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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de biologia
ROBSON TRAMONTINA
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS AUXILIARES (REDOX) DO
CUPIM COPTOTERMES GESTROI QUE ATUAM EM
CONJUNTO COM HIDROLASES GLICOLÍTICAS
CHARACTERIZATION OF AUXILIARY (REDOX) ENZYMES
FROM THE TERMITE COPTOTERMES GESTROI THAT
COOPERATE WITH GLYCOLYTIC HYDROLASES
CAMPINAS 2016
ROBSON TRAMONTINA
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS AUXILIARES (REDOX)
DO CUPIM COPTOTERMES GESTROI QUE ATUAM EM
CONJUNTO COM HIDROLASES GLICOLÍTICAS
CHARACTERIZATION OF AUXILIARY (REDOX) ENZYMES
FROM THE TERMITE COPTOTERMES GESTROI THAT
COOPERATE WITH GLYCOLYTIC HYDROLASES
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, na área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde. Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the Master’s degree of Sciences, in the field of concentration of Drugs, Medicines and Supplies for Health.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ROBSON TRAMONTINA, E ORIENTADA PELO DR FABIO MARCIO SQUINA COM COORIENTAÇÃO PELO PROF DR ANDRÉ RICARDO DE LIMA
DAMÁSIO. Orientador: FABIO MARCIO SQUINA Co-orientaodor: ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMÁSIO
CAMPINAS
2016
Campinas, 08 de julho de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Marcio Squina
Prof. Dr. Valdeir Arantes
Dra. Juliana Velasco de Castro Oliveira
Dr. Roberto Ruller
Os membros da comissão organizadora acima assinaram a Ata da Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
À dona Celitinha e seu Tramontina
Pelos 26 anos de compaixão, suporte,
compreensão e liberdade de escolha
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Caríssimos amigos, mestres e familiares, não haveria nenhuma condição de eu
chegar até aqui e sem dúvidas eu não teria forças para finalizar este trabalho, sem
vocês. Portanto, sou profundamente grato a todos, e gostaria de homenagear vocês
que fizeram parte desta obra e de minha vida.
Ao meu orientador, Dr. Fabio Squina, pela sua excelência, oportunidade, confiança,
incentivo e a liberdade de escolha, que tornaram este trabalho tão próspero e
motivador. Ao meu coorientador Dr. André Ricardo de Lima Damásio, pela amizade,
dedicação, e pelo exemplo de veterano que ele é.
Ao João Paulo Franco Cairo, “a casta doutoranda” que ensinou a “casta mestranda”
a crescer e se diferenciar, espero que um dia sejamos todos reis na “colônia da
pesquisa”.
Aos meus amigos e colaboradores fundamentais para este trabalho Fernanda
Mandelli e Marcelo Liberato, obrigado pela atenção e experiência compartilhada.
Ao CNPEM/CTBE pela infraestrutura e o suporte técnico dos melhores profissionais.
Em especial a: Jaciane Lenczac, Roberto Ruller, Sindelia Freitas, José Pradella,
Juliana Velasco, Sarita Rebelo e Silvio Consonni.
À Dra. Ana Maria Costa-Leonardo, por ter disponibilizado os cupins.
À universidade estadual de Campinas (UNICAMP), uma universidade pública e de
qualidade. Desejo que a UNICAMP sempre seja referência mundial.
Aos meus amigos do CTBE: Agnes; Amanda; Bruna Campos; Bruna Soares; Carla
Botelho; Carol; Douglas; Eduardo; Emerson; Fabiano; Gisele; Gabriela Felix;
Gabriela Ematsu; Juliana; Lívia; Lucas; Marcelo Rúbio; Mariana; Rebeca; Roberta;
Samantha; Thabata; Thiago; Pedro; Renan; Erica, que tanto me ajudaram,
motivaram e tornaram meus dias mais felizes. Cada um de vocês sabe o quão eu
sou grato!
Aos amigos do programa de pós-graduação em biociência e tecnologia de produtos
bioativos: Daniela Mizobuti (Mitsubishi) pelo BITEC e os SOS, Marcos Salvador,
Elaine Minatel e Rafael Chagas Pessoa pela simpatia e paternalismo mesmo em
uma universidade tão grande.
Ao Bruno Leite Silva por segurar comigo esta marimba que é a vida! Você é
fundamental.
Aos amigos que Campinas me proporcionou e levarei para a vida: Alejandro;
Guilherme e Djalma. Em especial à Antonielle, Carla Portela e Diogo que me
aconselharam de bom coração. Além dos amigos de sempre, Ewerton e Lucas.
Aos meus pais Valdecir, Celita e irmão Renan Tramontina; aos meus tios e primos.
A todos aqueles que direta ou indiretamente se envolveram na realização deste
trabalho.
À FAPESP pelo auxílio financeiro durante a realização deste trabalho.
"A melhor maneira de prever o futuro é criá-lo."
Peter F. Drucker
RESUMO
A descoberta de novas fontes enzimáticas para degradação e detoxificação da
lignocelulose em açúcares fermentescíveis é considerada o maior gargalo para a
viabilidade das biorefinarias de etanol de segunda geração (2G). Na natureza, os
cupins são sistemas biológicos modelos para o estudo da conversão da biomassa
vegetal. Deste modo, o cupim inferior Coptotermes gestroi utiliza como fonte de
nutrientes a madeira, fazendo o uso desta biomassa recalcitrante através de uma
complexa simbiose entre si como hospedeiro e seus simbiontes procarióticos e
eucarióticos. Após o uso das tecnologias “ômicas”, pose-se explorar melhor a
biologia dos cupins, em especial aspectos enigmáticos sobre a relação holobiôntica,
bioquímica e fisiológica relacionada à sua dieta. Há muitos indícios sobre uma
classe inexplorada de proteínas endógenas, enzimas pró-oxidantes antioxidantes e
detoxificantes (PADs) e enzimas auxiliares (AAs), que demonstram que estas
enzimas poderiam ter um papel fundamental na conversão de lignocelulose pelos
cupins inferiores. Portanto, a hipótese deste trabalho versa sobre o cupim C. gestroi
quanto à presença de um sistema de degradação e detoxificação de biomassa
lignocelulósica que complementa as hidrolases glicolíticas. Para isso, neste trabalho
foram conduzidos estudos enzimáticos, eletroquímicos, fermentativos e
microscópicos visando o estudo das enzimas endógenas de cupim, de maneira a
atribui-las potencial de aplicação biotecnológica. As enzimas endógenas do cupim,
endoglucanase (CgGH9-1), aldoketo redutase (CgAKR-1-1) e superóxido dismutase
(CgSOD-1) foram imunolocalizadas no aparelho digestivo de C. gestroi, confirmando
a presença destas na digestômica do inseto. Foi encontrado que, CgSOD-1,
CgAKR-1, CgADH-1 (Álcool desidrogenase), CgLAC-1 (Lacase) atuam em
sinergismo dependente de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante a
suplementação de coquetéis celulásicos. Outra aplicação encontrada para CgAKR-1
foi sua capacidade de agente detoxificante de biomassas contra os fenólicos
aldeídicos inibidores de fermentação. Foi identificada a primeira LPMO da família
AA10 em animais (CgAA10-2), que foi caracterizada e capaz de oxidar a celulose.
