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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX. Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT. Ms. Karina Bettega Felipe. Florianópolis, maio de 2011. 1. Princípio. 2. Amostra. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX
Florianópolis, maio de 2011
Ms. Karina Bettega Felipe
Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT
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1. Princípio
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2. Amostra Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar
após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.
3. Reagentes/soluções/suspensão celular
Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose
suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de
antibióticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina
10.000µg/mL (1%);
Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL
Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de
meio de cultura completo
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Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL
4. Procedimento Preparar uma suspensão celular na concentração de
0,5X105 células/mL:
a) Retirar o meio de cultura da garrafa
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b) Lavar a garrafa com PBS
c) Adicionar a tripsina
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d) Esperar a tripsina reagir
e) Preparo do meio de inativação
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f) Inativar a tripsina
g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon
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h) Centrifugar as células
i) Retirar meio com tripsina
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j) Ressuspender as células em meio simples
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k) Contar as células
Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra
Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10
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l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL
-200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL
- Contagem de células: 5 X 105 células/mL
-Número de células necessárias:
0,5 X105 células – 1000µl
X - 19200µl
X= 9,6 X105 células
5 X105 células – 1000µl
9,6X105 células- X
X= 1920µl
- Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células?
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- Suspensão utilizada para o teste:
- Precisaremos de 19.200µl 1920µl de soro
192µl de antibiótico
1920µl da suspensão celular
15168µl de meio
5 X105 células – 1000µl
0,5 X105 células - X
X= 100µl
100µl (0,5 X105 células) – 1000µl
X - 19200µl
X= 1920
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Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço
Preparo da suspensão celular
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24h
24, 48 ou 72 h
TRATAMENTO
Retirar o meio de cultura
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Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL)
Solução mãe
(1000µg/mL)
100µg/mL
1800µL meio
200µL
50µg/mL
1000µL meio
25µg/mL
1000µL meio
12,5µg/mL
1000µL meio
6,25µg/mL
1000µL meio
3,125µg/mL
1000µL meio
1000µL 1000µL 1000µL
1000µL
1000µL
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
100
100
50
50
50
25
25
25100
12,5
12,5
12,5
6,25
6,25
6,25
3,125
3,125
3,125
CTRL
CTRL
CTRL
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24h
24, 48 ou 72 h
TRATAMENTO
Retirar o meio de cultura
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O que vocês vão fazer!!!
Preparar solução
MTT
2h
5’
540 nm
Adicionar DMSO
Estabilização da cor
Lavar os poços 2X com PBS
Retirar o meio
5’
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Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL)
a) Preparo da solução estoque a 5mg/mL
- Pesar 5mg de MTT
- Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril.
b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL)
CV=CV
5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL
V= 1mL da solução estoque
+ 9 mL de meio completo
900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio
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O que vocês vão fazer!!!
Preparar solução
MTT
2h
5’
540 nm
Adicionar DMSO
Estabilização da cor
Lavar os poços 2X com PBS
Retirar o meio
5’
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Cálculos
Descontar o branco !
Fazer a média da absorbância
Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras