UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FISIOLÓGICAS

JOSÉ GUILHERME FERREIRA MARQUES GALVÃO

PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR:

ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS

JOÃO PESSOA – PB

2016

JOSÉ GUILHERME FERREIRA MARQUES GALVÃO

PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA PULMONAR:

ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS

Dissertação apresentada ao Programa

Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências

Fisiológicas do Centro de Biotecnologia, da

Universidade Federal da Paraíba como parte

dos requisitos para obtenção do título de

MESTRE EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS.

Orientadora: Profa. Dra. Sandra Rodrigues Mascarenhas

JOÃO PESSOA – PB

2016

DEDICATÓRIA

À minha fortaleza da inspiração, meus amados pais José Rosalvo e Gilda

À minha fortaleza do amor, minha alma gêmea Alynne

À minha fortaleza da verdade, meus queridos irmãos Lucas e Aurélio Neto

AGRADECIMENTOS

A Deus, aquele que sustenta todas as coisas pela palavra do seu poder, sendo

a luz das nossas pesquisas e vidas.

À minha orientadora, Profa. Sandra Rodrigues Mascarenhas, por ter me

ensinado antes de qualquer coisa, o verdadeiro sentido do altruísmo científico.

Obrigado por todas as oportunidades e principalmente por acreditar em mim,

quando até eu mesmo duvidei. A senhora é um dos seres humanos mais

incríveis que existe. O melhor humor ácido. O timing britânico mais oportuno. E

ainda reserva espaço para ser a mãe científica mais amiga.

Aos meus pais, José Rosalvo e Gilda, por toda a torcida e confiança ao longo

dos anos. Eu sei o quanto foi difícil para vocês, abrir mão de sonhos para

compartilhar dos nossos (seus filhos). Obrigada pelos seus ensinamentos, e

por mostrar que o respeito ao próximo sempre estará ligado a aceitar as

diferenças. A eterna gratidão, é o sentimento mais precioso que eu sinto nesse

momento. Eu amo muito vocês!

À minha esposa, Alynne, o meu porto seguro e minha verdadeira companheira

de jornada. Não entramos no caminho um do outro por acaso, tenho certeza

disso. Eu te amo por tudo! Pelo apoio incondicional – mesmo com os conselhos

e puxões de orelha mais certeiros – e por nunca se negar a enfrentar o mundo

como um só. Você é a minha pessoa.

Aos meus irmãos de sangue José Lucas e Aurélio Neto. Posso até ser o mais

velho, mas tenham a certeza de que vocês me ensinaram muito mais do que

imaginam por todas as nossas vidas. E ao irmão de coração Danilo Duarte,

pela alegria e coragem que inspira. Obrigado infinitamente pelas risadas e pela

sensação única de pertencimento. Nós nunca estaremos sozinhos.

Aos meus familiares, primos e tios – em especial às tias Lena (in memorian) e

Dodó –, por ter sonhado junto comigo e comemorado cada conquista como se

fosse a última! Vocês fizeram os retornos ao meu sertão serem mais calorosos

e especiais.

Aos meus sogros, Verônica e Roberto, e meus queridos cunhados João

Paulo e Gabriel, por terem sido minha segunda família desde o início. Sei o

quanto vocês confiam em mim e agradeço muito por isto.

Aos que fazem do Laboratório de Imunofarmacologia a melhor família de

irmãos, primos e tios científicos! Em especial ao grande irmão Luiz Henrique

por todo o companheirismo, amizade e ensinamentos nos últimos dois anos, e

às parceiras de asma, Laércia, Larissa, Talissa e Deyse. À professora Marcia

Regina Piuvezam, pelo apoio científico no laboratório, sempre com conselhos

pontuais e aos professores Cláudio e Giciane. Aos egressos e saudosos

Jacqueline, a irmã científica mais velha que me ensinou os primeiros passos

na imunologia e Adriano, o truqueiro mais bacana e histológico.

Aos professores e funcionários da Pós-Graduação em Fisiologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP), por toda a atenção e

cuidado que tiveram durante meu cumprimento dos créditos por lá. Foi uma

experiência indescritível estar com todos vocês.

Aos amigos do sertão, Júnior, Dênis, Aninha e Raquel por garantirem a

felicidade da volta. Aos amigos da graduação, Renan, André e Jucélio, pela

torcida e por terem sido o começo. Às amigas de república, Ana Jéssica e

Flávia, a companhia de vocês em Ribeirão Preto, mesmo que curta, nos trouxe

histórias e aprendizados para uma vida.

Aos professores da banca de mestrado, Maria do Socorro de França Falcão

(CBiotec, UFPB), Carmen Cabanelas Pazos de Moura (IBCCF, UFRJ) e

Marcia Regina Piuvezam (CCS, UFPB), por prontamente aceitarem o convite

para participar desta banca e pelas contribuições dadas a este trabalho.

A Crispim Duarte por seu excelente trabalho desempenhado junto ao Biotério

Prof. Dr. Thomas George.

A todos que fazem parte do Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em

Ciências Fisiológicas e do Centro de Biotecnologia (UFPB).

À Universidade Federal da Paraíba por possibilitar a realização desta

pesquisa, e ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.

“Não adianta a gente ficar sentado se preocupando.

O que tiver que ser será, e nós o enfrentaremos quando vier.”

(Harry Potter e o Cálice de Fogo)

RESUMO

GALVÃO, J. G. F. M. PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA

PULMONAR: ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS. 2016. Dissertação.

(Departamento de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa – PB, 2016).

A ouabaína (OUA), um potente inibidor da Na+/K+ ATPase, foi identificada como

uma substância endógena presente no plasma humano. Nos últimos anos, foi

evidenciado que a OUA é capaz de interferir em diversos aspectos do sistema

imunológico e em diferentes modelos de inflamação, porém o seu efeito na

inflamação alérgica pulmonar não tinha sido investigado previamente.

Processos inflamatórios alérgicos das vias aéreas inferiores são caracterizados

por migração celular e hiperresponsividade brônquica, em decorrência da

sensibilização por antígenos proteicos como a ovalbumina (OVA). Objetivo:

Avaliar o efeito da ouabaína no modelo de inflamação alérgica pulmonar

induzida por OVA. Métodos: Camundongos BALB/c fêmeas (n = 6) foram

sensibilizados e desafiados com OVA e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.)

com OUA (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações e uma hora antes

destas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de cada

desafio. Parâmetros da inflamação alérgica, como migração celular e produção

de citocinas no fluido do lavado broncoalveolar (BALF), produção de muco e

remodelamento histopatológico pulmonar quantificação de IgE sérica, foram

analisados posteriormente. Resultados: A ouabaína reduziu em 60% o número

total de células presentes no BALF como um reflexo da inibição de leucócitos

polimorfonucleares e linfócitos T CD3+, bem como a produção de citocinas do

fenótipo Th2, IL-4 e IL-13. Ademais, a ouabaína reduziu os parâmetros

inflamatórios histopatológicos, como hiperplasia das células caliciformes com

consequente diminuição de muco, além de reduzir o título de OVA-IgE

específica. Conclusão: Estes dados sugerem que a OUA apresenta efeito anti-

inflamatória no modelo de inflamação alérgica pulmonar, modulando

parâmetros do fenótipo Th2.

Palavras chaves: digitálicos cardiotônicos, linfócito, neutrófilo, alergia.

ABSTRACT

GALVÃO, J. G. F. M. PAPEL DA OUABAÍNA NA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA

PULMONAR: ASPECTOS FENOTÍPICOS E FUNCIONAIS. 2016. Dissertation.

(Departamento de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa – PB, 2016).

Ouabain (OUA), a potent Na+/K+ ATPase inhibitor, was identified as an

endogenous substance present in human plasma. It was shown that OUA is

able to interfere in several aspects of the immune system and inflammation, but

the effect of this substance in allergic lung inflammation had not been previously

investigated. Lower airways inflammation process is characterized by cell

migration and bronchial hyperresponsiveness, as a result of sensitization by

protein antigens such as ovalbumin (OVA). Aim: Evaluate the effect of ouabain

on the model of allergic pulmonary inflammation induced by OVA. Methods:

BALB/c mice (n = 6) were sensitized and challenged with OVA and pretreated

intraperitoneally (ip) with OUA (0.56 mg/kg) two days before the sensitization

and one hour before them, or dexamethasone (2 mg/kg) subcutaneously 1 hour

before to each challenge. Allergic inflammation parameters, such as cell

migration, and production of cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),

mucus production and pulmonary histopathologic remodeling, and IgE

quantitation were analyzed posteriorly. Results: Ouabain reduced (60%) BALF

cells as a reflex of polymorphonuclear leukocyte inhibition and T CD3+

lymphocytes, as well as it reduced the production of Th2 profile cytokines, IL-4

and IL-13. Furthermore, ouabain also reduced histopathologic parameters of

inflammation, such as hyperplasia of goblet cells and with consequent mucus

decrease, besides it reduced OVA-specific IgE titer. Conclusion: These results

suggests that OUA presents anti-inflammatory effect on pulmonary allergic

inflammation, modulating Th2 phenotype parameters.

Keywords: cardiotonic digitalics, lymphocyte, neutrophils, allergy.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química da ouabaína .................................................. 21

Figura 2. Efeitos imunomoduladores da ouabaína .................................... 24

Figura 3. Fisiopatologia da asma alérgica ................................................. 28

Figura 4. Esquema representativo do protocolo experimental de inflamação

pulmonar alérgica induzida por ovalbumina .............................................. 39

Figura 5. Esquema representativo da contagem de células totais e diferenciais

.................................................................................................................... 41

Figura 6. Esquema representativo das subpopulações de leucócitos, por

tamanho e granularidade celular, após análise por citometria de fluxo ..... 42

Figura 7. Esquema representativo da quantificação de citocinas pelo Ensaio

Imunoenzimático de ELISA sanduíche ....................................................... 43

Figura 8. Esquema representativo da preparação do corte histológico pulmonar

..................................................................................................................... 45

Figura 9. Esquema representativo da dosagem de IgE OVA-específica pelo

método de Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) ........................................... 48

Figura 10. Análise histopatológica do efeito da ouabaína sob o modelo de

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com

hematoxilina-eosina (HE) ........................................................................... 61

Figura 11. Efeito da ouabaína sobre as alterações histopatológicas no modelo

de inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com

coloração P.A.S. (Ácido Periódico de Schiff) ............................................. 64

Figura 12. Esquema representando os efeitos da ouabaína no processo

inflamatório alérgico pulmonar obtidos neste trabalho ............................... 76

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Efeito da ouabaína na migração de leucócitos totais e diferenciais

(linfócitos, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) para o espaço broncoalveolar

na inflamação alérgica pulmonar experimental induzida por OVA .................. 51

Gráfico 2. Efeito da ouabaína na porcentagem de granulócitos (eosinófilos e

neutrófilos) no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ...... 54

Gráfico 3. Percentual de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) no BALF após

o tratamento com ouabaína na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

.......................................................................................................................... 55

Gráfico 4. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na porcentagem de linfócitos

T CD3+ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ........... 57

Gráfico 5. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na produção das citocinas

IL-13, IL-4 e IFN-γ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

......................................................................................................................... 59

Gráfico 6. Score histológico de parâmetros inflamatórios no modelo de

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ............................................ 62

Gráfico 7. Análise quantitativa da presença de muco na região bronquiolar em

cortes histológicos no modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por

OVA ................................................................................................................. 66

Gráfico 8. Efeito da ouabaína no título de IgE-OVA específica no modelo de

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ............................................ 65

