Dengue disease is an increasing global health problem that threatens one-third of the world’s population. To control this emerging arbovirus, an efficient preventive vaccine is still needed. Because four serotypes of dengue virus (DV) coexist and antibody-dependent enhanced infection may occur, most strategies developed so far rely on the administration of tetravalent formulations of four live attenuated or chimeric viruses. Here, we evaluated a new strategy based on the expression of a single minimal tetravalent DV antigen by a single replicating viral vector derived from pediatric live-attenuated measles vaccine (MV). Wegenerated a recombinantMVvector expressing aDVconstruct composed of the four envelope domain III (EDIII) from the four DV serotypes fused with the ectodomain of the membrane protein (ectoM). After two injections in mice susceptible to MV infection, the recombinant vector induced neutralizing antibodies against the four serotypes of dengue virus. When immunized mice were further inoculated with live DV from each serotype, a strong memory neutralizing response was raised against all four serotypes. A combined measles-dengue vaccine might be attractive to immunize infants against both diseases where they co-exist.

Penyakit Dengue merupakan masalah kesehatan yang semakin meningkat dan mengancam 1/3 dari populasi dunia. Untuk mengontrol penyebaran arbovirus, sebuah vaksin pencegahan dibutuhkan. Karena ada 4 serotip dari virus dengur dan adanya antibodi dependen dapat menyebabkan terjadinya infeksi, rencana yang dikembangkan hingga saat ini adalah dengan pemberian formula tetravalent kepada 4 dari chimeric virus. Disni peneliti memantau rencana/strategi baru berdasarkan tetravalent DV antigen minimal dengan mengganti derivad tunggal dari vector replikasi virus dari measles vaccine (MV) hidup yang dilemahkan. Peneliti membuat Vector MV yang digabungkan dengan konstruksi aDV yang mengandul 4 domain envelpoe III (EDIII) dari 4 serotipe DV yang digabungkan dengan ectodomain dari membran protein (ecToM). Setelah 2 injeksi pada mencit yang dicurigai mengalami infeksi MV, vector kombinasi yang mengandung antibodi terhadap 4 serotip virus dengu dimasukkan. Ketika mencit yang terimmunisasi disuntik dengan DV hidup dari setiap serotip, memori yang kuat terhadap respon netralisasi meningkat terhadpa keempat serotipe virus. Measles-Dengue Vaccine kombinasi mungkin dapat berguna pada immunitas bayi terhadap kedua penyakit tersebut.

Dengue fever is currently the most significant arboviral disease, and one of the most severe public health problems that threatens 2.5 billion people in tropical and subtropical areas, infects an estimated 50–100 million people and causes about 25,000 death each year [1].Dengueviruses (DV) are enveloped, positive-stranded RNA viruses. The DV complex consists of four closely related but antigenically distinct DV serotypes, members of the Flaviviridae family [2]. Infection by one serotype provides protection against this serotype, but increases the risk of developing severe disease if infection by a different serotype occurs, possibly through an antibody-dependent enhancement (ADE) by cross-reactive DV antibodies [3,4]. Despite decades of efforts, no licensed vaccine against dengue is currently available. A preventive dengue vaccine needs to protect unexposed individuals against all four serotypes of DV. It must be tetravalent, safe for young babies, provide long-lasting protective immunity, and be cost-effective. For these reasons, most of the strategies developed so far rely on tetravalent formulations of four live attenuated vaccines or four chimeric viruses based on the exchange of homologous structural genes between different flaviviruses [5–8]. Both strategies have shown good immunogenicity in clinical trials [9–13] and are progressing to late clinical trials. However, their development is complicated by

problems of interference between the serotypes, and difficulty to optimize the formulation [14–17].