CgGOX-1 apresentou atividade de glicose oxidase, o que permitiu o
desenvolvimento de uma biopilha de açúcares provenientes de bagaço de cana de
açúcar hidrolisado. CgCAT-1 uma catalase, apresentou alta similaridade com uma
catalase de R. flavipes. Em vias gerais todas estas enzimas identificadas
apresentaram relação com a digestômica do inseto, reforçando o papel das enzimas
endógenas do cupim para a degradação da biomassa, detoxificação de xenobióticos
e atividade pró e antioxidante, ampliando o conhecimento da biologia deste inseto.
Por último, estas enzimas apresentam um grande potencial para as biorefinarias,
como enzimas com múltiplos propósitos e com características integrativas, visando à
consolidação dos processos envolvendo a produção de etanol 2G.
ABSTRACT
Discovering novel enzymes sources for lignocellulose degradation and detoxification
into fermentable sugars is considered one of the biggest bottlenecks towards the
sustainable production of second-generation ethanol. In nature, termites are
biological models for plant biomass conversion. Accordingly, the termite Coptotermes
gestroi degrades hardwoods to harness their nutrients, through a complex symbiosis
between the host termite and prokaryotic and eukaryotic symbionts. A deep insight
into the unknown termite biology was obtained by applying "omics" technologies,
especially with respect to holobiontic, biochemical and physiological aspects applied
to its diet. Many hypotheses about a class of endogenous proteins – the so called
pro-oxidant antioxidant and detoxifying enzymes (PADs) and auxiliary enzymes (AAs)
– indicate that such enzymes may play a key role in the bioconversion of
lignocellulose by termites. This work considers the presence of a redox lignocellulosic
degradation and detoxification system supporting glicosil hydrolases. Enzymatic,
electrochemical, microscopic and fermentative approaches were used in order to
support this consideration. The host enzymes, endoglucanase (CgGH9-1), aldoketo
reductase (CgAKR-1) and superoxide dismutase (CgSOD-1) were
immunolocalizated in C. gestroi's digestive tract, confirming their presence in the
insect digestomics. It was also found that supplementation with CgSOD-1, CgAKR-1,
CgADH-1 (alcohol dehydrogenase) and CgLAC-1 (Laccase) enhanced
saccharification of sugarcane bagasse performed by cellulosic cocktails. This
synergism was based on reactive oxygen species generation. CgAKR-1 also showed
to be a detoxifying agent against phenolic aldehydic inhibitors found in pretreated
lignocelulose. A first putative animal LPMO from the family AA10 (CgAA10-2) was
characterized and found capable of oxidizing cellulose. A glucose oxidase (CgGOX-
1) was used in the development of a biobattery composed of sugars from sugarcane
bagasse enzymatic hydrolysate. The catalase (CgCAT-1) showed high similarity with
a catalase from R. flavipes. In general all identified enzymes could be related to the
insect digestomics, reinforcing the role of termite endogenous redox enzymes on
biomass degradation, xenobiotics detoxification and pro/anti-oxidant which
contributes to understanding the termite biology. Finally, these enzymes present a
great potential in biorefinaries, serving for multi-purpose applications and being
considered as integrative enzymes by consolidating all processes in the production of
second-generation ethanol.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras
Figura 1 - Parede celular vegetal e seus principias componentes. ................. 24
Figura 2 - Processo de produção de etanol 2G. ............................................. 25
Figura 3 - Parâmetros físico-químicos no intestino de cupins inferiores.. ....... 32
Figura 4 - Mapa do vetor Pet28a .................................................................... 43
Figura 5 - representação da biopilha de glicose e CgGOX-1. ......................... 52
Figura 6 - Imunolocalização de CgGH9-1 no tecido intestinal de C. gestroi. .. 59
Figura 7 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum (0,4FPU/g
BEX) com diferentes concentrações da proteína CgGH1-1. t. ........................ 60
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose 1 % do produto de PCR de colônia
de ArcticExpress (DE3) para as construções do gene CgsymGH7-1 em
pET28a. ........................................................................................................ 61
Figura 9 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgsymGH7-1) .......................................................... 62
Figura 11 - Imunolocalização de CgSOD-1 no tecido intestinal de C. gestroi. 63
Figura 12 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 1FPU por
grama de BEX com a proteína CgSOD-1 (1,3mg/g BEX). .............................. 64
Figura 13 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum
(0,4FPU/g BEX) com diferentes concentrações da proteína CgGH1-1. ......... 65
Figura 14 - Inibição pelo furfural do crescimento de E. coli BL21 (DE3)
(PeT28A) com o gene de CgAKR-1 ou o vetor vazio. .................................... 68
Figura 15 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão em Rosetta-gami 2
(DE3) e purificação de CgAA10-2. .................................................................. 69
Figura 16 - Domínio conservado identificado na sequência de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgAA10-2) ............................................................... 70
Figura 17 - Figura - Análise filogenética de CgAA10-2 de insetos. ................. 71
Figura 18 - Predição de estrutura tridimensional de CgAA10-2 ...................... 72
Figura 19 - (A) Efeito do pH sobre a atividade de CgAA10-2. ........................ 73
Figura 20 - Análise de clivagem de BG por CgAA10-2 ................................... 74
Figura 21 - Análises de eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de
PCR TouchDown de CgALOX-1. .................................................................... 75
Figura 22 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgALOX-1) ............................................................... 76
Figura 23 - Análise filogenética de AOX e XDHs. ........................................... 77
Figura 24 - Análise de SDS-PAGE 12% da expressão do gene CgGOX-1 .... 78
Figura 25 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgGOX.1) ................................................................ 79
Figura 26 - Análise filogenética de GMC oxidorredutases de insetos. ............ 80
Figura 27 - Confecção da biopilha de glicose. ............................................... 82
Figura 28 - Análise da produção de energia elétrica a partir da biopilha
composta com o sistema (CgGOX-1+ glicose de BEX sacarificado + eletrodos
de carbono). .................................................................................................... 83
Figura 29 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e
purificação de CgADH-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ..... 85
Figura 30 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgADH-1) ................................................................. 86
Figura 31 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g
PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). .......................................................... 87
Figura 32 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e
purificação de CgCAT-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ...... 88
Figura 33 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgCAT-1) ................................................................. 89
Figura 34 - Detecção da atividade de catalase através do ensaio com o
reagente Amplex Red. .................................................................................... 90
Figura 35 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e
purificação de CgLAC-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ...... 91
Figura 36 - Domínio conservado identificado na sequência de nucleotídeos
correspondente à ORF (CgALOX-1) ............................................................... 93
Figura 37 - A atividade CgLAC-1. ................................................................... 94
Figura 38 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g
PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). .......................................................... 95
Figura 39 - Exemplificação do digestoma de cupins inferiores. ...................... 98
Figura 40 – Mecanismos propostos de atuação das enzimas auxiliares redox
de C. gestroi aplicáveis em biorefinarias. ....................................................... 99
Tabelas
Tabela 1 – Primers utilizados para amplificação de genes ............................. 41
Tabela 2 - Composição dos bagaços de cana-de-açúcar ............................... 48
Tabela 3 Comparativo entre as enzimas identificadas no metatranscriptôma
de C. gestroi. .................................................................................................. 55
Tabela 4 - Panorama dos resultados obtidos com as enzimas GHs, PADs e
AAs de C. gestroi. ........................................................................................... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