LISTA DE ABREVIATURAS

ANG II = Angiotensina II

ANOVA = Análise de variância

ATP = Trifosfato de adenosina

Al(OH)3 = Hidróxido de sódio

BALF = Fluido do lavado broncoalveolar

CD = Cluster of diferenciation

CEUA = Conselho de ética no uso de animais

DEXA = Dexametasona

ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay

FACS = Fluorescent-activated classificador de células

FSC = Forward scattered hight

FITC = Isotiocianato de fluoresceína

FcεRI = Receptor de alta afinidade pela região Fc da imunoglobulina E

HE = Hematoxilina-eosina

e.p.m. = Erro padrão da média

i.p. = Intraperitoneal

i.v. = Intravenosa

INF-γ = Interferon gama

IL = Interleucina

IgE = Imunoglobulina E

GATA 3 = Proteína 3 ligante do GATA

K+ = Íon potássio

LAK = Linfoquinas

LB = Linfócitos B

MAPK = Proteína cinase ativada por mitógeno

MHC-II = Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II

nM = Nanomolar

Na+ = Íon sódio

Na+/K+- ATPase = Bomba sódio, potássio ATPase

NFATc = Fator nuclear de ativação de células T c1

NF-κB = Fator de transcrição nuclear κB

OUA = Ouabaína

OVA = Ovalbumina

pM = Picomolar

PAS = Ácido periódico de Schiff

PCA = Anafilaxia cutânea passiva

PFE = Pico de fluxo expiratório

SSC = Side scattered hight

SNC = Sistema nervoso central

Th = T helper

TNF-α = Fator de necrose tumoral α

TPA = Éster de forbol

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................ 20

2.1 Ouabaína ............................................................................................................................ 21

2.2 A ouabaína e o sistema imunológico ......................................................................... 23

2.3 A inflamação alérgica pulmonar e os fenótipos da asma ..................................... 25

2.4 A fisiopatologia da asma alérgica Th2 ....................................................................... 27

3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................... 34

4. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 36

4.1 Objetivo geral ................................................................................................................... 37

4.2 Objetivos específicos ..................................................................................................... 37

5. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 38

5.1 Material ............................................................................................................................... 39

5.1.1 Substâncias e sais ....................................................................................................... 39

5.1.2 Aparelhos e equipamentos ........................................................................................ 39

5.2 Métodos .............................................................................................................................. 39

5.2.1 Animais ........................................................................................................................... 39

5.2.2 Grupos experimentais ................................................................................................. 39

5.2.3 Protocolo experimental de inflamação pulmonar alérgica induzida por OVA

..................................................................................................................................................... 40

5.2.4 Contagem de células totais e diferenciais no fluido do lavado

broncoalveolar (BALF) .......................................................................................................... 41

5.2.5 Diferenciação de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) e marcação celular

de subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF ......................................................... 43

5.2.6 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF .................................. 44

5.2.7 Histologia pulmonar .................................................................................................... 45

5.2.7.1 Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE) ......................................................... 47

5.2.7.2 Coloração P.A.S. (Ácido Periódico – Schiff) ...................................................... 48

5.2.8 Dosagem do título de IgE OVA-específica............................................................. 49

5.2.9 Análise estatística ........................................................................................................ 50

6. RESULTADOS ..................................................................................................................... 51

6.1 Efeito da ouabaína na migração de células totais e diferenciais para o fluido

do lavado broncoalveolar (BALF) ...................................................................................... 52

6.2 Efeito da ouabaína no percentual de granulócitos no BALF na inflamação

alérgica pulmonar analisado por citometria de fluxo ................................................... 55

6.3 Efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos T CD3+ presentes no

BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA ........................................ 58

6.4 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF na inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA ................................................................................ 60

6.5 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na

inflamação alérgica pulmonar induzia por OVA corados com hematoxilina-eosina

(HE)............................................................................................................................................. 62

6.6 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA corados com P.A.S. (Ácido

Periódico de Schiff) ............................................................................................................... 65

6.7 Efeito da ouabaína sob o título de IgE-OVA específica na inflamação alérgica

pulmonar experimental ......................................................................................................... 68

7. DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 70

8. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 78

REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 81

APÊNDICE A - Substâncias e sais ....................................................................................... 95

APÊNDICE B - Aparelhos e equipamentos ......................................................................... 97

ANEXOS .................................................................................................................................... 98

16

1. INTRODUÇÃO

17

A ouabaína é um glicosídeo cardiotônico que foi inicialmente isolada das

cascas, raízes e sementes de plantas pertencentes a família das Apocynaceae,

como a Acocanthera ouabaio e a Strophanthus gratus. Agindo como um

inibidor da Na+K+-ATPase, este glicosídeo foi utilizado por muitos anos no

tratamento da insuficiência cardíaca congestiva (NICHOLS; MALDONADO,

1993). A identificação da ouabaína como uma substância endógena no plasma

e tecidos de mamíferos superiores (HAMLYN et al., 1991; FERRANDI et al.,

1997) possibilitou sua utilização como agente efetor em diversos mecanismos

reguladores e mantenedores da homeostase (BAGROV et al., 2008). Esse

glicosídeo é produzido principalmente pelas glândulas adrenais, hipófise e

hipotálamo (FERRANDI et al., 1997; TYMIAK et al., 1993; KAWAMURA et al.,

1999; SCHONER et al., 2000) e estudos sugerem que em situações de

estresse agudo ocorre uma maior liberação de ouabaína, tal como a produção

de cortisol durante o exercício físico (GOTO et al., 1995) e durante a gravidez

(VAKKURI et al., 2000), sendo ambas as liberações reguladas pelos mesmos

fatores endócrinos.

O papel imunomodulador da ouabaína foi evidenciado a partir da sua

capacidade de inibir a proliferação de linfócitos induzida por diversos mitógenos

como a fito-hemaglutinina (QUASTEL et al., 1968; OLEJ et al., 1998), éster de

forbol (OLEJ et al., 1994) e concanavalina-A (SZAMEL et al., 1981;

RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008). A ouabaína induz a redução na

expressão de mCD14 em monócitos humanos (VALENTE et al., 2009),

aumenta a expressão da molécula CD69 na superfície de timócitos

(RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2003), sendo capaz também de reduzir

os níveis de MAPK p38 fosforilada e de NFATc1 (RODRIGUES-

MASCARENHAS et al., 2008) nessas mesmas células. Adicionalmente, nosso

grupo demonstrou que a ouabaína possui efeito anti-inflamatório e

antinociceptivo (VASCONCELOS et al., 2011), bem como modula eventos

moleculares da inflamação aguda ao reduzir a ativação de NF-κB em peritonite

induzida por zimosan (LEITE et al., 2015).

A inflamação é definida como uma resposta adaptativa que pode ser

desencadeada por estímulos endógenos e exógenos, resultando numa grande

18

variedade de processos fisiológicos e patológicos (MEDZHITOV, 2008).

Durante a resposta inflamatória, o limite entre os efeitos benéficos – que levam

a adaptação a desregulação fisiopatológica dos tecidos – e os efeitos

descontrolados – que levam ao desequilíbrio homeostático – pode ser

facilmente ultrapassado (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Desta forma,

entende-se que o estado inflamatório patológico está diretamente ligado ao

desenvolvimento de doenças como a artrite reumatoide (SILVERSTEIN et al.,

2000), a doença de Crohn (ATREYA et al., 2000), a asma alérgica (SIMPSON

et al., 2010) dentre outras.

Pouco se sabe sobre a ação da ouabaína em quadros inflamatórios

alérgicos. Foi demonstrado que em pacientes com asma moderada, baixas

concentrações dessa substância são capazes de causar broncodilatação

(AGRAWAL et al., 1986) e que ela é capaz de modular a liberação de

histamina em mastócitos (SENOL et al., 2007; LAGO et al., 2001). A asma é

uma doença infamatória crônica, na qual muitas células do sistema imune inato

e adaptativo agem em associação com células epiteliais, causando hiper-

reatividade brônquica, produção exacerbada de muco e remodelamento das

vias aéreas inferiores (SIMPSON et al., 2010). Essa doença inflamatória afeta

todas as idades, porém se apresenta com maior magnitude em crianças e

adolescentes, podendo os sintomas variar quanto à gravidade e frequência. É

relatada também uma maior incidência de ataques de asma no período noturno

e na realização de atividades físicas (BARNES, 2008).

Durante uma crise de asma, a mucosa dos brônquios intumesce,

resultando em estreitamento das vias aéreas e redução do fluxo de ar para

dentro e para fora dos pulmões e consequentes alterações na frequência

respiratória. Estas alterações podem ser retratadas como uma das principais

condições dos asmáticos, pois afeta não apenas a respiração, mas produz

outras complicações como a insônia, promovendo a fadiga diurna e níveis

reduzidos de atividade. Este quadro tem um impacto significativo na qualidade

de vida destes indivíduos, sendo o responsável por grande parte das ausências

escolares e no trabalho justificadas por motivos médicos (LAMBRECHT;

HAMMAD, 2015).

19

Na resposta inflamatória alérgica, a primeira exposição a antígenos

proteicos induz a ativação de linfócitos Th2, um dos pontos iniciais do

desenvolvimento da asma alérgica (DE MONCHY et al., 1985). Essa ativação

linfocitária, assim como a eosinofilia identificada no fluido do lavado

broncoalvelolar (BALF) e nos tecidos pulmonares (ROBINSON et al., 1992), o

aumento na concentração das interleucinas IL-4, IL-5 e IL-13 (WOODRUFF et

al., 2009) e a presença de IgE no soro de indivíduos atópicos (CHENG et al.,

2014), são repostas diretamente relacionadas com a inflamação alérgica.

20

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

21

2.1 Ouabaína

A ouabaína é um glicosídeo cardíaco conhecido inicialmente como um

composto de origem vegetal, extraído das cascas e raízes da árvore Ouabaio

(Acocanthera ouabaio) e de sementes do gênero Strophanthus (Strophanthus

gratus e Strophanthus kombé), ambos pertencentes à família das

Apocynaceae. Os glicosídeos cardíacos desenvolvem diferentes atividades ao

se ligarem a Na+/K+-ATPase, uma proteína presente na membrana celular, que

utiliza a energia do ATP para transportar íons Na+ e K+ contra um gradiente

eletroquímico, mantendo baixos níveis citosólicos de Na+ e altas concentrações

de K+ em praticamente todas as células animais (LINGREL, 2010). A sua

atividade enzimática é essencial para muitos eventos fisiológicos, para a

manutenção do equilíbrio osmótico e do pH, para a atividade de células

nervosas e musculares e para a manutenção do potencial de repouso celular,

possuindo um papel central na função renal através da reabsorção de Na+ e

água (NICHOLS; MALDONADO, 1993).

Em 1991, Hamlyn e colaboradores, identificaram uma substância

endógena, circulante no plasma de mamíferos superiores semelhante à

ouabaína. A ouabaína pode ser encontrada no plasma humano em

concentrações de 50 pM a 80 nM, sendo produzida pela adrenal, hipotálamo,

hipófise e na região anteroventral do terceiro ventrículo (PAMNANI et al., 1981;

HAMLYN et al., 1991; FERRANDI et al., 1997; SCHONER, 2000; SCHONER et

al., 2003). Essa substância apresenta características químico-estruturais,

biológicas e imunológicas idênticas as da ouabaína encontrada em vegetais

(FERRANDI et al., 1997; SCHONER, 2000). Portanto, nos últimos anos, a

ouabaína tem sido amplamente estudada por sua capacidade de interferir em

diversos mecanismos reguladores e mantenedores da homeostase (BAGROV;

SHAPIRO, 2008).

Caracterizada quimicamente como um composto hidrofílico, formada a

partir da união de um esteróide (ouabagenina) e um açúcar (ramnose) por uma

ligação glicosídica (Figura 1), a ouabaína tem como principais estímulos para a

sua secreção: o aumento de angiotensina II (ANG II), do hormônio

adrenocorticotrófico (DE WARDENER et al., 1961) e da concentração

22

plasmática de sódio e volume extracelular (BLAUSTEIN, 1993). Os níveis

endógenos de ouabaína podem ser alterados por diversos eventos fisiológicos

e patológicos. Assim, o estado homeostático da síntese de ouabaína endógena

tende a ser modificado quando se observa mudanças em parâmetros

fisiológicos responsáveis pela manutenção dos níveis da substância. Desta

forma a sua liberação ocorre em circunstâncias similares àquelas onde há

secreção de corticoides (GOTO et al., 1995).

Figura1. Estrutura química da ouabaína

Fonte: KAWAMURA et al., 1999.

Níveis elevados de ouabaína foram encontrados em pacientes

hipertensos (SCHONER, 2000), bem como em diferentes modelos de ratos

com hipertensão. Alguns estudos demonstraram a participação da ouabaína

endógena no desenvolvimento da hipertensão neurogênica, sendo a liberação

de ANG II, um dos principais mecanismos desencadeadores desta doença

(ROSSONI et al., 2003; XAVIER et al., 2004; WENCESLAU et al., 2011).

