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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
TESE DE DOUTORADO
Efeito do Tratamento por Plasma na Proliferação de Fibroblastos e
Esterilização de Membranas de Quitosana
MARINA DE OLIVEIRA CARDOSO DE MACÊDO
ORIENTADOR: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Tese nº 128/PPGCEM
Natal, RN
Agosto de 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
Marina de Oliveira Cardoso Macêdo
Efeito do Tratamento por Plasma na Proliferação de Fibroblastos e
Esterilização de Membranas de Quitosana
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências e Engenharia de Materiais do Centro
de Ciências Exatas e da Terra, e do Centro de
Tecnologia da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, como parte dos requisitos para obtenção
do título de Doutor em Ciências e Engenharia de
Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Natal, 8 agosto de 2013
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / SISBI / Biblioteca Setorial
Centro de Ciências Exatas e da Terra – CCET.
Macêdo, Marina de Oliveira Cardoso.
Efeito do tratamento por plasma na proliferação de fibroblastos e esterilização
de membranas de quitosana / Marina de Oliveira Cardoso Macêdo. - Natal, 2013.
96 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-
Graduação em Ciências e Engenharia de Materiais.
1. Quitosana – Tese. 2. Plasma – Tese. 3. Membrana – Tese. 4. Proliferação – Tese. 5.
Esterilização – Tese. I. Alves Júnior, Clodomiro. II. Título.
RN/UF/BSE-CCET CDU: 547.995
Dedico este trabalho a meus Pais
(Maria Dalva de Oliveira e Braz Cardoso), ao
meu esposo Haroldo Reis pelo amor,
compreensão, carinho e incentivo nas
dificuldades e aos amigos e familiares que
mesmo longe ou perto diziam: Força você vai
conseguir, estou torcendo por você.
Agradecimentos
A Deus por sempre me guiar e iluminar meus pensamentos.
A minha mãe Maria Dalva de Oliveira e a meu pai Braz Cardoso de
Araújo pelo incentivo, apoio, amor e carinho.
Ao meu esposo Haroldo Reis, pelo seu amor e por sempre ter me
ajudado no desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Dr. Clodomiro Alves Júnior pela orientação deste trabalho,
pelo incentivo á pesquisa.
Ao professor Dr. Hugo Alexandre por ter cedido o laboratório, as células
utilizadas neste trabalho e principalmente pela orientação nos assuntos
relacionados à parte biológica, agradeço ainda a todos os alunos do Biopol, em
especial a Dayanne e Jailma pela colaboração na execução dos ensaios
biológicos.
A Esp. Lourdes Freitas pela disponibilização de materiais para o ensaio
de esterilidade.
Ao Artejose e Leopoldino, técnicos do NEPGN/UFRN que muito
contribuíram na realização da analise de MEV.
Ao MSc. Danilo Cavalcante pela análise de AFM.
Ao MSc. Antônio Medeiros pela ajuda na caracterização das amostras.
Aos integrantes do Laboratório de Materiais Cerâmicos e Metais
Especiais, em especial a MSc. Samara Melo Valcacer por sempre me auxiliar
na pesagem dos materiais e nas doações de água destilada para os ensaios de
absorção.
Ao técnico em vidraria Williams Pereira de Castro por sempre
disponibilizar vidrarias para serem utilizadas nos ensaios.
A todos os professores da Engenharia de Materiais pelo apoio e
competência em ministrar as disciplinas do curso.
Ao secretário Ismael por sempre me ajudar a resolver os problemas
burocráticos do curso.
Aos amigos Professores Dr. Ayrton de Sá Brandim, Dr. Marcio Cleto e
Dr. Luiz Fernando, Dr. Rômulo pela amizade, incentivo e apoio no meu
aprimoramento acadêmico.
A todos os integrantes do LABPLASMA pela ajuda durante os anos que
estive no mesmo em especial aos que tive mais proximidade: Dr. Marcio
Willians, MSc. Narayanna, MSc. Duciane, MSc. Raquel, MSc. Jussier, MSc.
Natalia, Dr. Júlio Barbosa, Dr. Custódio, MSc. Marco Aurélio, etc.
A Capes pelo apoio financeiro.
Resumo
Macêdo, M.O.C, Efeito do Tratamento por Plasma na Proliferação de
Fibroblastos e Esterilização de Membranas de Quitosana. 2013. Tese
(Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2013.
A quitosana está sendo estudada para utilização como curativo devido
suas propriedades biológicas. Com o intuito de ampliar o uso em aplicações
biomédicas, membranas de quitosana foram modificadas por plasma, utilizando
os seguintes gases: nitrogênio (N2), metano (CH4), argônio (Ar), oxigênio (O2) e
hidrogênio (H2). As amostras foram caracterizadas por microscopia eletrônica
de varredura (MEV); microscopia de força atômica (MFA); ângulo de contato;
energia de superfície; ensaio de absorção de água. Testes biológicos também
foram realizados, como: teste de esterilização e proliferação de fibroblastos
(linhagem 3T3). Através do MEV foi possível observar as modificações
morfológicas ocorridas durante o tratamento por plasma, como a formação de
vales micro e nanométricos. A MFA foi utilizada para analisar diferentes
parâmetros de rugosidade (Ra, Rp, Rz) e topografia da superfície. Verificou-se
que as amostras tratadas tiveram aumento na rugosidade e uma superfície
com picos pontiagudos. O tratamento por plasma de metano diminuiu a
hidrofilicidade das membranas e também a taxa de absorção de água,
enquanto os outros tratamentos tornaram as membranas mais hidrofílicas. A
esterilização foi eficaz em todos os tempos de tratamento com os seguintes
gases: Ar, N2 e H2. Com relação à proliferação, todos os tratamentos
proporcionaram uma melhora da proliferação celular, sendo obtido aumento
entre 150% a 250% em relação à membrana não tratada. Destacaram-se os
tratamentos com Ar 60 min, O2 60 min, CH4 15min. Observando os resultados
das análises realizadas neste trabalho, verifica-se que não existe um parâmetro
único que influência a proliferação celular, mas sim um conjunto de condições
ideais que favorecem uma boa proliferação celular.
Palavras-chave: Plasma, Quitosana, Membrana, Proliferação, Esterilização.
Abstract
Macêdo, M.O.C, Effect of Plasma Treatment on proliferation of fibroblast
and sterilization of chitosan membranes. 2013. Thesis (Doctoral) –
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2013.
Chitosan is being studied for use as dressing due their biological properties.
Aiming to expand the use in biomedical applications, chitosan membranes were
modified by plasma using the following gases: nitrogen (N2), methane (CH4),
argon (Ar), oxygen (O2) and hydrogen (H2). The samples were characterized by
scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), contact
angle, surface energy and water absorption test. Biological Tests were also
performed, such as: test sterilization and proliferation of fibroblasts (3T3 line).
Through SEM we observed morphological changes occurring during the plasma
treatment, the formation of micro and nano-sized valleys. MFA was used to
analyze different roughness parameters (Ra, Rp, Rz) and surface topography. It
was found that the treated samples had an increase in surface roughness and
sharp peaks. Methane plasma treatment decreased the hydrophilicity of the
membranes and also the rate of water absorption, while the other treatments
turned the membranes hydrophilic. The sterilization was effective in all
treatment times with the following gases: Ar, N2 and H2. With respect to
proliferation, all treatments showed an improvement in cell proliferation
increased in a range 150% to 250% compared to untreated membrane. The
highlights were the treatments with Ar 60 min, O2 60 min, CH4 15 min.
Observing the results of the analyzes performed in this study, it appears that
there is no single parameter that influences cell proliferation, but rather a set of
ideal conditions that favor cell proliferation.
Keywords: Plasma, Chitosan, Membrane, Proliferation, Sterilization.
Lista de Figuras
Figura 2.1 Quitosana ............................................................................... 21
Figura 2.2 Quitina .................................................................................... 22
Figura 2.3 (a) Fluxograma do processo de desacetilação da quitina. (b)
Radicais predominantes da quitina e na quitosana........................ 23
Figura 2.4 Classificação das membranas quanto a sua morfologia. Nas
assimétricas, as regiões escuras representam a matriz sólida da
membrana e as regiões claras os vales da membrana ................. 24
Figura 2.5 Desenho reação do plasma ...................................................... 30
Figura 2.6 Etapas de formação do filme produzido por plasma
............................................................................................... 31
Figura 2.7 Processo de formação de sítios ativos em materiais tratados por
plasma ..................................................................................... 32
Figura 2.8 Quebra e remoção de cadeias poliméricas através do tratamento
por plasma.............................................................................. 33
Figura 2.9 Processo de reticulação. Neste caso ocorre a quebra de ligações
na superfície do polímero. Como não há espécies reativas do gás,
os radicais oriundos da quebra de ligação se unem à cadeia
adjacente, gerando nova ligação. Esse processo ocorre
geralmente quando é empregado um gás inerte no tratamento por
plasma como argônio e hélio........................................................ 34
Figura 2.10 Quebra da ligação OH da cadeia polimérica da quitosana e
inserção de grupos funcionais mais
hidrofóbicos.................................................................................. 35
Figura 2.11 Microscopia eletrônica de células fibroblásticas L929 cultivadas
em amostras de quitosana não tratada (NT), membranas de
quitosana tratadas por plasma de nitrogênio (N2) e membranas de
quitosana tratada por plasma de argônio (Ar)............................ 36
Figura 2.12 Inserção de grupos funcionais em polímeros tratados por plasma
de nitrogênio, através da quebra de ligações na cadeia polimérica
ou devido à remoção de átomos de
hidrogênio........................................................................... 37
Figura 2.13 Inserção de grupos funcionais em polímeros tratados por plasma 37
de oxigênio, através da quebra de ligações na cadeia polimérica
ou devido a remoção de átomos de
hidrogênio.....................................................................................
Figura 3.1 Fluxograma da realização do trabalho ....................................... 39
Figura 3.2 Reator de hidrogenação, utilizado para o tratamento de
membranas de quitosana por plasma ....................................... 41
Figura 3.3 Fotografia do reator de plasma. Nesta figura é possível visualizar
o posicionamento da membrana de quitosana dentro do reator.... 41
Figura 3.4 Superfície com picos pontiagudos e arredondados................... 43
Figura 3.5 Goniômetro utilizado neste trabalho .......................................... 44
Figura 3.6 Demonstrativo da formação do círculo e sua respectiva tangente
para obtenção do ângulo de contato por meio do surftens ............ 45
Figura 3.7 Esquema da disposição das amostras na placa de 24 poços, para
ensaio de cultura de células ................................................... 47
Figura 4.1 Microscopia eletrônica da superfície da amostra não
tratada........................................................................................ 51
Figura 4.2 Microscopia eletrônica da superfície da amostra tratada por
plasma de argônio 60 minutos .................................................... 52
Figura 4.3 Membranas de quitosana tratadas por plasma de hidrogênio em
diferentes tempos ................................................................... 54
Figura 4.4 Gráfico da rugosidade média (Ra) das amostras tratada e não
tratada...................................................................................... 56
Figura 4.5 Gráficos da rugosidade Rp, Rz e da relação Rp/Rz........................ 58
Figura 4.6 Imagens em 3D por microscopia de força atômica. (a) amostra
sem tratamento; (b) amostra tratada por plasma de argônio
durante 60 minutos;(c) oxigênio 60 minutos; (d) metano 60
minutos; (e) nitrogênio 60 minutos; (f) hidrogênio 60 minutos..... 59
Figura 4.7 Gráfico da molhabilidade das membranas tratadas e não tratadas. 60
Figura 4.8 Imagem do teste de molhabilidade baseado na técnica da gota
séssil. (a) Gota de água de 10uL em membranas de quitosana
tratadas por plasma de nitrogênio. (b) Gota de água de 10µL em
membranas de quitosana tratadas por plasma de metano............. 61
Figura 4.9 Energia superficial das amostras tratadas por plasma de 63
argônio..............................................................................
Figura 4.10 Energia superficial das amostras tratadas por plasma de
nitrogênio........................................................................ 64
Figura 4.11 Energia superficial das amostras tratadas por plasma de
oxigênio........................................................................... 65
Figura 4.12 Energia superficial das amostras tratadas por plasma de
metano.............................................................................. 66
Figura 4.13 Energia superficial das amostras tratadas por plasma de
hidrogênio......................................................................... 67
Figura 4.14 Ensaio de absorção em água destilada ......................... 68
Figura 4.15 Imagens dos microrganismos encontrados nas amostras não
tratadas e nas amostras em que o tratamento não foi eficaz ......... 70
Figura 4.16 Proliferação celular de fibroblastos da linhagem 3T3 nas amostras
tratadas e não tratadas por ensaio de MTT............................... 72
Figura 4.17 Micrografia de fibroblastos sobre membranas de quitosana não
tratada. (a) 3 dias de cultura,(b) 7 dias de cultura ........................... 74
Figura 4.18 Micrografia de fibroblastos sobre membranas de quitosana
tratada. (a) 3 dias de cultura, (b) 7 dias de cultura .......................... 75
Figura 4.19 Precipitados de carbono nas amostras por metano 45
min.(aumento de 200) .................................................................... 76
Figura 4.20 Relação entre ângulo de contato e proliferação .............................. 77
Figura 4.21 Relação entre tensão superficial e proliferação .............................. 79
Figura 4.22 Relação entre rugosidade e proliferação ........................................ 80
Lista de Tabelas
Tabela 3.1 Parâmetros utilizados durante o processamento da membrana
de quitosana por plasma ................................................................ 42
Tabela 3.2 Energia Superficial dos líquidos (água, formamida, glicerol)
............................................................................................... 45
Lista de Abreviaturas e Símbolos
Ar – Argônio
O2 – Oxigênio
H2 – Hidrogênio
N2 – Nitrogênio
CH4 – Metano
NT – Não tratada
Min – Minutos
MFA – Microscopia de força atômica
Mu - Massa úmida
Ms – Massa Seca
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
Ra – Parâmetro de rugosidade referente à média aritmética
Rp – Parâmetro de rugosidade referente à altura máxima do pico
Rz – Parâmetro de rugosidade referente à média entre os cinco maiores picos
e os cinco maiores vales.