Demam dengue saat i ni merupakan penyakit akibat arbovirus yang signifikan, dan salah satu dari masalah kesehatan berat yang mengancam 2.5 miliar orang pada daerah torpis dan subtropis, menginfeksi sekitar 50-100 juta orang dan menyebabkan 25.000 kematian setiap tahunnya. Virus Dengue (DV) memiliki envelope, dan merupakan virus RNA positif-stran/ Kompleks dari DV mengandung 4 antigen serotipe dari DV, yang menunjukkan hubungan dengan family Flaviviridae. Infeksi oleh salah satu dari serotip ini dapat menyebabkan munculnya proteksi terhadap serotip lain, namun dapat meningkatkan resiko terjadi penyakit infeksi yang parah oleh serotipe lainnya, kemungkinan karena antibody-dependent enchancement (ADE) oleh reaksi silang dari antibodi DV. Walaupun sudah dilakukan percobaa selama 1 dekade lebih, tidak tersedia vaksin yang diakui untuk dengue. Sebuah vaksin dengue untuk pencegahan membutuhkan proteksi terhadap individu yang tidak terkena virus terhadap 4 serotipe dari DV. Biasany hal ini aman terhadap bayi, dan menimbulkan imunitas protektif untuk jangka lama, dan sangat menghemat biaya. Karena alasan ini, kebanyakan rencana yang dikembangkan terhadap formulasin tetravalen dari 4 tipe vaksin hidup atau 4 chimeric virus berdasarkan penggantian dari struktur gen homologgus antara beberapa flavivirus. Kedua strategi ini sudah menunjukkan hasil yang baik berdasarkan dari percobaan klinis dan masih dilakukan terhadap percobaan klinis lanjut. Nmun perkembangan ini menunjukkan banyak masalah dalam pengenalan dari serotip dan kesulitan untuk mengoptimalkan formula ini. To avoid interference problems while still benefiting of the advantageous capacity of the live vaccines, one strategy is to express a single tetravalent DV antigen by a single replicating viral vector. The DV antigen would be of limited size and induce long-lasting protective immunity against DV infection regardless the serotype. The crystal structures of the envelope E protein from TBEV [18], DV1 [19], DV2 [20], DV3 [21] and WNV [22,23] have revealed that it contains three distinct ectodomains EDI, EDII and EDIII. The central EDII contains immunodominant epitopes close to the fusion loop. These epitopes elicit cross-reactive subneutralizing antibodies that can favor the risk of ADE [24–26]. On the opposite, the C-terminal immunoglobulin-like EDIII, a 100 amino-acid sequence stabilized by a disulfide bridge, is involved in receptor binding and contains critical epitopes that elicit both type-specific antibodies (i.e., that cross-neutralize DV but not other Flaviviruses), and serotype-specific antibodies (i.e., that neutralize one DV serotype but not another) [27–33]. For these reasons, the EDIII has emerged as the antigen of choice to develop a tetravalent DV vaccine [34–39].

Untuk menghindari masalah ini dan juga untuk mendapatkan keuntungan terhadap kapasitas dari vaksin hidup ini, salah satu strategi adalah dengan mengealkan antigen tunggal tetravalen DV dengan replikasi vektor virus tunggal. Antigen DV akan terbatas ukurannya dan akan menyebabkan efek protektif pada immune untuk jangka panjang terhadap infeksi DV terkait dari serotipe virus. Struktur kristal dari envelope E protein berasal dari TBEV, DV1, DV2, DV3, dan WNV sudah menunjukkan bahwa hal ini terkandung pada ectodomains EDI, EDII, dan EDIII, sebuah jembatan 100 asam amino yang stabil, dan melibatkan pengikatan reseptor serta mengandul epotopes penting untuk memperoleh antibodi spesifik (contoh untuk netralisasi silang DV namun tidak bisa pada flavivirus lainnya), sebuah antibodi spesifik antigen (contoh untuk netralisasi dari serotipe DV namun tidak pada serotipe lainnya). Berdasarkan hal ini, EDIII muncul sbagai pilihan dari antigen untuk mengembangkan vaksin tetravalen DV.

With the aim to develop an affordable vaccine that could be used in young children living in tropical areas, we propose a new strategy based on the expression of a minimal tetravalent DV antigen by a vector derived from pediatric live-attenuated measles vaccine (MV). Such a combined measles-dengue vaccine might be attractive to immunize children against measles and dengue in areas where both diseases co-exist. We previously developed a vector derived from the live-attenuated Schwarz strain of measles virus (MV) [40]. MV vaccine is a live-attenuated negative-stranded RNA virus proven to be one of the safest and most effective human vaccines. Produced on a large scale in many countries and distributed at low cost through the extended program on immunization (EPI) of WHO, this vaccine induces life-long immunity to measles after one or two injections [41–43]. We previously showed that MV vector stably expressed different proteins from HIV and flaviviruses and induced strong and long-term specific neutralizing antibodies and cellular immune responses, even in presence of preexisting immunity to MV [44–47]. In collaboration with an industrial vaccine manufacturer, we initiated a clinical development to build GMP and regulatory logistics for a recombinant MV-HIV vector and to evaluate its safety and immunogenicity in humans with preexisting immunity to measles. To adapt this technology to dengue vaccine and as a proof-of-concept,wepreviously designed and inserted into MV vector a minimal combined dengue antigen composed of the envelope domain III (EDIII) fused to the ectodomain of the membrane protein (ectoM) from DV serotype-1 [48]. Immunization of mice resulted in a long-term production of DV1 serotype-specific neutralizing antibodies that were not cross-reactive with the other DV serotypes. The presence of the pro-apoptotic sequence ectoM was critical to the immunogenicity of EDIII, its adjuvant capacity correlating with its ability to promote the maturation of dendritic cells and the secretion of proinflammatory and antiviral cytokines and chemokines involved in adaptive immunity

