VISUAL & NON-VISUALPHOTORECEPTION

Regulation and Signal transduction

LIGHT INPUT PATHWAY

Light

LIGHT INPUT PATHWAY

Hypothalamus

LIGHT INPUT PATHWAY

PHOTORECEPTION IN MAMMALS RESIDES IN THE RETINA

• There are six classes of neuron in the mammalian retina: rods (1), cones (2), horizontalcells (3), bipolar cells (4), amacrine cells (5) and retinal ganglion cells (RGCs) (6). Theyhave a laminar distribution (OS/IS, outer and inner segment s of rods and cones; ONL,outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, innerplexiform layer; GCL, ganglion cell layer; NFL, optic nerve fibre layer).

PHOTORECEPTOR

Visual(Rhodopsin, cone opsins)

Non-Visual

PHOTORECEPTION IN MAMMALS RESIDES IN THE RETINA

• There are six classes of neuron in the mammalian retina: rods (1), cones (2), horizontalcells (3), bipolar cells (4), amacrine cells (5) and retinal ganglion cells (RGCs) (6). Theyhave a laminar distribution (OS/IS, outer and inner segment s of rods and cones; ONL,outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, innerplexiform layer; GCL, ganglion cell layer; NFL, optic nerve fibre layer).

Non-Visual(ipRGCs, Melanopsin)

-- 4040 KDaKDa

-- 348348 aaaa

-- SingleSingle chainchain (G(G proteinprotein--coupledcoupled receptorsreceptors supersuper family,family, GPCRs)GPCRs)

Extracellular NExtracellular N --terminusterminus

PHOTORECEPTORS PHOTORECEPTORS –– PHOTOPIGMENTS:PHOTOPIGMENTS:OPSINSOPSINS

Extracellular NExtracellular N --terminusterminus

7 Trans7 Trans--Membrane DomainMembrane Domain

Intracellular CIntracellular C--terminusterminus

IIIIII

IIIIII

IVIV VV

VIVI

VIIIVIII

VIIVII

ININ

CLASSIFIED BY WAVELENGTH OF ABSORPTION (SHORT, MEDIUM, LONG)

SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAY

SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAY

SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAY

HYPERPOLARIZATION

SIGNAL TRANSDUCTION BRAIN

EXTRACELLULAR SURFACE

Extracellular (interhelical) loopsExtracellular (interhelical) loops

E1 � Gly101 - Gly106E2 � Gly174 - Asn199E3 � His278 - Pro285

Connessione H2-H3Connessione H4-H5Connessione H6-H7

Importanti per un corretto folding della proteina che consente un normale processamento e legame del retinale

EXTRACELLULAR SURFACE

Cys110-Cys187Stabilità e corretto folding della proteina.

Extracellular (interhelical) loopsExtracellular (interhelical) loops

E1 � Gly101 - Gly106E2 � Gly174 - Asn199E3 � His278 - Pro285

Connessione H2-H3Connessione H4-H5Connessione H6-H7

Importanti per un corretto folding della proteina che consente un normale processamento e legame del retinale

EXTRACELLULAR SURFACE

β4-strand(Ser186-Cys187-Gly188-Ile189)

Forma il pavimento extracellulare del retinal-binding pocket

Extracellular (interhelical) loopsExtracellular (interhelical) loops

E1 � Gly101 - Gly106E2 � Gly174 - Asn199E3 � His278 - Pro285

Connessione H2-H3Connessione H4-H5Connessione H6-H7

Importanti per un corretto folding della proteina che consente un normale processamento e legame del retinale

TRANS-MEMBRANE DOMAIN

H1 � Glu35 - Gln64H2 � Pro71 - His100H3 � Pro107 - Val139H4 � Asn151 - Val173

H5 � Asn200 - Gln225H6 � Glu247 - Thr277H7 � Ile286 - Ile306

Core rigido

Eliche mobili

Movimento associato

all’attivazione del recettore

TRANS-MEMBRANE DOMAIN

H1 � Glu35 - Gln64H2 � Pro71 - His100H3 � Pro107 - Val139H4 � Asn151 - Val173

H5 � Asn200 - Gln225H6 � Glu247 - Thr277H7 � Ile286 - Ile306

Core rigido

Eliche mobili

Motivo D(E)RYE134-R135-Y136

(conservato tra A-GPCRs)

Interazioni tra le eliche H3, H5 e H6 che mantengono lo

stato inattivo del recettore

Legame a Gt

Stabilizzazione stato inattivo recettore

Motivo NPXXYN302-P303-X-X-Y306(conservato tra A-GPCRs)

Movimento associato

all’attivazione del recettore

CYTOSOLIC SURFACE

C1 � His65 -Thr70C2 � Cys140 - Glu150C3 � Leu226 - Ala246 Interazione

Op-G t

CYTOSOLIC SURFACE

C1 � His65 -Thr70C2 � Cys140 - Glu150C3 � Leu226 - Ala246 Interazione

Op-G t

2 domini strutturali2 domini strutturali

Segmento terminale ���� Lys325 - Ala348

Siti responsabili dello spegnimento del segnale

H8 (An310 – Cys323)