•OH – Radical hidroxila
AA – Enzima de atividade auxiliar
aa. – Aminoácido
APTS – Ácido 8-aminopireno-1, 3,6-trisulfônico
ATP – Adenina Trifosfato
BG – Beta Glucano
BIN – Bagaço de cana-de-açúcar In-natura
C. GESTROI – Coptotermes gestroi.
CAZy – Banco de Dados de Enzimas Ativas em Carboidrato
cDNA – Ácido Desoxiribonucléico Complementar
CGAKR-1– Aldoketo redutase de C. gestroi
CGGH1-1– Beta glicosidase de C. gestroi
CGGH9-1– Endoglucanase de C. gestroi
CGLAC-1 – lacase de C. gestroi
CGSOD-1 – superóxido dismutase de C. gestroi
CGADH-1– álcool desidrogenase de C. gestroi
CGALOX-1– Aldeído oxidase de C. gestroi
CGAA10-2 – AA10 de C. gestroi
CGGOX-1– Glicose oxidase de C. gestroi
CGCAT-1 – Catalase de C. gestroi
CIs – Compostos inibitórios
CTBE – Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxiribonucléico
DNS – Ácido Dinitrosalicílico
ETECAP – Escola Técnica Estadual Conselheiro Antonio Prado
EROs – Espécies Reativas do Oxigênio
GF – Cromatografia de Filtração em Gel
GH – Família de Hidrolase Glicolítica
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HMF – Hidroximetilfurfural
HPF– sensor peroxinitrito
IMAC – Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado
IPTG – Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
kDa – Kilo Daltons
LB – Meio Luria-Bertani
LC-MS/MS – Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas
LGE-Laboratório de Genômica e Expressão
LNBio – Laboratório Nacional de Biociências
Mix – CgGH9-1 + CgAKR-1+ NADPH
mV – milivolt
MW. – Peso Molecular
NADP+ – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NCBI – Centro Nacional de Informação Biotecnológica
NM– nanômetro
PAD – Enzimas pró-oxidantes, antioxidantes e detoxificantes
PASB – Bagaço de cana de açúcar tratado com ácido fosfórico
PBS – Tampão fosfato-salina
PCR – Reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial Hidrogeniônico
PMSF – Fenilmetilsulfonilflúor
RNA – Ácido ribonucléico
S. STIPISIS – Scheffersomyces stipisis;
SCB – Bagaço de cana de açúcar;
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida e SDS
Taq – DNA Polimerase de Alta Fidelidade
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................... 9
ABSTRACT .................................................................................................... 10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................. 11
FIGURAS ........................................................................................................ 11
TABELAS ....................................................................................................... 13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................ 14
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................. 21
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................. 23
1.1. A biomassa lignocelulósica e o estado da arte das biorrefinarias ... 23
1.2. Enzimas e proteínas acessórias envolvidas na hidrólise de
biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol ........................................... 27
1.3. Enzimas oxidativas para sacarificação biomassa lignicelulósica .... 29
1.4. Enzimas Pró-oxidantes Antioxidantes e Detoxificantes (PADs): Um
novo conceito no tratamento da lignocelulose ....................................................... 30
1.5. A biologia do cupim aplicada a biorrefinaria .................................... 31
1.6. Enzimas PADs e AAs encontradas em C. gestroi ........................... 32
1.6.1. Aldoketo redutase (AKR) ............................................................. 33
1.6.2. Superóxido dismutase (SOD) ...................................................... 34
1.6.3. Lacases (LAC) ............................................................................. 34
1.6.4. Monooxigenases líticas de polissacarídeos da família 10 ......... 35
1.6.5. Glicose desidrogenase (GOXs) ................................................... 35
1.6.6. Aldeído oxidase (AOX) ................................................................ 35
1.6.7. Álcool desidrogenase (ADHs) ..................................................... 36
1.6.8. Catalases (CATs) ........................................................................ 36
CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS .......................................................................... 37