Concomitante com a produção de cortisol, a ouabaína é produzida em

diferentes níveis durante os três trimestres clássicos da gestação humana,

23

apresentando uma concentração três vezes maior no último trimestre

(VAKKURI et al., 2000).

A ouabaína também pode agir como um neuromodulador do sistema

nervoso central (SNC), aumentando a atividade de neurônios simpáticos em

ratos (DE WARDENER, 2001). Adicionalmente, este digitálico pode estimular

ou inibir a apoptose de células do SNC, a depender da concentração utilizada.

Este evento foi observado em estudos de regeneração de retina, onde

concentrações micromolares da ouabaína induziram a apoptose das células

ganglionares, enquanto que concentrações nanomolares protegeram as

mesmas células da apoptose (DE REZENDE CORREA et al., 2005; FIMBEL et

al., 2007).

2.2 A ouabaína e o sistema imunológico

O sistema imunológico é formado por células e órgãos cujas atividades

estão relacionadas ao estabelecimento da homeostasia a partir do

desenvolvimento de uma resposta imune. Essa resposta pode ser manipulada

por substâncias ativas para regular respostas indesejadas resultantes de

processos inflamatórios exacerbados, reações autoimunes e alérgicas, bem

como em situações de rejeição de transplantes, estimulando assim respostas

de proteção (CHAUSSABEL; PASCUAL; BANCHEREAU, 2010).

A ouabaína é capaz de interferir em diversos aspectos da resposta

imunológica exercendo diversos efeitos inibitórios (ECHEVARRIA-LIMA e

RUMJANEK, 2006; RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2009;

VASCONCELOS et al., 2011; LEITE et al., 2015; DA SILVA et al., 2016). Na

presença de glicocorticoides e durante a proliferação induzida por mitógenos,

ocorre um aumento na síntese da Na+/K+-ATPase, em sua conformação de

maior afinidade com a ouabaína, a forma E2 (QIU et al, 2003). A ouabaína,

então, reduz a proliferação linfocitária induzida por estímulos como éster de

forbol (TPA) (OLEJ et al, 1994) e interleucina 2 (STOECK et al, 1983; OLEJ et

al, 1998). Esta inibição ocorre também sobre a geração de células natural

killers ativadas por linfoquinas (LAK) e também sob a proliferação de timócitos

24

desencadeada por concanavalina-A, sem, no entanto, inibir a atividade

citotóxica dessas células (DE MORAES et al., 1989; OLEJ et al., 1994).

O papel da ouabaína em timócitos murinos ainda não está totalmente

esclarecido, entretanto estudos demonstram que esse digitálico induz a

expressão de CD69, através do influxo de cálcio (RODRIGUES

MASCARENHAS et al., 2003). A inibição da Na+/K+-ATPase por meio de

concentrações elevadas de ouabaína causa despolarização da membrana

plasmática destes timócitos, in vitro, e potencializa a morte induzida por

glicocorticoides (MANN et al., 2001). Outros dados demonstraram que esse

sinergismo entre ouabaína e hidrocortisona também pode ocorrer in vivo

(RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2006).

Por outro lado, em linfócitos maduros de sangue periférico, a ouabaína é

capaz de induzir um aumento da expressão do proto-oncogen c-myc, levando

parte dessa população à morte por apoptose (OLEJ et al., 1998). A inibição da

Na+/K+-ATPase por altas concentrações da ouabaína causa a despolarização

da membrana plasmática (MANN et al., 2001) e redução dos níveis de K+, que

por sua vez, induz a atividade das caspases (BORTNER; HUGHES;

CIDLOWSKI, 1997), reforçando o papel da ouabaína em processos

apoptóticos.

Estudos recentes vêm demonstrando que a ouabaína também é capaz

de modular a maturação dos linfócitos B (LB), visto que foi observado uma

redução no número de LB maduros na medula óssea e sangue periférico,

durante o tratamento por três dias consecutivos com esse glicosídeo (DE

PAIVA et al., 2011). A ouabaína ainda é capaz de reduzir as diferentes

populações de LB no baço e em linfonodos mesentéricos (DA SILVA et al.,

2016). Sugere-se que estes efeitos sejam decorrentes do sinergismo da

ouabaína com glicocorticoides, pois os mesmos resultados não foram

evidenciados in vitro.

Foi descrito que ouabaína consegue interferir em diversos aspectos da

resposta inflamatória aguda induzida por distintos agentes flogísticos e que sua

atividade anti-edematogênica e antinociceptiva está relacionada à inibição da

ação de mediadores como prostaglandinas e bradicininas, sendo este efeito

25

independente da ação da histamina (DE VASCONCELOS et al., 2011). Além

disso, a ouabaína é capaz de modular etapas moleculares dos eventos que

levam a inflamação aguda característica da peritonite induzida por zimosan, ao

reduzir as citocinas IL-1β e TNF-α e o número de células que migram para o

sítio inflamado. Esses eventos estão relacionados com a capacidade desse

glicosídeo em reduzir a ativação do fator de trasncrição NF-κB (Figura 2)

(LEITE et al., 2015).

Figura 2. Efeitos imunomoduladores da ouabaína

Fonte: GALVÃO, 2016.

2.3 A inflamação alérgica pulmonar e os fenótipos da asma

A inflamação alérgica é resultante de uma resposta imune exacerbada

contra substâncias que, para a maioria das pessoas são inócuas. As doenças

alérgicas mais comuns incluem a asma alérgica, a rinite alérgica, a alergia

alimentar, a dermatite atópica e o angioedema (HOLGATE; POLOSA, 2008). A

26

etiologia dessas doenças ainda é complexa e está constantemente associada à

susceptibilidade genética de indivíduos a iniciar respostas mediadas por IgE e

estímulos ambientais específicos, condição denominada atopia (SICHERER;

SAMPSON, 2007; MURDOCH; LLOYD, 2010).

Os dados epidemiológicos mais recentes indicam que as doenças

alérgicas possuem prevalência, morbidade e mortalidade crescente em todo o

mundo. Estima-se que essas doenças afetem cerca de 20% da população

mundial (EDWARDS et al., 2012), sendo 6,3 milhões o número de brasileiros

diagnosticados com asma alérgica no Brasil (BRASIL, 2015).

O diagnóstico clínico da asma é sugerido pela presença de um ou mais

sintomas, como dispnéia, tosse crônica, sibilância, opressão ou desconforto

torácico, sobretudo à noite ou nas primeiras horas da manhã, caracterizando

um processo inflamatório pulmonar que pode, ou não, estar associado a um

quadro alérgico (BOUSQUET et al., 2007). As manifestações que sugerem

fortemente a identificação da asma são: a variabilidade dos sintomas, o

desencadeamento dos mesmos por irritantes inespecíficos (como fumaças,

odores fortes e exercício) ou por aero alérgenos (como ácaros e fungos) e a

piora dos sintomas à noite e a melhora espontânea, ou após o uso de

medicações específicas para asma (RAMOS et al., 2006; PACHER et al, 2007).

Embora esse diagnóstico em sua forma clássica (asma alérgica) de

apresentação não seja difícil, a confirmação deve ser feita por um método

objetivo, uma vez que os sinais e sintomas da asma não são exclusivos dessa

condição. Logo, dentre os testes diagnósticos disponíveis na prática clínica

temos: a espirometria (antes e após o uso de broncodilatador), os testes de

bronco provocação e as medidas seriadas de Pico de Fluxo Expiratório (PFE).

Em certos casos, a comprovação da reversibilidade da obstrução ao fluxo

aéreo pode ser demonstrada apenas com o teste terapêutico com corticoide

oral (SOUSA, 2011).

Ao longo os anos, a asma tinha sido considerada como uma única

doença, porém sua heterogeneidade de sintomas acabou promovendo o

conceito de que a patologia poderia apresentar vários fenótipos ou grupos de

características consistentes. Desta forma, os fenótipos acabaram sendo

27

constituídos principalmente por dois tipos: asma do tipo Th2 – asma precoce,

asma tardia e asma induzida pelo exercício – e Asma não-Th2 – asma induzida

pela obesidade e asma neutrofílica (WENZEL, 2012).

Sendo assim, o fenótipo da asma é classificado pelas características

clínicas de um indivíduo que decorre da interação do genótipo com fatores

ambientais, o “endotype”, que é a via de sinalização celular capaz que

promover o fenótipo (ANDERSON, 2008; LOTVALL et al., 2011). Para se

definir um fenótipo é necessário caracterizar a patofisiologia, clínica,

biomarcadores, genética e uma resposta à terapia medicamentosa (LOTVALL

et al., 2011).

A classificação desses fenótipos na asma começou décadas atrás com

os conceitos de asma extrínseca (alérgica) e intrínseca (não alérgica)

(RACKEMANN, 1947). Indivíduos com asma extrínseca apresentavam a

doença no início da vida e eram caracterizados atópicos (produzem IgE-

específica à alérgenos). Por outro lado, asma intrínseca estava relacionada a

indivíduos que desenvolviam a doença mais tarde na vida (após 40 anos de

idade), mas que comprovadamente não passou pela sensibilização alérgica

necessária para validar o fenótipo Th2 (WENZEL, 2006).

2.4 A fisiopatologia da asma alérgica Th2

Desde o surgimento do conceito de que a imunidade poderia ser dividida

em Th1 e Th2 (MOSMANN et al., 1986), a asma tem sido considerada do tipo

Th2, sendo associada à atopia e à alergia, bem como as reações de

hipersensibilidade do tipo imediata, com a presença de eosinófilos e resposta

positiva aos corticosteróides. Apesar de estudos recentes demonstrarem a

existência de diferentes fenótipos de asma, como dito anteriormente, ainda

ocorre à prevalência da asma tradicional tipo Th2 (cerca de 70%) (HALDAR et

al., 2008; MOORE et al., 2010).

A fisiopatogênese da asma associa-se a mecanismos moleculares e

celulares da inflamação das vias aéreas. Na asma alérgica tipo Th2, essa

28

inflamação é amplamente dependente da sensibilização pela IgE. O primeiro

contato do organismo com o alérgeno inalado – proteínas de ácaros presentes

na poeira doméstica, ou no pelo de animais e no polén de flores –, ocorre com

o auxílio do Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II (MHC-II) e de

moléculas co-estimulatórias como CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) presente nas

células dendríticas. A apresentação e ativação dos linfócitos T auxiliares

indiferenciados (LT helper – Th0), ao estímulo alérgico dependem

essencialmente do MHC-II e da co-estimulação para a ativação dos linfócitos

Th0 e sua diferenciação em linfócitos do tipo Th2, (LLOYD et. al, 2010).

A ligação de CD80 ou CD86 ao CD28 em linfócitos Th0 aumenta a

localização nuclear do fator de transcrição NFAT1c (Nuclear factor of activated

T cell) e induz a expressão da proteína 3 ligante do GATA (GATA 3), o principal

regulador da diferenciação Th2 (RODRIGUEZ-PALMERO et al., 1999). Os

linfócitos Th2, por sua vez, passam a sintetizar citocinas que promovem a

diferenciação de linfócitos B em plasmócitos. Estudos para avaliação dos

fenótipos clínicos da asma alérgica demonstraram uma forte influência

hereditária e genética para este fenótipo de troca na asma Th2 (MOORE et al.,

2010). Sabe-se que os genes associados ao perfil imune Th2 envolvendo os

das citocinas IL-4, IL-13, IL-4Rα e do fator de transcrição GATA 3 apresentam

maior mutação neste fenótipo e esse grau é constantemente relacionado com a

severidade da inflamação pulmonar alérgica no quadro asmático (SLAGER et

al., 2011). Logo, os linfócitos B na presença de citocinas tais como IL-4 e IL-13

favorecem a troca de isotipo das imunoglobulinas produzidas pelo plasmócito

em IgE específica ao alérgeno sensibilizante (Figura 3) (WILLS-KARP, 1998).

A IL-4 é essencial para a proliferação e manutenção do perfil de

resposta imune adaptativa Th2, para a produção da imunoglobulina E (IgE) e

participa do processo de migração de eosinófilos do vaso sanguíneo para o

tecido. Sendo assim, a imunomodulação do perfil Th2 na asma é dependente

da presença de IL-4 (BRUSSELLE et al., 1994; CORRY et al., 1996).

