GT T A A C G G C TG A T C T A G A - 3 '* * * *

U 4 - 2 5 ' - T T T A T A G A A C A C T C T A T C C C T A G A A C A C T T T T A C C C T T C T G T T G A T A T T G A T T C A A C C A C G T C C C C G T T T A C

- 8 0 A T T A A T T G T T G C A A C G A G C G G A A A C C A C A A A A T G T C G G G C C A T C G A A T G A A A C C C C A C A A A T G T T T G A G T G A C T A T A T T C+ 1 A G C T T T G C G C T GG G GC G A T A A C G T GA C C A A T G A G G C T T T GC C G A G G T GC G T T T A T T G C T GG T T GA A A A C T T T T C C C A A T T

+ 8 1 G C C C G C G A T G T C C C C T G A A A C A T G G G T G G C A T A C G C A A T T T T T G A A C G C C T C T A G G A G G C A G A A A A A C A T C T T C A A A A T T

+ 1 6 1 C A T C T A A G T T C A n T T C GC A T T T T C GA T A T T GC G A A G T TA A T A A A A C A C A A T A T T TA T A C A T A C A A A T A T T C G T TG A T A A G

+ 2 4 1 G T T TC T A C C G A T T G G C T T T GC A T C A T T G GC T G C T T GG G C A G C T A A G A T C T T C T C C T T A G GA G T C A A T - 3 '* * * *

U 4 - 3 5 ' - G A A T T C G G A G G A A C G A A A C T T T A C A G A T C T T A A G A A A G T A G A A G A A

- 2 4 0 A A A T C A A T T T T G A G A T T T T T A T T A G T T T T T A T G C A G T T T T A A T C G A A G G G A A G A G A T T C G T T T C A A G A A A A C A G A G A G A C

- 1 6 0 T C C G A T A A A C C G C G A G C G A T T G C A A T T C G A A A A A G A C G A C C G C A A C G C A C A C G C G C C G C A T T C C G A A G A A T A C A G A A T G C

- 8 0 A G A A A G C A C C A T T G T GC G C G A A A G C C G C G A T T T G T C G GT T G C T GT G T T TT A T A G G A T C A G C T G A G T G A G C T GC T G A A T T T

+ 1 A G C T T T G C G C T G G G G C G A T A A C G T G A C C A A T G A G G C T T T G C C G A G G T G C G T T T A T T G C T G G T T G A A A A C T T T T C C C A A T T

+ 8 1 G C C C G C G A T G T C C C C T G A A A C A T G G G T G G C A T A C G C A A T T T T T G A A C G C C T C T A G G A G G C A G A A T A T A A A T A C T G A A C A G




+ 1 6 1 T T GA A C A T T T A G T T G GA A A A C A G T A T C C T T G G A G C A T T C A G G G C G C T A G T C A A C A T T G T A G A G A T G A A A A A T A T A T T C C T

+ 2 4 1 A G G T A A A G T G T G C A C C A T A T T A G T A C A T T A A A A T A C T C - 3 '

* * * *

U 5 - 1 5 ' - T T G G T T T C T G G A A T G T G A T C A C T G T T T T T G T T T T T T C T A G G C C T G A A A A T T T C C A A G C A A A A A C T C C G C C A C T

- 8 0 A G T T C C C C A A C G T G G T G A G C G A A A C C C G C C A G A T G T C C G T A C A C G G A G T T C A T C A C G T T C C A A T T T A G A G G T G C A C A A T C

+ 1 A A C T C T G G T T C C T C T G C A T T T A A C C G T G A A A A T C T T T C G C C T TT T A C T A A A G A T T T C C G TG C A A A G G A G C A T T T A C T G A G

+ 8 1 A T T A C A T A C A A T T T T T G G A G A C T C C T T GA G A A A G C G G G T C A A A A T A A A C T A C A G C A A A G G T A A T T T C TT T A T T T A C G A A G+ 1 6 1 C T T A C C T C T A C A T G T C C T T C C A T T G T C A C A A A T C G A T T T C T T T T T G T T T C A A C C T C G T G G T T C A T A T G A T A T T T C G T A A G

+ 2 4 1 G G C T T T T A G T A A A T G C T T A G G A T C C C A - 3 '

* * * *

U 5 - P s e u d o 5 ' - A C G C C G G A A A T T A G A A A T T G T C T T G A A G T T A T C C A T G C A A A G T T T G A T G C T C A

T C A G A G C A T C A T A A A T T A T G T T T C C C C G A A T C A G A A C A A C T G T A T G T T C C C A G A A A A C A A A A T C A A A T G T T T G T T T A G A T

T T A A A C C A A A C G T GA A C A T C G T T T GA T C G C A G A A A G T A G A GG T GG C A C T G A GC C A A A A T G GG T C GA C C C G C T C A A A C T T C

A A T T A A A A T G T A C A T T C A A G G A A T A A T A T A A T T C A T G T T T A A T T T T A A T T T G A C T G G C A T C G T T A G A A T A A C T A T C G A G T

( + 1 ) T G T TA G T A G A G G G GG G TT A T T A G G G TG G A A A A T C T T T T G C C T T T T A C T G A A T A T T T C C T T G C A A A G G A G C A T A C A T T G A G

T A T T A T A T A C A A T T T T T GG A G T C C C C T T GA G A A A G C G GA A T G A A A A T T A G T T TA A T A T C A T G T A T T T GT A A G A A T G C A T A

T T G T C T T T T A C T G T T T A T T T A A A T G A C G G T A A G G T T C G A T T T T A G T G T A A A A T T A T G T T T T C - 3 '* * * *

U 6 - 1 5 ' - G A G C T C C C A A C A C A T A G T G T T T C C A A T G T T A T A C C C A A T C A A T A A T A G C A A G T C A A T A A A C T A C C T C T A C A C T A T T T

- 8 0 C T G G T A A T A G G C G A A A C C T C T A C A C T G T C A G T C A C T T T G T A A G G T G T G C C T A T A T A T T T C C A T A A T A T T T C A T A C A A A T T

+ 1 G T T C T T C C G A G A A C A T A T A C T A A A A T T G G A A C A A T A C A G A G A A G A T T A G C A T G G C C C C T G C G C A A G G A T G A C A C G C A A A T

+ 8 1 T C G T G A A G C G T T C C A A A T T T T T T G A C T A A T T T C T G G T A T T A T T G T T T A G A A T T G T A A G A A A A T T T T A C A T T C C A G A A A A T

+ 1 6 1 G T A T C C A A A A A A C T T A C G C A A A C C T C G G A G C G T A T A G T T G C A T G A A G T G C T G G A T C C G A A T A C G A A C C G A C A A T T G T T A G

+ 2 4 1 A T C T T T - 3 '

* * * *

U 6 - 2 5 ' - G A G C T C C C A A C A C A T A G T G T T T C C A A T G T T A T A C C C A A T C A A T A A T A G C A A G T C A A T A A A C T A C C T C T A C A C T A T T T

- 8 0 C T G GT A A T A G G C G A A A C C T C T A C A C T G T C A G TC A C T T T G T A A G G T GT G C C T A T GT A T T T C C A T A A T A T T T C A T A C A A A T T

+ 1 G T T C T T C C G A G A A C A T A T A C T A A A A T T G G A A C A A T A C A G A G A A G A T T A G C A T G G C C C C T G C G C A A G G A T G A C A C G C A A A T

+ 8 1 T C G T G A A G C G T T C C A A A T T T T T T G A C T A A T T T C T G A C A T A G A G T T T T A C A T A T A T G T T G T G T G T A T T G T T T C A A T T T T A G

+ 1 6 1 T A T A T G T T C T C A A A G A A A G A T C C T C T T A A A A - 3 '

F i g u r e 1 . snRNA g e n e s e q u e n c e s . A p p r o p i a t e f r a g m e n t s f r o m t h e l a m b d a c l o n e s s h o w n i n F i g . 2 were s u b c l o n e d a n d s e q u e n c e d b y s t a n d a r d p r o c e d u r e s . G e n e s

a r e u n d e r l i n e d . N u m b e r i n g i s f r o m t h e f i r s t b a s e o f t h e s n R N A . I n t h e c a s e o f U 5 - P S , t h e r e g i o n o b v i o u s l y r e l a t e d t o U 5 i s u n d e r l i n e d . U 2 - l a a n d U 2 - l b a r ep r e s e n t e d a s a s i n g l e s e q u e n c e , s i n c e t h e r e i s o n l y a s i n g l e d i f f e r e n c e , a t p o s i t i o n - 3 0 .