Dengan tujuan untuk mengembangkan vaksin yang terjangkau yang dapat digunakan pada anak-anak yang hidup di daerah tropis, peneliti menyarankan strategi baru berdasarkan pemaparan dari antigen tetravalen DV minimal dengan derivat vector dari measles vaccine (MV) hidup dari anak. Kombinasi dari measles-dengue vaccine dapat menarik iimmunitas anak terhadap measles dan dengue pada daerah dimana penyakit ini sering menyerang. Peneliti sebelumnya sudah mengembangkan derivat vektor dari strain Measles Virus Schwarz yang hidup.Vaksin MV merupakan virus strain negatif RNA hidup yang terbukti sebagai salah satu dari vaksin yang teraman dan paling efektif untuk manusia. Vaksin ini dibuat dalam jumlah banyak di berbagai negara dan didistribusikan dengan biaya yang rendah melalui Extended Program on Immunization (EPI) dari WHO, vaksin ini dapat membentuk immunitas jangka panjang terhadpa measles setelah 1-2x injeksi. Peneliti sudah menunjukkan bahwa Vektor MV mengandung berbagai protein stabil dari HIV dan flavivirus dan menyebabkan pembentukan antibodi netral spesifik jangka panjang yang kuat disertai dengan respon immunitas, walaupun sebelumnya sudah ada terbentuk immunitas dari MV. Dengan kerjasama dari perusahaan industri vaksin, peneliti menunjukkan pengembangan klinis untuk membangun GMP dan logistik reguler untuk vektor kombinasi MV-HIV dan mengevaluasi kemanannya dan immunogennya pada manusia yang mempunyai immunitas terhadapmeasles sebelumnya. Untuk menyesuaikan teknologi vaksin dengue dan konsep yang belum terbukti ini, peneliti merancang dan memasukkan antigen dengue kombinasi yang mengandung envelope domain III (EDIII) yang digabungkan dengan ectodomain dari membran protein dari serotipe DV. Mencit diberikan immunisisasi untuk pembentukan jangka panjang dari antibodi netral spesifik serotipe DV1 tanpa reaksi silang dengan serotipe DV ainnya. Adanya

pro-apoptosis yang terjadi pada ecToM sangat penting terhadpa immunogen dari EDIII, kapasitas penambahan ini ebrhubungan dengan kemampuannya untuk membantu maturasi sel dendrit dan sekresi dari mediator inflammasi dan sitokin antriviral serta kemokin yang berperan terhadap immunitas adaptif.

In the present work, we designed tetravalent DV antigens incorporating the EDIII of DV1-4 in combination with the pro-apoptotic ectoM sequence and generated three recombinant MV vectors expressing these antigens. In a mouse model of MV infection, we demonstrated that one of the recombinant vectors is efficient at inducing neutralizing antibodies against DV of the four serotypes.

Dalam penelitian ini, peneliti merancang antigen tetravalent DV yang digabungkan dengan EDIII dari DV1-4 dalam kombinasi dengan pro-apoptotic ectoM dan membentuk vektor MV kombinasi dari antigen tersebut. Pada model mencit dengan infeksi MV, peneliti memasukkan satu dari vektor kombinasi ini dan menunjukkan efisiensi dalam membentu neutralizing antibodies terhadap DV dari 4 serotipe yang ada.

Materials and methods2.1. Cell cultureVero (African green monkey kidney) cells were maintained in DMEM Glutamax (Gibco-BRL) supplemented with 5% heatinactivated fetal calf serum (FCS, Invitrogen, Frederick, MD). Helper 293-3-46 cells (a gift from M.A. Billeter, Zurich University) used for viral rescue were grown in DMEM/10% FCS and supplemented with 1.2mg of G418 per ml.