θ – Ângulo de contato
– Energia superficial total
– Componente polar da energia de superfície
– Componente dispersiva da energia de superfície
FP – Fração de polaridade
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
SFB – Soro fetal bovino
Sumário
1 – Introdução ............................................................................................... 17
2 – Revisão Bibliográfica .............................................................................. 21
2.1 – Quitosana ............................................................................................. 21
2.1.1 – Membranas de Quitosana ................................................................. 24
2.1.2 - A Quitosana como Biomaterial - Propriedades Biológicas da quitosana
...................................................................................................... 26
2.2 – Adesão Celular e Proliferação ao Substrato Polimérico
.............................................................................................................. 27
2.3 - Tratamento de Polímeros por Plasma .................................................. 29
2.4 – Esterilização por Plasma............................................................... 33
2.5 – Membranas de Quitosana Tratadas por Plasma ................................. 34
3 – Metodologia ............................................................................................ 38
3.1 – Material de partida ............................................................................... 40
3.2 – Preparação de Membranas ................................................................. 40
3.3 – Tratamento por Plasma ....................................................................... 40
3.4 – Caracterizações das Membranas de Quitosana .................................. 42
3.4.1 – Microscopia eletrônica de varredura – MEV ..................................... 42
3.4.2 – Microscopia de força atômica – MFA ................................................ 43
3.4.3 – Ensaio de molhabilidade.................................................................... 43
3.4.4 – Energia de superfície ........................................................................ 45
3.4.5 – Ensaio de absorção .......................................................................... 46
3.5 – Ensaios Biológicos ............................................................................... 46
3.5.1 – Teste de esterilização do processo de manufatura das
membranas.......................................................................................................... 46
3.5.2 – Ensaio em cultura de células ............................................................ 47
3.5.3 – Proliferação MTT .............................................................................. 48
3.5.4 – Análise estatística e teste de correlação de Pearson............................. 48
3.5.5 – Morfologia celular .............................................................................. 49
4 – Resultados e Discussões ........................................................................ 51
4.1 – Caracterizações das Membranas de Quitosana .................................. 51
4.1.1 – Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ...................................... 51
4.1.2 – Microscopia de força atômica (MFA) ................................................ 55
4.1.3 – Ensaio de molhabilidade ........................................................................ 60
4.1.4 – Energia de superfície ............................................................................. 62
4.1.5 – Ensaio de absorção ............................................................................... 67
4.2 – Ensaios Biológicos .................................................................................... 68
4.2.1 – Teste de esterilidade do processo de manufatura das membranas ...... 68
4.2.2 – Análise de proliferação celular por MTT ........................................... 71
4.2.3 – Morfologia celular .............................................................................. 73
4.3 – Comparações da proliferação com as propriedades obtidas para as
membranas de quitosana ............................................................................. 77
4.3.1 – Ângulo de contato x Proliferação ...................................................... 77
4.3.2 – Energia de superfície x Proliferação ................................................. 78
4.3.3 – Rugosidade x Proliferação ................................................................ 79
5 – Conclusões e Perspectivas........................................................................ 82
5.1 – Conclusões .......................................................................................... 83
5.2 – Perspectivas de Trabalhos Futuros ........................................................... 85
Lista de Trabalhos Publicados ...................................................................... 86
Referências ................................................................................................... 89
Capítulo 1
Introdução
17
1 – Introdução
A utilização de biomateriais é bastante comum, seja para implantes
sofisticados ou para uso como curativos. Sejam metálicos, cerâmicos,
poliméricos ou compósitos, os biomateriais necessitam ter características
superficiais que possibilitem uma maior e mais rápida resposta biológica [1].
Todos os anos, milhões de pessoas sofrem com lesões cutâneas que
necessitam de tratamento e da utilização de biomateriais como curativos.
Quando a pele é ferida, ocorre uma série de eventos no local do ferimento
como dano celular, perda de tecido e alteração da relação entre os tecidos e o
ambiente circundante [2].
Quando a pele está severamente danificada, é necessário uma barreira
de proteção para a cura adequada desta pele. Esta barreira, comumente
denominada de curativo não deve apenas proteger a ferida do ambiente
envolvente, mas também deve favorecer o processo de cura, proporcionando
um microambiente ideal [3,4].
Na área biomédica, a pesquisa sobre membranas a base de
polissacarídeos para produção de curativos está em grande destaque, devido a
crescente necessidade de novos materiais e às novas tecnologias com
características de seletividade, permeabilidade, degradabilidade e
biocompatibilidade [5].
Os polissacarídeos têm sido amplamente utilizados em feridas, devido à
sua versatilidade relativa em termo de estrutura, composição, propriedades
intrínsecas e fisiológicas que podem ajudar na reconstrução apropriada da pele
na redução ou prevenção da formação do tecido cicatricial [5].
Os polímeros naturais são preferenciais para serem utilizados como
material biomédico, pois apresentam um menor índice de rejeição pelo tecido
vivo, ou seja, tem uma maior biocompatibilidade em relação aos polímeros
sintéticos, e também um menor custo de produção [6]. Alguns dos polímeros
naturais que são exaustivamente estudados na regeneração da pele são o
alginato, quitosana, ácido hialurônico, celulose, colágeno, gelatina e seus
derivados [7].
Dentre os polímeros supracitados há destaque para membranas de
quitosana elaboradas de forma pura ou misturadas com outros polímeros, as
18
quais vêm sendo utilizadas com sucesso na produção de curativos para
tratamento de queimadura, como pele artificial, por promover uma cicatrização
rápida do tecido. Além disso, diminuem os riscos de infecção da região afetada
e são facilmente biodegradadas pela atuação da lisozima. Materiais a base de
quitosana também são utilizadas na biotecnologia para o isolamento de
proteínas, ácidos nucleicos e enzimas [8, 9].
A quitosana possui propriedades biológicas, como a atividade
antimicrobiana, que a torna interessante para aplicações médicas e
farmacêuticas. Além de inibir o crescimento de microrganismos, possuir efeito
coagulante e ação analgésica tópica. Por essas propriedades, materiais a base
de quitosana vem sendo estudados como suportes para o crescimento celular
[10].
Além disso, vários estudos estão mostrando que derivados de
membranas de quitosana não são citotóxicos para os fibroblastos, mas tendem
a inibir a proliferação de células. Assim pesquisas têm sido realizadas com a
finalidade de melhorar a resposta celular em membranas de quitosana [11, 12].
Dentre os métodos realizados para melhorar a adesão e proliferação das
células tem-se a utilização de blendas, radiação gama, reações químicas e
modificação por plasma. A modificação por plasma tem tido maior destaque
pela sua versatilidade, pois o plasma pode realizar a funcionalização da
superfície em diferentes atmosferas [13, 14, 15, 16, 17].
Contudo existem poucas referências sobre o estudo da proliferação de
fibroblastos em membranas de quitosana tratadas por plasma. Entre as
pesquisas realizadas podemos citar os trabalhos de Zhu et. al [82]; López-
Pérez et. al [16] ; Silva et. al [62]; Luna et. al [83].
A atmosfera de plasma mais utilizada normalmente é a de oxigênio e
como resultado tem se a formação de diferentes grupos contendo oxigênio, tais
como: -OH, -C-O, -COOH na superfície da amostra. O argônio e o nitrogênio
são outros exemplos de gases utilizados no tratamento por plasma. Como
resultado da introdução de modificações químicas na superfície do material,
diferentes comportamentos celulares no material modificado podem ser
observados [18, 19].
Neste trabalho cinco conjuntos de experimentos usando tratamentos por
plasma de argônio, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio e metano em diferentes
19
tempos foram realizados com o objetivo de melhorar a biocompatibilidade de
membranas de quitosana na resposta dos fibroblastos in vitro e também de
estudar o efeito do plasma na esterilização das membranas.
O primeiro capítulo apresenta-se uma abordagem geral sobre alguns
aspectos sobre biomateriais, quitosana, propriedades biológicas e plasma. No
segundo capítulo é apresentada uma revisão da literatura no que se refere às
propriedades da quitosana, adesão celular ao substrato polimérico e
processamento de polímeros por plasma. No terceiro capítulo foi realizada uma
descrição dos materiais e metodologia utilizada, descrevendo os tratamentos
por plasma e as caracterizações realizadas. No quarto capítulo são expostos
os resultados obtidos dos tratamentos e o resultado das caracterizações por
MEV, MFA, ângulo de contato, tensão superficial, ensaio de absorção, teste de
esterilidade e ensaio de proliferação de fibroblastos. No quinto capítulo é feito
um relato das conclusões obtidas a partir dos resultados apresentados.
Capítulo 2
Revisão Bibliográfica
21
2 – Revisão Bibliográfica
2.1 – Quitosana
A quitosana é um polissacarídeo (amino) natural, quimicamente definida
como um copolímero natural, de cadeia linear, constituído por unidades
repetidas “2 amino 2 deoxi β D glucopiranose e (1 4) 2 acetamida 2 deoxi β D
glucopiranose” (Figura 2.1) [20-21]. Por ser produzida a partir de matérias-
primas de fontes renováveis e ser metabolizada por enzimas humanas,
especialmente a lisozima, por isso é considerada um biopolímero
biodegradável [22,23].
(a) Figura 2.1: Estrutura química da quitosana, CH2OH – grupo hidroximetil, OH – grupo hidroxil,
NH2- grupo amina, NHCOCH3 – grupo N - acetil [21].
Dentre as rotas de síntese para obtenção da quitosana, a de
desacetilização alcalina da quitina é a mais viável economicamente. Sua
obtenção ocorreu pela primeira vez em 1859, quando Rouget descobriu a
forma desacetilada da quitina [24].
A quitina (Figura 2.2) é uma substância estrutural presente nos
crustáceos, insetos e algumas espécies de fungos do gênero Mycelia, sendo
degradada pela enzima quitinase [25]. A quitina é constituída de unidades de
(1 4) 2 acetamida 2 deoxi D glucoprinanose e pode ser encontrada na forma
de dois polimorfos cristalinos, α e β quitina e na forma γ em fungos [21.]
Henri Braconnot em 1811 foi quem descreveu a quitina, denominando-a
inicialmente de fungina, por ter sido descrita em cogumelos. Em 1823 quando
Odier isolou o mesmo composto anteriormente denominado de fungina a partir
22
do exoesqueleto de crustáceos, foi que começou a usar-se a denominação de
quitina [26 e 27].
Figura 2.2: Estrutura da quitina, CH2OH – grupo hidroximetil, OH – grupo hidroxil,
NHCOCH3 – grupo N-acetil [21].
A quitina é encontrada na natureza como um material duro, anelástico
de baixa solubilidade e reatividade química, de cor esbranquiçada, não
imunogênico e rotineiramente utilizado como material quelante em reações
químicas [25]. São os subprodutos da indústria de beneficiamento do pescado
como, por exemplo, a casca de siri, camarão e lagosta, as fontes comerciais e
tradicionais de quitina [28].
Para a obtenção da quitosana a partir da quitina é necessária a remoção
de proteínas e a dissolução de sais inorgânicos. A quitina deve ser misturada
em solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 40%, a 120°C por 3 horas,
processo esse denominado de desacetilação da quitina [29] (Figura 2.3).
Variando-se o tempo, a concentração do banho de hidróxido de sódio
utilizado, além da temperatura em que ocorre a reação, é possível obter
quitosanas com diferentes graus de desacetilação. Portanto o termo quitosana
refere-se a um grande número de polímeros, que se diferenciam por seu grau
de desacetilação variando de 60% a 98% e massa molar de 1x105 – 1.2x106
Da.
O grau de desacetilação é verificado através de metodologias como
espectrometria de infravermelho (IRS), cromatografia gasosa (GC) ou
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) [30].
23
(a)
(b) Figura 2.3: (a) Fluxograma do processo de desacetilação da quitina. (b) Radicais
predominantes na quitina e na quitosana [25,33].
Geralmente a quitosana é insolúvel em soluções aquosas, com pH
superior a 6.3 a 6,5. Porém, em ácidos, os grupos aminos livres são
protonados e a molécula torna-se solúvel em pH ácido. Esta solubilidade está
ligada com a quantidade de grupos aminos protonados (-NH3+) na cadeia
polimérica [31]. Portanto sendo um policátion, a quitosana pode formar
complexos eletrostáticos com espécies carregadas negativamente incluindo
proteínas, enzimas, outros polímeros naturais ou sintéticos, fármacos e ânions
de baixa massa molecular [32].
24
Devido a sua composição, a quitosana apresenta propriedades
mecânicas, físicas, químicas e biológicas que a tornam apropriada para um
grande número de aplicações em produtos médicos e farmacêuticos. Além do
mais, presença de ligações hidrogênio inter e intramoleculares entre os
resíduos D glucosamina permite a formação de géis, filmes e fibras,
possibilitando a utilização da quitosana na preparação de membranas [34].
2.1.1 – Membranas de Quitosana
Uma membrana é definida como uma barreira fina, com propriedade
seletiva ao transporte de matéria e energia entre duas fases. As membranas
são utilizadas nas mais diversas áreas, como na indústria alimentícia,
tratamento de efluentes e em materiais biomédicos. As membranas podem ser
classificadas em homogênea ou heterogênea, apresentar uma estrutura
simétrica ou assimétrica, pode ser neutra ou possuir cargas elétricas e suas
espessuras podem variar entre 100 nm até mais de 1cm [35].
Quanto à morfologia, geralmente as membranas podem ser classificadas
em duas grandes categorias: membranas densas e porosas. Estas podem ser
ainda simétricas ou assimétricas (Figura 2.4) [36].