F i n a l l y , we r e p o r t t h e d i s c o v e r y o f a p u t a t i v e P S E , p r e s e n t

u p s t r e a m o f a l l 2 1 C . e l e g a n s s n R N A genes t h u s f a rc h a r a c t e r i z e d .

MATERIALS A N D M E TH O D S

T h e C . e l e g a n s g e n o m i c l i b r a r y e m p l o y e d i n t h i s s t u d y w a s

c r e a t e d b y K a r n e t a l 2 1 . C l o n e d p h a g e s w e r e grow n, m a i n t a i n e d ,a n d p h a g e DNA p r e p a r e d a s d e s c r i b e d 2 0 . T h e h y b r i d i z a t i o np r o b e s u s e d t o c l o n e t h e C . e l e g a n s s n R N A s w e r e 5 ' - 3 2 P - l a b e l e do l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s . A l i s t o f t h e s e p r o b e s i s p r o v i d e d i n

T h o m a s e t a 1 2 0 . O l i g o n u c l e o t i d e s w e r e l a b e l e d 2 2 , p u r i f i e de l e c t r o p h o r e t i c a l l y o r over S e p h a d e x G - 5 0 c o l u m n s ( P h a r m a c i a )a n d h y b r i d i z e d t o v a r i o u s b l o t s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d 2 0 . P h a g em a p p i n g a n d s u b c l o n i n g w e r e p e r f o r m e d u s i n g s t a n d a r dt e c h n i q u e s . T h e pTZ v e c t o r s y s t e m 2 3 was u s e d e x c l u s i v e l y .

C . e l e g a n s g e n o m i c DNA was p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h em e t h o d o f Emmons e t a l 2 4 . I n e a c h r e s t r i c t i o n d i g e s t , t e n

m i c r o g r a m s o f DNA was d i g e s t e d w i t h 5 0 u n i t s o f v a r i o u s

r e s t r i c t i o n e n z y m e s f o r 6-8 h r s . a c c o r d i n g t o s t a n d a r d

p r o c e d u r e s . DNA w a s e l e c t r o p h o r e s e d on 1 % a g a r o s e g e l s a n d

b l o t t e d o n t o H y b o n d - N u s i n g a n a l k a l i n e b l o t t i n g t e c h n i q u e

p r e v i o u s l y d e s c r i b e d 2 0 . P r o b e s f o r t h e s e b l o t s w e r e DNA

f r a g m e n t s g e n e r a t e d b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n d

e n d - l a b e l e d w i t h 3 2 P a s d e s c r i b e d a b o v e f o r t h e l a b e l i n g o f

o l i g o n u c l e o t i d e s . P CR w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e G e n e A m p D N AA m p l i f i c a t i o n R e a g e n t K i t f r o m P e r k i n E l m e r C e t u s . P CRr e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n t h e i n s t r u c t i o n s p r o v i d e db y t h e m a n u f a c t u r e r , e x c e p t t h a t n o n i d e t - P 4 0 w a s a d d e d t o af i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 5 % . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s p e r f o r m e d

a t 4 2 ° C f o r 2 h r i n 50% f o r m a m i d e , 6 x S S C , 2 . 5 x D e n h a r d t ' s

s o l u t i o n , 5 O m M s o d i u m p h o s p h a t e pH 6 . 5 , 0 . 1 % S D S , a n d

2 0 O g / m l s a l m o n s p e r m DNA. H y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u ti n t h e s a m e c o n d i t i o n s o v e r n i g h t . F i l t e r s w e r e w a s h e d t w i c e f o r1 5 m i n . i n 2 x SSC a n d 0 . 2 % SDS a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e n

t w i c e f o r 3 0 m i n . i n 0 . l x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t 5 5 0 C .P r i m e r - e x t e n s i o n s e q u e n c i n g o f C . e l e g a n s s n R N A s w i t h A v i a n

M y e l o b l a s t o s i s V i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( S e i k a g a k u A m e r i c a )w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d b y G e l i e b t e r 2 5 .

RESULTS A N D DISCUSSION

C l o n i n g C . e l e g a n s s n R N A G e n e s

C . e l e g a n s s n R N A g e n e s w e r e c l o n e d u s i n g r a d i o l a b e l e do l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s w h i c h w e r e c o m p l e m e n t a r y t o h i g h l y -c o n s e r v e d r e g i o n s w i t h i n p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d s n R N A s .T h e s e o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e c a p a b l e o f h y b r i d i z i n g t o a n t i - S ma n d a n t i - t r i m e t h y l g u a n o s i n e c a p p r e c i p i t a b l e C . e l e g a n s R N A s




1 k b

K KRXO O B X R R OI II I II

U 1 - 1

B L # 1 0 1

K O T K I P T T T x R XH H HAA

B L # 1 0 6

I V T R I X , T Y h 9 R X . 9 _ T X , TR , XX ,

U2-9

B L # 1 0 8

VO X G O B K G R B BBR BR GI I 1 1 1 fUL J III 1 1 I

B L # 1 0 2

..U *. . . U

U2-1 a U2-1bU-

T K T , O X T BB O X T

RU2-3

V2RR

U 2 - 4

B L # 1 03

I V, ° T ° , , R T x , ~ JR ROff

~~c*_U 2 - 5 U 2 - 6

B L # 1 04

X X R K R T

U2-7

B L # 1 0 5

U2-8

V

U 4 -U4-1 U4-2

B L # 1 0 9

B X R O R O , O

U 4 - 3

B L # 1 1 0

R 0 X RX XO XRO B X

U5-1

B L # 1 1 2

X B X R X R ( R o r R ) R, , , mm.

U5 - PS

B L # 1 0 7 1 k b

R X , E R 9 F R X { j p ) q T T R T X

U6-1 U6- 2

F i g u r e 2 . R e s t r i c t i o n maps o f C . e l e g a n s s n R N A g e n e - c o n t a i n i n g c l o n e s . The l o c a t i o n a n d o r i e n t a t i o n ( w h e r e known) o f t h e c l o n e d snRNA genes are i n d i c a t e d .

I n cases w h e r e t h e e x a c t p o s i t i o n o f t h e g e n e i s u n k n o w n , a b r a c k e t d e n o t e s t h e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t h a r b o r i n g t h e g e n e . R e s t r i c t i o n s i t e s are i n d i c a t e d by t h e l e t t e r s

K , K p n I ; R , E c o R I ; X , X b a I ; 0, X h o I ; B , B a m H I ; T , S s t I ; H , H i n d H I ; G , B g I I I . R o m a n n u m e r a l s i n d i c a t e t h e chromosome onto w h i c h t h e p h a g e h a s b e e n l o c a t e d .

T h e l e f t e n d o f t h e f r a g m e n t s h o w n a b u t s t h e l e f t arm o f t h e l a m b d a h o s t . B L # 1 1 2 c o n t a i n s t h e U 5 p s e u d o g e n e , a s well a s a n d EcoRI s i t e which i s present i n

o n e o f t h e tw o l o c a t i o n s s h o w n . U 1 - 2 a n d U 1 - 3 ar e l o c a t e d o n c h r o m o s o m e V , a n d a r e s t r i c t i o n map o f t h e s e g e n e s c a n b e f o u n d i n R u s s n a k and C a n d i d o 2 6 .

o f t h e e x p e c t e d s i z e s ( s e e F i g . 1 i n r e f . 2 0 ) . A f t e r r e s t r i c t i o nm a p p i n g , s u b c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g , t h e c l o n e d g e n e s w e r e

s h o w n t o e n c o d e snRNAs b y c o m p a r i n g t h e DNA sequence t o

R N A sequence o b t a i n e d f r o m p r i m e r - e x t e n s i o n o f t o t a l C . e l e g a n sR N A ( d a t a n o t s h o w n ) . S p e c i f i c a l l y , R N A sequence w a s o b t a i n e df o r n u c l e o t i d e s 15-48 o f U 1 , 2 - 1 5 2 o f U 2 , 2 - 4 1 o f U 4 , 2 - 2 6 o f

U 5 , a n d 2 - 22 o f U 6 ( s e e F i g . 4 ) .A s i n g l e U l gene, t e n U 2 genes, t h r e e U 4 genes, a s i n g l e U5

g e n e , a n d two U 6 genes w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d i n c l u d i n g- 2 5 0 b p u p s t r e a m a n d - l O O b p d o w n s t r e a m o f e a c h ge ne ( F i g .