Interazione Op-Gt

Interazioni Op-fosfolipidi

CC--terminale (Met308 terminale (Met308 -- Ala348)Ala348)

RETINALL’associazione dell’11-cis-retinale all’opsina avviene

mediante un legame tipo BASEBASE DIDI SCHIFFSCHIFF

Legame tra il gruppo Legame tra il gruppo aldeidico dell’11aldeidico dell’11--ciscis--retinale retinale e il gruppo amminico e il gruppo amminico εε della della

Lys296Lys296 (elica H7)(elica H7)

Residuo fondamentale Residuo fondamentale �� la sua mancanza la sua mancanza genera una proteina costitutivamente attivagenera una proteina costitutivamente attiva

RETINALL’associazione dell’11-cis-retinale all’opsina avviene

mediante un legame tipo BASEBASE DIDI SCHIFFSCHIFF

Legame tra il gruppo Legame tra il gruppo aldeidico dell’11aldeidico dell’11--ciscis--retinale retinale e il gruppo amminico e il gruppo amminico εε della della

Lys296Lys296 (elica H7)(elica H7)

Residuo fondamentale Residuo fondamentale �� la sua mancanza la sua mancanza genera una proteina costitutivamente attivagenera una proteina costitutivamente attiva

RETINALL’associazione dell’11-cis-retinale all’opsina avviene

mediante un legame tipo BASEBASE DIDI SCHIFFSCHIFF

Legame tra il gruppo Legame tra il gruppo aldeidico dell’11aldeidico dell’11--ciscis--retinale retinale e il gruppo amminico e il gruppo amminico εε della della

Lys296Lys296 (elica H7)(elica H7)

Residuo fondamentale Residuo fondamentale �� la sua mancanza la sua mancanza genera una proteina costitutivamente attivagenera una proteina costitutivamente attiva

RETINAL

The different sensitivities are due tomodest differences in the opsinsequence that change the side groupsin the pocket. Key, charged amino acidsthat are important in this tuning are inposition 180, 197, 277, 285 and 308.

Transducin (G t)

In seguito all’attivazione, vengono indotte delle modificazioni conformazionali nel versantecitoplasmatico del recettore che creano un sito di legame per la proteina G TRASDUCINA (Gt)

Gt

Tα � 39 KDa

Tβ � 36 KDa

Tγ � 8 KDa

Estremità C-terminale coinvolta nel legame al recettore attivato

Glu113 Glu113 -- Phe350Phe350

RhodopsinRhodopsin--binding sitebinding site

Cys321Importante nel Se sostituita, Tα perde

la capacità di legare

T-GDP Bassa affinità per Rh* e bassa affinità per PDE

TT--GTPGTP Alta affinità per Rh* e alta affinità per PDE

Cys321legame a Rh*

la capacità di legare

Rh*

due forme

Nel legame di Gt, a livello di Rh, sono coinvolti i loop citoplasmatici C3 e C4, compresa l’α-elica

anfipatica H8 � residui essenziali sono Glu134 e Arg135, situati nel motivo conservato D(E)RY,

dimostrato dal fatto che la loro sostituzione con aa neutri impedisce l’interazione Rh*-Gt

Idrolisi di GTP da parte di TαInattivazione di R*Rigenerazione di R

Luce

GDP

GTP

Rh

α β

α

β

γ

γγPDEi

T-GDP

α

β

γα β

γγ

Tα-GTP

TβγPDEi

α

β

γα β

γγPDEi

R*-T-GDPTransducin (G t)

γγ

β

γα β

α

α

cGMP 5’-GMP

Tα-

cGMPfosfodiesterasi

H2O H+

Ca2+

K+

4Na+

[Ca2+] < 50 nM

cGMP

cGMP

Ca2+

K+

4Na+

[Ca2+] = 500 nM

Ca2+

Segmento esternoR*

H

-2OP

O

O

H H

Guanina

H

O

CH2

OH

5’

3’

cGMP

O

H H

Guanina

H

OH

-23OPOCH2

OH

H

5’-GMP IperpolarizzazioneIperpolarizzazione

Tα-GTP-PDEγ

R*

RECOVERY & ADAPTATION

• Attività GTPasica della subunità α della trasducina• La subunutà inibitrice della fosfodiesterasi si riassocia

all’enzima• Attivazione della guanilil ciclasi (inibita da elevate

concentrazioni di Ca Ca 2+2+ superiori a 100nm)concentrazioni di Ca Ca 2+2+ superiori a 100nm)• Attivazione della rodopsina chinasi (inibita dalla proteina

che lega il Ca Ca 2+2+ in presenza di elevate concentrazioni di calcio)