Figura 2.4: Classificação das membranas quanto a sua morfologia. Nas assimétricas,
as regiões escuras representam a matriz sólida da membrana e as regiões claras os vales da membrana.
25
Na área biomédica a utilização de membranas está tendo um grande
destaque, devido à crescente necessidade de novos materiais e novas
tecnologias com características de seletividade, permeabilidade,
degradabilidade e biocompatibilidade. Os polímeros naturais como a quitosana
são preferenciais para serem utilizados como material biomédico, pois
apresentam um menor índice de rejeição pelo tecido vivo, ou seja, tem uma
maior biocompatibilidade em relação aos polímeros sintéticos, e também um
menor custo na sua produção [6].
Membranas de quitosana pura ou misturadas com outros polímeros são
utilizadas com sucesso na produção de curativos, no tratamento de
queimaduras como pele artificial, promovendo uma cicatrização rápida do
tecido, diminuindo os riscos de infecção da região afetada e é facilmente
degradada pelo organismo pela atuação da lisozima [37]. Além disso, também
são utilizadas na biotecnologia para o isolamento de proteínas, ácidos
nucléicos e enzimas [38].
Devido a capacidade da quitosana de formar filmes e membranas em
soluções ácidas diluídas, diversas aplicações que exploram esta propriedade
estão sendo estudadas [39]. A técnica mais simples para a preparação das
membranas de quitosana é a evaporação do solvente em uma solução de
quitosana sobre uma placa de vidro que, geralmente, produz membranas
flexíveis, resistentes e transparentes [40].
As membranas de quitosana apresentam alta resistência mecânica e
elevada permeabilidade à ureia e à creatinina. São impermeáveis às proteínas
séricas e apresentam a vantagem única de evitar a liberação de metais tóxicos
na corrente sanguínea [41].
Filmes finos e membranas de quitosana tem sido objeto de avaliações
biológicas, nas quais a ausência ou não de vales e suas dimensões tornam-se
fundamentais para a definição de aplicações. Macro e microporos apresentam
uma relação “tamanho-exclusão” apropriada ao emprego em montagens de
membranas filtrantes de baixa pressão, adequadas a sistemas de purificação
de água ou separação de resíduos [42].
Membranas nanoporosas são utilizadas em sistemas de controle de
troca e permeação de gases, para liberação de drogas ou compostos
26
moleculares e como coberturas comestíveis sobre alimentos processados e
embalagens genéricas [43].
Membranas densas de quitosana também têm sido testadas como “pele”
temporária e como material apropriado para reestruturação de cartilagens ou
em aplicações tópicas para regeneração e cicatrização de injúria [43].
2.1.2 – A Quitosana como Biomaterial - Propriedades Biológicas
Atualmente a quitosana está em destaque como material para
aplicações médicas e farmacêuticas. As principais razões para esse interesse
são suas propriedades biológicas, entre elas podemos citar sua atividade
antimicrobiana. A quitosana inibe o crescimento de micro-organismos como
Escherichia coli, Fusarium sp, Coliforms fecais, Shingella dysenteriae,
Salmonella typhimurium, Bacillus cereus,Agrobacterium tunefaciens, etc [44].
Esse mecanismo de atividade antimicrobiana está intimamente
relacionado às propriedades físico-químicas da quitosana e às características
da membrana do microrganismo. Quando a bactéria é gram-positiva a atividade
antimicrobiana aumenta quanto maior for a massa molar do polímero. Nas
bactérias gram-negativas, quanto menor a massa molar da quitosana, maior a
atividade antimicrobiana [10].
Nas bactérias gram-positivas, a membrana atua inibindo a absorção de
nutrientes. Nas bactérias gram-negativas, a quitosana de baixa massa
molecular penetra mais facilmente na bactéria causando distúrbios no
metabolismo [10].
Efeito coagulante é outra propriedade biológica da quitosana. A
quitosana reduz o tempo de coagulação sanguínea de forma dose-dependente.
Isso é atribuído a sua capacidade de agregar os eritrócitos devido a interação
das cargas positivas dos grupos aminos livres da quitosana com as cargas
negativas de receptores dos eritrócitos, contendo resíduos de ácido
neuramínico e murâmico [45].
A quitosana possui ação analgésica tópica, decorrente da captura de
hidrogênios ácidos liberados no local da inflamação pela ionização do grupo
amínicos a NH3+. A quitosana também atua absorvendo a bradicinina
27
(mediador químico importante para a produção da dor no local inflamado)
liberada no sítio da inflamação [46]. A aceleração da cicatrização pode
acontecer através do uso da quitosana. Por causa da sua propriedade
imunomoduladora, essa propriedade dá à quitosana a capacidade de ativar
quase que exclusivamente o macrófago, o que explica também a característica
da biodegradabilidade desse polímero no organismo [47]. Essa característica,
associada à baixa toxicidade, faz da quitosana um polímero biocompatível.
Quando os macrófagos são ativados pelos oligômeros da quitosana de
baixa massa molecular, liberam interleucina-1, que estimula a proliferação de
fibroblastos e influencia a estrutura do colágeno. Ocorre também nesse
processo a liberação de N-acetilglucosaminidase, que hidrolisa a quitosana em
monômeros de N-acetilglucosamina e glucosamina que são necessários à
biossíntese do ácido hialurônico e outros componentes da matriz extracelular
pelos fibroblastos. Além disso, promovem a migração de neutrófilos, facilitando
a resposta inflamatória [48]. Em cultura de células tratadas com quitosana
verifica-se o aumento da atividade da lisozima extracelular, o que estimula a
formação do tecido conjuntivo [44].
N-acetilglucosamina é o maior componente do epitélio e sua presença é
essencial na reparação tecidual das feridas. A quitosana é despolimerizada
pela lisozima, presente naturalmente no fluido da lesão, e funciona como fonte
de liberação retardada de monômeros N-acetilglucosamina no processo de
cicatrização. Feridas tratadas com quitosana mostram menor grau de
fibroplasia, favorecendo a reepitelização com formação de cicatriz lisa [44].
2.2 – Adesão e Proliferação Celular no Substrato Polimérico
Para que aconteça uma boa interação polímero-célula é necessário que
se estabeleça a adesão celular ao substrato. Entretanto o substrato não
necessita obrigatoriamente apresentar características semelhantes às da
matriz extracelular para que a adesão ocorra. A similaridade físico-química é
almejada quando o objetivo é a promoção da diferenciação celular ou para que
um determinado polímero tenha uma interação mais efetiva ao sítio de
implantação [49]. Núcleo
28
Somente depois de estarem aderidas, as células iniciam seu processo
de espalhamento, divisão e produção da matriz extracelular nova. O
espalhamento ou espraiamento é um processo complexo que envolve
modificações na morfologia celular, em consequência de alterações no
citoesqueleto, criando assim uma melhor interação com o substrato. A
integração do biomaterial com células ou tecidos depende ainda da própria
estrutura dos dispositivos produzidos [50].
Desta forma, atualmente busca-se a produção de polímeros que
apresentem características físico-químicas e mecânicas – tais como o balanço
adequado entre hidrofilicidade/hidrofobicidade, disposição de cargas elétricas,
dureza, elasticidade e resistência cujos valores sejam os mais próximos
possíveis aos dos tecidos nos quais serão implantados. Existe uma relação
entre a hidrofilicidade e a adesão celular. Dentro de certos parâmetros,
substratos mais hidrofílicos tendem a suportar uma melhor interação com
células [51].
Outro fator importante na produção de substratos para a adesão e
crescimento celular é a produção de materiais poliméricos porosos. Alguns
pesquisadores afirmam que, materiais porosos promovem o crescimento
celular, bem como induzem as células a produzir componentes da matriz
extracelular [52].
A distribuição uniforme e as interconexões dos poros são importantes
para facilitar a formação de tecidos na forma de uma rede organizada, tendo
grande aplicação na reconstrução tecidual [53]. Entretanto, existem
desvantagens no processo de preparação de amostras porosas que requerem
o uso de solventes orgânicos. Técnicas como casting e inversão de fase
podem deixar resíduos que influenciarão na cultura celular, além de
impossibilitarem a inclusão de agentes farmacologicamente ativos durante o
preparo [54].
Materiais a base de quitosana vêm sendo estudados como suportes
para o crescimento celular. Membranas porosas de quitosana mostram uma
boa integridade e receptividade ao espalhamento celular. Os grupamentos
amino livres da quitosana podem aumentar o espalhamento e a proliferação de
células endoteliais [50].
29
Desenvolver novas técnicas e aprimorar as já desenvolvidas continua
sendo um importante enfoque de estudo na utilização de polímeros
biorreabsorvíveis na engenharia de tecidos. Desta forma, nos últimos anos
novas técnicas de processamento de biopolímeros têm sido apresentadas.
Como exemplo, pode-se mencionar o processamento de biopolímeros por
plasma.
2.3 – Processamento de Polímeros por Plasma
Diversos estudos têm sugerido que as interações entre um ambiente
biológico e materiais artificiais são determinadas predominantemente pelas
propriedades superficiais do material como hidrofilicidade, rugosidade
(aspereza), condutividade, lubricidade, densidade de ligações cruzadas e
energia de superfície [55].
Entretanto, muitas vezes, os polímeros não possuem todas as
propriedades superficiais necessárias para o uso como biomaterial. Têm-se
observado, portanto, um grande avanço em técnicas de modificação da
superfície para alterar as propriedades físicas e químicas de polímeros sem
afetar as propriedades inerentes do material. O tratamento por plasma tem se
tornado um importante processo industrial para a modificação superficial de
polímeros [56]. Neste contexto, uma das técnicas mais comumente aplicada
para produzir superfícies que forneçam respostas biológicas mais apropriadas
está o processamento de biopolímeros por plasma.
O plasma é um gás parcialmente ionizado, composto de partículas
carregadas: elétrons e íons, radiação térmica, luz visível, radiação ultravioleta,
campo eletromagnético, radicais e produtos químicos [57].
Em laboratório, o plasma é gerado pela diferença de potencial elétrico
aplicada entre dois eletrodos (cátodo e ânodo), em um sistema hermeticamente
fechado contendo um gás. Nesse sistema elétrons são acelerados na mesma
direção do campo elétrico, mas em sentido contrário, colidindo com as
partículas do gás (Figura 2.5) [57].
30
Esse impacto provoca a liberação de mais elétrons e formação de íons,
que novamente são influenciados pelo campo elétrico e por sua vez colidem
com outras partículas, ocasionando a ionização do gás [57].
(a) (b) (c)
Figura 2.5: Esquema da reação do plasma, - moléculas do gás, - elétrons, - íons. (a) Partículas do gás no reator, (b) Colisão das moléculas com os elétrons; (c) Formação
de íons após a colisão.
Dependendo do gás utilizado durante o tratamento, o material
apresentará características diferentes. No caso do tratamento com
hidrocarbonetos, tais como metano, etano, eteno, acetileno e benzeno, a
característica principal é a formação de filmes de carbono amorfo hidrogenado
(a-C:H). Estes filmes apresentam propriedades físicas superiores relacionadas
à microdureza, índice de refração ótica e impermeabilidade. Além disso, como
o recobrimento contém apenas carbono e hidrogênio, eles não acarretam
problemas do ponto de vista ambiental [58-59].
Nesse tipo de tratamento o impacto dos elétrons energéticos com as
moléculas do gás no reator resulta na formação de íons de C e H. Esses íons
juntamente com átomos, moléculas neutras, moléculas excitadas e radicais
livres presentes no plasma se ligam à superfície ativada do material em
tratamento, formando assim um filme polimérico geralmente de caráter
hidrofóbico sobre a superfície do material (Figura 2.6) [58].
31
Figura 2.6: Etapas da formação de um filme polimérico produzido por plasma [102].
Para gases não formadores de filme como o O2, H2, N2 e Ar. o impacto de
elétrons e íons do plasma quebra algumas ligações do material, arrancando
elétrons ou átomo do material, resultando na formação de sitos ativos na
superfície (radicais livres). Essa superfície ativada sofre um rearranjo molecular
como a formação de novas ligações e pode também reagir com as espécies
químicas presentes. Essas espécies químicas presentes colidem com o
material se ligando a algum radical, formando assim um grupo funcional
hidrofílico (Figura 2.7) [60].
32
Figura 2.7: Desenho esquemático da formação de sítios ativos. 1 – Bombardeamento de íons e formação de espécies ativas, 2- Formação de novas ligações e grupos funcionais [60].
Quando um material polimérico é inserido no plasma, muitos fenômenos
podem ocorrer resultantes da interação plasma/superfície do material.
Os principais efeitos da interação entre as espécies químicas ativas do plasma
ao colidir com a superfície polimérica é a quebra das cadeias (Figura 2.8),
moléculas, a formação de novos grupos funcionais e/ou alterações
morfológicas, como a formação de microporosidade [61].
Figura 2.8: Representação esquemática da quebra e remoção de cadeias poliméricas
através do tratamento por plasma [84].
Em um processo típico de plasma, os radicais criados na superfície
polimérica pela remoção do hidrogênio combinam-se com os radicias do gás de
trabalho modificando assim a superfície. Processos como funcionalização da
superfície, reticulação e etching ocorrem durante o tratamento por plasma
33
(Figura 2.9). As condições de trabalho vão determinar qual processo irá
predominar durante o tratamento [62].
Figura 2.9: Representação esquemática do processo de reticulação. Neste caso ocorre
a quebra de ligações na superfície do polímero, como não há espécies reativas do gás, os radicais livres oriundos da quebra da ligação, se unem a cadeia adjacente, gerando uma nova ligação. Esse processo ocorre geralmente quando é empregado um gás inerte no tratamanto
por plasma, como argônio e hélio [84].