Materi dan Metode2.1 Kultur SelSel Vero (ginjal African Green Monkey) dipertahankan dalam DMEM Glutamax (Gibco-BRL) yang ditambahkan dengan 5% heatinactivated fetal calf serum (FCS, invitrogen, Frederick, MD). Sel Helper 203-3-46 (Hadiah dari Universitas M.A Bileter Zurich) digunakan untuk pengembangan virus yang tuumbuh dalam DMEM 10% FCS dan ditambahkan dengan 1.2 mg G418/ml

2.2. Construction of pTM-MVSchw-TetraA, pTM-MVSchw-Tetra B and pTM-MVSchw-TetraC plasmidsThe plasmid pTM-MVSchw, which contains an infectious MV cDNA corresponding to the anti-genome of the Schwarz MV vaccine strain, has been described elsewhere [40]. The tetrameric antigens have been generated by chemical synthesis by Genecust. The antigens TetraA, TetraB and TetraC have been designed based on the sequences encoding the EDIII from the E protein (aa 295–394) and the ectodomain of the membrane M protein (aa 1–40) from the M protein from strain FGA/89 French Guiana for serotype DV1 [80], Jamaica/N.1409 for DV2 (Genbank accession no. M20558) [81], DV3 H87 (WHO reference strain, Genbank accession no. M93130) and 63632/76 Burma for DV4. When indicated in the construction (see Fig. 1), the original furin-like cleavage site RRDKR was introduced. All the antigens contain in the 5_ end the human calreticulin-derived endoplasmic reticulum targeting signal sequence contained in the pEGFP-RE vector (Clontech). The sequences respect the “rule of six”, which stipulates that the number of nucleotides into the MV genome must be a multiple of 6 and contain the BsiWI digestion site at the 5_ end, and the BssHII digestion site at the 3_ end. The sequences have been optimized

for measles virus expression in mammalian cells. The cDNA antigen sequences corresponding to TetraA, TetraB and TetraC were received from Genecust in the pUC57 vector, and inserted into BsiWI/BssHII-digested pTM-MVSchw-ATU2, which contains an additional transcription unit (ATU) between the phosphoprotein (P) and the matrix (M) genes of the Schwarz MV genome [40]. The resulting plasmids were designated as pTM-MVSchw-TetraA, pTM-MVSchw-TetraB and pTM-MVSchw-TetraC

2.2 Pembuatan dari Pt,-mvsCHW-tETRa, Otm-mvSchw-Tetra Band dan pTM-MVSchw-Tetra C PlasmidsPlasmid dari Ptm-MVSchw yang mengandung MV cDNA yang bertanggung jawab terhadpa anti genome dari Strain vaksin Schwarz MV sudah dideskripsikan sebelumnya. Tetrameric Antigen dibentuk dengan sintesis kimiawi oleh Genecust. Antigen TetraA, Tetrab, DAN tETRAc dirancang berdasarkan dari French Guiana dari serotipe DV1, Jamaica/N. 1409 untuk DV2 (Genbank accession no M20558),DV3 H87 (WHO reference strain, Genbank accession no. M93130) dan 63632/76 Burma untuk DV4. Ketika dilakukan kontruksi, sisi furine dari RRDKR diperkenalkan. Semua antigen yang mengandung 5_end human derivat calreticulin reitkulum tendoplasma targeting signal yang terkandung dalam Pegfp-RE vector (Clontech). Sekuens dari rule of six, yang menggambarkan jumlah dari nucleotid genome MV dimana harus berjumlah kelipatan dari 6 dan mengandung sisi digestif BsiWI pada 5_end, dan Area digenstif BssHII pada 3_end. Sekuensi harus dioptimalkan untuk ekpresi virus campak pada sel mamalia. Sekuens antigen cDNA yang bertanggung jawab pada Tetra A, Tetra B, dan Tetra C didapatkan dari Genecust pada vektor Puc57, dan dimasukkan ke dalam BsiWi/BssHII0digested PTM-MVSchw-ATU2, dimna mengandung additional transcription unit (ATU) antara phospoprotein (P) dan matriks (M) gen dari Genom MV Schwarz. Hasil dari plasmid yang dirancang ini seperti pTM-MVSchw-TetraA, pTM-MVSchw-TetraB dan pTM-MVSchw-TetraC

2.3. Rescue of recombinant MV-TetraA, MV-TetraB andMV-TetraC from the cloned cDNA Rescue of recombinant Schwarz MV from the plasmids pTMMVSchw- TetraA, pTM-MVSchw-TetraB and pTM-MVSchw-TetraC was performed as previously described [40] using the helper-cellbased rescue system described by Radecke et al. [82] and modified by Parks et al. [83]. The titers of MV-TetraA, MV-TetraB and MVTetraC were determined by an endpoint limit dilution assay on Vero cells. The TCID50 was calculated by using the Kärber method.