•• I livelli di Ca I livelli di Ca 2+ 2+ regolano la velocità con cui il regolano la velocità con cui il sistema viene riportato allo stato inizialesistema viene riportato allo stato iniziale

ipRGCs are the principal conduits for non-image-for ming vision

ipRGCs are the principal conduits for non-image-for ming vision

ipRGCs are the principal conduits for non-image-for ming vision

The ipRGC fibres in the brain decrease in aDTA mice

X-gal Cholera toxin

/

Mice lacking ipRGCs (Melanopsin) do not photoentrai n or mask

Light-Dark cycle

ShiftedLight-Dark cycle

ConstantLight Regime

Mice lacking ipRGCs (Melanopsin) do not photoentrai n or mask

Masking

Neuro-2a cell transfected with 6xHis-tagged human melanopsin–EGFP vector.EGFP fluorescence (a)anti-tetra-His immunoreactivity (b).

Expression of Melanopsin renders mammalian cells li ght-sensitive

RecordingsRecordings fromfrom aa melanopsinmelanopsintransfectedtransfected cellcell preincubatedpreincubated withwith 99--ciscis--retinaldehyderetinaldehyde exposedexposed toto 420420--nmnm lightlightretinaldehyderetinaldehyde exposedexposed toto 420420--nmnm lightlight((1010 s)s) revealedrevealed intensityintensity--dependentdependentinwardinward currentcurrent..

Expression of Melanopsin renders mammalian cells li ght-sensitive

Neuro-2a cell transfected with 6xHis-tagged human melanopsin–EGFP vector.EGFP fluorescence (a)anti-tetra-His immunoreactivity (b).

RecordingsRecordings fromfrom aa melanopsinmelanopsintransfectedtransfected cellcell preincubatedpreincubated withwith 99--ciscis--retinaldehyderetinaldehyde exposedexposed toto 420420--nmnm lightlight

MelanopsinMelanopsin absorbsabsorbs inin thetheblueblue spectrumspectrum

retinaldehyderetinaldehyde exposedexposed toto 420420--nmnm lightlight((1010 s)s) revealedrevealed intensityintensity--dependentdependentinwardinward currentcurrent..

Expression of Melanopsin renders mammalian cells li ght-sensitive

TheThe 360360--nmnm andand 420420--nmnm stimulistimuli givegive nearnear--equivalentequivalent responsesresponses whereaswhereas responsesresponsestoto thethe longerlonger wavelengthswavelengths isis progressivelyprogressivelyattenuatedattenuated

Spectral sensitivity

Expression of Melanopsin renders mammalian cells li ght-sensitive

TheThe 360360--nmnm andand 420420--nmnm stimulistimuli givegive nearnear--equivalentequivalent responsesresponses whereaswhereas responsesresponsestoto thethe longerlonger wavelengthswavelengths isis progressivelyprogressivelyattenuatedattenuated

Spectral sensitivity

Summary

- The only neurons, in mammals, that are directly sensitive t o light are thephotoreceptor cells (Rod, cones and ipRGCs).

- Light striking the retina initiates a cascade of chemical a nd electricalevents, mediated by Opsins, that ultimately trigger nerve i mpulses to thebrain.

-Opsins belong to the GPCRs, characterized by a conserved 7TM d omainmotif .motif .

- Binding of the chromophore, 11-cis retinal, is essential in the mechanismof light perception.

- Phototransduction cascade involves different protein (Tr ansducin,PDE….) leading to the hyperpolarization of the cellular membr ane.

Summary II

- ipRGCs, expressing melanopsin, are responsible for the non -image-forming vision.

- ipRGCs fibres project directly to the SCN, modulating physi ologyand behaviour

- Ablation of ipRGCs abolish photoentrainment in mice.

- Melanopsin is the photopigment responsible of the signaltransduction to the SCN.

StryerStryer,, BIOCHEMISTRYBIOCHEMISTRY ((66THTH EDITION)EDITION)pagpag.:.: 353353,, 859859--860860

LehningerLehninger,, PRINCIPLEPRINCIPLE OFOF BIOCHEMISTRYBIOCHEMISTRY ((55THTH

EDITION)EDITION)pagpag.:.: 461461--465465

MelyanMelyan,, ZZ..,, EE.. EE.. TarttelinTarttelin,, etet alal.. ((20052005)).. "Addition"Addition ofof humanhuman melanopsinmelanopsinrendersrenders mammalianmammalian cellscells photoresponsivephotoresponsive.."" NatureNature 433433((70277027)):: 741741--55..

GulerGuler,, AA.. DD..,, JJ.. LL.. EckerEcker,, etet alal.. ((20082008)).. ""MelanopsinMelanopsin cellscells areare thethe principalprincipalconduitsconduits forfor rodrod--conecone inputinput toto nonnon--imageimage--formingforming visionvision.."" NatureNature 453453((71917191))::102102--55..