2.4 – Esterilização de Superfícies por Plasma
O plasma além de modificar a superfície dos materiais durante os
tratamentos, também pode atuar como agente esterilizante. As propriedades de
desinfecção do ambiente de plasma são conhecidos há algum tempo e tem
sido provado ser eficaz na destruição de bactérias e seus esporos. A
esterilização por plasma é uma técnica interessante para esterilização de
dispositivos biomédicos, bem como seu uso em aplicações de cirurgia.
A técnica de esterilização de superfície usando plasma foi descrito pela
primeira vez em 1968 por Menashi. Depois outros pesquisadores como
Boucher, Brithel, Jacobs e Lin indicaram a esterilização por plasma, como um
processo viável. A técnica também foi estudada por McGowen. No entanto,
apesar destas patentes e estudos, o tratamento com plasma não entrou em
uso generalizado como uma técnica de esterilização superficial [63].
Boucher analisou a esterilização por plasma e descreveu como uma
técnica ideal para processamento de artigos sensíveis ao calor. Ele também
alegou que o procedimento não deixa resíduos tóxicos em materiais
processados. Gases utilizados por Boucher foram ar, argônio, halogênicos,
oxigênio, nitrogênio e aldeídos em plasma de radiofrequência [63].
A técnica de esterilização por plasma oferece várias vantagens potenciais
sobre os métodos mais comumente utilizados, tais como química, térmica e
esterilização por radiação. A esterilização por plasma é adequada para
materiais sensíveis ao calor e elimina o tempo de arejamento necessário em
alguns métodos de esterilização química. Além disso, essa técnica também
Núcleo Núcleo
34
pode ser vantajosa em casos em que o processamento por plasma é usado
como um passo final na fabricação dos dispositivos biomédicos.
2.5 – Membranas de Quitosana Tratadas por Plasma
Atualmente vários polímeros têm sido tratados por plasma seja para
estudo da modificação superficial ou para estudo do plasma como agente
esterilizante destes materiais. Dentre os materiais biopoliméricos modificados
por plasma tem-se as membranas de quitosana.
Membranas de quitosana têm sido tratadas por plasma usando-se
diferentes gases visando as mais diversas finalidades como: sistema de
liberação de fármacos, aumento da biocompatibilidade, suporte para
crescimentos de células etc. Esses tratamentos alteram microscopicamente a
topografia superfícial e a composição química superficial das membranas.
Assis (2007) avaliou os efeitos da deposição de uma fina camada de
hexametildissilazana (HMDS) sobre a superfície de filmes de quitosana. O
objetivo era depositar um filme hidrofóbico ao vapor de água com a finalidade
de aumentar a utilidade em embalagens e acondicionamento. O tratamento
resultou na inserção de grupos funcionais como Si – N - Si; Si – O; Si-CH2; Si –
CH3 (Figura 2.10) [70].
Núcleo Núcleo
35
Figura 2.10: Representação esquemática da quebra da ligação OH da cadeia polimérica
da quitosana e inserção de grupos funcionais hidrofóbicos [70].
Em estudo realizado por Silva et al. (2008) dois conjuntos de
experimentos usando tratamentos com nitrogênio e argônio em diferentes
tempos (10, 20, 30 40 min) foram realizados. O objetivo desse trabalho foi
melhorar a biocompatibilidade das membranas de quitosana na resposta dos
fibroblastos in vitro [62].
Os ensaios de rugosidade em microscópio de força atômica confirmaram
o aumento da rugosidade nas membranas tratadas, isso é um indicativo que
ocorreu o processo de ecthing durante os tratamentos. Através do ensaio com
ângulo de contato foi possível confirmar o aumento da energia de superfície
das amostras depois do tratamento por plasma e as medições com XPS
confirmaram a incorporação de oxigênio e grupos contendo nitrogênio na
superfície das membranas após os tratamentos. Quanto aos testes biológicos,
observou-se que as amostras tratadas tanto com nitrogênio, como com argônio
melhoraram a adesão e proliferação de fibroblastos nas membranas de
quitosana (Figura 2.11)[62].
36
Figura 2.11: Microscopia eletrônica de células fibroblásticas L929 cultivadas em amostras de quitosana não tratada (NT), membranas de quitosana tratadas por plasma de
nitrogênio (N2) e membranas de quitosana tratada por plasma de argônio (Ar) [62].
Estudos da modificação de quitosana por plasma de nitrogênio confirmam
um aumento significativo do teor de nitrogênio na superfície das membranas
tratadas. A clivagem dos grupos restantes de –NHCOCH3 da quitosana é a
razão para esse aumento [62].
Quando a membrana de quitosana é tratada por plasma de nitrogênio,
não ocorre apenas o processo de etching em sua superfície, ocorre também o
processo de funcionalização da superfície, através da adição de grupos
funcionais como –NH2, -NH, = NH, CONH2 ou CΞN (Figura 2.12) [62].
37
Figura 2.12: Representação esquemática da inserção de grupos funcionais em
polímeros tratados por plasma de nitrogênio através da quebra de ligações na cadeia polimérica ou devido a remoção de átomos de hidrogênio [84].
Em membranas de quitosana tratadas tanto com nitrogênio , como com
argônio observa-se através de análise de XPS um aumento da intensidade
relativa do componente C-H, e um decaimento do grupo C-O em relação a
amostra não tratadas. Para amostras tratadas com plasma de argônio por 30 e
40 minutos observa-se um aumento do componente C=O [62].
Para amostras tratadas por plasma de oxigênio normalmente ocorre a
formação de diferentes grupos contendo oxigênio, tais como: -OH, -C-O, -
COOH [62] (Figura 2.13). Observa-se também um aumento do componente
C=O e uma diminuição do grupo C-NH2 em relação à amostra não tratada [64].
Figura 2.13: Representação esquemática da inserção de grupos funcionais em
polímeros tratados por plasma de oxigênio através da quebra de ligações na cadeia polimérica ou devido a remoção de átomos de hidrogênio [84].
Pesquisa realizada por Wanichapichart et al. (2009) em membranas de
quitosana tratadas por plasma de argônio teve como resultado aumento da
hidrofilicidade, molhabilidade e permeabilidade iônica nas membranas tratadas.
O plasma de argônio também alterou a morfologia das membranas,
provocando uma aspereza na superfície das amostras. Além disso, observou-
se alterações na estrutura superficial de grupos funcionais como C=O, C-H, C-
O que aumenta a propriedade de permuta iônica das membranas [65].
Capítulo 3
Metodologia
39
3 – Metodologia
O presente trabalho foi dividido em duas partes. A primeira parte
consiste na preparação e caracterização das amostras de quitosana com
diferentes tratamentos por plasma. A segunda parte consiste na realização de
ensaios biológicos para determinar o potencial de esterilização das membranas
tratadas, bem como a proliferação de células fibroblásticas sobre essas
membranas. A seguir na figura 3.1 é apresentado o fluxograma de realização
do trabalho.
Figura 3.1: fluxograma da realização do trabalho
Preparação das membranas
Parte 1: Tratamento por plasma (15, 30,
45,60 min.)
Parte 1: Caracterização
das membranas
Parte 2: Cultura de Células
Parte 2: Caracterização
Biológica
• MEV • AFM • Molhabilidade • Energia de
Superfície • Ensaio de
Absorção
• Teste de Esterilidade
• MTT • Morfologia
Celular
• Argônio • Oxigênio • Nitrogênio • Metano • Hidrogênio
40
3.1 – Material de partida
Segundo o fabricante (Polymar Ltda, Fortaleza, Brasil) a quitosana
apresenta grau de desacetilação em torno de 90%. Sua massa molar ( Mv = 2,0
x 105 Da) foi determinada pelo método de viscosimetria, utilizando a equação
de Mark-Howink-Sakurada [67, 68].
3.2 – Preparação das membranas
A quitosana em pó foi dissolvida em ácido acético a 2% com agitação
constante durante 24h. Após este período a solução de quitosana passou por
duas filtrações, para retirada de impurezas. A primeira em um filtro com tela de
nylon e a segunda em um filtro Mille Millipore® (41µm). Depois um volume de
30 ml da solução foi vertido sobre as placas de petri e as mesmas
acondicionadas em estufa por 24 h em temperatura de 50ºC. Posteriormente
as membranas formadas foram neutralizadas com NaOH a 5%, seguido de
acomodação e secagem em temperatura ambiente por 24h.
3.3 – Tratamentos por plasma
Na figura 3.2 observa-se o esquema do reator utilizado neste trabalho.
Ele é composto de um tubo de vidro de borossilicato, fechado por dois flanges
de aço inox. O flange superior está polarizado anodicamente (aterrado) e no
mesmo foram inseridos as conexões para os gases de trabalho. Na periferia do
flange inferior estão as conexões para bomba mecânica e sensor de pressão.
Na parte central do reator, está localizado o cátodo (porta amostra) e tubo em
inox, no qual está inserido um termopar. O tubo está catodicamente polarizado,
ficando eletricamente isolado do flange pelo auxilio de buchas de teflon. A
amostra foi colocada presa a um anel, a uma distância de 50 mm do cátodo
(Figura 3.3).
41
Figura 3.2: Esquema do reator de hidrogenação, utilizado para o tratamento de membranas de
quitosana por plasma.
Figura 3.3: Fotografia do reator de plasma. Nesta figura é possível visualizar o posicionamento da membrana de quitosana dentro do reator.
As membranas de quitosana foram tratadas em 5 atmosferas diferentes, a
saber: metano (CH4), oxigênio (O2), hidrogênio (H2), nitrogênio (N2), argônio
(Ar), durante os tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos mantendo fixos a pressão,
Posição da
amostra no
reator
42
corrente, fluxo de gás e distância amostra-cátodo conforme mostrados na
tabela 3.1.
Tabela 3.1: Parâmetros utilizados para cada gás durante o processamento da membrana de quitosana por plasma.
Pressão (mbar)
Corrente (A)
Fluxo de gás (cm3/min.)
Distância da amostra para
o cátodo (mm)
Potência (W)
4,5 0,14 10 50 70
3.4 – Caracterizações das Membranas de Quitosana
Após os tratamentos por plasma, as amostras foram caracterizadas
quanto aos aspectos topográficos (integridade física, rugosidade),
molhabilidade, ensaio de absorção, capacidade de esterilidade de cada gás,
proliferação dos fibroblastos e análise estatística da proliferação.
3.4.1 – Microscopia eletrônica de Varredura – MEV
Neste trabalho utilizou-se um microscópio eletrônico de varredura da
marca PHILLIPS modelo XL30, equipado com detetores de elétrons secundário
(SE) e de elétrons retroespalhados (BSE), pertencente ao Núcleo de Estudos
de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da UFRN. Este foi utilizado no modo SE
para aquisição de imagens da superfície da amostra, a fim de saber se houve
ou não formação de vales durante o tratamento. As amostras foram revestidas
com ouro e imagens foram obtidas utilizando voltagem de aceleração eletrônica
de 20 kV.
43
3.4.2 – Microscopia força atômica – MFA (Rugosidade e topografia)
Para análise da rugosidade e topografia das amostras de quitosana
utilizou-se um microscópio de força atômica marca Shimadzu, modelo SPM-
9600 (Japão), pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural –
NEPGN da UFRN. Utilizou-se o equipamento no modo dinâmico ou
intermitente numa taxa de varredura de 1 Hz. Áreas aleatórias de 5 m x 5 m
foram escaneadas e analisadas pelo programa SPM Maneger versão
3.4(Japão). Foram analisados os parâmetros de rugosidade média aritmética
(Ra), soma da altura máxima dos picos (Rp), Soma da altura máxima dos picos
com a profundidade máxima dos vales (Rz) e a razão Rp/Rz para saber se os
picos na superfície eram pontiagudos ou arredondados (Figura 3.4).
Figura 3.4: Desenho demonstrativo da superfície com picos pontiagudos e arredondados
[71].
A topografia foi analisada utilizando na mesma região de análise da
rugosidade, utilizando as imagens em 3D obtidas no AFM.
3.4.3 – Molhabilidade
Para análise da molhabilidade, utilizou-se o método da gota séssil, onde
uma gota é depositada sobre a superfície da amostra. O conhecimento do
ângulo de contato está associado à molhabilidade. Os líquidos utilizados foram
água, formamida e glicerol. O goniômetro utilizado nesta análise foi
desenvolvido no Laboratório de Processamento de Materiais por Plasma –
Labplasma/UFRN e está esquematizado na figura 3.5.
500µm
44
Figura 3.5: Esquema do goniômetro utilizado neste trabalho [78].
As amostras foram colocadas sobre a base plana e em seguida foi
depositada uma gota de 10µl dos seguintes líquidos: água destilada, formamida
e glicerol, sobre a superfície das membranas. Este procedimento foi
acompanhado em tempo real e registrado em um computador por meio do
software Pinnacle Studio Quickstart versão 8. Em seguida, ainda usando-se o
Pinnacle Studio isolaram-se os quadros (imagens) referentes aos instantes
desejados: 00s, 10s, 20s, 30s, 40s, 50s, 60s.
De posse destas imagens passou-se a utilizar o software Surftens versão
demo. Neste software ao se fazer 5 marcações, gera-se um circulo e sua
respectiva tangente, conforme é mostrado na figura 3.6. Os valores de ângulo
de contato que estão apresentados neste trabalho representam uma média das
medições de três imagens sendo que foram feitas cinco medições para cada
imagem.
45
Figura 3.6: Demonstrativo da formação do círculo e sua respectiva tangente para
obtenção do ângulo de contato por meio do Programa Surftens.
3.4.4 – Energia de Superfície
A Energia de superfície foi calculada utilizando a equação de Fowkes
(Equação 3.1) [69]. Para tanto, foram utilizados os valores dos ângulos de
contato medidos anteriormente e os valores das componentes polar e
dispersiva de cada uma dos líquidos, estes dados são apresentados na tabela
3.2.