29

Figura 3. Fisiopatologia da asma alérgica

Na asma alérgica, o processo de sensibilização se dá após a primeira exposição ao alérgeno

com o auxílio das células dendríticas e posterior produção de IgE (1). Durante o segundo

contato (2), os mastócitos degranulam e liberam diversos mediadores e citocinas responsáveis

pela eosionopoese e eosinofilia característica (3), hipertrofia e hiperplasia de células

musculares lisas, com posterior remodelamento das vias aéreas inferiores (4) e metaplasia das

células caliciformes com o aumento da produção de muco, caracterizando a

hiperresponsividade brônquica (5). Fonte: Adaptada de LAMBRECHT; HAMMAD, 2015.

A IL-13 participa do processo de hiper-reatividade brônquica, hiperplasia,

hipertrofia e metaplasia das células caliciformes, esse processo leva a

diferenciação das células epiteliais a produzirem muco espesso contendo as

mucinas MUC5AC e MUC5BC, causando obstrução do lúmen das vias aéreas

(WILLS-KARP et al., 1998).

A eosinofilia característica do processo inflamatório pulmonar alérgico é

decorrente da ação da IL-5, a qual participa do processo de maturação desses

30

leucócitos na medula óssea, a eosionopoese. O recrutamento de eosinófilos

para o tecido pulmonar e para a mucosa intersticial decorre pela atuação de

quimiocinas, como eotaxina 1, 2 e 3 (CCL11, CCL24 e CCL26,

respectivamente). Substâncias liberadas dos eosinófilos após sua ativação e

citólise, como a proteína catiônica eosinofílica (ECP) e proteína básica principal

(MBP), podem causar diretamente a hiper-reatividade brônquica devido a

danificação local das células do tecido pulmonar (COYLE et al., 1994; COYLE

et al., 1995; YOUSEFI; SIMON, 2012). Os eosinófilos ainda apresentam a

capacidade de apresentar os antígenos aos linfócitos T (VAN RIJT et al., 2003).

Posteriormente a fase de diferenciação Th2, as IgEs produzidas irão

ligar-se aos receptores de alta afinidade do tipo FcεRI, presentes na membrana

celular de mastócitos e de basófilos pulmonares, ricos em mediadores da

inflamação (HOGAN et al., 1998), favorecendo a diferenciação e ativação dos

eosinófilos pela ação da IL-5 (PALMQVIST et al., 2007). O contato

subsequente do mesmo alérgeno com a submucosa, promove uma ligação

cruzada entre o alérgeno e as IgEs presentes na superfície dos mastócitos e

basófilos, através de uma reação antígeno-anticorpo, provocando a

degranulação destas células e a liberação de mediadores pré-formados

(histamina) e derivados dos fosfolipídios de membrana (serotonina,

leucotrienos, prostaglandinas, fator de ativação plaquetária), capazes de

causar contração do músculo liso brônquico e inflamação da mucosa

respiratória ou seja, provocar broncoespasmo e edema (MCKAY, 2004;

BARNES, 2008; EDWARDS et al, 2012).

A resposta tardia ocorre como consequência da regulação positiva de

citocinas, quimiocinas e de moléculas de adesão que motivam a ativação e o

recrutamento de células inflamatórias, em particular dos linfócitos, basófilos e

eosinófilos e ainda neutrófilos e macrófagos para o local onde ocorreu o

contato. Os eosinófilos que infiltram a mucosa brônquica fixam também IgEs na

sua membrana e respondem ao contato com o alérgeno libertando mediadores

(SHAKOORY et al., 2004). O acúmulo de eosinófilos gera quimiocinas pró-

inflamatórias e enzimas citolíticas incluindo a proteína catiônica eosinofílica e a

proteína básica principal que provocam ruptura da integridade do epitélio das

31

vias aéreas. Alguns asmáticos também apresentam além de eosinofilia,

neutrofilia na expectoração. Isto evidencia um processo inflamatório misto,

demonstrando que existem sim interações entre a ativação de outras vias

imunológicas e desvio para outros fenótipos, como o perfil imune Th17 com

produção de IL-17 e consequente migração neutrofílica (DOE et al., 2010).

Um equilíbrio entre os mecanismos pró e anti-inflamatórios nas

interfaces da mucosa epitelial – um dos locais de maior exposição a

microrganismos constitutivos e alérgenos –, permite uma protecção eficaz

contra agentes patogênicos e ainda evita respostas inflamatórias adversas

associadas à inflamação alérgica, tal como a asma (MALOY; POWRIE 2011).

Durante muitos anos, postulou-se que as respostas inflamatórias na asma

aconteciam devido a uma deficiência dos linfócitos T CD4+ reguladores naturais

ou induzidos (Tregs). Em camundongos, o resultado usual da inalação de

antígenos inócuos, tais como a OVA, é a tolerância, um processo mediado pela

indução de Tregs por Foxp3 (OSTROUKHOVA et al., 2012). De fato,

camundongos que não expressam Foxp3, apresentam uma elevação de CNS1

– uma proteína marcadora de processos inflamatórios –, bem como uma

escassez de Tregs e um consequente desenvolvimento de fortes respostas

Th2 (JOSEFOWICZ et al., 2012).

Os linfócitos T CD8+ também desempenham um papel imunoregulador

no processo inflamatório das vias aéreas na asma alérgica devido a inibição do

processo de sensibilização do organismo para alérgenos, atenuando a

resposta Th2 via inibição da produção de IgE e produção da citocina IFN-γ, a

qual, está envolvida na alteração da capacidade das células dendríticas

pulmonares (DCs) durante a apresentação antigênica polarizar os linfócitos T

CD4+ para o fenótipo Th1 (TANG et al., 2012). A depleção dos linfócitos T

CD8+ está envolvida com o aumento dos níveis séricos de IgE alérgeno -

específica, remodelamento e hiper-reatividade das vias aéreas (STOCK et al.,

2004; TSUCHIYA et al., 2009).

O perfil de resposta imune Th1, também desempenha um papel

fundamental na regulação das respostas celulares desencadeada pelo fenótipo

Th2. Esse controle é mediado por citocinas como IFN-γ, IL-2 e TNF-β. Onde o

32

IFN-γ, por exemplo, antagoniza a formação do fator de transcrição GATA 3 e,

portanto, reduz a polarização para geração das células Th2 (GAVETT et al.,

1995). No entanto, ao contrário das evidências clássicas de que o perfil Th1

necessariamente anula o perfil Th2, provou-se que em alguns casos a IL-18,

um indutor do IFN-γ – é capaz de aumentar a sensibilização alérgica, e

diversas características do processo infamatório pulmonar alérgico (WILD et

al., 1999).

33

34

3. JUSTIFICATIVA

35

A resposta inflamatória consiste na progressão de eventos iniciais até o

possível desenvolvimento de uma resposta crônica (MEDZHITOV, 2008). Já foi

demonstrado que a ouabaína é capaz de interferir em diversos modelos de

inflamação (RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008; VASCONCELOS et

al., 2011; JACOB et al., 2013). No entanto, o seu papel na inflamação alérgica,

ainda não tinha sido investigado anteriormente

Neste trabalho, foi avaliada a capacidade da ouabaína estender os seus

efeitos na inflamação aguda para processos de inflamação mais tardios ou

crônicos, como a inflamação pulmonar alérgica induzida pela hipersensibilidade

à ovalbumina em camundongos BALB/c. Esta hipótese está embasada no

efeito da ouabaína na liberação de mediadores pelos mastócitos (SENOL et al.,

2007), na modulação da migração celular (LEITE et al., 2015), na maturação de

linfócitos B (DA SILVA et al., 2016) e na síntese de citocinas que também são

características da inflamação alérgica pulmonar (JACOB et al., 2013).

36

4. OBJETIVOS

37

4.1 Objetivo geral

Avaliar o efeito da ouabaína no modelo de inflamação alérgica pulmonar

induzida por ovalbumina.

4.2 Objetivos específicos

Avaliar a migração de células totais e diferenciais (linfócitos,

macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) no fluido do lavado broncoalveolar

(BALF) dos diferentes grupos de animais experimentais;

Identificar, utilizando a citometria de fluxo, as subpopulações de

linfócitos T (CD3+) presentes no BALF dos animais sensibilizados e

desafiados com OVA e tratados ou não com ouabaína;

Quantificar a produção de citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF dos

diferentes grupos de animais experimentais;

Demonstrar os parâmetros histopatológicos que envolvem a migração

de leucócitos para o espaço perivascular e peribroncoalveolar;

vasodilatação; integridade epitelial; oclusão alveolar; hiperplasia das

células caliciformes e hiperprodução de muco;

Quantificar o título de IgE-OVA específica nos soros dos animais dos

diferentes grupos experimentais.

38

5. MATERIAL E MÉTODOS

39

5.1 Material

5.1.1 Substâncias e sais

A lista de substâncias utilizadas encontra-se no apêndice A.

5.1.2 Aparelhos e equipamentos

A lista de aparelhos e equipamentos utilizados encontra-se no apêndice

B.

5.2 Métodos

5.2.1 Animais

Para a realização desse trabalho, todos os protocolos experimentais

foram aprovados pelo Conselho de Ética no Uso de Animais (CEUA) com

registro no. 100/2015 (ANEXO A). Camundongos da linhagem BALB/c fêmeas

com idade entre 6-8 semanas, pesando de 20 a 25g e ratas Wistar, pesando de

120 a 150g foram utilizados no protocolo experimental de inflamação pulmonar

alérgica induzida por ovalbumina. Os animais foram mantidos em gaiolas de

polipropileno a uma temperatura de 25 ± 2 ºC, em ciclos de claro e escuro de

12 horas com livre acesso à água e a uma dieta controlada, a base de ração do

tipo pellets (PURINA®) durante todo o período de experimentação.

Os animais utilizados nesse trabalho foram fornecidos pelo biotério Prof.

Dr. Thomas George do IPeFarM/UFPB. Cada grupo experimental

compreendeu 6 animais. Para avaliação da reprodutibilidade dos resultados

foram realizadas três repetições de cada protocolo experimental.

5.2.2 Grupos experimentais

Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (n=6), o

grupo Salina – representando os animais saudáveis e não sensibilizados com

ovalbumina (OVA) –, o grupo OVA – representando os animais que

apresentaram alterações imunológicas devido a um quadro patológico alérgico

inflamatório pulmonar, devido a sensibilização com OVA –, o grupo DEXA –

animais sensibilizados com OVA e tratados com a droga padrão utilizada na

40

terapêutica da inflamação alérgica pulmonar, a dexametasona (2 mg/kg) – e o

grupo OUA – animais sensibilizados com OVA e tratados com a substância

teste ouabaína (0,56 mg/kg).

5.2.3 Protocolo experimental de inflamação pulmonar alérgica induzida

por OVA

O modelo de inflamação pulmonar alérgica induzida por OVA

desenvolvido neste presente trabalho, foi adaptado do protocolo experimental

de Lloyd e colaboradores (2000). Dois dias antes das sensibilizações (dias -1, -

2, 10 e 11) e uma hora antes das mesmas (dias 0 e 12), os camundongos

foram pré-tratados com injeções intraperitoneais (i.p) contendo 200 µL de

ouabaína (0,56 mg/Kg) ou salina, a fim de sofrerem o mesmo estresse

provocado. Nos dias 0 e 12 do protocolo, os camundongos BALB/c fêmeas

foram sensibilizados com a injeção de 10μL/g via intraperitoneal (i.p.) de uma

suspensão contendo 50 μg/mL de OVA grade V (SIGMA Chemical, St. Louis,

MO) e 10 mg/mL de Al(OH)3 (VETEC, Rio de Janeiro, RJ) em solução salina.

No período compreendido entre os dias 19 a 22 do protocolo

experimental, os animais foram desafiados diariamente com aerossol de OVA

grade II (SIGMA Chemical, St. Louis, MO) a 5% em solução salina. Uma hora

antes de cada desafio com aerossol, o grupo DEXA foi tratado com 200 µL de

dexametasona (2 mg/kg), a fim de termos uma droga padrão para realizarmos

as posteriores comparações. Cada desafio foi realizado durante 30 minutos

diários em uma câmara fechada, sob um fluxo contínuo de aerossol, com o

auxílio de um nebulizador ultrassônico. No vigésimo terceiro dia – 24 horas

após o último desafio – os animais foram eutanasiados por overdose

anestésica (cetamina + xilazina), e posteriormente foram coletados os materiais

biológicos: sangue, fluido do lavado broncoalveolar (BALF) e tecido pulmonar

(pulmões) (Figura 4).