2.1. Objetivos Gerais .............................................................................. 37
2.2. Objetivos Específicos ...................................................................... 37
CAPÍTULO 3 – CLONAGEM, OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
APLICAÇÃO DE ENZIMAS DE COPTOTERMES GESTROI .................................. 37
3.1. Introdução ....................................................................................... 37
3.2. Objetivos do capítulo .......................... Erro! Indicador não definido.
3.3. Materiais e métodos ........................................................................ 39
3.3.1. O cupim ....................................................................................... 39
3.3.2. Identificação de genes alvos através de análise da expressão
diferencial gênica e proteica .................................................................... 39
3.3.3. Seleção dos genes ...................................................................... 40
3.3.4. Desenho de oligonucleotídeos para amplificação de sequências
alvos................ ........................................................................................ 41
3.3.5. Amplificação dos genes ............................................................... 41
3.3.6. Purificação e digestão dos genes amplificados ........................... 42
3.3.7. Quantificação de DNA ................................................................. 42
3.3.8. Preparação do vetor pET28a e ligação do gene ......................... 43
3.3.9. Clonagem em Escherichia coli .................................................... 44
3.3.10. Seleção das colônias transformantes por CS-PCR (Colony
Screening by PCR) .................................................................................. 44
3.3.11. Extração do DNA plasmidial ...................................................... 44
3.3.12. Cultivo dos transformantes e expressão das proteínas ............. 45
3.3.13. Lise celular para obtenção das proteínas recombinantes ......... 46
3.3.14. Purificação das enzimas em colunas cromatográficas .............. 46
3.3.15. Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes (SDS-PAGE) .................................................................... 47
3.3.16. Dosagem de proteínas .............................................................. 47
3.3.17. Biomassas vegetais hidrolisadas .............................................. 47
3.3.18. Estudo de suplementação de coquetéis celulósicos comerciais e
extratos fúngicos...................................................................................... 48
3.3.19. Determinação de açúcares ........................................................ 49
3.3.20. Avaliação da oxidação de carboidratos pelas enzimas ............. 50
3.3.21. Análises filogenéticas ................................................................ 50
3.3.22. Caracterização de CgGOX-1 ..................................................... 51
3.3.22.1. Atividade de glicose oxidase de CgGOX-1 ................................ 51
3.3.22.2. Confecção de uma biopilha de CgGOX- .................................... 51
3.3.23. Caracterização de AA10-2 ........................................................ 52
3.3.23.1. Atividade de LPMO ................................................................... 52
3.3.23.2. Predição de estrutura tridimensional ......................................... 53
3.3.24. Atividade de CgLAC-1 .................................................................. 54
3.3.25. Atividade de CgCAT-1 ............................................................... 54
3.4. Resultados e Discussão .................................................................. 55
3.4.1. Investigação e seleção de enzimas de C. gestroi com potencial
biotecnológico .......................................................................................... 55
3.4.2. Clonagem, obtenção e caracterização de enzimas de C. gestroi 58
3.4.3. Glicosil hidrolases: CgGH1-1; CgGH9-1 e CgsymGH7-1 ............ 58
3.4.3.1. Imunolocalização de CgGH9-1 ................................................. 58
3.4.3.2. Suplementação enzimática com CgGH1-1 ............................... 59
3.4.3.3. Exoglucanase (CgsymGH7-1) .................................................. 61
3.4.4. CgSOD-1 – Superóxido Dismutase ............................................. 62
3.4.4.1. Imunolocalização de CgSOD-1 ................................................... 62
3.4.4.2. Suplementação de coquetéis enzimáticos com CgSOD-1 .......... 63
3.4.5. CgAKR-1 - Aldoketo Redutase ........................................................ 66
3.4.5.1. .... A expressão de CgAKR-1 em E. coli BL21 (DE3) promove maior
tolerância ao furfural ................................................................................. 66
3.4.6. CgAA10-2 - (LPMO - AA10) ............................................................ 69
3.4.6.1.Análises bioinformáticas de CgAA10-2 .......................................... 70
3.4.6.2.Caracterização bioquímica de CgAA10-2 ....................................... 73
3.4.7. CgALOX-1 - Aldeído Oxidase (AA5) - Xantina Oxidase .................. 75
3.4.8. CgGOX.1- Glicose Desidrogenase/Oxidase (AA3) ......................... 78
3.4.8.1.Análises bioinformáticas e bioquímicas de CgGOX.1..................... 79
3.4.8.2. Desenvolvimento de uma biopilha a partir de CgGOX-1 e glicose de
bagaço de cana de açúcar ......................................................................... 81
3.4.9. CgADH-1 - Álcool desidrogenase ................................................... 84
3.4.10. CgCAT-1 – Catalase ....................................................................... 88
3.4.10.1.Caracterização Bioquímica de CgCAT-1 ...................................... 90
3.4.11. CgLAC-1 – Lacase .................................................................... 91
3.4.11.1.Caracterização bioquímica de CgLAC-1 ....................................... 93
3.4.11.2.Suplementação de ®Celluclast 1,5L com CgLAC-1 ..................... 94
3.5. Discussão Geral .............................................................................. 96
CAPÍTULO 4 – ARTIGO EM PREPARAÇÃO .............................................. 100
CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................. 149
ANEXOS ....................................................................................................... 150
1 - CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA CBIO .................................. 155
2 - PUBLICAÇÕES.................................................................................... 150
3- DECLARAÇÃO ................................................................................ 155
21
INTRODUÇÃO GERAL
A lignocelulose é a biomassa mais abundante no planeta, atuando como uma
matriz de função estrutural na parede celular de plantas, considerada uma fonte de
matérias primas renováveis, ilimitadas e biodegradáveis [1]. A lignocelulose pode ser
convertida em biocombustíveis, produzidos por uma unidade industrial que integra
equipamentos e processos de conversão de biomassa, denominada de biorrefinaria,
segundo o National Renewable Energy Laboratory (USA) [1].
O etanol celulósico ou etanol de segunda geração (2G) é o principal candidato
para combustível líquido a ser produzido por uma biorrefinaria lignocelulolítica, pois
atualmente este é o biocombustível mais comercializado no mercado nacional e
internacional [2]. Atualmente, são necessários grandes avanços para que os
processos de produção de etanol 2G se tornem economicamente viáveis nas
biorrefinarias. Entre eles, a utilização de ferramentas enzimáticas é uma das vias
mais promissoras nos setores de biorrefinaria para a produção de etanol 2G [1,3].
Os setores privados, universidades e laboratórios do governo fazem uso da
pesquisa e desenvolvimento para a descoberta de enzimas e a formulação de
coquetéis enzimáticos mais eficientes e mais específicos para degradação de
lignocelulose, como por exemplo a da cana de açúcar, reduzindo os custos da
conversão desta biomassa em monossacarídeos [4].
Em relação à bioprospecção de enzimas que atuam na lignocelulose e suas
fontes naturais, os cupins são tidos como um modelo de reator biológico para
desconstrução da biomassa vegetal. Os cupins alimentam-se de uma dieta rica em
material lignocelulósico, onde o processo de degradação deste material é altamente
eficiente, embora permanece ainda pouco elucidado. Neste contexto, estudos de
genômica e proteômica foram efetuados pelo nosso grupo de pesquisa e revelaram
a presença de enzimas auxiliares (AA) e enzimas pró-oxidantes antioxidantes e
detoxificantes (PADs) em cupins da espécie Coptotermes gestroi, e a relação destas
com sua dieta [5].
Como não há evidencias da ação destas enzimas em conjunto com
holocelulases clássicas, este trabalho de mestrado foi desenvolvido para
compreender melhor estas enzimas e suas possíveis aplicações em química verde.
Neste contexto, o trabalho desenvolvido encontra-se dividido em capítulos, visando
dar maior ênfase aos objetivos de cada etapa.
22
Abaixo encontra-se uma breve descrição sobre os capítulos propostos e
resultados obtidos:
Capítulo 1 - Revisão bibliográfica apresentando as informações que
contextualizam o leitor sobre biorrefinarias, sacarificação e
detoxificação de biomassa através de enzimas, a biologia do cupim C.
gestroi, bem como as recentes descobertas que motivaram a
realização deste estudo e que justificam os esforços neste trabalho;
Capítulo 2 - Objetivos que motivaram cada etapa do trabalho;
Capítulo 3 – Clonagem, obtenção, caracterização parcial e aplicação
biotecnológica das Glicosil Hidrolases, AAs e PADs de C. gestroi.