[
] [
√ ] √
√
√
(3.1)
Tabela 3.2 – Energia superficial dos líquidos usados.
Líquidos ( ⁄ )
( ⁄ ) ( ⁄ )
Água 72,8 51,0 21,8
Formamida 58,2 18,7 39,5 Glicerol 63,4 26,2 37,2
46
3.4.5 – Ensaio de absorção de água
A quantidade de água absorvida pelas membranas foi determinada pela
imersão destas em água destilada a 37ºC por 72h. As membranas de
quitosana tratadas e não tratada por plasma foram inicialmente pesadas em
uma balança analítica (Mettler Toledo H35AR) com três casas decimais e
imersas em água destilada. Acompanhou-se a percentagem de ganho de
massa através da pesagem da amostra em diferentes tempos. O ganho
percentual de massa M foi calculado através da relação:
100% xm
mm
s
su (3.2)
Onde mu e ms, representam respectivamente as massas das membranas
úmida e seca.
3.5 – Ensaios Biológicos
3.5.1 - Teste de esterilização do processo de manufatura das membranas
As membranas de quitosana foram tratadas por plasma, ao término dos
tratamentos as membranas eram retiradas do reator e colocadas em tubos
esterilizados. Estes tubos eram acondicionados em um recipiente contendo
algodão embebido em álcool 70%. Contornando o equipamento de plasma
existiam 5 lamparinas para garantir um ambiente estéril em volta do reator. A
pinça utilizada para retiradas das amostras do reator eram umedecidas em
álcool 70% e flambadas. O ensaio de esterilização consistiu em colocar as
membranas tratadas, não tratadas e desinfectadas com álcool 70% em placas
de 24 poços contendo meio de cultura celular DMEM e incuba-las a 37ºC com
5% de CO2 durante 7 dias. Diariamente os poços com as membranas foram
observados ao microscópio ótico Nikon CFI60, Spectrum-Spectrum
Bioengenharia Médica Hospitalar LTDA (São Paulo, SP, Brasil) para verificar o
47
surgimento de microrganismos sobre as membranas. O ensaio foi realizado em
sextuplicata.
3.5.2 – Ensaios em Cultura de Células
O ensaio de cultura de células foi realizado em triplicata. Após o
tratamento por plasma as membranas de quitosana foram levadas ao
laboratório de Biotecnologia e Polímeros Naturais – BIOPOL no Centro de
Biociências da UFRN, para esterilização por autoclavagem a 120ºC por 30 min.
Posteriormente às etapas de limpeza, o experimento seguiu em ambiente
estéril numa câmara de fluxo laminar. As membranas de quitosana foram
colocadas numa placa de cultura de 24 poços, sendo uma membrana por poço.
Em seguida adicionou-se 0,5mL de meio de cultura (DMEM) suplementado
com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibiótico juntamente com células
fibroblásticas de linhagem 3T3 (1,5 x 104 células por poço) (Fig. 3.7). As placas
permaneceram em condição de cultura celular em câmara de CO2 a 37 ºC.
Figura 3.7: Esquema da disposição das amostras na placa de 24 poços, para ensaio de
cultura de células.
48
3.5.3 – Proliferação MTT
O ensaio de proliferação por MTT (brometo de 3 - [4,5 - dimetil - tiazol - 2
il] – 2,5 difenil tetrazólio) se baseia na absorção do sal tetrazólico MTT pelas
células, sendo reduzido no interior da mitocôndria, pela desidrogenase
mitocondrial de células viáveis a um produto chamado formazan. Este produto,
acumulado dentro da célula na forma de cristais, é extraído através da adição
de um solvente apropriado. Neste trabalho o solvente utilizado foi o metanol
(PA). O ensaio de proliferação por MTT mede a respiração celular, que é
proporcional à quantidade de formazan produzida, e ao número de células
viáveis em cultura.
Neste trabalho as amostras de quitosana estiveram em cultivo celular por
72h (3 dias) e 168h (7 dias). Depois as amostras foram retiradas da incubadora
e adicionou-se MTT aos poços, retornou-se a placas à câmara de cultura por
mais 4h. Completado este tempo os cristais foram solubilizados em metanol
(PA).
Em seguida todo o líquido foi retirado da placa de 24 poços e colocado
numa placa de 96 poços. A proporção de troca foi a seguinte: cada poço da
placa de 24 preencheu 3 poços da placa de 96. Esta troca foi necessária para
leitura em espectrofotômetro específico para leitura de placas de 96 poços. A
leitura foi realizada utilizando comprimento de onda de 570 nm. Os valores
foram analisados em porcentagem de absorbância em relação ao controle
(poço sem disco).
3.5.4 – Análise Estatística e Teste de Correlação de Pearson
Para análise estatística da proliferação celular utilizou-se o teste da
ANOVA que mede a variabilidade entre os valores e em seguida fez-se o teste
t-student para avaliar o nível de significância estatística para p<0,05.
Foram aplicados testes de correlação de Pearson entre proliferação
celular e as propriedades de superfície para avaliar a influência sobre a
resposta celular.
49
3.5.5 – Morfologia Celular
A morfologia celular foi observada por microscópio ótico Nikon CFI60,
Spectrum-Spectrum Bioengenharia Médica Hospitalar LTDA (São Paulo, SP,
Brasil). As membranas foram observadas na própria placa de cultura no 3º e o
7º dia de incubação.
Capítulo 4
Resultados e Discussões
51
4 – Resultados e discussão
4.1 – Caracterizações das Membranas de Quitosana
4.1.1 – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Processos de corrosão, erosão são inevitáveis quando os polímeros são
expostos ao plasma. O MEV foi utilizado para observar eventuais alterações na
morfologia superficial das membranas [64].
A micrografia eletrônica de varredura das membranas de quitosana sem
tratamento revelou que a mesma possui uma superfície homogênea, lisa, sem
vales e sem danos (Figura 4.1). Essas características da membrana não
tratada apresentadas neste trabalho, estão de acordo com as membranas
desenvolvidas por Lima (2006) e Oliveira (2006). Tanto as membranas
preparadas nesta pesquisa como as membranas preparadas por Lima e
Oliveira (2006) foram feitas pela técnica de evaporação do solvente [85,86].
Figura 4.1: Microscopia eletrônica da superfície da amostra não tratada.
Neste trabalho verificou-se que amostras tratadas por plasma de argônio
durante 15 minutos ou aquelas tratadas por plasma de nitrogênio até 45
minutos não apresentaram danos à morfologia superficial das membranas,
permanecendo com a superfície lisa, assim como as amostras não tratadas.
52
Entretanto, tempos maiores de tratamento com plasma desses gases (argônio
e nitrogênio) apresentaram danos nanométricos (Figura 4.2) e micrométricos
aleatórios.
Para tratamento em atmosfera de oxigênio ou de metano foram
observados os danos para todos os tempos de tratamento utilizados, sendo em
maior dimensão e intensidade para maiores tempos de exposição ao plasma.
No trabalho realizado por Silva (2008) com plasma de argônio e
nitrogênio, onde o tempo de tratamento foi de 10, 20, 30 e 40 minutos em
reator de radiofrequência com potência de 20 W, não houve nenhuma
modificação significativa na morfologia da superfície das membranas tratadas
por plasma [62].
Os dados da morfologia superficial das amostras de Silva (2008)
tratadas por nitrogênio estão semelhantes aos das amostras tratadas por
nitrogênio neste trabalho. Entretanto as amostras tratadas por plasma de
argônio diferem, pois para as amostras tratadas por plasma de argônio com o
tempo acima de 15 minutos ocorreu a presença de danos.
Nos tratamentos realizados por López-Pérez (2007) em membranas de
quitosana tratadas por plasma de oxigênio com duração de 15 minutos em
reator de radiofrequência com potência de 30 W, também não ocorreu
alterações na morfologia das membranas [64].
Figura 4.2: Membrana de quitosana tratada por plasma de argônio 60 minutos.
53
Neste trabalho empregaram-se diferentes tempos de tratamento e uma
potencia de 70 W, ou seja, mais do que o dobro da potência usada nos
trabalhos de Silva (2006) e López-Pérez (2007). Segundo López-Pérez os
processo de corrosão e erosão do plasma são dependentes do tempo e da
potência aplicada. Comparando os tempos de tratamento e a potência utilizada
neste trabalho, com os trabalhos dos autores citados acima, temos a
confirmação desta afirmação.
Esposito et. al. (2007) trataram suportes de poli (ácido láctico – co –
ácido glicólico) por plasma de oxigênio em menor tempo do que o utilizado
neste trabalho, apenas 10 minutos e com diferentes potências 50 W e 100 W.
Comparando a superfície das amostras tratadas com menor e maior potência,
ele percebeu que os danos aumentaram nas membranas tratadas com maior
potência. Esses dados corroboram com a afirmação de López - Pérez (2007)
de que quanto maior a potência maior a erosão [87].
Dentre os tratamentos realizados nesta pesquisa, o de hidrogênio teve
grande destaque, pois ao contrário dos outros tratamentos, não houve a
presença de danos aleatórios. Observa-se no tratamento por plasma de
hidrogênio a ocorrência de células de erosão uniformemente distribuídas, e
com profundidade proporcional ao tempo de tratamento, indicando uma
homogeneidade no processo de interação plasma - superfície. A figura 4.3
ilustra as superfícies tratadas por plasma de hidrogênio em diferentes tempos.
Nas imagens das membranas tratadas por plasma de hidrogênio (Figura
4.3) foi possível visualizar a influência do tempo de tratamento no aumento do
processo de erosão da amostra. Como o processo de erosão nas amostras
tratadas por plasma de hidrogênio ocorreu de maneira uniforme é possível
controlar a porosidade das amostras. Nos outros tratamentos como os danos
ocorreram de maneira aleatória, não é possível fazer um controle da
porosidade.
54
Figura 4.3: Membranas de quitosana modificadas por plasma de hidrogênio em diferentes tempos de tratamento. Observa-se “células” de erosão, uniformemente distribuídas.
Membranas com vales nanométricos e/ou micrométricos, como os
obtidos nesse trabalho são capazes de permitir trocas gasosas, (fator esse
importante para aplicação dessas membranas como curativos), filtração de sal,
bactérias, proteínas e outras partículas mil vezes menores que o milímetro [66].
Além disso, essas membranas porosas ou com vales podem aumentar a
hidrofilicidade. Favorecem a adesão, proliferação e diferenciação de alguns
(b)
15 min
30 min
45 min
60 min
55
tipos celulares como fibroblastos e osteoblastos, pois podem induzir às células
a produzirem componentes da matriz extracelular [88,89]. Segundo Berry et. al.
(2004), as células fibroblásticas são sensíveis às alterações na morfologia da
superfície, influenciando a motilidade e possivelmente a proliferação celular
[90].
4.1.2 – Microscopia de Força Atômica - MFA
Na caracterização por MFA foram explorados os parâmetros de
rugosidade (Ra, Rp e Rz) e a topografia. A relação (Rp/Rz) tem sido utilizada
para determinar a forma do pico. A rugosidade média é o parâmetro de
medição de rugosidade mais utilizado no mundo. Entretanto o valor de Ra não
define a forma do pico, restringindo apenas às informações das alturas médias
de picos e vales. Portando pode-se dizer que com os dados da Rugosidade Ra
é possível obter informações somente sobre a rugosidade geral da amostra,
enquanto que com os dados da relação Rp/Rz é possível obter informações
sobre a forma do pico da amostra.
Observando a figura 4.7 temos os valores da rugosidade média das
amostras tratadas e não tratadas. Através deste gráfico nota-se que
independente do gás e do tempo utilizado no tratamento a plasma, as
superfícies tratadas apresentaram uma variação em sua rugosidade. De uma
maneira geral, todas as amostras tratadas tiveram valores de rugosidade
superiores à amostra sem tratamento (Ra = 1,265 nm).
O aumento da rugosidade Ra foi mais notável nas amostras tratadas por
plasma de hidrogênio, que apresentou os maiores aumentos de rugosidade Ra,
variando de 3,422 nm para as amostras com menor tempo de tratamento (15
min) a 11,23 nm para amostras com maiores tempo de tratamento (60 min).
Com relação aos outros tratamentos por plasma de argônio de 30, 45 e
60 min, houve aumento da rugosidade em relação à amostra não tratada na
ordem de 1,069 nm; 0,823nm e 1,848 nm respectivamente.
56
Figura 4.4: Gráfico da rugosidade média (Ra) das membranas tratadas e não tratada
Nas amostras tratadas por plasma de oxigênio em todos os tempos de
tratamento houve aumento da rugosidade em relação à não tratada. Entretanto
não houve variação de rugosidade naquelas tratadas por 15 e 30 minutos,
permanecendo a rugosidade Ra de 2,2 nm. Nas tratadas por 45 e 60 min
houve aumento de 2,11nm e 4,463 nm em relação à rugosidade da não
tratada, respectivamente.
Com relação às superfícies tratadas com o gás metano, não houve muita
diferença entre a rugosidade Ra da não tratada e das tratadas. Naquelas
tratadas por 15 minutos houve aumento de 0,1 nm. Nas superfícies tratadas
por 30 min, houve pequeno aumento da rugosidade em torno de 0,48nm e nas
amostras tratadas 45 e 20 minutos houve uma pequena diminuição da
rugosidade em relação a não tratada de 0,1 nm.
O tratamento feito por gás metano, que é um hidrocarboneto é
caracterizado por um tratamento onde ocorre baixa erosão do polímero, com
possível deposição de oligômeros na superfície. Entretanto, na observação da
superfície das membranas tratadas por plasma de metano por microscopia
eletrônica de varredura, não foi possível a visualização destes oligômeros na
superfície da amostra [70].