1 ) . I n a d d i t i o n , a U5 p s e u d o g e n e w a s s e q u e n c e d . R e s t r i c t i o n m a p s

o f s n R N A g e n e - c o n t a i n i n g c l o n e s a r e s h o w n i n F i g . 2 . S e v e r a l

c l o n e s c o n t a i n e d p a i r s o f s n R N A genes ( B L # 1 0 2 , 1 0 3 , 1 0 7 , a n d

1 0 8 ) , a n d o n e ( B L # 1 0 1 ) c o n t a i n e d t h r e e . T h e e x i s t e n c e o f twoa d d i t i o n a l Ul g e n e s , l o c a t e d a t t h e b o r d e r s o f t h e h s p - 1 6

d u p l i c a t i o n 2 6 , was a l s o c o n f i r m e d b y p r i m e r - e x t e n s i o n

s e q u e n c i n g ( n o t s h o w n ) .

The l o c a t i o n s o f s n R N A genes i n t h e C . e l e g a n s g e n o m e

S e v e r a l o f t h e c l o n e d g e n e s h a v e b e e n l o c a l i z e d o n t o t h e g e n o m i c

map o f C . e l e g a n s b y m o l e c u l a r h y b r i z a t i o n . T h e s e e x p e r i m e n t s

w e r e p e r f o r m e d b y S u l s t o n a n d C o u l s o n a n d b y L u t t e r b a c h a n d

W a t e r s t o n ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) . The l o c a t i o n s o f t h e s e

s n R N A genes ar e d e n o t e d i n F i g . 2 . S i n c e m a n y o f t h e p h a g e s

i s o l a t e d c o n t a i n e d 2 or 3 g e n e s , i t i s s u r p r i s i n g t h a t n o f u r t h e r

c l u s t e r i n g o f s n R N A genes i s e v i d e n t . W i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e

c l u s t e r i n g n o t e d a b o v e , t h e g e n o m i c o r g a n i z a t i o n o f t h e c l o n e d

s n R N A g e ne s a pp ea r s r a n d o m .

E s t i m a t i n g s n R N A g e n e number

O n c e s u b c l o n e s w e r e o b t a i n e d , g e n o m i c DNA b l o t s w e r e

p e r f o r m e d i n o r d e r t o e s t i m a t e t h e s i z e o f t h e s n R N A g e n e

f a m i l i e s . Due t o t h e small s i z e o f t h e genes a n d t h e l a c k o f u s e f u lr e s t r i c t i o n s i t e s , we m a d e p r o b e s u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o ni n o r d e r t o a c h i e v e s p e c i f i c h y b r i d i z a t i o n . T h e r e s u l t s , s h o w n

i n F i g . 3 , c l e a r l y d e m o n s t r a t e t h a t a l l o f t h e C . e l e g a n s snRNAs

a r e s p e c i f i e d b y s m a l l g e n e f a m i l i e s . S o m e g e n o m i c DNA

f r a g m e n t s p r o d u c e d more i n t e n s e h y b r i d i z a t i o n s i g n a l s t h a n

o t h e r s . T h e r e a re s e v e r a l p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e

d i f f e r e n t i a l l y h y b r i d i z i n g f r a g m e n t s . F i r s t , t h e r e c o u l d b e weakh y b r i d i z a t i o n t o r e l a t e d sequences, s u c h a s t h e p s e u d o g e n e f o u n d

o n BL # 1 1 2 ( F i g . 2 ) , or t o h i g h l y d i v e r g e d s n R N A g e n e s . T h e r e

c o u l d b e s t r o n g h y b r i d i z a t i o n t o DNA f r a g m e n t s w h i c h c o n t a i n

m u l t i p l e genes, o f w h i c h t h e r e are s e v e r a l known e x a m p l e s ( s e eF i g . 2 ) . F i n a l l y , t h e r e c o u l d b e c o m i g r a t i o n o f g e n e - c o n t a i n i n gf r a g m e n t s . We e s t i m a t e t h a t t h e r e are a b o u t e l e v e n U1 g e n e s ,

t w e l v e U 2 g e n e s , s i x U 4 g e n e s , n i n e U5 g e n e s , a n d t e n U 6 g e n e s .

S e c o n d a r y s t r u c t u r e s o f t h e C . e l e g a n s s n R N A s

T h e e x i s t e n c e o f c a t a l y t i c R N A s , a n d i n p a r t i c u l a r o f s e l f - s p l i c i n gR N A s , s u g g e s t s t h a t t h e RNA m o i e t i e s o f snRNP s a r e d i r e c t l yi n v o l v e d i n c a t a l y s i s o f n u c l e a r mRNA s p l i c i n g . H e n c e , t h e

B L # l 1 1

I

I V

x

RKI I

x

V



1 3

R X ( ) R XO

1 )

RXO

*a

.. : . . . . .

E

R XO

-

6 e . .

- 9.5

. - 6 . 8

- 4 . 4

2 . 2 5- 2 . 0

- 1 . 3 5

- 1. 1

O . 9 )

0.6

F i g u r e 3 . G e n o m i c DNA b l o t a n a l y s i s o f s n R N A g e n e s . C . e l e g a n s g e n o m i c DNA w a s r e s t r i c t e d w i t h t h e e n z y m e s E c o R I ( R ) , X b a I ( X ) a n d X h o I ( 0 ) , e l e c t r o p h o r e s e do n a 1% a g a r o s e g e l , a n d b l o t t e d o n t o H y b o n d - N . The b l o t s w e r e p r o b e d w i th e n d -l a b e l e d DNA f r a g m e n t s g e n e r a t e d b y p o l y m e r a s e c h a i n - r e a c t i o n ( P C R ) . I n A ) ,t h e b l o t w a s p r o b e d w i t h a f r a g m e n t c o r r e s p o n d i n g t o -99 t o + 1 6 1 o f U l - I ( r e l a t i v e t o t h e s t a r t s i t e o f t r a n s c r i p t i o n ) . I n B ) t h e b l o t w a s p r o b e d w i t h an e n d - l a b e l e d

P C R - g e n e r a t e d f r a g m e n t w h i c h c o r r e s p o n d s t o -5 t o +184 o f U 2 . T h e b l o t i n C ) w a s p r o b e d w i t h a f r a g m e n t w h i c h c o r r e s p o n d s t o -2 0 t o +140 o f U 4 - 1 .

I n D ) t h e b l o t w a s p r o b e d w i t h a f r a g m e n t c o r r e s p o n d i n g t o -9 2 t o + 1 2 1 o f U S - 1 . T h e b l o t i n E ) w a s p r o b e d w i t h a f r a g m e n t c o r r e s p o n d i n g t o -4 9 t o +9 8 o f U 6 - 1 .

s t r u c t u r e o f t h e snRNAs i s o f g r e a t i n t e r e s t . T h e m o s t i n f o r m a t i v ea n d a c c u r a t e a p p r o a c h t o w a r d i n f e r r i n g h i g h e r o r d e r RNA

s t r u c t u r e h a s proven t o b e p h y l o g e n e t i c c o m p a r i s o n o f

h o m o l o g o u s RNA sequences27 -29. S i n c e t h e sequences o f

snRNAs f r o m many d i f f e r e n t o r g a n i s m s are k n o w n , s e v e r a la u t h o r s h a v e p e r f o r m e d s u c h a n a l y s e s 9 ' 3 0 ' 3 1 a n d

p h y l o g e n e t i c a l l y - s u p p o r t e d s t r u c t u r e m o d e l s e x i s t f o r a l l f i v es p l i c e s o m a l RNAs.