Capítulo 4 - Trabalho submetido para publicação mais anexos: The
Coptotermes gestroi Aldoketo reductase: A multi-purpose enzyme on
Biorefinery applications
23
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. A biomassa lignocelulósica e o estado da arte das biorrefinarias
Atualmente as principais fontes de energia e matéria prima para síntese de
compostos químicos e combustíveis são derivadas do petróleo [6]. A queima dos
combustíveis fósseis libera gás carbônico na atmosfera, e por se tratarem de uma
fonte não renovável, acabam afetando o meio ambiente, principalmente através do
efeito estufa, causando indiretamente também problemas econômicos e sociais [6].
O esgotamento destes recursos não renováveis, e os demais danos causados pela
indústria petroquímica tem despertado a atenção mundial na busca de fontes de
energia renováveis para atender as necessidades da matriz energética e de novos
materiais para as gerações presentes e futuras [1]. Atualmente, a ênfase no uso de
biocombustíveis é uma promissora estratégia para a redução da poluição, e desta
forma, atender as demandas do protocolo de Kyoto [6].
As plantas são organismos heterotróficos que captam os fótons originários da
luz solar, dióxido carbono e água convertendo-os em energia armazenada em forma
de biomassa vegetal formada principalmente por lignocelulose [3]. A lignocelulose
por sua vez atua como uma matriz de função estrutural na parede celular de plantas.
Ela é constituída por polissacarídeos como a celulose, hemicelulose e pectina, além
de polímeros fenólicos denominados de lignina (Figura 1) [7]. A forma de
organização da celulose é feita através de microfibrilas constituídas por monômeros
de glicose unidos por meio de ligações β-1,4 que estão envolvidas em uma matriz
lignossacarídica formando uma estrutura rígida. A hemicelulose é o segundo
polissacarídeo mais abundante na parede celular das plantas, sendo mais
heterogênea que a celulose. Os dois principais constituintes deste grupo são o
xilano, sendo a maioria da hemicelulose de gramíneas e formado principalmente por
monômeros de xilose unidos por ligações β-1,4 na cadeia principal, e a galacto
(gluco) manana que é a hemicelulose mais presente em plantas lenhosas. A pectina
é o terceiro grupo predominante da parede celular de plantas, formado de cadeias
24
principais de resíduos de ácido galacturônico com ligações do tipo α-1, 4 e cadeias
laterais com diversos resíduos de monossacarídeos e outros componentes [8].
Figura 1 - Parede celular vegetal e seus principais componentes. Adaptado de Rubin (2008)[7].
Através de enzimas hidrolíticas e oxidativas, estes polissacarídeos podem ser
desconstruídos em açúcares monoméricos [3].Todos estes monossacarídeos podem
ser utilizados como matérias primas fundamentais para a obtenção de uma imensa
gama de produtos, que abrange desde biocombustíveis até polímeros, sendo o
etanol lignocelulósico uma das moléculas de maior interesse atualmente. Desta
forma, o conceito de biorrefinaria lignocelulósica enquadra-se nessa tecnologia,
visando o aproveitamento integral dos resíduos agroindustriais gerados em uma
determinada cadeia produtiva, de modo a agregar valor à mesma [9,10].
25
O Brasil possui um amplo conhecimento técnico e institucional para a
produção de etanol a partir da cana de açúcar há mais de 30 anos [9,10]. E tem
sido um exemplo dos requisitos para o desenvolvimento sustentável de produção de
etanol lignocelulósico [9,10]. De acordo com o US Energy Information Administration,
(2016) o Brasil e os EUA são os dois maiores produtores e exportadores de etanol
do mundo, com o etanol sendo produzido a partir de matérias-primas de milho nos
EUA e de cana de açúcar no Brasil. Em ambos os processos, a lignocelulose gerada
como um resíduo na forma de bagaço de cana de açúcar ou palha de milho pode
ainda ser convertida em etanol em um processo denominado de segunda geração
(2G). A Figura 2 demonstra um esquema de biorrefinaria de etanol 2G utilizando
hexoses e pentoses derivadas da lignocelulose de cana de açúcar para a produção
de etanol.
Figura 2 – Esquema de processo de produção de etanol 2G a partir de bagaço de cana de açúcar (SCB) . 1 (Moagem): O SCB é recolhido, transportado e moído; 2 (Pré-tratamento): O SCB é livre de impurezas e passa por um pré-tratamento físico-químico para remover a lignina e separar a celulose em fração sólida da fração hemicelulósica líquida, diminuindo a recalcitrância deste material; 3 (Sacarificação): Os materiais pré-tratados são enzimáticamente hidrolisados através de coquetéis lignocelulolíticos; 4 (Fermentação): Os açúcares liberados durante a etapa de sacarificação são fermentados a etanol por leveduras fermentadoras de C5 e C6 juntamente com o açúcar gerado por tecnologias 1G; 5 (Destilação): O produto fermentado é destilado e o etanol é recuperado. Fonte: Baseado em infográfico da
empresa Raízen (Acesso 26/04/2016 – direito de imagem cedido).
1
26
A complexidade químico-estrutural da lignocelulose está relacionada com as
diversas funções biológicas desta (suporte mecânico, proteção contra patógenos e
regulação da homeostase vegetal), porém, dificulta o processamento deste material.
Assim, a complexidade das ligações químicas, a recalcitrância das fibras de
holocelulose e a presença de compostos inibidores resultantes do processamento
deste material são os principais problemas enfrentados na sacarificação e
fermentação da biomassa vegetal [11,12].
A fim de reduzir estes problemas, diferentes processos de pré-tratamento são
utilizados para aumentar a degradação enzimática da lignocelulose, alterando a
estrutura destas biomassas e por consequência separando-as em frações sólidas e
liquidas [13–15].
Componentes aromáticos derivados da degradação da lignina e de açúcares,
bem como metabólitos secundários de plantas, são encontrados na biomassa in-
natura e em quantidades elevadas nas biomassas pré-tratadas (ex: pré-tratamento
hidrotérmico) [16]. Estes componentes inibidores (CIs) são capazes de inibir a
atividade de enzimas lignocelulolíticas e prejudicam a fermentação alcoólica de
leveduras [11]. Estes químicos incluem derivados de açucares (furfural e
hidroximetilfurfural) e compostos aromáticos derivados da lignina (aldeído benzóico,
seringaldeído).
A presença de 20 mmol/L de furfural, por exemplo, pode inibir totalmente o
crescimento de muitas cepas de leveduras fermentadoras [11]. Dentre alguns dos
mecanismos que inibem o crescimento celular e a fermentação alcoólica, o furfural
causa danos na parede e membrana celular, inibe a atividade de diversas enzimas,
causa danos ao DNA, RNA e síntese de proteínas, além de promover uma produção
acentuada de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) intracelularmente [11]. Desta
forma, os CIs encontrados nas frações hemicelulolíticas da biomassa pré-tratada
(ex: fração solúvel após o pré-tratamento térmico do bagaço de cana de açúcar,
também designado por Licor C5) dificultam o processo fermentativo deste material
rico em açucares fermentecisveis [11,17].