As membranas tratadas por plasma de nitrogênio também apresentaram
aumento da rugosidade em relação à amostra não tratada. O aumento da
0
2
4
6
8
10
12
NT Ar O2 CH4 H2 N2
Ru
gosi
dad
e M
édia
(n
m)
15 min 30 min 45 min 60 min
57
rugosidade naquelas tratadas por plasma de nitrogênio em relação à não
tratada variou de 0,645 nm a 4,050 nm.
No trabalho realizado por Luna et.al. (2011) que tratou membranas de
quitosana por 10, 20, 30 e 40 min por plasma de argônio e nitrogênio,
observou-se que nas amostras tratadas por plasma de nitrogênio o aumento
significativo da rugosidade Ra só ocorreu nos tratamentos de 30 e 40 minutos.
Enquanto que nos tratamentos realizados por plasma de argônio a rugosidade
aumentou com 20 minutos de tratamento [83]. Os resultados de Silva et. al.
(2008) corroboram com os resultados de Luna.
Neste trabalho as membranas tratadas por plasma de nitrogênio já
apresentaram aumento da rugosidade Ra a partir de 15 minutos de tratamento.
Entretanto a potência utilizada neste trabalho foi maior do que a potência
utilizada nos tratamento de Luna et. al. e Silva et. al., 70 W, 20 w, 20 w
respectivamente.
Em relação à rugosidade Ra das amostras tratadas por plasma de
argônio neste trabalho e nos trabalhos realizados por Luna et. al. e Silva et. al.
os resultados corroboram.
Na pesquisa realizada por Wanichapichart et. al. (2009) também tratou
membranas de quitosana por plasma de argônio e observou aumento da
rugosidade Ra com apenas 5 minutos de tratamento. No entanto, a potência
utilizada por ele foi de 90 W, maior do que a potência utilizada nas pesquisas
citadas anteriormente [65].
Ogino et. al. (2007) também tratou membranas de quitosana por plasma
de argônio e oxigênio por 3 minutos com uma potência de 700 W. Tanto as
amostras tratadas por plasma de argônio (2,11 nm) como as tratadas por
plasma de oxigênio (14,6 nm) apresentaram aumento da rugosidade Ra em
relação à amostra não tratada (1,96 nm) [91].
Comparando os resultados da rugosidade Ra deste trabalho com a
rugosidade dos outros trabalhos apresentados nesta tese, observa-se que a
potência de trabalho tem bastante influência na alteração da rugosidade da
amostra. E para o gás argônio é necessário potências muito elevadas para que
ocorra um aumento da rugosidade em poucos minutos de tratamento.
Na figura 4.5 são apresentados os valores de Rp e Rz e da relação
Rp/Rz que indicam como está a topografia das amostras. Segundo Muzilli
58
valores de Rp/Rz menor que 0,5 indicam uma superfície arredondada e valores
maiores que 0,5 uma superfície mais pontiaguda [71]. Como pode ser
observado, nos tratamentos realizados neste trabalho obtiveram-se amostras
com superfícies pontiagudas, ou com tendências a serem pontiagudas, uma
vez que os valores Rp/Rz foram maiores ou próximos a 0,5.
Figura 4.5: Rugosidade Rp, Rz e da relação Rp/Rz.
Observando os dados da figura 4.5 e a figura 4.6 reforça-se a
importância da adoção de parâmetros além do Ra, pois como visto na figura
4.6b a amostra pode ter em sua topografia picos em apenas algumas regiões e
isso eleva o valor de Ra e não dá uma visão real da superfície.
Nas imagens de AFM (Figura 4.6) foi possível observar que as
topografias das membranas estão de acordo com a relação Rp/Rz, uma vez
que apresentam picos em sua maioria pontiagudos. Exceto as amostras
tratadas por plasma de hidrogênio, que apesar de ter Rp/Rz igual a 0,59 nm,
ainda tem picos não tão pontiagudos como nas outras amostras.
A relação Rp/Rz proposta informa o formato dos picos independente de
sua altura e da quantidade de picos existentes. Esse parâmetro juntamente
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
NT Ar15
Ar30
Ar45
Ar60
O215
O230
O245
O260
CH415
CH430
CH445
CH460
N215
N230
N245
N260
H215
H230
H245
H260
Rp(nm) Rz(nm) Rp/Rz
59
com as imagens de AFM fornece uma visão da superfície em que as células
foram de fato cultivadas.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Figura 4.6: Imagens em 3D por microscopia de força atômica: (a) amostra sem tratamento; (b) amostra tratada por plasma de argônio durante 60 minutos; (c) membranas tratadas por plasma
de oxigênio durante 60 minutos; (d) metano 60 minutos; (e) nitrogênio 60 minutos; (f) hidrogênio 60 minutos.
Ainda analisando a figura 4.6, observa-se que as amostras tratadas por
plasma de argônio, oxigênio e nitrogênio, apesar de ter picos maiores do que
as amostras não tratadas têm seus picos distribuídos de forma irregular sobre a
amostra. Sendo que as amostras tratadas por plasma de argônio são as que
possuem menor quantidade de picos.
As amostras não tratadas, tratada por plasma de metano e tratadas por
plasma de hidrogênio, tem seus picos distribuídos de forma uniforme. E a altura
dos picos das amostras tratadas por plasma de metano tem pouca diferença
em relação à amostra não tratada. As amostras tratadas por plasma de
hidrogênio são as que tiveram os maiores picos.
60
As membranas de quitosana tratada por plasma de argônio no trabalho
de Wanichapichart et. al. (2009) também apresentaram picos distribuídos
irregularmente sobre a membrana e a membrana não tratada apresentou seus
picos uniformemente distribuídos corroborando com os resultados deste
trabalho.
4.1.3 – Ensaio de Molhabilidade
Na Figura 4.7 são apresentados os valores dos ângulos de contato
medidos a partir da técnica da gota séssil de água destilada sobre superfícies
das amostras tratadas e não tratadas. Com exceção apenas das superfícies
tratadas em plasma de metano, em todos os tratamentos ocorreu uma
diminuição dos ângulos de contato.
Figura 4.7: Molhabilidade das membranas tratadas e não tratadas.
Destacam-se as amostras tratadas por plasma de nitrogênio que
apresentaram ângulo de contato tendendo à zero, ou seja, completo
espalhamento (Figura 4.8). Ao contrário das demais, as amostras tratadas por
plasma de metano apresentaram um ângulo de contato maior que as amostras
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NT Ar O2 CH4 H2 N2
Ân
gulo
de
Co
nta
to (
Ɵ)
15 min 30 min 45 min 60 min
61
não tratadas, confirmando o caráter hidrofóbico que esse tratamento
geralmente produz em superfícies de polímeros [59, 72].
(a) (b)
Figura 4.8: Imagem do teste de molhabilidade baseado na técnica da gota séssil. (a) Gota de água de 10µL em membranas de quitosana tratadas por plasma de nitrogênio. (b) Gota de
água de 10µL em membranas de quitosana tratadas por plasma de metano.
Para os tratamentos realizados com os gases argônio, oxigênio e
hidrogênio, quanto maior os tempos de exposição ao plasma mais hidrofílicas
tornaram-se as superfícies enquanto as amostras tratadas por plasma de
metano ocorreu o inverso. Existem relatos que a inserção de grupos hidrofílicos
ou hidrofóbicos durante os tratamentos por plasma utilizando, gases como
argônio, oxigênio, nitrogênio e hidrogênio ocorre inserção de grupos hidrofílicos
como: (OH; C-OH; C-O-O-H; H-C=O; C-O; H-H-C=O; NH2), enquanto as
amostras tratadas por plasma de metano há uma inserção de grupos
hidrofóbicos, por exemplo: CH, CH2, C-C sobre a superfície da amostra [73,
74].
Wanichapichart et. al. (2009) caracterizaram membranas de quitosana
tratadas por plasma de argônio quanto à molhabilidade. Observou-se que
membranas não tratadas que tinham 65º diminuíram para 25º após o
tratamento, ou seja, o tratamento tornou a membrana mais hidrofílica [65].
Esposito et. al. (2007) trataram membranas de poli (ácido láctico – co-
ácido glicólise) por plasma de oxigênio durante 10 minutos e realizou o teste de
molhabilidade, pela técnica da gota séssil e observou também que houve uma
diminuição do ângulo de 92,9º para 62,1º [87].
Macêdo et. al. (2010) realizou estudo sobre o perfil da molhabilidade de
membranas de quitosana tratadas por plasma de hidrogênio, onde observou-se
62
que houve uma diminuição 24, 32º no ângulo de contato das amostras
tratadas por plasma de hidrogênio em relação a não tratada, devido ao
aumento da componente polar [92].
Freitas (2009) tratou tecido de algodão por plasma de metano e
observou houve um aumento do ângulo de contato. A amostra não tratada
antes do tratamento tinha ângulo igual a 0º e depois do tratamento por plasma
de metano o ângulo de contato foi para 123,30º, ou seja, o tratamento tornou a
amostra mais hidrofóbica [72].
Os trabalhos citados acima corroboram com os resultados encontrados
neste trabalho de que gases como argônio, oxigênio e hidrogênio tem caráter
hidrofílico e metano tem características hidrofóbicas.
A hidrofilicidade é um dos fatores que afetam a citocompatibilidade dos
biomateriais. A adesão e crescimento celular nas superfícies são considerados
como sendo fortemente influenciados pelo balanço
hidrofilicidade/hidrofobicidade, frequentemente descritos como molhabilidade
[87].
4.1.4 – Energia de Superfície
A energia de superfície é um indicador da química da superfície, em
termos das interações que podem ocorrer. Sabe-se que a energia de superfície
afeta fortemente as interações biológicas, tais como a adesão, proliferação e a
morfologia celular [75].
A energia de superfície foi determinada a partir dos resultados dos
ângulos de contato medidos através da técnica da gota séssil na superfície das
membranas logo após os tratamentos. Nas amostras tratadas por plasma de
argônio (Fig. 4.9) foi observado que os componentes polares e dispersivos
possuem flutuações cíclicas, sendo geralmente mais dispersivo que amostras
não tratada e levemente menos polares, resultando numa tensão superficial
total levemente inferior às superfícies não tratadas.
63
(a)
Figura 4.9: Energia superficial das amostras tratadas e não tratadas por plasma de argônio
Em pesquisa realizada por Silva et al (2008) e Luna et al. (2011)
observou-se que nas amostras de quitosana tratadas por plasma de argônio
nos tempos de 10 e 40 minutos houve uma diminuição da energia de superfície
e para os tempos de 20 e 30 minutos a energia de superfície aumentou. Nas
amostras tratadas por nitrogênio houve uma diminuição da energia de
superfície para os tempos de 10,20, 30 minutos e nos tratamentos de 40
minutos houve um aumento da energia.
Neste trabalho todos os tempos de tratamento utilizando o gás argônio,
promoveram uma diminuição da energia de superfície enquanto que os
tratamentos com nitrogênio proporcionaram aumento da energia de superfície
das amostras. Essa diferença dos resultados de energia de superfície
encontrados por Silva et. al e Luna et. al em relação aos resultados
encontrados neste trabalho podem ser explicados pela potência utilizada. Silva
et. al e Luna et. al. utilizaram uma potência de 20 W e neste trabalho utilizou-se
uma potência de 70 W.
Nas amostras tratadas por plasma de nitrogênio (Fig. 4.10) ao contrário
do argônio, as componentes polares e dispersivas se mantiveram constantes
para todos os tempos de tratamentos, onde o valor do componente polar foi
muito superior ao da amostra não tratada e a componente dispersiva teve
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
NT Ar-15 Ar-30 Ar-45 Ar-60
mJ/
m^2
Polar Dispersiva Total
64
aproximadamente o mesmo valor, resultando numa tensão superficial total
superior à amostra não tratada.
Figura 4.10: Energia superficial das amostras tratadas e não tratadas por plasma de nitrogênio
Já o plasma de oxigênio varia com o tempo de tratamento de forma
direta para a componente polar e de maneira inversa para a componente
dispersiva. Isso resulta também num aumento da tensão superficial total
proporcionalmente ao tempo de tratamento, tendendo à estabilidade em torno
do valor de 70 mJ/m2. (Figura 4.11).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NT N2-15 N2-30 N2-45 N2-60
mJ/
m^2
Polar Dispersiva Total
65
Figura 4.11: Energia superficial das amostras tratadas e não tratadas por plasma de oxigênio
Membranas de quitosana também tratadas por plasma de oxigênio por
López-Pérez et. al. (2007) também tiveram um aumento na energia superficial
em relação às amostras não tratadas. Isto ocorreu devido ao aumento das
duas componentes polar e disperviva, assim como aconteceu neste trabalho
[17].
Em trabalho realizado por Esposito et. al. (2007) com membranas de
poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) tratadas por plasma de oxigênio
observou-se um também aumento da energia de superfície das amostras
tratadas. O aumento da energia de superfície das membranas de PLGA
ocorreu devido o aumento das duas componentes, polar e dispersiva, tendo
maior destaque o aumento da componente polar. Estes resultados estão de
acordo com os resultados encontrados aqui para o tratamento de quitosana por
plasma de oxigênio [87].
Igualmente ao plasma de argônio, no plasma de metano houve
flutuações cíclicas para os valores das componentes e da tensão superficial
total, sendo os valores das componentes dispersivas sempre maiores que a
amostra não tratada enquanto os valores das componentes polares foram
menores (Figura 4.12). Assim, com relação à molhabilidade, há uma
similaridade na ação do plasma de argônio com o do metano.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NT O2-15 O2-30 O2-45 O2-60
mJ/
m^2
Polar Dispersiva Total
66
Figura 4.12: Gráficos da energia superficial das amostras tratadas e não tratadas por plasma
de metano
Freitas (2009) realizou estudo de energia superficial em amostra de
tecido de algodão tratadas por plasma de metano. Ela observou que ocorreu
uma diminuição da energia de superfície nas amostras tratadas por metano e
que isto ocorreu pela diminuição nos valores da componente polar,
confirmando os resultados encontrados neste trabalho.