We a n a l y z e d t h e s t r u c t u r e s o f t h e C . e l e g a n s snRNAs f o rs e v e r a l r e a s o n s . F i r s t , c o n s e r v a t i o n o f i m p o r t a n t s t r u c t u r a le l e m e n t s c o n s t i t u t e s e v i d e n c e t h a t t h e t r u e s n R N A gene h o m o l o g sh a v e b e e n c l o n e d . S e c o n d , s i n c e n o snRNAs f r o m m e m b e r s o f

t h e n e m a t o d e p h y l u m h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d , t h e c o m p a r i s o no f C . e l e g a n s s n R N A c o u l d h e l p t o c o n f i r m o r d i s p r o v e p r o p o s e d

s t r u c t u r e e l e m e n t s . F i n a l l y , s u c h a p h y l o g e n e t i c c o m p a r i s o n c o u l dh e l p t o r e v e a l n o v e l f e a t u r e s o f t h e C . e l e g a n s s n R N A s - f e a t u r e sw h i c h may f u n c t i o n i n a c c o m o d a t i n g t r a n s - s p l i c i n g .

S u c h a p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s was p e r f o r m e d c o m p a r i n g t h en e w l y - a c q u i r e d C . e l e g a n s s n R N A s e q u e n c e s w i t h t h e s e q u e n c e s

o f snRNAs f r o m o t h e r o r g a n i s m s [ b o t h b y us a n d b y G u t h r i e

a n d P a t t e r s o n 9 , t o w h o m we p r o v i d e d t h e sequences o f C .e l e g a n s U 2 , U 4 , a n d U 6 ] . O u r a n a l y s i s was c o n s i s t e n t w i t h t h er e s u l t s o f G u t h r i e a n d P a t t e r s o n . T h e m i n i m a l s e c o n d a r y

s t r u c t u r e s o f C . e l e g a n s s p l i c e o s o m a l snRNAs are s h o w n i nF i g . 4 .

T h e f i r s t l o o p r e g i o n o f human U 1 h a s b e e n s h o w n t o c o n t a i n

t h e m a j o r r e c o g n i t i o n d e t e r m i n a n t s f o r t h e U1 - s p e c i f i c p r o t e i nU 1 - 7 0 K 3 2 ' 3 3 . T h i s sequence i s i d e n t i c a l b e t w e e n C . e l e g a n s ,D r o s o p h i l a , X e n o p u s , a n d h u m a n U 1 . T h e h a i r p i n r e g i o n , k n o w n

t o i n t e r a c t w i t h t h e U1-A p r o t e i n 3 4 , i s a l s o h i g h l y c o n s e r v e d

b e t w e e n C . e l e g a n s a n d o t h e r o r g a n i s m s . S e v e r a l c o m p e n s a t o r y

n u c l e o t i d e c h a n g e s i n t h e C . e l e g a n s sequence p r o v i d e a d d i t i o n a ls u p p o r t f o r t h e h e l i c a l e l e m e n t s i n U l .

T h e C . e l e g a n s U 2 sequence i s p a r t i c u l a r l y h e l p f u l i n

c o n f i r m i n g p r o p o s e d s t r u c t u r a l e l e m e n t s . I n t h e r e g i o n o f U 2 f r o m

p o s i t i o n 7 t o 5 6 ( F i g . 4 ) , C . e l e g a n s h a s more n u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s f r o m h u m a n U2 t h a n d o S c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b eo r S . c e r e v i s i a e . A c o m p e n s a t o r y c h a n g e ( p o s i t i o n s 1 5 - 2 0 / G -

C t o U - A , a l s o p r e s e n t i n T r y p a n o s o m a b r u c e i U 2 3 5 ) i s t h e o n l yp h y l o g e n e t i c e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f t h e f i r s t s t e m . T h e

b r a n c h s i t e i n t e r a c t i o n r e g i o n o f U2 ( n u c l e o t i d e s 3 5 - 4 0 , s ee

P a r k e r e t a 1 7 ) i s f o l l o w e d b y a p s e u d o k n o t 3 0 c o m p r i s e d o f

n u c l e o t i d e s 4 9 t h r o u g h 5 4 a n d n u c l e o t i d e s 6 3 t h r o u g h 6 8 ( F i g .4 ) . T h r e e c o m p e n s a t o r y n u c l e o t i d e c h a n g e s p r o v e t h e e x i s t e n c eo f t h i s h e l i c a l e l e m e n t , two o f w h i c h ar e u n i q u e t o C . e l e g a n s

U 2 ( 5 2 - 6 5 / C - G, 5 3 - 6 4 /G - C ) . O v e r a l l , t h e s e q u e n c e a n d

p u t a t i v e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f C . e l e g a n s U 2 a r e q u i t e s i m i l a rt o t h o s e c h a r a c t e r i z e d i n o t h e r m u l t i c e l l u l a r e u k a r y o t e s , a n d i t

p o s s e s s e s n o u n u s u a l sequence o r s t r u c t u r a l e l e m e n t s . I n c o n t r a s t ,

t h e U2 p r e s e n t i n T . b r u c e i ( a l s o k n o w n t o c o n d u c t t r a n s - s p l i c i n g )i s very u n u s u a l i n t h e b r a n c h - s i t e i n t e r a c t i o n r e g i o n 3 5 .

T h e i n t r a s p e c i e s m i c r o h e t e r o g e n e i t y o f t h e C . e l e g a n s U2


" A

R X ( )

l i w

4 6 k




c A C 0 - C AA c G G C

G U C uU U U-A

U A - U U -AC - G U - A

Q CU-AAC:C , C.J-soA-u

C~~~~~~6-ACGCUCUtU.As2 G A AC - uG-cu.G

T T 4 6 0 - C - G1)1- C CGAA ~ 1TG

S C A a C C u C ~ ~ ~ G A U C A A AC ' ' ' ' " A - 'CCUU 2 t - G C U

A-UU-AUU * G 2 0 C- Gu-A G -CG -C G C U -AG - C u U G C Au-G G-C U -A

4 A 0 A G A -U 1 0 o o C- G A GC-GICGC G G A A U CC C U G G C A G U C U j C G A U * G U C - G G A1 I 1 1 II I I

1 I I 1 G C-G U - C A U u-AA C G C G C U U A GGG A C C G U U A GA GU U G - C - 1 6 0 GCCAGU y Go A \ 1 2 C G -C G u C - GI G - C10G-C U C - G U C A U * G0 U -A 1 4 o G U g u - A G - 8C-GU6.C-G U -A A U-5 ' - 2 . 2 Z 7 r e G p p p A A A C U U A C C U G G - C U U , A A U U U U U G . C G U A U - . A A - . 3 I 5 ' - Z 7 r m G p p p A A - U A U U A C A U A C A A U U U U U G G . A G - . C A - . 3

S m S m

; A AAJ2 ~~~~~~~~~G-C

AUUAG-CUG Y U

G -C

CAA

u-20 C-G~20-

C-GAUA

G-C~~~~~-

IC

G*U

CG121.AU - 1 4 0u A 6 0 - C - G A -u

u .G40-u

1 0 0 A G - C u 1 6 0 U U G

5' ~ ~ 1

CAUAGUuAGAA-C \ G C

5The G p p p A2 s e u e c U e p r e s e n t C A A A e u e c o A U U 2 - l a - l b U3, G U A Ua n - 6 . U 2 - 2 AUabr a a t p o i t o172.27haCG p o i t o 1 1 0 a nGAC

UCUUAUCGu,~~~~ ~ C C u A G - C A C C G Im -AA U'CtqI C- G G G G U C G ICG

III I , C G C U C GC C G G G C C . "

A U 6

3 '

G AGGC

A UA U ,C C G N 4 0GA$~~~~~GGAG~~~~~100CG...G ~ ~ ~ ~ ~ A ACC G A

G A U AA UGGU'-2. Z m G p p 7 G C U m G C G C n U A GGGC U C - GA G G A A C G C G U C C C C G A HILC-G

3'-UU U UUAAA- UAG. u . C

- G U~O C-G C-G A CAC A G C G U - G U G

U u'FA. - C 0 A U - C-G-A A ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ A 0 u A ~ A U-AG-C UG 80