De uma forma global, para tornar o processo de produção de etanol
lignocelulósico viável, é necessário resolver alguns problemas de processo: 1) A
27
disponibilidade de biomassas hidrolisáveis como matérias-primas; 2)
Desenvolvimento de novas técnicas viáveis para degradar a lignocelulose (ex: pré-
tratamento físico-químico); 3) Seleção de enzimas eficientes e de baixo custo e de
produção em escala industrial para sacarificar os polissacarídeos em açucares
fermentescíveis; 4) Desenvolvimento de processos detoxificantes de biomassa
lignocelulósica contendo inibidores da hidrílise e fermentação; 5) Seleção e
desenvolvimento de leveduras fermentadoras de pentoses e resistentes a inibidores
da fermentação [2,11].
1.2. Enzimas e proteínas acessórias envolvidas na hidrólise de biomassa
lignocelulósica para produção de bioetanol
As proteínas ativas em carboidratos caracterizam-se principalmente pela sua
capacidade de transformar, desestabilizar e/ou reorganizar essas classes de
macromoléculas [18]. Entre essas proteínas destacam-se as glicosil hidrolases
(GHs) (EC 3.2.1.), que são um amplo grupo de enzimas que hidrolisam as ligações
glicosídicas entre dois ou mais carboidratos ou entre um carboidrato e outra
molécula. As GHs podem ser de origem vegetal, microbiana ou animal, e são
responsáveis pela hidrólise de polissacarídeos contidos nas paredes celulares dos
vegetais, tais como celulose, hemiceluloses e pectinas. Essas enzimas são
comumente conhecidas por celulases, xilanases, pectinases dentre outras [18]. Além
das GHs, outras proteínas chamadas de acessórias atuam em carboidratos, tais
como as glicosil transferases, expansinas (Swollenin), módulos de ligação a
carboidratos (CBM - Carbohydrate Binding Module), polissacarídeos liases (PL),
carboidrato esterases (CE) e as enzimas de atividades auxiliar (AA), de acordo com
o sistema de classificação desenvolvido por Henrissat e colaboradores denominado
de Carbohydrate Active enzymes database (CAZy) [19,20].
Devido à complexidade da parede celular vegetal, interações sinérgicas entre
uma grande quantidade de enzimas se fazem necessárias para que possa ocorrer
uma eficiente quebra de todos os polissacarídeos presentes na parede celular
vegetal [21]. A celulose cristalina, o principal constituinte da biomassa, necessita
28
para sua completa degradação, enzimas essenciais como as endoglucanases, que
são capazes de degradar a molécula de celulose de forma aleatória; as
monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) que são capazes de oxidar
moléculas de celulose e xilano e atuam principalmente na porção cristalina destes
polímeros; as celobiohidrolases (CBH) que degradam a celulose em celobiose a
partir de suas extremidades redutoras; e as β-glicosidases (BG) que são capazes de
degradar celobiose em glicose livre. Já para a despolimerização da hemicelulose,
um conjunto maior de enzimas é necessário, incluindo endoxilanases (EX), β-
xilosidases (BX), arabinofuranosidases, β-glucuronidases, esterases, entre várias
outras dependendo da composição desse polissacarídeo [18].
Neste contexto, o estudo de enzimas hidrolíticas e oxidativas são peças
chave na produção de etanol celulósico. Atualmente a bioprospecção de novas
enzimas através de sistemas clássicos como ferramentas ômicas, expressão
heteróloga, engenharia de proteínas e o desenvolvimento racional de misturas
enzimáticas, estão sendo realizados para esta finalidade [22–24]. Sabe-se hoje que
as misturas enzimáticas devem ser racionalizadas e adaptadas de acordo com a
biomassa lignocelulósica específica e os tipos de pré-tratamentos empregados nesta
[25].
Na evolução dos coquetéis celulolíticos de enzimas da empresa Novozymes
(Celluclast; CTec 1; CTec 2, CTec 3 e HTec3), foi verificado que algumas enzimas
foram adicionadas ao longo dos anos. Alguns exemplos de enzimas observadas são
as monooxigenases líticas de polissacarídeos dependentes de cobre (AA9), β-
glucosidases modificadas por engenharia de proteínas e hemicelulases como
componentes destes coquetéis [25,26]. É importe ressaltar também que não foi
criado nenhum coquetel enzimático formulado especialmente para o bagaço da cana
de açúcar, pois a maioria destes coquetéis comerciais foi formulado para hidrólise
de resíduos lignocelulósicos de milho [25]. Portanto, é possível desenvolver o estudo
da suplementação enzimática destes coquetéis visando seu maior rendimento, em
especial focado no cenário nacional para a hidrólise de bagaço de cana de açúcar.
29
1.3. Enzimas oxidativas para sacarificação biomassa lignicelulósica
A literatura originalmente propõe dois tipos de sistemas de degradação da
parede celular vegetal: o sistema hidrolítico já mencionado acima, e o sistema
oxidativo, responsável pela despolimerização da lignina e diminuição da
recalcitrância da holocelulose [3].
Recentemente, a descoberta de que monooxigenases (LPMOs) são
fundamentais para a degradação de carboidratos, revolucionou as pesquisas na
área de química verde [27,28]. Este sistema oxidativo apresenta enzimas não
clássicas para degradação da lignocelulosese, que atuam por oxidação de forma
direta e indireta tanto nas fibras lignocelulósicas, como nas ligações carboidrato-
carboidrato, carboidrato-lignina, lignina-lignina ou de forma aleatória [29–32].
As LPMOs e outras enzimas oxidativas ativas em carboidratos são
classificadas pelo banco de dados CAZy em uma categoria adequada denominada
“Auxiliary Activities” (AAs) [27]. São exemplos de AAs as lacases, manganês
peroxidases, celobiose desidrogenase e LPMOs da família 9 (GH61), 10 (CBM33),
11 e 13. Todas estas proteínas atuam oxidativamente na desconstrução da
biomassa [27,33].
Muitas outras oxidases que atuam em lignocelulose foram identificadas,
embora predominantemente em fungos [27]. Durante o ataque microbiano, estas
oxidases promovem um clivagem mais eficiente componentes da parede celular das
plantas, produzindo ou consumindo EROs (por exemplo, peróxido de hidrogênio -
H2O2) [34]. Os fungos dos gêneros Postia sp., Phanerochaete sp., Wolfiporia sp. e
Perenniporia sp. utilizam os chamados componentes de fenton para complementar o
seu repertório enzimático, alcançando uma melhor eficiência na desconstrução da
parede celular vegetal [35]. A reação de Fenton (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH−) é
uma potente reação de oxidação de compostos orgânicos na presença de H2O2 que
são capazes atuar diretamente na quebra das ligações químicas e/ou oxidação dos
carbonos em diversos tipos de biomoléculas.[36].