Para as amostras tratadas em plasma de hidrogênio tanto os valores das
componentes polares como das componentes dispersivas tiveram seus valores
ampliados frente à amostra não tratada (Figura 4.13). O valor da tensão
superficial total aumenta com o tempo de tratamento, chegando a 70 mJ/m2
para tempos de tratamento acima de 30 minutos, que é o valor também
atingido pelas atmosferas de nitrogênio e oxigênio. Isso indica que houve maior
interação das forças intermoleculares [76].
Pérez (2007) em seu trabalho de ativação de filme de
hexametildisiloxano com uso de plasma de baixa pressão e radiação UV
observou que após os tratamentos também houve aumento da energia de
superfície das amostras tratadas por plasma de hidrogênio. Esse resultado
corrobora com o encontrado nos tratamentos realizados com plasma de
hidrogênio neste trabalho [93].
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
NT CH4-15 CH4-30 CH4-45 CH-60
mJ/
m^2
Polar Dispersiva Total
67
Figura 4.13: Energia superficial das amostras tratadas e não tratadas por plasma de hidrogênio
4.1.5 – Ensaio de Absorção
O ganho de massa decorrente da absorção de água pelas membranas
tratadas e não tratadas foi analisado através da imersão destas em água
destilada durante 72 h. Na Figura 4.14 é apresentada a massa percentual de
água absorvida pelas membranas no intervalo de 72 h. As membranas tratadas
por plasma de metano apresentaram menor capacidade de absorção de água
em relação às outras membranas. Este resultado confirma mais uma vez o
caráter hidrofóbico das superfícies tratadas por esse gás. A maior capacidade
de absorção observada foi na superfície tratada com plasma de oxigênio
durante 60 minutos. Nesse caso houve uma variação de 110% para 160% que
representa 50% do aumento. Para todos os resultados, verifica-se um
comportamento linear da absorção com o tempo de tratamento. Isso é um dado
importante, pois permite maior controle dessa propriedade quando se deseja
produzir componentes para liberação de fármacos, por exemplo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NT H2-15 H2-30 H2-45 H2-60
mJ/
m^2
Polar Dispersiva Total
68
Figura 4.14: Gráfico do ensaio de absorção em água destilada.
O aumento do intumescimento do polímero aumenta a mobilidade das
cadeias poliméricas, com isso ocorre o alargamento e separação das cadeias e
consequentemente a erosão do polímero, resultando em sua desintegração
total [94].
4.2 – Ensaios Biológicos
4.2.1 – Teste de Esterilização do Processo de Manufatura das Membranas
A esterilização é uma etapa fundamental no processamento de
biomateriais, e a funcionalidade de qualquer sistema de esterilização deve ser
determinada através de sua eficácia em exterminar organismos, além de sua
habilidade em não prejudicar ou de não afetar de forma negativa as
propriedades funcionais dos dispositivos biomédicos [94]. Os principais agentes
esterilizantes de biomateriais são os vapores seco e úmido, óxido de etileno e a
radiação [95].
Dallan (2005) realizou pesquisa com três técnicas de esterilização em
membranas de quitosana. Em sua pesquisa as técnicas utilizadas foram álcool
etílico a 70%, óxido de etileno e radiação gama. Entre as três técnicas
utilizadas, o óxido de etileno foi o que apresentou os resultados mais
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
NT Ar O2 CH4 H2 N2
%A
bso
rçã
o d
e á
gu
a
15 min 30 min 45 min 60 min
69
promissores em termos de manutenção das características físicas, mecânicas
e biológicas das membranas [95].
No entanto essa técnica é tóxica, tem potencial carcinogênico, e o uso
na forma pura não é recomendado já que apresenta alta inflamabilidade e
explosividade [96].
Nascimento et. al. (2012) também realizaram pesquisa com diferentes
técnicas de esterilização em membranas de quitosana. As técnicas utilizadas
foram óxido de etileno, autoclave, glutaraldeído e radiação ultravioleta. Em
todas as técnicas utilizadas, observaram-se diferenças significativas no grau de
cristalinidade. Em relação às análises morfológicas houve alteração nas
membranas esterilizadas por gluteraldeído [97].
Atualmente a técnica de tratamento por plasma tem sido utilizada para
esterilização de materiais biomédicos, pois não afeta as propriedades
volumétricas do material. Além disso, podem ser utilizados gases orgânicos
e/ou inertes e não geram produtos tóxicos [98].
Neste trabalho após os tratamentos por plasma com os gases
hidrogênio, nitrogênio e argônio, durante 15, 30, 45 e 60 minutos. Oxigênio (60
minutos) e metano (30, 45 e 60 minutos), não observou-se a presença de
microrganismo em 7 dias de incubação das amostras.
Nas amostras tratadas por plasma de oxigênio (15, 30, 45 minutos) e
metano 15 minutos, após 24h de incubação. Observou-se a presença de
fungos nas amostras. Nas amostras não tratadas também foi possível
visualizar a presença de fungos, após 24 de incubação (Figura 4.15).
A técnica de plasma utilizada neste trabalho apresenta um grande
potencial para ser usada como agente esterilizante de membranas de
quitosana, já que impediu o crescimento de micro - organismos durante 7 dias
de observação.
70
Figura 4.15: Imagens dos micro -organismos encontrados nas amostras não tratadas e nas amostras em que o tratamento por plasma não foi eficaz (aumento de 100). (a) amostra não
tratada; (b) amostra tratada por plasma de oxigênio, (c) amostra tratada por plasma de metano.
Oliveira (2007) também utilizou a técnica de plasma com gás oxigênio
puro para esterilização de produtos médico-hospitalares. Foram selecionados
para os testes de esterilização o poli (cloreto de vinila) – PVC, polietileno de
alta densidade (HDPE), polipropileno (PP), poliuretano (PUR) e policarbonato
(PC) [98].
Nos tratamentos com plasma de oxigênio puro com potência de 100 W
foi possível, esterilizar as amostras em 40 minutos de tratamento. Com
potência de 150 W a esterilização ocorreu em 30 minutos. Nas potências de
200 W e 300W a esterilização ocorreu com 26 min e 22 min, respectivamente
[98].
(a) (b)
(c)
71
Os resultados de Oliveira (2007) corroboram com os apresentados neste
trabalho. No entanto ele obteve uma esterilização por plasma de oxigênio em
menor tempo, isso ocorreu devido à utilização de uma maior potência em seus
tratamentos por plasma.
Rovanni (2011) também estudou o potencial de esterilização do plasma.
Através de pesquisa sobre a inibição de biofilme de S. Epidermidis em placas
de poliestireno por plasma utilizando uma mistura de N2/H2 (24%%:76%), com
potência de 0,44 W, nos tempos de 5, 15, 30, 60 e 120 minutos. A redução
significativa ocorreu para os tempos de 60 e 120 minutos. A demora na
redução do biofilme de S. Epidermidis nas placas de poliestireno,
provavelmente foi pela baixa potência utilizada nos tratamentos. Nos
tratamentos realizados nesta pesquisa usou-se uma potência de 70 W obtendo
amostras esterilizadas em 15 minutos de tratamento para os gases nitrogênio e
hidrogênio [99].
Ayhan et. al. (1998) estudaram a eficácia da esterilização de fios de
suturas naturais e sintéticas por plasma de argônio em diferentes potências de
trabalho (10, 20 e 40 W) e diferentes tempos (5, 15 e 30 min.). As suturas
foram esterilizadas em todas as condições de tratamento. Indicando que o
tratamento por plasma de argônio é uma alternativa para esterilização de
biomateriais poliméricos sensíveis ao calor [100]. Os resultados de Ayhan et. al
confirmam os resultados encontrados nesta pesquisa com o plasma de
argônio.
4.2.2 – Análise de Proliferação Celular (MTT)
Na figura 4.16 observa-se que os resultados obtidos a partir dos ensaios
de MTT mostraram que as membranas tratadas por plasma com qualquer dos
gases utilizados, promoveram uma maior proliferação de fibroblastos do que as
membranas de quitosana não tratada.
As membranas de quitosana possuem uma natureza básica monopolar,
que não interage bem com a natureza bipolar das proteínas da matriz
extracelular, isso dificulta a adesão e proliferação das células sobre as
membranas. Com os tratamentos por plasma pode ter ocorrido uma mudança
72
na natureza monopolar das membranas que favoreceu a proliferação dos
fibroblastos [85].
Os tratamentos que apresentaram maior aumento da proliferação foram
argônio (60 min), metano (15min) e oxigênio (60 min) (Fig. 4.16). De maneira
geral observa-se nos gráficos que quanto maior o tempo de tratamento também
maior a proliferação. Entretanto isso não ocorre para os tratamentos realizados
com o gás metano. Neste tratamento há uma diminuição da proliferação com o
aumento do tempo de tratamento (45 e 60 minutos) conforme a figura 4.16.
Acredita-se que a diminuição na proliferação nas amostras de 45 e 60
minutos CH4, esteja relacionada com os precipitados de carbono que ficaram
na amostra durante o tratamento, bem como a diminuição da molhabilidade do
material. Isso pode ter feito com que as amostras desses tratamentos não
proporcione um ambiente favorável a uma maior proliferação das células.
Figura 4.16: Proliferação celular de fibroblastos da linhagem 3T3 nas amostras tratadas e não tratadas por ensaio de MTT
Estudos realizados por Silva et. al (2008) com quitosana tratada por
plasma de nitrogênio e argônio em diferentes tempos também comprovam que
0
0,5
1
1,5
2
2,5
NT Ar15
Ar30
Ar45
Ar60
O15
O30
O45
O60
N215
N230
N245
N260
H215
H230
H245
H260
CH415
CH430
CH445
CH460
Pro
lifer
ação
Cel
ual
r (%
)
3 dias 7 dias
73
os tratamentos de membranas de quitosana com estes gases aumentam a
proliferação celular [62]. Os resultados de Silva et. al. (2008) corroboram com
os de Luna et. al. (2011) que também modificou membranas de quitosana por
plasma de argônio e nitrogênio López – Perez et. al (2007) também tratou
membranas de quitosana por plasmas de oxigênio e observou o aumento da
proliferação de células nas membranas tratadas em relação a não tratada
[62,64, 83].
Neste trabalho, além dos gases comumente utilizados nos ensaios de
proliferação em membranas de quitosana tratadas por plasma, também
utilizamos o hidrogênio e o metano. Com esses gases também obtivemos bons
resultados. Isso demonstra que os gases utilizados no tratamento por plasma
podem modificar as superfícies de biomateriais deixando-os mais
biocompatíveis. Essas modificações que o plasma provocou nas membranas
como aumento da molhabilidade, modificação da topografia e energia de
superfície (componentes polar e dispersiva) melhoraram a proliferação dos
fibroblastos sobre a quitosana.
O aumento de fibroblastos sobre as membranas de quitosana tratadas
por plasma é um indicativo de que curativos a base de quitosana tratados por
plasma possam promover uma melhor e mais rápida cicatrização da pele.
Para a validação do ensaio de proliferação, aplicou-se a análise
estatística utilizando o teste ANOVA e o teste t-student. O resultado obtido
mostrou que o ensaio foi significativo para p<0,001em todas as condições.
4.2.3 – Morfologia Celular
Células de ancoragem-dependente como fibroblastos, células
osteoblásticas e endoteliais precisam aderir para depois proliferar.
Considerando que os materiais estudados neste trabalho poderão ser usados
como curativos para a pele, o efeito da modificação da superfície foi avaliado
pela morfologia das células cujo fenótipo fibroblástico é indicativo de
espalhamento e boa adesão.
74
A figura 4.17 e a figura 4.18 mostram fotomicrografias de células
aderidas em materiais não tratados e tratados depois de 3 e 7 dias de cultura
respectivamente.
Figura 4.17: Micrografia de fibroblastos sobre membranas de quitosana não tratada. (a) 3 dias
de cultura, (b) 7 dias de cultura.
(b)
(a)
75
Figura 4.18: Micrografia de fibroblastos sobre membranas de quitosana tratada. (a) 3 dias de
cultura, (b) 7 dias de cultura.
Observa-se que na figura 4.17 das amostras não tratadas por plasma,
que as células aderentes não apresentam características morfológicas de
células fibroblasticas nos três primeiros dias (forma arredondada das células) e
somente no sétimo dia observa-se o alongamento das células. Isso indica uma
(b)
(a)
76
deficiência na duração da resposta celular e um pobre ancoramento das
células ao material.
Por outro lado na figura 4.18 das amostras tratadas por plasma, as
células demonstram muito boa aderência para estas superfícies, pois no
terceiro dia de cultivo as células já estavam apresentando um citoplasma
alongado típico das células fibroblásticas. Os tratamentos por plasma
certamente provocaram alterações nas propriedades físico-químicas das
membranas de quitosana apropriadas para a adesão e proliferação de
fibroblastos. Esta hipótese foi confirmada depois de 7 dias de cultura em que
observou-se uma confluência das células em torno de 70%.
O não espraiamento de algumas células também foi observado em
membranas tratadas por plasma de metano 45 e 60 minutos. Essas amostras
apresentaram uma diminuição da molhabilidade e da rugosidade. Além disso,
observou-se nessas amostras, a presença de precipitados de carbono (pontos
pretos sobre a membrana, após o tratamento por plasma de metano), oriundo
da quebra das moléculas de CH4 durante o tratamento por plasma. Esses
fatores citados acima podem ter influenciado no não espraiamento das células
nas membranas tratadas por plasma de metano por 45 e 60 minutos confirme a
figura 4.19.
Figura 4.19: Precipitados de carbono nas amostras tratadas por metano (45 min). Após
três dias de proliferação. Aumento de 200.