41

Figura 4. Esquema representativo do protocolo experimental de inflamação pulmonar

alérgica induzida por ovalbumina

.

5.2.4 Contagem de células totais e diferenciais no fluido do lavado

broncoalveolar (BALF)

Para quantificação do número total das células e do número de células

diferenciais, 24 horas após o último desafio, ocorrido no dia 22 do protocolo

experimental, os animais foram anestesiados, após esse procedimento foi

coletado o sangue pelo plexo braquial, em seguida a traqueia foi exposta com

auxílio de pinça e tesoura cirúrgica, para maior visualização dessa estrutura os

lobos da glândula tireoide foram retirados e então foi inserido um cateter

periférico IV-18G de poliuretano (Descarpack) para a coleta do BALF.

No cateter foi conectada uma seringa contendo 1 mL de HBSS-/- gelado,

este foi administrado na traqueia sentido pulmão. Inicialmente foi injetado

apenas 0,5 mL de HBSS-/- gelado, aguardou-se um tempo de 10 segundos e

então foi aspirado o mesmo volume, finalizando a primeira lavagem, em

seguida foi injetado todo o volume de HBSS-/- gelado contido na seringa de 1

mL, após 10 segundos foi aspirado, sendo realizado a segunda lavagem, o

BALF coletado foi transferido para um tubo tipo eppendorf e armazenado no

gelo, para preservar a viabilidade celular. Em seguida uma nova seringa foi

42

conectada ao cateter e foi injetado mais 0,5 mL de HBSS-/- gelado, repetindo a

espera de 10 segundos e aspirando todo o BALF contido no pulmão, realizando

assim três lavagens, o BALF foi transferido para o mesmo tubo eppendorf,

totalizando o BALF com 1,5 mL de HBSS-/- gelado.

Uma alíquota do BALF (10 μL) foi retirada e adicionada, na proporção

1:4, a 30 μL de solução de Turk (VETEC, Rio de Janeiro, RJ), que devido a sua

ação hemolítica, lisa as hemácias e cora os leucócitos do BALF. Foi então

retirado uma alíquota de 10 μL da solução de Turk com BALF e levada a

câmara hemocitométrica (Neubauer), sendo realizada a contagem das células

totais no microscópio óptico (40 X - BX40, OLYMPUS) (Figura 5). Após a

contagem das células totais ser realizada, o BALF foi centrifugado (centrífuga

CR422, JONAM) em 1000 rpm a 4ºC por 5 minutos. Os sobrenadantes foram

retirados e congelados à -20ºC para posterior dosagem de citocinas

(BEZERRA-SANTOS et al., 2006).

O pellet do BALF foi ressuspenso em 500µL de HBSS-/- gelado e

homogeneizado, em seguida foi retirado 200 μL do BALF e centrifugado na

citospin (FANEN, São Paulo, SP, Brasil Mod. 2400). As lâminas obtidas foram

fixadas e coradas pelo método panóptico (Kit Panóptico, Renylab), o qual se

baseia em três passos principais: a fixação das células na lâmina por ação de

um fixador, um corante básico cora de azul, estruturas ácidas como o núcleo

das células, e um corante ácido cora de rosa estruturas celulares básicas como

o citoplasma, então esses contrastes de coloração celular proporciona uma

visualização e contagem diferencial de células realizada por microscopia

óptica. Cada lâmina foi percorrida até a contagem de 100 células, utilizando

para isso a objetiva de imersão (100X), os leucócitos contados foram divididos

em quatro subpopulações: linfócitos; macrófagos; eosinófilos e neutrófilos

(Figura 5).

43

Figura 5. Esquema representativo da contagem de células totais e diferenciais

5.2.5 Diferenciação de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) e marcação

celular de subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF

A distinção das populações celulares heterogêneas utilizando a

citometria de fluxo é permitida pela avaliação dos parâmetros forward scattered

hight (FSC) e side scattered hight (SSC), os quais distinguem as células pelo

tamanho (difração da luz) e granularidade (difusão da luz) respectivamente. A

análise do tamanho dos linfócitos foi identificada por FSClo/SSClo e a

granularidade dos granulócitos por SSChi (VAN RIJT et al., 2004), (Figura 6).

A análise por citometria de fluxo também foi realizada pela quantificação

da fluorescência dos marcadores celulares. A fluorescência verde emitida pelo

isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi detectada após passagem em filtro de

530nm (FL1). A fluorescência laranja da ficoeritrina (PE) foi detectada após

passagem em filtro de 585nm (FL2). O citômetro de fluxo (FACSCalibur II,

Becton Dickinson) utilizado foi equipado com laser de íons de argônio de

15mW em 488nm, resfriado a ar.

44

Figura 6. Esquema representativo das subpopulações de leucócitos, por tamanho e

granularidade celular, após análise por citometria de fluxo

O pellet do BALF foi utilizado para análise dos parâmetros FSC e SSC,

bem como para a expressão de CD3 pelas subpopulações de linfócitos

avaliadas. Para a marcação das moléculas de superfície das células utilizamos

o anticorpo anti-CD3 (FITC) (eBioscience). Para isto, 5 x 105 células/mL foram

centrifugadas a 1200 rpm. Para impedir ligações inespecíficas, as células foram

previamente mantidas na presença de soro de camundongo por 5 minutos e

posteriormente incubadas por 20 minutos a 4°C em 10 μL do anticorpo, na

concentração estipulada pelo fabricante. No fim da incubação, as células foram

lavadas e resuspensas em HBSS-/- para leitura em citômetro de fluxo.

5.2.6 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF

O sobrenadante do BALF armazenado a -20°C foi utilizado para a

quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ, onde foi utilizado o teste

imunoenzimático ELISA sanduíche, de acordo com o protocolo especificado no

kit do fabricante (eBioscience, Inc. Science Center Drive, San Diego, CA-USA).

45

De forma sucinta, o método de sanduíche, ou captura, é indicado para

identificação de antígenos (IL-4, IL-13 e IFN-γ), e este antígeno fica entre dois

anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno (citocinas) é

adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o BALF contendo o antígeno (IL-

4, IL-13 e IFN-γ) é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao

antígeno marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com

o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos

poços indica a presença do antígeno (IL-4, IL-13 e IFN-γ), e os poços que não

mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão. A leitura foi

realizada em leitor de placa (MICROPLATE READER versa Max, tunable, BN

2529 Molecular Devices) a 450nm. As quantidades de citocinas foram

calculadas a partir de cada curva-padrão de cada citocina quantificada. A figura

8 demonstra esquematicamente e de forma geral a quantificação das citocinas

utilizando o ELISA sanduiche (Figura 7).

Figura 7. Esquema representativo da quantificação de citocinas pelo Ensaio

Imunoenzimático de ELISA sanduíche

46

5.2.7 Histologia pulmonar

Para avaliar as características histológicas pulmonar dos camundongos,

ambos os lóbulos direito e esquerdo do pulmão de cada animal foram

coletados 24 horas após o último desafio ocorrido no dia 22 do protocolo

experimental. Após anestesia e coleta do sangue pelo plexo braquial e BALF, o

tórax do animal foi aberto com auxílio de pinça e tesoura cirúrgica e então foi

realizada a perfusão cardíaca com administração de 20 mL de salina no

coração, no intuito de realizar uma lavagem do pulmão.

Para evitar a digestão do tecido por enzimas presentes no interior das

células (autólise) ou por enzimas bacterianas, os cortes foram colocados em

fixadores: formalina tamponada por 72 horas e logo após em álcool etílico 70%

até o momento do corte histológico. Esse procedimento mantem a integridade

do tecido, uma vez que os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao

interagirem com os grupos aminos das proteínas, por pontes de hidrogênio.

Os pulmões fixados foram inicialmente hidratados por imersões em água

corrente durante 24 horas. Após esse procedimento as amostras foram

desidratadas durante 1 hora em cada diferente concentração de álcool etílico

(70, 80, 90 e 100%). O processo de desidratação foi realizado porque a água

presente nos tecidos não é miscível em substâncias apolares como a parafina

para inclusão, além disso, a graduação nas concentrações de álcool é

imprescindível para que ocorra a desidratação homogênea dos tecidos,

evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

Após a remoção do álcool, o tecido pulmonar passou por duas horas

imersos em xilol e em seguida em parafina líquida (parafina histológica-

ERVIEGAS, São Paulo, SP), mantida nesse estado com o auxílio de

dispensador de parafina a 56°C – ponto de fusão (CR422, JONAM) e

posteriormente, o tecido foi transferido para o molde contendo parafina líquida.

Poucos minutos após ser colocada na fôrma, à parafina solidificou e obteve-se

o "bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. Os blocos

de parafina assim formados, foram retirados das fôrmas e realizados cortes

histológicos com espessura de 5μm, com o auxílio de um micrótomo (SP Labor

47

300). Os cortes foram colocados em banho-maria (38 – 39°C), sendo retirados

após, com lâminas. A secagem das lâminas foi realizada em temperatura

ambiente.

Com os cortes aderidos nas lâminas, estes foram corados com

Hematoxilina-Eosina (HE) ou Ácido Periódico de Schiff (PAS) e depois foi

realizado a montagem das lâminas. Como meio de montagem foi utilizado o

bálsamo do Canadá. Cada grupo de animais teve três lâminas coradas em

cada coloração (Figura 8).

Figura 8. Esquema representativo da preparação do corte histológico pulmonar

5.2.7.1 Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)

A técnica hematoxilina-eosina (HE) é clássica, dicrômica e de alta

finalidade diagnóstica: hematoxilina, corante básico que cora componentes

ácidos como os núcleos de todas as células, e eosina corante ácido que cora

componentes básicos como o citoplasma de todas as células, proporcionando

uma observação geral de todas as estruturas pulmonares. As lâminas foram

inicialmente desparafinizadas por imersão no xilol, o primeiro xilol com duração

de 10 min e o segundo xilol com duração de 10 min. Em seguida, as lâminas

passaram pelo processo de hidratação em álcool absoluto, o primeiro álcool

por 5 min e o segundo álcool por 5 min.

48

As lâminas foram colocadas sucessivamente em álcool 90, 80 e 70% por

5 min e água destilada por 1 min. Então, foram imersas na hematoxilina por 30

segundos, mergulhadas rapidamente em água destilada, depois em água

destilada novamente, com a finalidade de retirar o excesso de corante. Em

seguida, as lâminas foram colocadas no corante eosina, por 5 min, e em

seguida desidratadas com álcool 80, 90% e absoluto 3 min em cada. O material

histológico passou pelo banho em xilol por 10 min, onde o primeiro xilol foi por

5 min e o segundo xilol por mais 5 min. Após coloração foi colocado sobre o

corte o bálsamo do Canadá e uma lamínula. Depois, com auxílio de uma pinça,

foram retiradas as bolhas e a lamínula foi comprimida com firmeza sobre o

corte para o espalhamento do bálsamo. Após 24h foram retirados os excessos

de bálsamo para acabamento do preparo das lâminas. Nas lâminas coradas

pela hematoxilina-eosina são observados em azul escuro, ou roxo os núcleos,

em rosa o citoplasma e em vermelho as hemácias.

Para análise morfológica dos cortes corados pela hematoxilina e eosina

(HE), foi criado um score (pontuação) de 0 – 7, onde este é quantificado de

acordo com a lesão evidenciada. As lesões evidenciadas foram vasodilatação

(presente (1) ou ausente (0)); manutenção da integridade bronquiolar

(inalterada (0), parcial (1) ou total (2)); migração de células, onde zero (0)

significa ausência de migração, (1) poucas células 0-9 células por campo, (2)

mais de 10 células por campo e (3) formação de “ninhos” de células

perivascular e peribronquiolar. Por fim, como parte do score avaliou-se a

congestão (presente (1) ou ausente (0)). Quando presente soma-se o número

referente a análise, quando ausente, 0. Parâmetros avaliados em 5 campos da

lâmina (COSTA et al., 2008; ZOU, 2014).