2.3 Rescue dari recombinant MV-TetraA, MV-TetraB dan MV-TetraC dari cDNA klonRescue (menyelamatkan) recombinan dari Schwarz MV berasal dari plasmin pTMMVSchw- TetraA, pTM-MVSchw-TetraB dan pTM-MVSchw-TetraC dilakukan seperti yang sudah dijelaskan di atas dengan menggunakan sistem sel berbasis helper (penolong) yang sudah dideskripsikan Radecke et al. Dan dimodifikasi oleh Parks et Al. Titer dari MV-TetraA, MV-TetraB dan MVTetraC ditentukan dengan menggunakan penilaian dilusi endpoint limit dari sel Vero. TCID50 dihitung menggunakan metode Karber

2.4. Production of recombinant EDIII proteins in Drosophila S2 cellsThe EDIII PCR products described above were cloned into pMT/Bip/V5-His A plasmid (Invitrogen) between BglII and NotIrestriction sites. The clones were validated by sequencing. Drosophila S2 cells (Invitrogen) were transfected by these plasmids using the Calcium Phosphate Transfection Kit

(Invitrogen). Transfected cells were selected by adding 25_g/ml blasticidin. The EDIII protein production was induced by adding 750_MCuSO4. Cell culture supernatant was filtered on 0.2_Mfilters before concentration on10,000-MWCoVivaspin columns (Vivasciences) eluted with PBS. Recombinant proteins were semi-quantified by Western blot using the MAb 9D12 reactive to EDIII from DV [31].

2.4 Produksi dari rekombinan protein EDIII pada Sel Drosophila S2Produk PCR EDIII yang dijelaskan diatas merupakan klon dari pMT/Bip/V5-His A plasmid (Invitrogen) antara BglII dan NotI restriction sites. Klon ini dipastikan mengalami sekuensi. Sel Drosophila S2 (Invitrogen) dipindahkan oleh plasmid ini menggunakan Calcium Phospate Transfection Kit (Invitrogen). Sel yang dipindahkan ini dipilih dengan menggunakan 25_g/ml blasticidin. Produksi protein EDIII dilakukan dengna menambah 750_McuSO4. Kultur sel difiltrasi pada 0.2_Mfilter dengan kosentrasi 10.000-MWCoVivaspin Collumns (Vivascience) yang ditambah dengan PBS. Protein rekombinan ini masih belum terhitung oleh Western blot dengan menggunakan the MAb 9D12 reactive to EDIII dari DV

2.5. Production of recombinant EDIII proteins in E. ColiThe following DV strains from the collection of Institut Pasteur were used: strain FGA/89 French Guiana for serotype DV1 [84], Jamaica/N.1409 for DV2 [81], PaH881/88 Thailand for DV3 and 63632/76 Burma for DV4. The Escherichia coli strain BL21 (DE3) and SB medium have been described [85]. Plasmids pLB11, pLB12, pLB13, pLB14, coding respectively for EDIII from DV serotypes 1, 2, 3, and 4 (residues 296–400) with an hexahistidine tag in Cterm, under control of the T7 promoter and pelB signal sequence, were constructed by insertion of RT-PCR products obtained with primers specific for EDIII, in plasmid pET20b+ (Novagen) [70]. The DV-EDIII-H6 recombinant proteins were produced from these plasmids in E. coli BL21(DE3). Bacteria were grown at 24 ◦C in SB medium with ampicillin (200_g/mL) until A600nm = 1.5–2.0 and then induced for 2.5 h with 1mM IPTG to obtain the expression of the recombinant genes. The purification of DV-EDIII-H6 proteins from bacteria’s periplasmic fluid was performed by chromatography on a NiNTA resin (Qiagen, Hilden) and concentration determined by absorbance spectrometry as previously described [69]. The protein fractions were analyzed by SDS-PAGE in reducing conditions. The fractions that were homogeneous at >95%, were pooled, dialyzed against 50mMTris–HCl, pH 8.0, 50mMNaCl, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 ◦C.