G-C 1 2 0 C-G

A - G C A-U C-G C-G14,APCA ~ G . U G A A A A C U U U U C C C A A U U G C C C G - C , A A _ U UU U U G A C G -C A GAA - 3

A A ASG A A S

U G C U U . . o G4 0 - A

GACU6 A UAACAAGGUUAAAA

U20-CAUAUA

C G A G A A C

5 ' I

F i g u r e 4 . T h e C . e l e g a n s s p l i c e o s o m i a l s n R N A s . A l l snRNAs a r e s h o w n i n t h e i r m o s t p r o b a b l e s e c o n d a r y s t r u c t u r e , b a s e d on p h y l o g e n e t i c s e q u e n c e c o m p a r i s o n .A m o n g t h e m e m b e r s o f t h e U l a n d U 2 g e n e s c l o n e d t o d a t e , t h e r e i s s e q u e n c e v a r i a t i o n . A l t e r n a t e b a s e s ( u n d e r l i n e d ) a r e p r e s e n t n e x t t o t h e i r r e s p e c t i v e p o s i t i o n s .A l t e r n a t e b a s e s s h o w n i n U t I a r e f r o m U 1 - 2 a n d U 1 - 3 ( w h i c h a r e i d e n t i c a l i n s e q u e n c e ) . E x c e p t f o r a d e l e t i o n a t p o s i t i o n 8 1 , a l l o f t h e c h a n g e s a r e s u b s t i t u t i o n s .T h e m a i n U 2 s e q u e n c e r e p r e s e n t s t h e s e q u e n c e o U 2 - l a , - l b , - 3 , - 4 , - 5 , a n d - 6 . U 2 - 2 h a r b o r s a U a t p o s i t i o n 1 7 2 . U 2 - 7 h a s a U a t p o s i t i o n 1 1 0 , a n Aa t 1 1 7 , a U a t 1 4 2 , a G a t 1 4 5 , a G a t 1 4 6 , a n d a n A a t 1 5 4 . U 2 - 8 c o n t a i n s a C a t 1 1 3 . U 2 - 7 h a s a G a t p o s i t i o n 2 5 , a n d A a t 1 1 1 , a U a t 1 3 8 , a U a t1 4 2 , a n d a C a t 1 5 6 . T h e U4/U6 s t r u c t u r e i s f r o m Z u c ke r - A p r i s o n e t a I 3 8 .




5 , 3 ,

C o n s e n s u s : A C G 6 6 N A A 6 6 N C N A A A - - T T 6 6 G 6 T A C A C

Ul-1 -6 1 A GC G G A G A CCGC A A A A - - T G T C G G G A C A C

U 1-2 ,3 -61 CGCGGA ACCCGCCAGA--TGTCA TGCTA T

U2-1 a , b -65

U2- 2 -65U2-3 -6 5

U2-4 -65

U2-5 -6 5

U2-6 -6 5

U2-7 -6 5

U2-8 -6 5

U2 -9 -65

U4-1

U4- 2

U4-3

CACGCGCGCCCATGAT--T GTQGGTACAC

CACGCGCGCCCATGA T T-TGTCGGT ACACCACGCGCACCCACGAGT-T GTCGGTACAC

CACGCGCACCCATGAGT-T G T C G GC A C A C

CCCGCGCACCCCTGACT-TGTCGGTACAC

TACGCGCACCCCTGA T T-TGTCGGT ACAC

CACGCGCGCCCCTGATT-T GTC G G T A C A C

CACGCGCGCCCCCTGATT-TGTC T G T A C A C

CACGCGCGCCCTGTA T T-TGTCGGT ACAC

-63 CGCGGAAACCGTCAAG--TGCCCGTTCAT-6 3 A GC G G A A A CC A C A A A A - - T G T C G G GCC A T

-6 3 CGCG A A A GCCGC G A T T - - T G T C G G T T GC T

U5-1 -6 4 AGCGAAACCCGCCAGA--TGTCCGTACAC

S L - 1 -6 6 A T C G T A G A CC TC GC T C GC T G T C T GC T G T A

SL-1* -69 GACGCGGGCCTCGA TTGGTGTCGGCCGCT

SL-2 -65 CTCGC T T GCC TC G A A A T G T G T C G G T A C A C

U6-1,2 -72 GGCG-A A ACCTCTACAC-TGTCAGT-CAC

F i g u r e 5 . T h e p u t a t i v e C . e l e g a n s p r o x i m a l sequence e l e m e n t . T h e n u m b e r s t o

t h e r i g h t o f t h e g e n e n a m e s i n d i c a t e t h e p o s i t i o n o f t h e 5 ' - m o s t n u c l e o t i d e o f

t h e sequence s h o w n , r e l a t i v e t o t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e . T h e consensu s

o f a l l t h e s e sequences i s i n d i c a t e d a t t h e t o p , w i t h e s p e c i a l l y h i g h l y c o n s e r v e d

p o s i t i o n s a s t e r i s k e d . S L - 1 * i s f r o m t h e SL R N A 1 gene f r o m C a e n o r h a b d i t i sb r i g g s a e ( P . C a n d i d o , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e S L - 2 sequence i s f r o m H u a n g

a n d H i r s h 4 3 .

R N A s ( s h o w n i n F i g . 4 ) p a r a l l e l s t h e i n t e r p h y l u m h e t e r o g e n e i t yo f U 2 . C h a n g e s a r e c l u s t e r e d 3 ' o f t h e S m b i n d i n g s i t e , i n s t e m s

m 1 1 a n d I V . N e a r l y a l l o f t h e c h a n g e s w i t h i n t he C . e l e g a n s U 2

ge ne f a m i l y a r e c o n s e r v a t i v e w i t h r e s p e c t t o s e c o n d a r y s t r u c t u r e .

T h e o n l y n o n - c o n s e r v a t i v e c h a n g e s are t h e A t o U c h a n g e a t

p o s i t i o n 1 3 8 , a n d t h e C t o A c h a n g e a t p o s i t i o n 1 5 4 . T h e f o r m e r

c h a n g e i s p o s t u l a t e d t o move a b u l g e o n e p o s i t i o n 3 ' , a n d t h e

l a t t e r c h a n g e w o u l d i n c r e a s e t h e s i z e o f a b u l g e b y o n e n u c l e o t i d ei n b o t h s t r a n d s o f t h e h e l i x i n t h e m o d e l s h o w n . S i n c e t h e p o s i t i o na n d s i z e o f t h e s e b u l g e s are n o t c o n s e r v e d ( F i g . 4 a n d r e f . 9 ) ,t h e s e d i f f e r e n c e s a l s o p a r a l l e l t h e i n t e r p h y l u m h e t e r o g e n e i t yo b s e r v e d i n U 2 .

T h e U 5 s nR NA i s t h e l e a s t c o n s e r v e d o f a l l o f t h e s p l i c e o s o m a lsnRNAs w i t h r e s p e c t t o n u c l e o t i d e s e q u e n c e 9 . H o w e v e r , U5s e e m s t o b e h i g h l y - s t r u c t u r e d . By f a r t h e m o s t c o n s e r v e d r e g i o ni s t h e u p p e r m o s t p a r t o f s t e m / l o o p I ( p o s i t i o n s 3 8 - 4 8 ) ; t h esequence i n t h i s r e g i o n i s i d e n t i c a l i n C . e l e g a n s , D r o s o p h i l a ,

a n d h u m a n . M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f h u m a n U5 s u g g e s t s t h a t t h i sr e g i o n i s l i k e l y t o m e d i a t e th e a s s o c i a t i o n o f U5 s n R N A w i t ht h e i n t r o n - b i n d i n g p r o t e i n 3 6 ' 3 7 . C . e l e g a n s US i s e a s i l y a l i g n e dw i t h US R N A s o f other o r g a n i s m s , a n d i t s p a t t e r n o f conservation

p a r a l l e l s t h e g e n e r a l p a t t e r n . H o w e v e r , s i n c e r e l a t i v e l y f e w

h o m o l o g o u s n u c l e o t i d e s c a n b e i d e n t i f i e d , i t i s d i f f i c u l t t o a s s e s s

w h e t h e r C . e l e g a n s US h a s a n y u n u s u a l s e q u e n c e e l e m e n t s .T h e a n a l y s i s o f t h e s t r u c t u r e s o f U4 a n d U6 snRNAs i s u n u s u a l

i n t h a t i t must t a k e i n t o a c c o u n t t h e two i n t e r m o l e c u l a r stems

w h i c h a r e p r o p o s e d t o m e d i a t e t h e b i o l o g i c a l a s s o c i a t i o n o f tese

s n R N A s 3 l , 3 8 . P h y l o g e n e t i c e v i d e n c e f o r t h e i r e x i s t e n c e i s

e s p e c i a l l y i m p o r t a n t i n l i g h t o f e x p e r i m e n t s w h i c h s h o w t h a t t h e

T m o f d i s s o c i a t i o n o f t h e s e R N A s i s t h e s a m e w h e t h e r U 4 / U 6

snRNP i s l e f t i n t a c t o r i f i t i s t r e a t e d w i t h SDS a n d p r o t e i n a s eK 3 9 . T h e i n t e r m o l e c u l a r s t e m I i s s o h i g h l y c o n s e r v e d t h a t t h e r ea r e n o c o m p e n s a t o r y c h a n g e s w h i c h s u p p o r t i t s e x i s t e n c e . S t e m

I I i s l e s s c o n s e r v e d a n d i t s e x i s t e n c e i s p r o v e d b y s e v e r a lc o m p e n s a t o r y c h a n g e s i n t h e y e a s t , t r y p a n o s o m e , a n d p l a n ts e q u e n c e s . I n g e n e r a l , t h e p a t t e r n s o f C . e l e g a n s U4 a n d U6s t r u c t u r e a n d s e q u e n c e h o m o l o g y a r e n o t s t r i k i n g l y d i f f e r e n t f r o m

t h o s e i n o t h e r o r g a n i s m s .