5.2.7.2 Coloração P.A.S. (Ácido Periódico – Schiff)

O ácido periódico de Schiff revela glicogênio e mucina intracelular. As

lâminas foram inicialmente desparafinadas por imersão no xilol durante 10 min

hidratadas em álcool absoluto, álcool 90, 80 e 70% por 5 min e água destilada

por 1 min. Depois foram colocadas no ácido periódico por 10 min, na água

destilada por 1 min e no reativo de Schiff por 25 min, quando retiradas foram

49

colocadas em 3 banhos sulfurosos de 2 min cada e mergulhadas 1 min em

água. Em seguida, as lâminas foram colocadas em hematoxilina por 5 min e

mergulhadas em água. Durante 6 min foram desidratadas com álcool 80, 90%

e absoluto sendo 2 min em cada álcool. Para clareamento foi utilizado xilol, as

lâminas foram imersas no primeiro xilol por 5 min e no segundo xilol por 5 min.

Nas lâminas coradas por P.A.S. é observado em bolina a presença de

glicogênio ou polissacarídeos neutros (contendo grupos 1,2 glicol), mucina

(glicoproteína, principal constituinte do muco), proteoglicanos não se coram, os

núcleos e os citoplasmas se coram em roxo claro. Nos cortes analisados por

PAS a análise foi quantitativa e realizada a partir do software KS 300.

5.2.8 Dosagem do título de IgE OVA-específica

O título de IgE OVA-específica foi determinado pelo teste de anafilaxia

cutânea passiva (PCA). Inicialmente 24 horas após o último desafio, no dia 23

do protocolo experimental. Os animais foram anestesiados e então realizada

assepsia com álcool 70% em seguida o plexo braquial foi exposto com auxílio

de pinça e tesoura cirúrgica e foi coletado cerca de 0,5 a 1mL de sangue com o

auxílio de uma pipeta Pasteur, esse foi armazenado em tubos do tipo

eppendorf inclinados a 45º e estocados em geladeira por cerca de 4 horas,

para facilitar formação dos coágulos e coleta dos soros, realizada após a

centrifugação do sangue em 1500 RPM a 4°C por 10 minutos. Os soros foram

armazenados a –20ºC para serem utilizados no PCA.

Os soros armazenados foram diluídos em salina. Para cada amostra foi

realizada oito diluições seriadas (1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1.024; 1:2.048;

1:4.096 e 1:8.192) e um volume de 50 μL dessas amostras foi injetado por via

intradérmica (i.d.) em oito diferentes sítios do dorso de ratas Wistar depiladas e

previamente anestesiadas. Após 24 horas, foi realizado o desafio antigênico

nas caudas das ratas pela administração intravenosa (i.v.) de 0,5 mL/animal na

veia da cauda de uma solução contendo 10 mg/mL do corante Azul de Evans a

1% (VETEC, Rio de Janeiro, RJ) e 4 mg/mL de OVA grade V. Após 30 minutos,

os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical, e os diâmetros das

manchas formadas no dorso foram medidas com o auxílio de uma régua

50

milimétrica de 20cm. O título foi determinado pela maior diluição do soro capaz

de promover uma mancha mensurável 5 mm (Figura 9) (COSTA et al., 2008).

Figura 9. Esquema representativo da dosagem de IgE OVA-específica pelo método de

Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA)

5.2.9 Análise estatística

Todos os dados foram analisados pelo programa Graph Pad Prism©

versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.A.). Para analisar os

dados obtidos por citometria de fluxo, utilizamos o FlowJo software.

Todos os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão

da média (e.p.m.) e analisados estatisticamente empregando-se o ANOVA one-

way seguido do teste de Tukey, onde foram considerados significativos os

valores de p < 0,05.

51

6. RESULTADOS

52

6.1 Efeito da ouabaína na migração de células totais e diferenciais para o

fluido do lavado broncoalveolar (BALF)

No modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por ovalbumina

(OVA), espera-se um aumento na migração celular para o sítio inflamado

(pulmões) em decorrência das sensibilizações e posteriores desafios (segundo

contato) realizados durante o protocolo (LLOYD et al., 2000). As

sensibilizações e desafios com o alérgeno proteico aumentaram em 69% (p <

0,001) o número de leucócitos totais no espaço broncoalveolar do grupo OVA

quando comparado ao grupo salina (Gráfico 1A). Na comparação da migração

celular ocorrida nos grupos pré-tratados com a ouabaína (0,56 mg/kg) em

relação à ocorrida no grupo OVA, observou-se que o pré-tratamento com a

substância teste foi eficaz em reduzir 60% (p < 0,01) a migração celular para o

espaço broncoalveolar (Gráfico 1A), assim como a droga padrão

dexametasona (2 mg/kg) no grupo DEXA, 66% (p < 0,01) (Gráfico 1A).

Na análise dos leucócitos diferenciais, observou-se que o grupo OVA

apresentou um aumento significante no número de linfócitos, macrófagos,

eosinófilos e neutrófilos (p < 0,001) no BALF em comparação com o grupo

salina (Gráfico 1B, C, D e E). Já com relação à migração de leucócitos

diferenciais na comparação entre os grupos tratados com OUA e o grupo OVA,

nota-se uma diminuição de polimorfonucleares como, linfócitos (p < 0,01),

eosinófilos (p < 0,001) e neutrófilos (p < 0,01) (Gráfico 1B, D e E), porém a

ouabaína não foi capaz de reduzir o número de macrófagos (Gráfico 1C). O

mesmo foi observado nas comparações entre os grupos DEXA e OVA.

53

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

###

** **

Célu

las t

ota

is x

10

6/

mL

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Lin

fócit

os x

10

6/

mL

***

##

** **

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Macró

fag

os x

10

6/

mL

#

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Eo

sin

ófi

los x

10

6/

mL ###

*** ***

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0.0

0.1

0.2

0.3

Neu

tró

filo

s x

10

6/

mL

** **

##

Gráfico 1. Efeito da ouabaína na migração de leucócitos totais e diferenciais (linfócitos,

macrófagos, eosinófilos e neutrófilos) para o espaço broncoalveolar na inflamação

alérgica pulmonar experimental induzida por OVA

A

B C

D E

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com OVA e pré-

tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações

e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de

cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e a migração de

54

leucócitos foi quantificada em microscopia óptica comum. A. Células Totais; B. Linfócitos; C.

Macrófagos; D. Eosinófilos e E. Neutrófilos. Os resultados foram expressos como média ±

e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de

Tukey. Valores de #p < 0,05,

##p < 0,01 e

###p < 0,001 foram considerados significativos quando

comparados com o grupo salina, e **p < 0,01 e ***p < 0,001 foram considerados significativos

quando comparados com o grupo OVA.

55

6.2 Efeito da ouabaína no percentual de granulócitos no BALF na

inflamação alérgica pulmonar analisado por citometria de fluxo

O grupo OVA apresentou aumento significativo de 88,8% (p < 0,001) na

migração celular de granulócitos – representados por eosinófilos e neutrófilos –

para o espaço broncoalveolar, em relação ao grupo salina (Gráficos 2 e 3,

respectivamente). Na comparação da migração celular de granulócitos ocorrida

nos grupos pré-tratados com ouabaína em relação à ocorrida no grupo OVA,

observou-se uma redução de 41,1% (p < 0,05), abaixo da redução de 64,3% (p

< 0,01) observada no tratamento com a droga padrão dexametasona (Gráficos

2 e 3, respectivamente). Estes dados corroboram a modulação da migração de

eosinófilos e neutrófilos mencionados, na contagem diferencial de células nas

lâminas produzidas a partir do BALF.

56

Gráfico 2. Efeito da ouabaína na porcentagem de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos)

no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

Camundongos BALB/c fêmeas (n = 6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina

(OVA) e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após

sua centrifugação, o pellet foi utilizado para classificação dos leucócitos pela análise do

tamanho celular (FSC- forward scatter, por difração de luz) e granularidade ou complexidade

citoplasmática (SSC- side scatter, por difusão de luz) na citometria de fluxo. As regiões

demarcadas fazem referência ao tamanho celular e complexidade intracelular característica

dos granulócitos (eosinófilos e neutrófilos). As figuras foram analisadas pelo programa FlowJo

software. Os resultados são representativos de 3 experimentos.

57

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

5

10

15

20

**

*

###

###

Célu

las (

%)

em

R1

Gráfico 3. Percentual de granulócitos (eosinófilos e neutrófilos) no BALF após o

tratamento com ouabaína na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com OVA e pré-

tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações

e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de

cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após sua

centrifugação, o pellet foi utilizado para classificação dos leucócitos pela análise do tamanho

celular (FSC- forward scatter, por difração de luz) e granularidade ou complexidade

citoplasmática (SSC- side scatter, por difusão de luz) na citometria de fluxo. Os resultados

foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA

one-way, seguida do teste de Tukey. Valores ###

p < 0,001 foram considerados significativos

quando comparados com o grupo salina, e *p < 0,05; **p < 0,01 foram considerados

significativos quando comparados com o grupo OVA.

58

6.3 Efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos T CD3+ presentes

no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

Para demonstrar o efeito da ouabaína sob a subpopulação de linfócitos

T CD3+, selecionamos um dot plot representativo (um experimento – n= 6) do

grupo OVA (Gráfico 4A). Um histograma representando a intensidade de

fluorescência do anticorpo anti-CD3, explicita a migração desta subpopulação

de linfócitos para o espaço broncoalveolar (Gráfico 4B). O grupo OVA

apresentou um aumento de 37% (p < 0,001) na migração celular de linfócitos T

CD3+ para o espaço broncoalveolar, em relação ao grupo salina (Gráfico 4C).

O pré-tratamento com ouabaína reduziu o número de linfócitos T CD3+ em 15%

(p < 0,05) quando comparado ao grupo OVA (Gráfico 4C). A droga padrão

dexametasona diminuiu em 38% (p < 0,001) a migração celular de linfócitos T

CD3+ (Gráfico 4C).

59

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

20

40

60

80

*

***

###

% C

élu

las C

D3

+(M

1)

Gráfico 4. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na porcentagem de linfócitos T CD3+

no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

A B

C

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e após

sua centrifugação, o pellet foi utilizado para quantificar os linfócitos T CD3+ através da

intensidade de fluorescência, captada pela marcação de antígenos de superfície com

anticorpos monoclonais específicos ligados a fluorocromos pela técnica de citometria de fluxo.

A região demarcada do dot plot representativo é referente a população de linfócitos de um

grupo OVA. O histograma representa a intensidade de fluorescência da marcação com anti-

CD3 em um experimento. As figuras foram analisadas pelo programa FlowJo software. A

diferença entre os grupos foi analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey.

Valores ###

p< 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo salina,

e *p< 0,05; ***p< 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo

OVA.

60

6.4 Quantificação das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-γ no BALF na inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA

Citocinas clássicas do perfil Th2, IL-4 e IL-13 (Gráfico 5A e B),

apresentaram-se em níveis elevados (p < 0,001) no grupo OVA, em

comparação aos níveis das mesmas no grupo salina. O pré-tratamento com

ouabaína (0,56 mg/kg) foi capaz de reduzir os níveis de IL-4 (37,7%) e IL-13

(30%) (p < 0,05) (Gráfico 5 A e B). Os níveis de IFN-γ não se mostraram

elevados no grupo OVA em comparação ao grupo salina, comprovando a

polarização da resposta para o fenótipo Th2, já que o IFN-γ é uma citocina de

perfil Th1 (ELENKOV; CHROUSOS, 1999) (Gráfico 5C).

A droga padrão dexametasona reduziu, como esperado, os níveis de

todas as citocinas analisadas (Gráfico 5A, B e C).