2.5 Produksi dari Rekombinan EDIII protein pada E ColiStrain DV yang berasal dari institut Pasteur digunakan. strain FGA/89 French Guiana untuk serotype DV1 [84], Jamaica/N.1409 untuk DV2 [81], PaH881/88 Thailand untuk DV3 and 63632/76 Burma untuk DV4. Strain Escherichia coli BL21 (DE3) dan medium SB digunakan dalam hal ini. PlasmidspLB11, pLB12, pLB13, pLB14, dengan kode untuk EDIII from DV serotypes 1, 2, 3, dan 4 (residu 296–400) dengan hexanistidine pada Cterm, dibawah pengawasan dari T7 promoter dan pelB signal sequence,dikontrusi dengan memasukkan produk RT-PCR yang didapatkan langsung secara spesifik untuk EDIII, pada plasmid pET20b+ (Novagen). Protein DV-EDIII-H6 rekombinan dihasilkan dari plasmid pada E. coli BL21(DE3). Bakteri dibiakkan pada suhu 24 ◦C dalam medium SB dengan ampicillin (200_g/mL) hingga A600nm = 1.5–2.0 dan diinduksi selama 2.5 jam dengan 1mM IPTG untuk mendapatkan gene recombinan. Purifikasi dari protein DV-EDIII-H6 dari cairan periplasmid bakteri dilakukan dengan chromatography pada NiNTA resin (Qiagen, Hilden) dan kosentrasi diatur berdasarkan penyerapan spectrometry seperti yang telah dijelaskan[69]. Fraksi protein dianalisa oleh SDS-PAGE in reducing conditions. Fraksi ini menunjukkan

tingkat homogen pada angka >95%, didialisa dengan 50mMTris–HCl, pH 8.0, 50mMNaCl, dan dibekukan dalam ntirogen cair serta disimpan pada suhu −80 ◦C.

2.6. ImmunofluorescenceImmunofluorescence staining was performed on infected cells, as described elsewhere [86]. Cells were probed with mouse anti- DV1 HyperImmune Ascitic Fluid [87] for the EDIII of DV1, the Mab 3H5 for the EDIII of DV2, the Mab 8A1 for the EDIII of DV3, and mouse anti-DV1 HyperImmune Ascitic Fluid [87] for the EDIII of DV4 (all DV-specific antibodies were used at 1/100 dilution). Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories) was used as secondary antibody (1/100 dilution)

2.6 ImmunofluoresensiImmunofluorescence staining dilakukan pada sel yang terinfeksi seperti yang sudah pernah dijelaskan sebelumnya. Sel yang diperiksa pada cairan anti- DV1 HyperImmune Ascitic Mencit[87] untuk EDIII pada DV1, Mab 3H5 untukEDIII pada DV2, the Mab 8A1 untuk the EDIII pada DV3, dan Cairan anti-DV1 HyperImmune Ascitic Fluid Mencit untuk EDIII pada DV4 (semua DV-specific antibodies digunakan dengan pengenceran 1/100). Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories) digunakan sebagai antibodi sekunder (pengenceran 1/100 )

2.7. Western blot assaysProtein lysates dari sel Vero cells yang terinfeksi oleh virus rekombinan dibagioleh SDS-PAGE gel electrophoresis Dan dipindahkan ke membran sel (Amersham Pharmacia Biotech). DV1, atau DV2 EDIII (5 ng) yang dihasilkan oleh sel drosophila dimasukkan sebagai kontrol positif. Masalh pada 4E11 Mab Mencit untuk deteksi dari DV1 EDIII, Mab 3H5 untuk deteksi dari DV2 EDIII, Mab 8A1untuk deteksi dari DV3 EDIII, dan Mab 1H10 untuk DV4 EDIII (semua DV-specific antibodies digunakan dengan pengenceran 1/100). Anti-mouse immunoglobulin G (IgG)-horseradish peroxidase (HRP) terkonjugasi dari kambing (Amersham) digunakan sebagai antibodi sekudner (pengenceran 1/5000). Aktifitas Peroxidase diperlihatkan dengan penggunaan chemiluminescence detection kit (Pierce).

2.7 Eksperimen mencitMencit CD46-IFNAR yang dicurigai mengalami infeksi MV dipelihara seperti yang sudah dijelaskan di atas[40]. Mencit dipelihara dalam kondisi bebas patogen pada Pasteur Institute animal facility. Mencit berusia 6 minggu -CD46-IFNAR diberikan 105 TCID50 intraperitoneal dari recombinant MV-TetraA, MV-TetraB, MV-TetraC, atau MV. Untuk mendeteksi respon anamnestik yang ditimbulkan akibat immunisasi, mencityang diberikan i.p. 105 FFU dari strain FGA/89 French Guiana untuk serotype DV1 [80], Jamaica/N.1409 for DV2 (Genbank accession no. M20558) [81], PaH881/88 Thailand untuk DV3 dan 63632/76 Burma untuk DV4. Semua mencit percobaan diberikan pemberian ulang 2-3x.Semua eksperimen disetujui dan dilakukan berdasarkan panduan dari Office of Laboratory Animal Care at Pasteur Institute.

2.9. ELISA untuk respon humoralUntuk memantau respin antibodi spesifik, mencit dibambil darahnya melalui jalur periorbital beberapa kali setelah penyuntikan. Serum dibuat tidak aktif dengan pemanasan 56 ◦C selama 30 menit dan adanya anti-MV antibodies dideteksi oleh ELISA (Trinity Biotech). HRP-anti-mouse immunoglobulin (Jackson Immuno Research) terkonjugasi digunakan sebagai antibodi sekunder Anti-DV antibodies terdeteksi oleh ELISA menggunakan 96-well plates yang dilapisi oleh protein EDIII

Dari DV1, DV2, DV3, DV4 yang dihasilkan dari E. coli atau sintetik. HRPconjugated anti-mouse immunoglobulin digunakan sebagai antibodi sekunder. endpoint titers dari sera dihitung dengan pengencaran 2x dibandingkan absorbsi dari sera dari Mencit yang disuntikkan MV inoculated mice sebagai kontrol negatif.

2.10. Focus reduction neutralization testAnti-DV neutralizing antibodies terdeteksi dengan menggunakan focus reduction neutralization test (FRNT) pada sel Vero dngan menggunakan 50 FFU padaVero-adapted DV1 Hawaï (WHO reference strain, Genbank accession no. AF226687), strain Jamaica/N.1409 for DV2, PaH881/88 Thailand untuk DV3 dan 63632/76 Burma untuk DV4. endpoint titer dihitung dari serum tertinggi dari test pengenceran untuk mengurangi jumlahdari FFU setidaknya 50% (FRNT50) atau 90% (FRNT90).

3.1. Rancangan dari antigen tetravalent DV dan pemaparan dengan mereplikasi recombinant MV vectorPekerjaan peneliti sebelumnya dalah melakukan penggabungan DV1 EDIII (100 residues) dengan residu 40-long dari Mprotein (ectoM) sangat efisien untuk membentuk serotype-specific neutralizing antibodies terhadap DV1[49]. Berdasasrkan ahsil ini, peneliti membuat tiga tetravalent antigens (TetraA, TetraB, TetraC) yang dirancang untuk dipaparkan pada EDIII oleh setiap 4 DV serotypes sebagai antigen tunggal(Fig. 1). Segmen pendek (E290–300) antara EDI dan EDIII, yang cukup fleksibel hingga dapat menyebabkan pergeseran EDIII saat proses penggabungan [50] was disimpan sebagai sekuensi penghubung antara setiap EDIII. Untuk membuat individualisisasi dari4 segmen EDIII saat proses pada tetravalent antigens,peneliti menambahkan bagian C-terminal furin dari DVprM protein (RRDKR). Konstruksi TetraA dirancang untuk menggambarkan 4 EDIII dari DV1 hingga DV4 yang digabungkan dengan sekuensi ectoM tunggal dari DV1 pada C-terminal end. Pada konstruksi TetraB and TetraC, 4 salinan dari ectoM ditambahkan pada C-terminal disetiap EDIII unutk memeriksa efek dari posisi, jumlah salinan, dan asal serotipe dari ectoM. Pada konstruksi TetraB construct pada setiap EDIII dikaitkan dengan ectoM terhadap serotipenya, sementara pada TetraC keempat ectoM merupakan serotip tipe 1.