77
4.3 – Comparações da proliferação com as propriedades obtidas para as
membranas quitosana
4.3.1 Ângulo de Contato X Proliferação
Na figura 4.20 observa-se o gráfico da relação ângulo de contato versus
proliferação. As superfícies analisadas neste trabalho apresentaram
características de moderadamente hidrofílicas, super-hidrofílicas e
moderadamente hidrofóbicas. As superfícies que se apresentam
moderadamente molháveis, são passíveis de uma boa interação com o meio
biológico [78].
Através deste gráfico procurou-se encontrar uma relação entre ângulo
de contato e proliferação celular nas membranas de quitosana. Observa-se que
a proliferação aumenta, à medida que diminuí o ângulo de contato nos
tratamentos com plasma de argônio, oxigênio, hidrogênio e metano. No
tratamento com plasma de nitrogênio não observou-se essa relação, o valor do
ângulo permaneceu constante em todos os tratamentos e mesmo assim houve
um aumento da proliferação. Provavelmente outra propriedade pode estar,
influenciando o aumento da proliferação.
Figura 4.20: Relação entre ângulo de contato e proliferação.
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NT
Ar
15
Ar
30
Ar
45
Ar
60
O 1
5
O 3
0
O 4
5
O 6
0
N2
15
N2
30
N2
45
N2
60
H2
15
H2
30
H2
45
H2
60
CH
4 1
5
CH
4 3
0
CH
4 4
5
CH
4 6
0
Pro
life
raç
ão
(%
)
An
gu
lo d
e C
on
tato
(°)
Proliferação Ângulo de contato (água)
78
Realizando teste de correlação de Pearson entre a proliferação e o
ângulo de contato, constatou-se que existe uma correlação negativa entre
ângulo de contato e proliferação.
Os tratamentos com plasma de Ar, O2, apresentaram uma correlação
muito forte entre ângulo de contato e proliferação, apresentando valores de
correlação de Pearson é igual a -0,90 e -1,00 respectivamente. Para os
tratamentos com H2, a correlação foi forte de -0,83. Em relação ao tratamento
com metano a correlação foi moderada, igual a -0,66. Quanto ao tratamento
com nitrogênio, a correlação foi bem fraca, igual a 0.
4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação
Ponsonet e colaboradores relacionaram componente polar da energia de
superfície com o comportamento de células fibroblásticas sobre a superfície de
titânio. Eles associaram a alta adesão obtida com a baixa energia superficial,
na ordem de ⁄ [75].
Em pesquisas realizadas com polímeros tratados por plasma observa-se
que alguns autores como López-Pérez et. al. (2007) e Espósito et. al (2007)
que modificaram quitosana e PLGA, respectivamente por plasma de oxigênio
relacionaram o aumento da proliferação ao aumento da energia de superfície.
Entretanto nos trabalhos de Silva et. al. (2008) observa-se uma diminuição da
energia de superfície em membranas de quitosana tratadas por plasma de
nitrogênio e argônio e mesmo assim houve um aumento da proliferação celular
[17, 87,62].
Os valores obtidos neste trabalho foram bem variáveis entre 37,01 e
74,29. Nos tratamentos com os gases argônio e metano houve diminuição da
energia de superfície e para os tratamentos por plasma de nitrogênio, oxigênio
e hidrogênio houve aumento da energia de superfície (Fig. 4.21) e em todos os
tratamentos houve um aumento da proliferação celular em relação às amostras
não tratadas.
No teste estatístico de correlação de Pearson, para energia de superfície
e proliferação, encontraram-se os seguintes resultados: Para as amostras
tratadas por plasma de Ar ocorreu uma correlação moderada e positiva de
79
0,64. Nas amostras tratadas por plasma de O2 a correlação foi muito forte e
positiva igual a 1. Os tratamentos realizados com plasma de metano
apresentaram uma correlação fraca e negativa -0,14. Os tratamentos com
nitrogênio tiveram uma correlação forte e negativa. -0.70. E para os
tratamentos com hidrogênio a correlação foi forte também, mas positiva, 0,87.
Figura 4.21: Relação entre energia superficial e proliferação.
4.3.3 - Rugosidade X Proliferação
O sucesso da proliferação de células nos biomateriais não depende
somente das propriedades físico-química, tais como energia de superfície, mas
também da rugosidade e topografia [79, 80, 81]. Entretanto, na maioria dos
casos relatados na literatura somente o parâmetro Ra é apresentado e
relacionado com a proliferação celular. Neste trabalho observou-se que para
valores semelhantes de Ra, foram obtidos diferentes graus de proliferação (Fig.
4.25).
Neste trabalho, além da rugosidade Ra, relacionou-se a proliferação com
os parâmetros Rp, Rz e Rp/Rz. Estes parâmetros são importantes para a
caracterização topográfica das amostras, com relação ao formato dos picos.
Valores de Rp/Rz iguais ou acima de 0,5 nm são considerados picos
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pro
life
raç
ão
(%
)
Ten
são
Su
perf
icia
l (m
J/m
^2)
Proliferação Polar Dispersiva Total
80
pontiagudos e menores que 0,5 nm picos arredondados. Os picos encontrados
nas membranas de quitosana tratadas por plasma são pontiagudos com o valor
de Rp/Rz em torno de 0,5 a 0,82 nm (Fig. 4.22).
Figura 4.22: Relação entre rugosidade e proliferação.
Aplicando o teste de correlação de Person entre a rugosidade e a
proliferação celular observa-se que para a rugosidade Ra houve uma
correlação positiva muito forte e forte nos tratamentos realizados com plasma
de argônio (0,98), oxigênio (0.84) e hidrogênio (0,89) e uma correlação positiva
e moderada para metano (0,50) e nitrogênio (0,65).
Para a rugosidade Rp houve uma correlação positiva forte para Ar
(0,81), O2 (0,84), N2 (0,87) e muito forte para H2 (0,91). Para o metano a
correlação foi positiva e moderada (0,68). Em relação à rugosidade Rz, seguiu
os mesmos padrões da rugosidade Rp. Argônio (0,78); oxigênio (0,86);
nitrogênio (0,74); hidrogênio (0,90).
Para a rugosidade Rp/Rz houve uma mudança na correlação. Para as
amostras tratadas por plasma de Ar, CH4, N2, houve uma correlação positiva
forte, 0,77; 0,73 e 0,77 respectivamente. As amostras tratadas por plasma de
O2, a correlação foi positiva e moderada, 0,44. Nas amostras de H2 a
correlação foi negativa e muito forte, -0.94.
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
0
20
40
60
80
100
Pro
life
raç
ão
(%
)
Ru
go
sid
ad
e (
nm
)
Proliferação Rp Rz Rp/Rz *100 Ra
81
Acredita-se então que além da topografia, outros fatores como os
citados acima influenciem, conjuntamente, na resposta biológica das
membranas. Ou seja, não existe um parâmetro único que irá influenciar a
proliferação celular sobre o biomaterial, mas sim um conjunto de parâmetros
em condições ideais que iriam propiciar uma maior proliferação. E estes
conjuntos de parâmetros provavelmente serão diferentes em cada biomaterial a
ser estudado.
Capítulo 5
Conclusões e Perspectivas
83
5.1 – Conclusões
Através da análise dos parâmetros analisados, pode-se concluir que:
Os tratamentos por plasma melhoraram a proliferação de fibroblastos sobre as
membranas de quitosana. Destacando-se os tratamentos por plasma de
argônio 60 min, oxigênio 60 min, metano 15 min.
Com o tratamento por plasma de hidrogênio obteve-se membranas com uma
superfície com porosidade uniforme.
Os tratamentos por plasmas demonstram ter um grande potencial para a
esterilização das membranas. Sobressaindo-se os tratamentos com argônio,
nitrogênio e hidrogênio.
Observando os resultados das análises realizadas neste trabalho, verifica-se
que vários parâmetros influenciam a adesão e proliferação celular. Entretanto a
rugosidade e molhabilidade são os parâmetros de maior influência.
Em escala micrométrica, apenas nas membranas tratadas com H2 foi possível
observar modificação na topografia. Verificou-se a presença de vales cuja
profundidade foi proporcional ao tempo de tratamento.
Em escala nanométrica, verificou-se que todas as condições resultaram na
modificação topográfica. Após os tratamentos por plasma as membranas
apresentaram uma superfície com picos pontiagudos, com Rp/Rz > 0,5.
As membranas tratadas apresentaram vários níveis de molhabilidade, tendo
amostras moderadamente hidrofílicas, super – hidrofílicas (tratadas com N2) e
moderadamente hidrofóbicas (tratadas com CH4).
As membranas depois dos tratamentos apresentaram energia de superfície
entre 60 e 70 mJ/m2 para amostras tratadas com N2, H2 ou O2 e
aproximadamente igual a 40 mJ /m2 para amostras tratadas com Ar, CH4 ou
amostras não tratadas.
Quanto a morfologia celular, as células tratadas apresentaram um formato
alongado com 3 dias de cultivo sobre as membranas de quitosana tratadas, o
que não aconteceu com as membranas não tratadas e com as amostras
tratadas por plasma de metano 45 e 60 minutos.
84
5.2 – Sugestões de Trabalhos Futuros
Ensaio de adesão dos fibroblastos
Estudo sobre a correlação das espécies químicas presentes no plasma durante
o tratamento por plasma e as espécies químicas presentes na superfície da
membrana após os tratamentos.
Correlação da proliferação dos fibroblastos e as espécies químicas presentes
na superfície da membrana.
Estudo das propriedades mecânicas das membranas de quitosana antes e
depois do tratamento por plasma.
Realizar ensaios mecânicos após os ensaios de proliferação.
Realizar estudos de proliferação com outros tipos celulares.
85
Lista de Trabalhos Publicados Relacionados à Tese
Revistas
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; D.L. Gomes; N.F. Daudt; H.A.O. Rocha; C.
Alves Jr. USE PLASMA OF OXYGEN, ARGON AND METHANE FOR
STERILIZATION OF CHITOSAN MEMBRANES. Artificial Organs (Submetido –
em análise pós-correções sugeridas).
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; G.C, Silva; M.A.M, Silva; C, Alves Jr.
Estudo comparativo da modificação superficial de membranas de
quitosana tratadas por plasma de oxigênio, nitrogênio e hidrogênio.
Revista Eletrônica de Materiais e Processos (UFCG), v.7, (2012) 95 – 103.
ISSN 1809 – 8797.
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; J.C.P, Barbosa; C.L.B, Guerra Neto;
M.R.Pereira. O uso do plasma de nitrogênio para modificação superficial
em membranas de quitosana. Revista Brasileira de Inovação Tecnológica em
Saúde, v.2, (2011) 7- 22. ISSN 2236 – 1103.
Congressos
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; D.L. Gomes; N.F. Daudt; H.A.O. Rocha; C.
Alves Jr. O uso do plasma de oxigênio, metano, argônio para esterilização
de membranas de quitosana. 7º Congresso Latino Americano de Órgãos
Artificiais e Biomateriais, 2012.
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; D.L. Gomes; N.F. Daudt; H.A.O. Rocha; C.
Alves Jr. Proliferação de fibroblastos em membranas de quitosana
tratadas por plasma de oxigênio, argônio e metano. 7º Congresso Latino
Americano de Órgãos Artificiais e Biomateriais, 2012.
M.O.C, Macêdo; H. R. A. Macêdo; D.C. Braz; N.F. Daudt; C. Alves Jr. Efeito
do Plasma de hidrogênio e oxigênio na superfície de membranas de
quitosana. 20º CBECIMat - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos
Materiais, 2012.
86
Lista de trabalhos publicados (Outros)
Revista
N. F. Daudt; J.C.P. Barbosa, M. O. C Macêdo; M. B. Pereira; C. Alves Júnior.
Effect of Cage Configuration in Structural and Optical Properties of TiN
Films Grown by Cathodic Cage Discharge. Material Research, ahead of
print, pp. 0-0. Epub, May 10, 2013. ISSN 1516-1439.
M.O.C, Macêdo; H.R.A, Macêdo; A.B. Nascimento Neto; M.A.M Silva; C.L.B
Guerra Neto; C. Alves Jr. Estudo da porosidade de arcabouços de Ti-Nb2O5
para aplicação biomédica. Revista Brasileira de Inovação Tecnológica em
Saúde, v.2 (2012), 10-15.
H.R.A, Macêdo; M.O.C, Macêdo; R.F.M Silveira; C.L.B, Guerra Neto;
N.F.Daudt; H.A.O, Rocha; C. Alves Jr. Proliferação celular em discos de
titânio grau 2 temperados e revenidos. Revista Brasileira de Inovação
Tecnológica em Saúde, v.2 (2012), 25-31.
N.F.Daudt; J.C.P. Barbosa; M.O.C, Macêdo; A.B. Nascimento Neto; C.L.B,
Guerra Neto; C. Alves Jr. Estudo da viabilidade da técnica de plasma em
descarga de gaiola catódica para obtenção de filmes de TiN para
revestimento biocompatíveis. Revista Brasileira de Inovação Tecnológica em
Saúde, v.2 (2012), 16-24.
H.R.A, Macêdo; M.O.C, Macêdo; H.A.O, Rocha;C.L.B, Guerra Neto; C. Alves
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Brasileira de Inovação Tecnológica em Saúde, v.1 (2011), 4-12
C.L.B Guerra Neto; H.R.A, Macêdo; M.O.C, Macêdo; M.A.M Silva; C. Alves Jr.
Nitretação do titânio em cátodo oco para uso biomédico. Revista Brasileira
de Inovação Tecnológica em Saúde, v.2 (2011), 23-31.
87
H.R.A, Macêdo; M.O.C., Macêdo; D.O. Freitas; C. Alves Jr. Estudo da
molhabilidade do titânio tratado termicamente. Revista Eletrônica de
Materiais e Processos – UFCG, v.5 (2010), 61-67.
Congressos
M.O.C, Macêdo; H.R.A, Macêdo; L.C.D. Santos; C.Alves Jr. Preparation and
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