C . e l e g a n s s n R N A G e n e P r o m o t e r s

I n a l l snRNA g e n e s c h a r a c t e r i z e d t o d a t e , t h e p r o m o t e r e l e m e n t sa r e c o n t a i n e d w i t h i n t h e 5 ' - f l a n k i n g s e q u e n c e 5 . C . e l e g a n ssnRNA g e n e s d o n o t a p p e a r t o b e a n e x c e p t i o n i n t h i s r e g a r d .S e q u e n c e s i m i l a r i t i e s e n d s h o r t l y a f t e r te t r a n s c r i p t i o n u n i t e n d s ,a t w h i c h p o i n t t h e n u c l e o t i d e s a r e p r e d o m i n a n t l y c o m p r i s e d o f

a d e n y l i c a n d t y m i d y l i c a c i d s . S e v e r a l r e g u l a t o r y e l e m e n t s h a v e

b e e n d e f i n e d i n t h e snRNA g e n e s o f o t h e r o r g a n i s m s 4 0 - 4 4 .E x c e p t f o r t w o e l e m e n t s , t h e p r o x i m a l s e q u e n c e e l e m e n t ( P S E )

a n d t h e d i s t a l s e q u e n c e e l e m e n t ( D S E ) , t h e s e s e q u e n c e s a r e n o t

c o n s e r v e d b e t w e e n d i f f e r e n t g e n e f a m i l i e s o r b e t w e e n d i f f e r e n ts p e c i e s e x a m i n e d 1 0 . A m a n u a l s e a r c h o f 5 ' f l a n k i n g r e g i o n sf r o m C . e l e g a n s U l , U 2 , U 4 , U 5 , a n d U6 snRNA g e n e s n o t

o n l y f a i l e d t o r e v e a l a n y s e q u e n c e s s i m i l a r t o t h e g e n e - a n d

s p e c i e s - s p e c i f i c e l e m e n t s d i s c o v e r e d p r e v i o u s l y , b u t a l s o f a i l e dt o r e v e a l a n y s e q u e n c e s r e s e m b l i n g t h e P S E o r DS E c h a r a c t e r i z e di n o t h e r o r g a n i s m s .

T h e C . e l e g a n s g e n e f a m i l y i n w h i c h t h e g r e a t e s t n u m b e r o f5 ' - f l a n k i n g r e g i o n s h a s b e e n s e q u e n c e d i s t h e U2 g e n e f a m i l y .We f o u n d a s t r i k i n g p a t t e r n o f n u c l e o t i d e c o n s e r v a t i o n w i t h i nt h e s e s e q u e n c e s . T h e r e g i o n f r o m - 1 t o -6 4 ( r e l a t i v e t o t h et r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ) i s v e r y s i m i l a r i n a l l 9 s e q u e n c e s ; t h en u c l e o t i d e s a t 5 3 o u t o f 6 4 p o s i t i o n s a r e i d e n t i c a l i n s e v e n o u t

o f t h e n i n e s e q u e n c e s ( F i g . 1 ) . I n f a c t , s o f e w p o s i t i o n s a r e n o t

c o n s e r v e d t h a t d i s c r e t e s e q u e n c e e l e m e n t s w i t h i n t h i s r e g i o n c a n

n o t b e d e f i n e d . U p s t r e a m o f t h a t r e g i o n , s e q u e n c e s b e c o m e

d i s s i m i l a r a n d r i c h i n a d e t i n e a n d t h y m i n e b a s e s .A c o m p a r i s o n o f s e q u e n c e s 5 ' o f t h e C . e l e g a n s U4 g e n e s

c h a r a c t e r i z e d i s m u c h l e s s s t r i k i n g t h a n t h a t o f t h e U2 g e n e s .R e l a t i v e l y f e w n u c l e o t i d e p o s i t i o n s a r e c o n s e r v e d b e t w e e n t h et h r e e p u t a t i v e U4 p r o m o t e r s s e q u e n c e d . I n o n l y o n e r e g i o n ,c e n t e r e d a r o u n d -50 ( s e e b e l o w ) , i s t h e r e a s t r e t c h o f c o n s e r v e dp o s i t i o n s . S i n c e t h e s e r e g i o n s a r e s o d i s s i m i l a r , m o r e U4p r o m o t e r s e q u e n c e s m u s t b e o b t a i n e d b e f o r e s u c h a s e q u e n c e

c o m p a r i s o n w i l l b e i n f o r m a t i v e .T h e t w o c l o n e d U6 g e n e s d i f f e r a t a s i n g l e p o s i t i o n o f t h e 1 5 9 b p

o f a v a i l a b l e u p s t r e a m s e q u e n c e , s u g g e s t i n g t h a t t h e y r e p r e s e n ta n e v o l u t i o n a r i l y r e c e n t d u p l i c a t i o n o r c o n v e r s i o n e v e n t . T h u sa c o m p a r i s o n o f t h e s e s e q u e n c e s i s o f l i t t l e v a l u e .

A c o m p a r i s o n o f a l l C . e l e g a n s s n R N A g e n e u p s t r e a m r e g i o n sr e v e a l e d a c o m m o n s e qu e n c e m o t i f w h i c h i s c e n t e r e d a t a b o u t

-50 r e l a t i v e t o t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e ( F i g . 5 ) . I n t h ea b s e n c e o f a s e q u e n c e r e s e m b l i n g t h e PSE f o u n d i n t h e s n R N Ap r o m o t e r s o f o t h e r o r g a n i s m s , we p r e s u m e t h i s s e q u e n c e

r e p r e s e n t s t h e t h e C . e l e g a n s v e r s i o n o f t h e P S E . T h e p o s i t i o no f t h e p r o p o s e d C . e l e g a n s PSE i s s i m i l a r t o t h e p o s i t i o n o f t h eP S E ' s d e f i n e d i n o t h e r o r g a n i s m s , w h i c h a r e l o c a t e d b e t w e e n

-40 a n d - 7 0 5 . I t i s p r e s e n t n o t o n l y i n t h e U l , U 2 , U 4 , a n dU S g e n e s o f C . e l e g a n s ( p r e s u m a b l y t r a n s c r i b e d b y p o l I I ) , b u ta l s o i n t h e U 6 g e n e s ( p r e s u m a b l y t r a n s c r i b e d b y p o l I I I . T h ep r e s e n c e o f t h e PSE i n b o t h o f t h e s e g e n e c l a s s e s i s a f u r t h e r




s i m i l a r i t y t o P S E ' s i n o t h e r o r g a n i s m s . A d d i t i o n a l l y , s e q u e n c e s

c o n f o r m i n g t o t h e C . e l e g a n s P S E a r e p r e s e n t i n a s i m i l a r p o s i t i o ni n t h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n s o f t h e S L R N A g e n e s i n C . e l e g a n s[ k n o w n t o b e t r a n s c r i b e d b y R N A p o l y m e r a s e I I ( B e k t e s h ,G o l o m b , a n d H i r s h , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) ] . T h e e l e m e n t i s

2 6 t o 2 9 n u c l e o t i d e s l o n g , d e p e n d i n g o n t h e g e n e . I n c o m p a r i s o n

t o o t h e r p r o m o t e r e l e m e n t s c h a r a c t e r i z e d , t h e C . e l e g a n s P S E

i s u n u s u a l l y l o n g , s u g g e s t i n g t h a t t w o t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s m a yb i n d t o i t . S i n c e t h e r e i s n o o b v i o u s s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e 5 'a n d 3 ' h a l v e s o f t h i s e l e m e n t , t h e s e w o u l d l i k e l y b e t w o d i f f e r e n tf a c t o r s .We n o t e t h a t s o m e p r o m o t e r r e g i o n s c o n t a i n m u c h b e t t e r

m a t c h e s t o t h e c o n s e n s u s t h a n d o o t h e r s . T h e U 1 , U 5 , a n d S L 2

g e n e s c o n t a i n t h e b e s t m a t c h e s , w h i l e S L I R N A g e n e s a r e t h em o s t d i f f e r e n t . P e r h a p s t h i s i s b e c a u s e a r e d u c e d a f f i n i t y f o r t h et r a n s c r i p t i o n f a c t o r ( s ) i s n e c e s s a r y t o p r e v e n t o v e r p r o d u c t i o n o fS L I RNA, s i n c e t h e S L I R N A g e n e s a r e h i g h l y r e i t e r a t e d ' 8 .