61

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

30

60

90

120

***

*

##

###

IL-4

(p

g/m

L)

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

20

40

60

80

**

#

*

IL-1

3 (

pg

/mL

)

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

20

40

60

80

100

**IFN

- (

pg

/mL

)

Gráfico 5. Efeito do pré-tratamento com ouabaína na produção das citocinas IL-13, IL-4 e

IFN-γ no BALF na inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

A B

C

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O BALF dos animais foi coletado 24h após o último desafio e

centrifugado. O sobrenadante foi coletado e utilizado o ensaio imunoenzimático (ELISA

sanduíche) para quantificação das concentrações das citocinas. A. IL-13; B. IL-4 e C. IFN-γ. Os

resultados foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por

ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de #p < 0,05 e

###p < 0,001 foram

considerados significativos quando comparados com o grupo salina, e *p < 0,05, **p < 0,01 e

***p < 0,001 foram considerados significativos quando comparados com o grupo OVA.

62

6.5 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na

inflamação alérgica pulmonar induzia por OVA corados com hematoxilina-

eosina (HE)

A figura 10 (A – D) mostra o efeito morfológico do pré-tratamento com

ouabaína (0,56 mg/kg) ou tratamento com dexametasona (2 mg/kg) sob o

modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar. Nas imagens coradas

pela Hematoxilina-Eosina, observadas em aumento total de 20x nota-se que o

animal saudável, salina (A), não apresentou alterações morfológicas na

constituição do parênquima pulmonar. Entretanto, no animal doente, OVA (B),

observou-se evidências de parâmetros inflamatórios como migração de células

com formação de anéis (seta), infiltrado celular (bola), perda da integridade

epitelial bronquiolar (raio).

A alteração histológica é demonstrada no score histológico no gráfico 6,

onde o animal OVA evidenciou uma inflamação tecidual (p < 0,001) em relação

ao animal salina. Nos animais pré-tratados com ouabaína (D) e tratados com

dexametasona (C) observou-se redução da migração de células inflamatórias

(seta), que funciona como padrão inflamatório do modelo, corroborando com os

dados anteriores que mostraram as duas substâncias reduzindo os níveis de

IL-4, citocina essencial para proliferação e manutenção do fenótipo Th2, no

processo inflamatório pulmonar (BRUSSELLE et al., 1994). Os tratamentos

foram capazes de reduzir todos os parâmetros inflamatórios analisados, como

explicita os dados do score histológico inflamatório (Gráfico 6).

63

Figura 10. Análise histopatológica do efeito da ouabaína sob o modelo de inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com hematoxilina-eosina (HE)

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último

desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e

coloração por HE. Os parâmetros inflamatórios observados foram a migração de células com

formação de ninhos no espaço perivascular e peribronquiolar (seta), infiltrado celular (bola),

perda da integridade epitelial bronquiolar (raio). Tecidos corados por hematoxilina e eosina,

vistos em microscópio óptico comum em aumento total de 20x.

64

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

2

4

6

8

******

###

Sco

re H

isto

lóg

ico

Gráfico 6. Score histológico de parâmetros inflamatórios no modelo de inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/Kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último

desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e

coloração por HE. Os parâmetros inflamatórios observados foram a migração de células no

espaço perivascular e peribronquiolar, vasodilatação, manutenção da integridade epitelial

bronquiolar e congestão. Tecidos vistos em microscópio óptico comum em aumento total de

20x. Os resultados foram expressos como média ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi

analisada por ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de ###

p < 0,001 foram

considerados significativos quando comparados com o grupo salina e ***p < 0,001 foram

considerados significativos quando comparados com o grupo OVA.

65

6.6 Efeito da ouabaína na análise histopatológica do tecido pulmonar na

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA corados com P.A.S.

(Ácido Periódico de Schiff)

A figura 11 (A – D) mostra a análise histopatológica do pré-tratamento

com ouabaína (0,56 mg/Kg) ou tratamento com dexametasona (2 mg/kg) sob o

modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar. Nas imagens de tecidos

coradas pelo P.A.S., observadas em um aumento total de 40x nota-se que o

animal salina (A) – saudável –, não apresenta alterações morfológicas na

constituição do parênquima pulmonar como a hipertrofia ou hiperplasia de

células caliciformes. Por outro lado, o animal OVA (B), apresenta evidências do

aumento dessas células (seta), bem como alterações hiperplásicas.

Nos animais pré-tratados com ouabaína (D) e tratados com

dexametasona (C) parâmetros morfológicos determinados pela coloração PAS,

foram alterados: diminuição da hiperplasia e hipertrofia das células caliciformes

e hiperprodução de muco em comparação com o grupo OVA. Esta redução, se

justifica também pela ação das substâncias na diminuição nos níveis de IL-13,

a principal citocina ligada ao processo de hiper-reatividade brônquica,

hiperplasia, hipertrofia e metaplasia das células caliciformes, no modelo

experimental utilizado (WILLS-KARP et al., 1998).

66

Figura 11. Efeito da ouabaína sobre as alterações histopatológicas no modelo de

inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Secções coradas com coloração P.A.S.

(Ácido Periódico de Schiff)

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/Kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último

desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e

coloração por P.A.S. (Ácido Periódico de Schiff). O parâmetro observado é a hipertrofia e

hiperplasia de células caliciformes, evidenciadas pela coloração de PAS. Tecidos corados por

P.A.S., vistos em microscópio óptico comum em aumento total de 40x.

67

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

0

2000

4000

6000

8000

10000

Pix

el/

m2

Gráfico 7. Análise quantitativa da presença de muco na região bronquiolar em cortes

histológicos no modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. O tecido pulmonar dos animais foi coletado 24h após o último

desafio e realização da perfusão cardíaca. O pulmão foi submetido a técnica histológica e

coloração por PAS. Foi realizada a análise da intensidade de coloração do PAS em pixel/µm2

nos diferentes grupos de tratamento. As análises foram realizadas através do software KS300.

68

Sal

ina

OVA

DEX

AOUA

7

8

9

10

11###

*****

Lo

g2 Ig

E-O

VA

es

pe

cíf

ica

6.7 Efeito da ouabaína sob o título de IgE-OVA específica na inflamação

alérgica pulmonar experimental

Como esperado, nos soros dos animais do grupo salina não foi

detectado IgE, pois os mesmos não foram sensibilizados (Gráfico 8). O título de

IgE-OVA especifica foi maior que 1024 no grupo OVA. No grupo

dexametasona, houve uma redução no título de IgE (256) quando comparado

com o grupo OVA (Gráfico 8). O pré-tratamento com a ouabaína também foi

capaz de reduzir esse título para 512 (p < 0,01), quando comparado ao grupo

OVA (Gráfico 8).

Gráfico 8. Efeito da ouabaína no título de IgE-OVA específica no modelo de inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA

Camundongos BALB/c fêmeas (n=6) foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA)

e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com ouabaína (0,56 mg/kg) dois dias antes das

sensibilizações e uma hora antes das mesmas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1

hora antes de cada desafio. Os soros dos animais foram coletados 24h após o último desafio e

título de IgE OVA-específica, determinado pelo teste de PCA. Os resultados foram expressos

como média do log2 do título de IgE ± e.p.m. A diferença entre os grupos foi analisada por

ANOVA one-way, seguida do teste de Tukey. Valores de ###

p < 0,001 foram considerados

significativos quando comparados com o grupo salina e ***p < 0,001 foram considerados

significativos quando comparados com o grupo OVA.

69

70

7. DISCUSSÃO

71

O presente trabalho demonstrou que a ouabaína é capaz de modular

diversos aspectos da resposta inflamatória desencadeada na inflamação

alérgica pulmonar induzida por OVA, incluindo migração celular para os

pulmões, tendo eosinófilos, neutrófilos e linfócitos T CD3+ como principais

exemplos dos leucócitos modulados; níveis de citocinas (IL-4 e IL-13); aspectos

histopatológicos, como infiltrado peribronquiolar, perivascular e produção de

muco, e o título de IgE-OVA específica.

Por muitos anos, acreditou-se que os efeitos da ouabaína estendiam-se

apenas as suas caracteristicas clássicas de glicosídeo cardiotônico

(BLAUSTEIN,1993) e este hormônio só desempenhava, portanto, seu

mecanismo como inibidora da Na+/K+-ATPase (LINGREL, 2010). No entanto,

nosso grupo tem evidenciado, que o tratamento por três dias consecutivos com

a ouabaína na dose de 0,56 mg/kg apresenta uma atividade anti-inflamatória e

anti-nociceptiva dependente de mediadores como a prostaglandina e a

bradicinina (DE VASCONCELOS et al., 2011), modula negativamente a

inflamação aguda peritoneal em modelo experimental de leishmaniose causada

pela Leishmania (L.) amazonensis, ao reduzir a migração celular e os níveis de

citocinas pró-inflamatórias características da infecção, como o TNF-α e o IFN-γ

(JACOB et al., 2012).

Recentemente, foi descrito que a ouabaína também apresenta a

capacidade de reduzir a resposta inflamatória na peritonite induzida por

zimosan, diminuindo não só a migração celular, como a permeabilidade

vascular, ao inibir a ativação do NF-κB, um fator de transcrição essencial para

a produção das citocinas IL-1β e TNF-α (LEITE et al., 2015), ambas integrantes

desse modelo de peritonite. Além disso, sabe-se que a ouabaína é capaz de

modular mecanismos celulares de mastócitos (LAGO et al., 2001; SENOL et

al., 2007), células fundamentais para o desencadeamento, por exemplo, das

respostas inflamatórias alérgicas pulmonares (BARNES, 2008).

Os modelos de inflamação alérgica pulmonar frequentemente utilizam a

ovalbumina (OVA) como o antígeno sensibilizante. O processo envolve a

sensibilização sistêmica com o auxílio de um adjuvante (Al(OH)3) (KUMAR;

HERBERT; FOSTER, 2008). A via de sensibilização e escolha do antígeno

72

pode oferecer diferentes perspectivas sobre a fisiopatogênese da inflamação

nas vias aéreas inferiores. Por exemplo, a OVA tem a vantagem de estar

disponível em formas relativamente puras, com níveis muito baixos de

endotoxinas contaminantes de preparações antigênicas convencionais,

permitindo assim, a indução de uma resposta predominante do fenótipo Th2

(HERBERT et al., 2010).

Neste modelo, fomos capazes de detectar que o pré-tratamento com a

ouabaína (0,56 mg/kg) por três dias (DE VASCONCELOS et al., 2011), antes

das sensibilizações, reduziu o número de células totais presentes no fluido do

lavado broncoalveolar (BALF) (Gráfico 1A), bem como o número de

subpopulações específicas como granulócitos (eosinófilos e neutrófilos)

(Gráfico 1 D e E; Gráfico 2 e Gráfico 3) e linfócitos (Gráfico 1B e Gráfico 4).

Durante o processo inflamatório alérgico pulmonar, o segundo contato

com o alérgeno, provoca a degranulação de mastócitos (HOGAN et al., 1998) e

o posterior recrutamento de várias células, como os eosinófilos (PALMQVIST et

al., 2007), neutrófilos (SHAW et al., 2007) e linfócitos (SIEGLE et al., 2006)

para a região da inflamação. Estas células podem liberar moléculas

inflamatórias, como citocinas, quimiocinas, ROS e enzimas proteolíticas, que

podem causar danos teciduais (SERHAN; SAVILL, 2005). Assim, a regulação

do recrutamento destas células e sua depuração são processos críticos na

inflamação (MANNA; SREENIVASAN; SARKAR, 2006).

O tratamento medicamentoso da asma brônquica – um dos tipos de

inflamação alérgica pulmonar – se baseia no uso de corticoides, resultando na

modulação negativa de eosinófilos, que sofrem apoptose (WOOLLEY et al.,

1996). Sabendo que a ouabaína apresenta propriedades químico estruturais

semelhantes a de outros corticosteroides, (FERRANDI et al., 1997; SCHONER,

2000) bem como é capaz de induzir apoptose (ORLOV et al, 1999) e de

amplificar os efeitos da morte celular induzida por FAS (NOBEL et al, 2000,

BORTNER et al, 2001), podemos sugerir que sua ação na diminuição da

eosinofilia (Gráfico 1D) no BALF, pode estar relacionada as características

citadas anteriormente, apesar de não ter sido identificada a presença de

células com perfil apoptótico nas amostras estudadas.