Para isto, enzimas redutoras de oxigênio (O2), tais como da família GMC
oxiredutase, oxidases de álcool e açúcares e oxidases dependentes de cobre são
30
utilizadas por estes fungos, tanto intra quanto extracelularmente para iniciar a reação
de Fenton [27,33].
1.4. Enzimas Pró-oxidantes Antioxidantes e Detoxificantes (PADs): Um novo
conceito no tratamento da lignocelulose
Recentemente, Liu et al. (2016) [11] destacou a importância para o
desenvolvimento de um método de detoxificação viável, in-situ e simples, a fim de se
produzir etanol 2G de baixo custo, visto que nenhum processo de detoxificação
biológico além de lacases tem sido estudado para esta abordagem [11].
Neste sentido, as enzimas descritas como PADs são uma classe de proteínas
que promovem a degradação e/ou eliminação de toxinas endógenas e exógenas,
bem como a geração ou degradação de espécies reativas de oxigênio (EROs) [38].
As superóxido dismutases, peroxidases, catalases, p450, Aldoketo redutases,
aldeído desidrogenases são exemplos de PADs [39]. A maioria destas PADs são
expressas em resposta à estimulação de xenobióticos, bem como ao stress
oxidativo [38,40], onde o banco de dados DetoxiProt agrupa grande parte destas
proteínas [39].
As enzimas PADs são fortes candidatas para reduzir a ação negativa dos CIs,
uma vez que muitas PADs são capazes de convertê-los nos seus metabólitos menos
reativos e menos tóxicos, bem como participar da geração de EROs que atuam na
diminuição da recalcitrância da lignocelulose por degradação oxidativa destas
biomassas [11,41]. O estudo das vias metabólicas e a expressão diferencial frente
ao estresse causado pelos CIs poderiam ser utilizados como fonte de descobertas
de novas PADs, visando o melhor aproveitamento da lignocelulose [42]. O National
Center for Agricultural Utilization Research (EUA) tem obtido bons resultados com
microrganismos fermentadores (bactérias e leveduras) identificando, caracterizando
e expressando enzimas PADs como as álcool desidrogenases, metilglioxal
redutases e outras PADs de origem microbiana [43–46]. Além disso, proteínas como
31
as aldoketo redutases, por exemplo, encontram-se mais expressas em resposta aos
CIs em leveduras e bactérias fermentadoras, bem como em insetos degradadores
da madeira [39,44,47]. Portanto as PADs são muito promissoras para a criação de
coquetéis enzimáticos detoxificantes.
1.5. A biologia do cupim aplicada a biorrefinaria
A espécie em estudo, C. gestroi, pertence à família Rhinotermitidae e é um
cupim xilófago, ou seja, se nutre principalmente de madeira. Por ser uma espécie
exótica, logo encontrou nichos disponíveis e começou a se expandir pelo território
nacional, causando sérios problemas e ganhando o status de praga urbana, gerando
um prejuízo multimilionário [48]. A habilidade desses insetos em digerir materiais
lignocelulósicos pode ser comparada a uma “micro biorrefinaria” de origem natural
[49]. Este processo inicia-se por uma eficiente quebra física da parede celular
vegetal executada pelas suas mandíbulas, facilitando a passagem do material pelo
seu minúsculo trato digestivo, aumentando a área da superfície para a ação das
enzimas que irão atuar na biomassa (Figura 3). À medida que esse material é
triturado, dois sistemas enzimáticos irão agir, um caracterizado como o arsenal de
enzimas endógenas e outro de enzimas simbiônticas [50] (Figura 3). O trato
digestivo dos cupins possui microambientes com grande fluxo de matéria orgânica,
enzimas, variações de regiões anaeróbicas (no centro do tubo digestivo) e de
regiões microóxicas (regiões epiteliais do tubo digestivo), variações de pH (pH > 12
no início do intestino médio - midgut - com pH neutro ou levemente ácido - pH 6.5 na
câmera fermentativa - hindgut) além de zonas com potencial redox alto [51]. Todos
estes fatores geram um ambiente propício a uma eficiente degradação da biomassa
vegetal. Uma vez mimetizado, esse microambiente poderá ser agregado a
processos biotecnológicos de grande importância, tal como a produção de
bioprodutos lignocelulósicos [51].
32
Figura 3 - Parâmetros físico-químicos no intestino de cupins inferiores. Medidas de pH, pressão parcial – P (kPa) de O2. Adaptado de Brune 2014 [51].
Entretanto a eficiência na degradação da lignocelulose pelos cupins não está
totalmente esclarecida. Portanto, os estudos em larga escala dos genes, proteínas e
componentes relacionados com a dieta do cupim são denominados de “Digestômica”
e estão sendo realizados a fim de se obter maior conhecimento da biologia deste
inseto [52].
1.6. Enzimas PADs e AAs encontradas em C. gestroi
O processo de como os cupins degradam a lignina e os polissacarídeos,
tolerando seus subprodutos tóxicos, permanece pouco conhecido. Através do
metatranscriptoma do cupim Reticulitermes flavipes e seus simbiontes, foram
identificados muitos genes envolvidos no uso da biomassa [39,53,54]. Os dados
demonstraram a superexpressão de enzimas PAD, tais como catalases, lacases e
33
aldoketo redutases em cupins submetidos à dieta uma dieta rica em lignina [39].
Além disso, a clonagem e expressão de uma catalase e uma aldoketo redutase
neste mesmo estudo evidenciaram que as mesmas atuaram em sinergia com
celulases e lacases endógenas para a degradação de lignocelulose [39]. Porém
nenhum mecanismo foi proposto para tal fenômeno, ficando evidente a necessidade
de mais estudos para entender o papel dessas enzimas redox na conversão da
biomassa por cupins.
Dentro desse contexto, em 2006 foi iniciado o projeto do sequenciamento do
genoma de C. gestroi (lge.ibi.unicamp.br/cupim/). Em sequência, Leonardo e
colaboradores (2010) descreveram o metatranscriptoma para operários e soldados
de C. gestroi, onde a análise de unigenes revelou que cerca de 600 deles estão
relacionados a proteínas ativas em carboidratos entre hidrolases glicosídicas e
proteínas acessórias [48].
Recentemente, outras análises dos genes de C. gestroi foram feitas por Do et.
al. (2014) e análises bioquímicas e metaproteômica foram efetuadas por nosso
grupo de pesquisa [5,54].Foram identificados no cupim C. gestroi, a presença de
vários genes que codificam CAZys e PADs que poderiam contribuir para a
degradação da lignocelulose com potencial aplicação biotecnológica [5]. As
sequências em estudo serão descritas em detalhes no item abaixo.