T h e o n l y s n R N A g e n e s f r o m o t h e r n e m a t o d e s t o b e r e p o r t e dt o d a t e a r e t h e S L I R N A g e n e s o f A s c a r i s s u u m a n d B r u g i a

m a l a y i i . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e g e n e s d o n o t c o n t a i n a s e q u e n c e

r e l a t e d t o t h e p r o p o s e d C . e l e g a n s P S E . A n i n v i t r o s y s t e m

d e r i v e d f r o m A s c a r i s t h a t a c c u r a t e l y t r a n s c r i b e s t h e A s c a r i s S L Ig e n e 4 6 , f a i l s t o t r a n s c r i b e t h e C . e l e g a n s snRNA g e n e s

( M a r o n e y , H a n n o n a n d N i l s e n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h u s

i t a p p e a r s t h a t t h e s n R N A g e n e c o n t r o l l i n g e l e m e n t s h a v e

d i v e r g e d s u r p r i s i n g l y f a r w i t h i n t h e n e m a t o d e p h y l u m .

T r a n s c r i p t i o n T e r m i n a t i o n S i g n a l s i n C . e l e g a n s s n R N AG e n e s

T h e f o r m a t i o n o f m a t u r e 3 ' e n d s o f v e r t e b r a t e U 1 , U 2 , a n d U4

h a v e b e e n s h o w n t o b e p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l e v e n t s . T r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t i o n o c c u r s u p t o 1 5 n u c l e o t i d e s d o w n s t r e a m o f t h e m a t u r e

3 ' e n d s o f t h e s n R N A s 4 1 ; t h e e x t r a n u c l e o t i d e s a r e p r o b a b l yt r i m m e d b y a n e x o n u c l e a s e 4 2 ' 4 7 . T r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t i o nr e q u i r e s t h r e e s e q u e n c e e l e m e n t s ; 1 ) s e q u e n c e s w i t h i n t h e

p r o m o t e r 4 7 ' 4 8 2 ) s n R N A - i n t e r n a l s e q u e n c e s 4 1 ' 4 8 ' 4 9 a n d 3 ) as e q u e n c e e l e m e n t 3 ' o f t h e t r a n s c r i p t i o n u n i t ( t h e 3 ' b o x ) 4 1 ' 4 7 .T h e b e s t d e f i n e d o f t h e s e e l e m e n t s i s t h e 3 ' b o x . Yuo e t a l 4 7f o u n d s e q u e n c e s s i m i l a r t o t h e h u m a n 3 ' b o x i n snRNA

g e n e s f r o m s e v e r a l o r g a n i s m s , a l l w i t h i n 3 5 n u c l e o t i d e s o ft h e b a s e c o r r e s p o n d i n g t o t h e m a t u r e 3 ' - e n d o f t h e s n R N A .

T h e y d e r i v e d a c o n s e n s u s s e q u e n c e f o r t h e 3 ' b o x :

G T T T N O 3 A A A G / A N N A G A ( G / A s i g n i f i e s a s i n g l e n u c l e o t i d ep o s i t i o n a n d i n d i c a t e s t h a t e i t h e r G o r A i s p r e s e n t t h e r e ) . N o

s e q u e n c e r e s e m b l i n g t h e 3 ' b o x c a n b e f o u n d 3 ' o f t h e C . e l e g a n sU 1 , U 2 , U4 o r U S g e n e s . T h e r e i s a c o n s e r v e d s e q u e n c e p r e s e n tj u s t 3 ' o f t h e U2 g e n e s w h i c h i s c a p a b l e o f f o r m i n g a s t e m - l o o ps t r u c t u r e . O t h e r w i s e , t h e r e a r e n o b l o c k s o f c o n s e r v e d s e q u e n c e si n t h e s e 3 ' r e g i o n s , e x c e p t f o r s e v e r a l b l o c k s o f A - a n d T - r i c h

s e q u e n c e s .U6 g e n e s a r e t r a n s c r i b e d b y p o l I I I . T h e t e r m i n a t i o n o f

t r a n s c r i p t i o n o f U6 g e n e s i s m e d i a t e d b y a r u n o f t h y m i d i n er e s i d u e s a t t h e 3 ' e n d s o f t h e g e n e s 5 . A r u n o f t h y m i d i n e s i s

p r e s e n t i n t h e C . e l e g a n s U 6 g e n e s s t a r t i n g a t p o s i t i o n + 9 8 .

ACKNOWLEDGEMENTS

We a r e g r a t e f u l t o C h r i s t i n e G u t h r i e a n d J o A n n W i s e f o r g i f t so f o l i g o n u c l e o t i d e s a n d t o S u s a n B e k t e s h , M e r i a m G o l o m b ,D a v i d H i r s h a n d T i m N i l s e n f o r s h a r i n g t h e i r u n p u b l i s h e d r e s u l t s .

We a r e a l s o g r a t e f u l t o W o l f G a l l w i t z f o r h i s h e l p w i t h DNAs e q u e n c i n g . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t G M 3 0 8 7 0 t o T . B .

f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s . J . D . T .

w a s s u p p o r t e d b y a R e s e a r c h S e r v i c e A w a r d GM7227 f r o m

N . I . G . M . S .

REFERENCES

1 . P a d g e t t , R . A . , G r a b o w s k i , P . J . , K o n a r s k a , M . M . , S e i l e r , S . , a n d S h a r p , P . A .( 1 9 8 6 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 5 , 1 1 1 9 - 1 1 5 0 .

2 . M a n i a t i s , T . a n d R e e d , R . ( 1 9 8 7 ) . N a t u r e 3 2 5 , 6 7 3 - 6 7 8 .

3 . S t e i t z , J . A . , B l a c k , D . L . , G e r k e , V . , P a r k e r K . A . , K r a m e r , A . , F r e n d e w e y , D .a n d K e l l e r , W . ( 1 9 8 8 ) i n B i r n s t e i l , M . L . ( e d . ) , S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f M a j o ra n d M i n o r S m a l l N u c l e a r R i b o n u c l e o p r o t e i n P a r t i c l e s . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w

Y o r k , 1 1 5 - 1 5 4 .

4 . R i e d e l , N . , W o l i n , S . , a n d G u t h r i e , C . ( 1 9 8 7 ) S c i e n c e 2 3 5 , 3 2 8 - 3 3 1 .

5 . P a r r y , H . D . , S c h e r l y , D . a n d M a t t a j , I . W . ( 1 9 8 9 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . , 1 4 ,1 5 - 1 9 .

6 . Z h u a n g , Y . , a n d W e i n e r , A . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 6 , 8 2 7 - 8 3 5 .

7 . P a r k e r , R . , S i l i c i a n o , P . G . , a n d G u t h r i e , C . ( 1 9 8 7 ) C e l l 4 9 , 2 2 9 - 2 3 9 .

8 . G r a b o w s k i , P . J . a n d S h a r p , P . A . ( 1 9 8 6 ) S c i e n c e 2 3 3 , 1 2 9 4 - 1 2 9 9 .

9 . G u t h r i e , C . a n d P a t t e r s o n , B . ( 1 9 8 8 ) . A n n u . R e v . G e n . 2 2 , 3 8 7 - 4 1 9 .