73

A neutrofilia (SHAW et al., 2007; WAKASHIN et al., 2008), um dos

pontos da inflamação das vias aéreas inferiores, que cada vez mais fica em

evidência nos modelos de inflamação alégica pulmonar (BELLINI et al., 2011;

BRANDT et al., 2013), foi reduzida pelo pré-tratamendo com a ouabaína no

nosso modelo (Gráfico 1E). Estudos, demonstraram que a ouabaína é capaz

de diminuir a migração de neutrófilos na peritonite induzida por concanavalina

A (VASCONCELOS et al., 2011) e por zimosan (LEITE et al., 2015). Ademais,

foi observado que, em animais infectados com Streptococcus pneumoniae,

uma bactéria gram-positiva, a digoxina, um glicosídeo cardíaco, foi capaz de

inibir a migração de neutrófilos, impedindo assim, o desenvolvimento da

pneumonia pneumocócica no hospedeiro (ESPOSITO; POIRIER; CLARK,

1989), corroborando os nossos achados.

Os linfócitos T CD3+ tem um papel fundamental na patogênese da asma

e no desenvolvimento do perfil Th2 que modula o processo inflamatório

alérgico crônico das vias aéreas (JOSEFOWICZ et al., 2012). As citocinas

produzidas pelos linfócitos do fenótipo Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) promovem a

produção de IgE, eosinofilia sérica e tecidual e hiperreativade das vias áreas,

uma vez que, os níveis destas citocinas estão aumentados no BALF de

pacientes que desenvolvel algum quadro inflamatório pulmonar (BLOEMEN et

al., 2007; FINKELMAN et al., 2010; PORTER et al., 2011).

Ao avaliar as subpopulações de linfócitos T CD3+ no BALF, os animais

do grupo OVA apresentaram um aumento na migração desses linfócitos em

relação ao grupo salina (Gráfico 4), corroborando assim a quantificação de

linfócitos, e demonstrando a presença e atuação destes leucócitos na

imunomodulação do processo inflamatorio das vias aéreas característico da

asma alérgica (HUANG et al., 2009). O pré-tratamento com a ouabaína na

dose de 0,56 mg/Kg reduziu a migração de linfócitos CD3+, bem como o

tratamendo com a dexametosona (Gráfico 4).

A ouabaína é capaz de inibir a proliferação de timócitos ativados por

concanavalina A (SZAMEL et al, 1981) e induzir atrofia tímica em sinergismo

com outros corticoides como a hidrocortisona (RODRIGUES-MASCARENHAS

et al., 2006). Ela também reduz a fosofrilação de p38 e consequentemente os

74

níveis de NFATc1, ambas moléculas de vias de sinalização independentes de

alterações iônicas e absolutamente indispensáveis para a translocação do

receptor de linfócitos T na resposta imunitária (RODRIGUES-MASCARENHAS

et al., 2008). Elucidado estes dois pontos, podemos sugerir que a ação da

ouabaína na redução das subpopulações de linfóctios T CD3+ está relacionada

com os eventos moleculares de maturação (RODRIGUES-MASCARENHAS et

al., 2006) e resposta celular (RODRIGUES-MASCARENHAS et al., 2008) das

células T, que pode estar sendo inibidos pela ouabaína.

O aspecto imunológico da asma induzida no modelo de inflamação

alérgica pulmonar utilizado nesse estudo caracteriza-se por apresentar um

perfil de resposta imune tipo 2 com preponderância de células do fenótipo Th2.

Esse fenótipo celular é caracterizado por produzir citocinas tais como IL-4, IL-5,

IL-13 preferencialmente e ser dependente de IgE e IgG1 –imunoglobilinas

consideradas marcadores fenotípicos da asma alérgica (COSTA et al., 2008). A

produção dessas imunoglobulinas é dependente das citocinas IL-4 e IL-13

(TODO-BOM e PINTO, 2006) e elevados níveis de IgE estão associados com

reações alérgicas do tipo imediato e gravidade da doença (COSTA et al.,

2008).

As reduções nos níveis de IL-4 e IL-13 pelo pré-tratamento com a

ouabaína, observadas neste presente trabalho (Gráfico 5A e B), podem estar

relacionadas tanto com a capacidade desse glicosídeo em reduzir as

subpopulações de linfócitos T CD3+, células essenciais para a manutenção do

processo inflamatório (RODRIGUEZ-PALMERO et al., 1999; SLAGER et al.,

2011), quanto com a sua ação moduladora sob os mastócitos (LAGO et al.,

2001; SENOL et al., 2007), um dos principais efetores do processo asmático

alérgico, após o segundo contato com o antígeno (HOGAN et al., 1998) e

também um dos principais produtores de IL-4 e IL-13

O IFN-γ é uma citocina de perfil Th1, raramente é encontrada em níveis

elevados durante a exacerbação do fenótipo Th2 na asma alérgica (WILD et

al., 1999; MAZZARELLA et al., 2002). No nosso estudo, apenas o tratamendo

com a dexametasona foi capaz de reduzir os níveis da citocina (Gráfico 5C).

Em outros modelos de inflamação, a ouabaína é capaz de modular as

75

concentrações de IFN-γ (JACOB et al., 2012), mas sendo o fenótipo Th2

dominante na resposta inflamatória pulmomar alérgica (ELENKOV;

CHROUSOS, 1999), esta citocina não se mostra elevada o suficiente, como

comprovado neste trabalho (Gráfico 5C), para que a ouabaína module sua

produção.

As alterações histopatológicas do processo inflamatório alérgico são

pontos delimitantes para se avaliar a imunomodulação em protocolos de alergia

pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al., 2012; MONTEIRO et al., 2016). Os

padrões inflamatórios avaliados neste presente estudo através das colorações

das secções pulmonares com hematoxilina-eosina (HE) e PAS (Ácido Periódico

de Schiff) foram migração de células para o espaço perivascular e

peribronquiolar, vasodilatação, manutenção da integridade epitelial bronquiolar,

entupimento alveolar, hiperplasia e hipertrofia das células caliciformes e

hiperprodução de muco. Todos essas características foram moduladas pelo

pré-tratamento com a ouabaína.

A redução do padrão e do score inflamatório nas secções HE (Figura 10

e Gráfico 6) podem ser corroboradas pela capacidade que a ouabaína tem de

imunomodular a liberação de mediadores pelos mastócitos (LAGO et al., 2001;

SENOL et al., 2007), já que as reações de fase tardia do fenótipo Th2 como

aumento nos níveis de IL-4, sustentação da migração eosinófilica

(BRUSSELLE et al., 1994; CORRY et al., 1996) e infiltração vascular e

peribronquiolar de células (EDWARDS et al, 2012) são dependentes da ação

dos mastócitos ativados no segundo contato com o antígeno (MCKAY et al.,

2004).

A ouabaína também reduz a hiperplasia das células caliciformes na

secções PAS, o que corrobora com a diminuição dos níveis de IL-13, uma das

principais citocinas participantes do aumento no processo de hiperreatividade

brônquica e de células epiteliais hiperplásicas nos pulmões (WILLS-KARP et

al., 1998).

Por fim, determinamos o título de IgE-OVA específica com a finalidade

de confirmar que realmente foi desencadeado um processo inflamatório

alérgico pulmonar, mediado pela hipersensibilidade a ovalbumina (LLOYD et

76

al., 2000; KUMAR; HERBERT; FOSTER, 2008). A ouabaína foi capaz de

reduzir o título IgE-OVA específica, que se mostrou elevado no grupo OVA,

confirmando a sensibilização mediada por IgE nesse modelo (Gráfico 8). Essa

redução, pode ser justificada pela capacidade que a oubaína tem de inibir a

maturação de linfóctios B no baço e na circulação periférica (PAIVA et al.,

2011), ou mesmo, pelo seu papel limitante na dinâmica entre as diferentes

subpopulações de linfócitos B nos órgãos periféricos (DA SILVA et al.,2016).

Com esses achados, podemos sugerir que a ouabaína é capaz de

estender sua atividade anti-inflamatória ao modelo de inflamação alérgica

pulmonar, no entanto, outros protocolos são necessários para caracterizar os

mecanismos moleculares pelos quais a ouabaína atua neste modelo. Este

conjunto de dados sugere que a ouabaína possui um papel fisiológico

modulador da resposta inflamatória, interferindo negativamente em

características fenótipcas do modelo de inflamação alérgica pulmonar, que

envolvem a migração de células para o sítio inflamado, a produção de citocinas

do perfil Th2, as características histopatológicas do processo e os níveis de

IgE.

77

78

8. CONCLUSÕES

79

A análise dos resultados permite concluir que:

O pré-tratamento com a ouabaína (0,56 mg/kg), mostrou uma ação anti-

inflamatória uma vez que foi capaz de reduzir a migração de células

para o sítio da inflamação;

A ouabaína reduz a subpopulação de linfócitos T CD3+ no fluido do

lavado broncoalveolar (BALF);

A ouabaína atenuou a produção de citocinas características do fenótipo

Th2, IL-4 e IL-13, porém não interferiu nos níveis de IFN-γ;

As alterações histopatológicas do modelo de inflamação pulmonar

alérgica foram moduladas negativamente pela oubaína;

A ouabaína reduziu a proporção do título de IgE-OVA específica

presente no BALF.

80

Figura 12. Esquema representando os efeitos da ouabaína no processo inflamatório

alérgico pulmonar obtidos neste trabalho

81

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95

APÊNDICE A - Substâncias e sais

Ácido acétido glacial (C2H4O2) – VETEC

Ácido clorídrico (HCl) –VETEC

Ácido fosfotunguístico (H3PW12O40) – VETEC

Ácido periódico (HIO4) – VETEC

Álcool metílico (CH3OH) – VETEC

Aldeído fórmico (CH2O) – MERCK

Alúmen de potássio (KAI(SO4)2) – MERCK

Anticorpo Monoclonal: anti-CD3

Bissulfito de sódio (NaHSO3) – MERCK

Carvão ativado – VETEC

Cloral hidratado – VETEC

Cloreto de potássio (KCl) – MERCK

Cloreto de sódio (NaCl) – SIGMA

Cloridrato de quetamina – VETBRANDS

Clorofórmio (CHCl3) – LTF

Corante azul de evans – VETEC

Corante cromotropo 2R – VETEC

Corante eosina Y – VETEC

Corante hematoxilina – VETEC

Corante Panóptico – NEWPROV

Corante test-green F.C.F. – VETEC

Corante violeta de genciana – VETEC

96

Dexametasona – Aché ®

D-gluxose (C6H12O6) – SIGMA

Etanol (C2H5OH) – CBiotec

Ficoeritrina

Fosfato de potássio (KH2PO4) – REAGEN

Fosfato de sódio anidro (Na2HPO4) – MERCK

Formaldeído – MERCK

Glicerina (C3H3(OH)3) – VETEC

Hidróxido de alumínio (Al(OH)3) – VETEC

Hidróxido de sódio (NaOH) – REAGEN

Metabissulfito de sódio (Na2S2O5) – MERCK

Ouabaína – SIGMA

OVA grade II – SIGMA

OVA grade V – SIGMA

Óxido de mercúrio amarelo (Hg2O) – LAFAN

Parafina para Histologia – COAL

Timol (C10H14O) – VETEC

Xilol (C6H4(CH3)2) – VETEC

97

APÊNDICE B - Aparelhos e equipamentos

Agitador Vortex – VWR – Scientific Pro ducts

Autoinclusor – Leica EG 120

Balança analítica – Sartorius

Banho histológico – ANCAP

Centrífuga refrigerada - Centra MP4R – International Equipement Company

(IEC)

Citômetro – FACS Callibur

Estufa – ICAMO – modelo 3

Histotécnico processador automático de tecidos – OMA – DM – 40

Microscópio óptico – Nikon

Micrótomo – Leica RM 2125 – RT

Nebulizador – Pulmosonic Star – Soniclear

98

ANEXOS

ANEXO A – Certidão da comissão de ética no uso de animais (CEUA)

99

ANEXO B – Artigo em colaboração publicado em 2015 (Mediators of

Inflammation - WebQualis CAPES: B2; Fator de impacto: 3,236; Online

ISSN: 0962-9351).

100

ANEXO C - Artigo em colaboração publicado em 2015 (frontiers in

Physiology - WebQualis CAPES: B1; Fator de impacto: 3,534; Online

ISSN: 1664-042X).

101

ANEXO D – Artigo submetido com os resultados desta dissertação

(Immunobiology - WebQualis CAPES: B1; Fator de impacto: 3,044; Online

ISSN: 0171-2985).