Antigen yang dibuat oleh sintesis kimawi dari E290–394 dan M1–40 dari strain DV1 FGA/89, DV2 strain Jam 1409, DV3 Strain H97, dan DV4 strain 63632. Sekuens dari codon-optimized terhadap pemaparan pada sel mamalia. Sekuens AAAGGG, AAAAGG, GGGGAA dapat menyebabkan perbaiikan pada MV polymerase dan berubah pada sekuens yang serupa. Sekuens virus yang dikolon ke bawah berdasarkan dari cellular calreticulin signal peptide sequence (ssCRT) untuk mengenali antigen melalui jalur sekresi menyebabkan pengikatan dari formasi disulfid dan pelipatan yang benar terhadap EDIII [49]. Hasil dari konstruksi ss-CRT-TetraA, ss-CRT-TetraB, ss-CRT-TetraC yang dimasukkan additional transcription unit (ATU) ke dalam vector MV (pTM-MVSchw plasmid), yang mengandung MV cDNA infeksi yang ebrtanggung jawab terhadap antigenome dari Schwarz MV vaccine strain (Fig. 1). MV-TetraA, MV-TetraB and MV-TetraC berhasil diselamatkan dengan mengubah pTMMVSchw- TetraA, pTM-MVSchw-TetraB dan pTM-MVSchw TetraC plasmids ke sel helper dan perambatan ke sel Vero [40].

Detection of intracellular DV antigens in recombinant Mvinfected Vero cells was first assessed by immunofluorescenceanalysis using hyperimmune mouse ascitic fluid (HMAF) directed against DV1 or DV4 and monoclonal antibodies (mAbs) specific to EDIII from DV2 (mAb 3H5 [51]) or DV3 (mAb 8A1 [52]) provided by Robert Putnak, Walter Reed Army Institute of Research). HMAF was used for the immunofluorescence detection of DV4 since the monoclonal antibody 8A1 that was used in western blots (see below) did not recognize the epitope under non-denaturing conditions. For DV1 the immunofluorescence assay was performed either with the 4E11 mAb (data not shown) and the anti-DV1 HMAF. As shown in Fig. 2, DV antigens were clearly immunostained indicating that the three recombinant MV vectors were efficient to produce EDIII from the four serotypes of DV. The stability of expression of the correct DV sequences was verified by RT-PCR and sequencing of viral RNAs produced in infected cells after 5 passages of recombinant viruses (data not shown). We analyzed the processing of recombinant DV antigens by monitoring the intracellular and extracellular forms of individual EDIII in Vero cells infected by recombinant MV (Fig. 3). Immunoblotting analysis was performed using mAbs 3H5,

8A1, and 1H10 [51], the latter recognizing specifically the EDIII from DV4. The DV1 EDIII was detected using DV-neutralizing mAb 4E11 [53]. Soluble DV1 EDIII secreted from a stably established Drosophila S2 cell line served as a positive control. In cell lysates from MV-TetraA infection, we detected the expected 5 fragments of 13, 25, 37, 49 and 54 kDa, respectively, indicating that the furin cleavage sites are accessible. MV-TetraB and MV-TetraC infections produced a higher number of fragments corresponding to the expected sizes generated by the eight furin cleavage sites (13, 18, 30, 35, 47, 53 65 and 70 kDa). TetraA and TetraC antigens were also detected in unconcentrated supernatants of infected cells, although the supernatant volume was 100 times larger than the lysate volume, thus indicating an efficient antigen secretion. TetraA antigen was even found in higher concentration in supernatant than in cell lysate and all the cleavage products were secreted. On the contrary, TetraB antigen was not detected in cell supernatants.

Weassessed the replication of the recombinant MV-TetraA,MVTetraBand MV-TetraC viruses on Vero cells, using the same MOI(0.01) as for standard MV stock production (Fig. 4). The growth ofFig. 4. Growth kinetics of recombinant MV-TetraA, MV-TetraB and MV-TetraCviruses compared with standard MV on Vero cells (MOI 0.01). Cell-associated virustiters are indicated in TCID50.MV-TetraA was similar to that of control MV, and its final titer waseven slightly higher. In contrast, we found that both MV-TetraB andMV-TetraC were less efficient to replicate in Vero cells and progenyvirus production was significantly detected only after two roundsof virus life cycle. The impairment of viral growth was associated toearly death of infected cells (data not shown). It is likely that expressionof multiple copies of the cytotoxic ectoM sequence potentiatesMV-mediated cell death. According to this hypothesis, we reportedthat accumulation of ectoM by MV vector enhances the apoptoticproperties of the recombinant virus [49].