1 0 . K o n a r s k a , M . M . a n d S h a r p , P . A . ( 1 9 8 8 ) P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A 8 5 ,

5 4 5 9 - 5 4 6 21 1 . D a h l b e r g , J . E . a n d L u n d , E . ( 1 9 8 8 ) i n B i m s t e i l , M . L . ( e d . ) , S t r u c t u r e a n d

F u n c t i o n o f M a j o r a n d M i n o r S m a l l N u c l e a r R i b o n u c l e o p r o t e i n P a r t i c l e s .

S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k ,1 2 . N a y l o r , S . L . , Z a b e l , B . U . , M a n s e r , T . , G e s t e l a n d , R . a n d S a k a g u c h i , A . Y .

( 1 9 8 4 ) S o m . C e l l M o l . G e n . 1 0 , 3 0 7 - 3 1 3 .

1 3 . L i n d g r e n , V . , B e r n s t e i n , L . B . , W e i n e r , A . M . , a n d F r a n c k e , U . ( 1 9 8 5 ) M o l .C e l l . B i o l . , 5 , 2 1 7 2 - 2 1 8 0 .

1 4 . L i n d g r e n , V . , A r e s , M . , W e i n e r , A . M . a n d F r a n c k e , U . ( 1 9 8 5 ) N a t u r e 3 1 4 ,1 1 5 - 1 1 6 .

1 5 . B l a t t , C . , S a x e , D . , M a r z u l u f f , W . F . , L o b o , S . , N e s b i t t , M . a n d S i m o n , M . I .( 1 9 8 8 ) S o m . C e l l M o l . G e n . 1 4 , 1 3 3 - 1 4 2 .

1 6 . A l o n z o , A . , J o r c a n o , J . L . , B e c k , E . , H o v e m a n n , B . a n d S c h m i d t , T . ( 1 9 8 4 )J . M o l . B i o l . 1 8 0 , 8 2 5 - 8 3 6 .

1 7 . S o l l n e r - W e b b , B . ( 1 9 8 8 ) . C e l l 5 2 , 1 5 3 - 1 5 4 .

1 8 . K r a u s e , M . , a n d H i r s h , D . ( 1 9 8 7 ) C e l l 4 9 , 7 5 3 - 7 6 1 .

1 9 . B l u m e n t h a l , T . , a n d T h o m a s , J . D . ( 1 9 8 8 ) T r e n d s G e n e t i c s 4 , 3 0 5 - 3 0 8 .

2 0 . T h o m a s , J . D . , C o n r a d , R . C . a n d B l u m e n t h a l , T . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 4 , 5 3 3 - 5 3 9 .2 1 . K a r n , J . , B r e n n e r , S . , B a r n e t t , L . a n d C e s a r e n i , G . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d .

S c i . , U . S . A . 7 7 , 5 1 7 2 - 5 1 7 6 .

2 2 . M a n i a t i s , T . , F i t s c h , E . F . , a n d S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 2 ) M o l e c u l a r C l o n i n g : A

L a b o r a t o r y M a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r U n i v e r s i t y P r e s s , C o l d S p r i n gH a r b o r .

2 3 . M e a d , D . A . , S z c z e s n a - S k o r u p a , E . a n d K e m p e r , B . ( 1 9 8 6 ) P r o t e i n E n g . 1 ,6 7 - 7 4 .

2 4 . E m m o n s , S . W . , K l a s s , M . R . a n d H i r s h , D . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A

7 6 , 1 3 3 3 - 1 3 3 7 .

2 5 . G e l e i b t e r , J . ( 1 9 8 6 ) BRL F o c u s 9 , 5 - 8 .

2 6 . R u s s n a k , R . H . a n d C a n d i d o , P . M . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 , 1 2 6 8 - 1 2 7 8

2 7 . F o x , G . E . a n d W o e s e , C . R . ( 1 9 7 5 ) N a t u r e 2 5 6 , 5 0 5 - 5 0 7 .

2 8 . N o l l e r , H . F . a n d W o e s e , C . R . ( 1 9 8 1 ) . S c i e n c e 2 1 2 , 4 0 3 - 4 1 1 .

2 9 . J a m e s , B . D . , O l s e n , G . J . , L i u , J . a n d P a c e , N . R . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 2 , 1 9 - 2 6 .

3 0 . A r e s , M . a n d I g e l , A . H . , ( 1 9 8 8 ) i n C e c h , T . ( e d . ) M o l e c u l a r B i o l o g y o f R N A ,U C L A S y m p o s i a on M o l e c u l a r a n d C e l l u l a r B i o l o g y . A l a n R . L i s s , N e w

Y o r k 9 4 , 1 3 - 2 3 .3 1 . B r o w , D . A . , a n d G u t h r i e , C . G . ( 1 9 8 8 ) N a t u r e 3 3 4 , 2 1 3 - 2 1 8 .

3 2 . H a m m , J . , K a z m a i e r , M . a n d M a t t a j , I . W . ( 1 9 8 7 ) E M B O J . 6 , 3 4 7 9 - 3 4 8 5 .

3 3 . P a t t o n , J . R . , P a t t e r s o n , R . J . a n d P e d e r s o n , T . ( 1 9 8 7 ) M o l . C e l l . B i o l . 7 ,4 0 3 0 - 4 0 3 7 .

3 4 . S c h e r l y , D . , B o e l e n s , W . , va n V e n r o o i j , W . J . , D a t h a n , N . A . , H a m m , J . , a n d

M a t t a j , I . W . ( 1 9 8 9 ) EMBO J . 8 , 4 1 6 3 - 4 1 7 0 .

3 5 . T s c h u d i , C . , R i c h a r d s , F . F . , a n d U l l u , E . ( 1 9 8 6 ) N u c l . A c i d s R e s . 1 4 ,8 8 9 3 - 8 9 0 3 .

3 6 . G e r k e , V . , a n d S t e i t z , J . A . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 7 , 9 7 3 - 9 8 4 .

3 7 . T a z i , J . , A l i b e r t , C . , T e m s a m a n i , J . , R e v e i l l a u d , I . , C a t h a l a , G . B r u n e l , C . , a n d

J e a n t e u r , P . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 7 , 7 5 5 - 7 6 6 .

3 8 . Z u c k e r - A p r i s o n , E . , T h o m a s , J . D . , a n d B l u m e n t h a l , T . ( 1 9 8 8 ) N u c l . A c i d s

R e s . 1 6 , 7 1 8 8 .

3 9 . H a s h i m o t o , C . , a n d S t e i t z , J . A . ( 1 9 8 4 ) N u c l . A c i d s R e s . , 1 2 , 3 2 8 3 - 3 2 9 3 .




4 0 . K r o l , A . , L u n d , E . a n d D a h l b e r g , J . E . ( 1 9 8 5 ) E M B O J . 4 , 1 5 2 9 - 1 5 3 5 .

4 1 . C i l i b e r t o , G . , B u c k l a n d , R . , C o r t e s e , R . , a n d P h i l i p s o n , L . ( 1 9 8 5 ) EMBO J .

4 , 1 5 3 7 - 1 5 4 3 .

4 2 . M a t t a j , I . W . , a n d De R o b e r t i s , E . M . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 0 , 1 1 1 - 1 1 8 .

4 3 . V a n k a n , P . a n d F i l i p o w i c z , W . ( 1 9 8 8 ) EMBO J . 7 , 7 9 1 - 7 9 9 .

4 4 . V a n k a n , P . , E d o h , D . a n d F i l i p o w i c z , W . ( 1 9 8 8 ) N u c l . A c i d s R e s . 1 6 ,1 0 4 2 5 - 1 0 4 4 0 .

4 5 . H u a n g , X . - Y . a n d H i r s h , D . ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 6 ,

8 6 4 0 - 8 6 4 4 .4 6 . M a r o n e y , P . A . , H a n n o n , G . J . a n d N i l s e n , T . W . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A ,

8 7 , 7 0 9 - 7 1 3 .

4 7 . Y u o , C . - Y . , A r e s , M . a n d W e i n e r , A . M . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 2 , 1 9 3 - 2 0 2 .

4 8 . K o n i n g s , D . A . M . a n d M a t t a j , I . W . ( 1 9 8 7 ) E x p . C e l l R e s . 1 7 2 , 3 2 9 - 3 3 9 .

4 9 . S h u s t e r , E . O . , a n d G u t h r i e , C . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 5 , 4 1 - 4 8 .

1990 thomas the splicesomal snrnas of c. elegans

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