1.6.1. Aldoketo redutase (AKR)
AKRs pertencem à superfamília de enzimas que desempenha a oxirredução
de uma ampla variedade de compostos [56]. A nomenclatura sistemática para a
superfamília AKR foi adotada e encontra-se em bancos de dados específico (ver:
www.med.upenn.edu/akr) [56]. Em vias gerais estas enzimas reduzem grupamentos
aldeídos ou cetônicos a álcoois utilizando NAD[P]H como cofator [56].
AKRs estão envolvidas em múltiplas reações em vários organismos, desde o
metabolismo de carboidratos à desintoxicação de xenobióticos, além de possuírem
amplas aplicações industriais e clínicas [57,58]. AKRs são comprovadamente
capazes de degradar carboidratos, e assim como as aryl-álcool desidrogenases,
34
auxiliam na degradação da lignina [59].
Sendo assim, esta classe de enzimas torna-se um forte ponto de partida para
novos estudos aplicados a biorrefinarias de etanol 2G, pois estas PADs apresentam
a capacidade de reduzir os aldeídos fenólicos inibidores da fermentação, tais como o
furfural, aos seus respectivos álcoois menos tóxicos e menos reativos, para
leveduras fermentadoras e aos coquetéis celulolíticos [60,61].
1.6.2. Superóxido dismutase (SOD)
As SODs são enzimas que catalisam a dismutação do ânion superóxido (O2
•) em peróxido de hidrogênio e oxigênio. SOD é ubíqua para todas as formas de
vida, possuindo quatro tipos diferentes de centros metálicos, dividindo estas famílias
em SODs contendo Cu/Zn, Ni, Mn e Fe [62]. O sítio catalítico de cobre das SODs
assemelham-se às enzimas classificadas como CBM33 (AA10) que são enzimas
capazes de oxidar a celulose [63]. Também foi reportado que SOD é uma enzima
geradora de radical hidroxila na presença de altas concentrações de peróxido de
hidrogênio, e tem ação efetiva na transformação da lignina [64].
1.6.3. Lacases (LAC)
Lacases (EC1.10.3.2) são uma família de oxidases “azuis” dependentes de
cobre pertencentes à família AA1 do CAZy; são capazes de oxidar uma grande
variedade de compostos fenólicos e aromáticos, com concomitante redução do
oxigênio molecular em água [53]. Recentemente, sequências endógenas de lacases
foram encontradas em insetos degradadores da madeira [53]. Além disso, o
tratamento enzimático com lacases tem sido sugerido como uma abordagem
promissora na detoxificação e sacarificação de biomassa lignocelulósica [53].
35
1.6.4. Monooxigenases líticas de polissacarídeos da família 10 (AA10)
Esse domínio proteico codifica enzimas chamadas de LPMOs da família de
atividade auxiliar 10 (AA10 - antiga CBM33) [65]. Estas enzimas atuam
principalmente na porção cristalina de celulose, onde, após a redução de seu sítio
catalítico contendo cobre, este acaba por oxidar os carbonos 1 ou 4 das moléculas
de glicose neste polímero [35,65]. O ácido aldónico resultante na molécula de
celulose, leva a uma desestabilização da ligação glicosídica, favorecendo a ação de
celulases clássicas [35,65]. Portanto, LPMOs são o novo paradigma para a
desconstrução da biomassa lignocelulósica, pois estas enzimas oxidativas
suplementam coquetéis celulásicos, levando a diminuição da carga enzimática
utilizada, consequentemente, reduzindo os custos da etapa de hidrólise na cadeia de
produção de etanol de segunda geração [3,65].
1.6.5. Glicose desidrogenase (GOXs)
As GOXs (CE 1.1.1.47) pertencem a uma classe de enzimas que catalisam a
reação química da glicose + NADP+ em D-glucono-1,5-lactona + NADPH, atuando
no grupo CH-OH desta molécula [66]. Além disso, estas enzimas foram classificadas
no banco de dados do CAZy como pertencentes da família AA3. GOX possuem
diversas aplicações biotecnológicas, que vão desde o desenvolvimento de sensores
colorimétricos, biossensores eletroquímicos, desenvolvimento de biopilhas e a
remoção de O2 nos alimentos [67].
1.6.6. Aldeído oxidase (AOX)
As superfamílias de enzimas aldeído oxidase/desidrogenase (AOX-XDH)
catalisam a oxidação irreversível dependente de NAD(P)+ de um amplo espectro de
aldeídos endógenos e exógenos aos seus respectivos ácidos carboxílicos [68].
Estas enzimas contêm três domínios: O domínio ligante de NADP+; o domínio
catalítico e um domínio ligante. A parte superior de sua estrutura é composta de
resíduos de todos os três domínios e confere a especificidade aos seus substratos
aldeídicos [68].
36
AOX e XDHs são enzimas detoxificantes do tipo não citocromo P450
(CYP450). Estas enzimas são importantes agentes antioxidantes, atuando na
regeneração de NADPH e a eliminação de radicais hidroxilas através de seus
grupamentos cisteína e a metionina [68]. Embora em humanos AOX1 seja mais
conhecida como uma enzima de metabolização de drogas e xenobióticos, as AOX
correspondentes de insetos também foram encontradas na degradação de
compostos odorantes aldeídicos, como feromônios e compostos voláteis de plantas -
alguns destes também reportados como CIs [69,70].
1.6.7. Álcool desidrogenase (ADHs)
ADHs (EC 1.1.1.1) fazem parte de um grupo de enzimas desidrogenases que
ocorrem em muitos organismos e facilitam a interconversão entre álcoois e aldeídos
ou cetonas com a redução/oxidação de NAD+ e NADH [45]. As ADHs de
Scheffersomyces stipiti, por exemplo, estão envolvidas na redução de furfural e HMF
e na produção de etanol durante a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos [45].
Contudo, as funções de muitas ADHs de cupins ainda permanecem desconhecidas.
1.6.8. Catalases (CATs)
Embora os EROs desempenhem papéis importantes na biologia de
organismos degradadores da lignocelulose, sua acumulação provoca danos
oxidativos nas macromoléculas do próprio organismo. As catalases constituem o
sistema de defesa principal contra o peróxido de hidrogênio, um dos mais frequentes
EROs presentes durante a degradação de lignocelulose [71].
As catalases são metaloenzimas que decompõe o H2O2 em água e oxigênio
molecular. Algumas catalases são superexpressas em fungos filamentosos, bem
com em insetos degradadores da madeira como uma forma de proteção contra
EROS do próprio organismo durante a degradação oxidativa da lignocelulose
[53,71].
37
CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS
1.1. Objetivos Gerais
Nossa hipótese de trabalho versa sobre o cupim C. gestroi quanto à presença
de um sistema oxidativo de degradação de biomassa lignocelulósica que
complementa as hidrolases glicolíticas. Neste sentido, nossos objetivos contemplam
desenvolver um estudo sistemático da degradação do bagaço de cana de açúcar,
utilizando enzimas hidrolíticas clássicas e as enzimas oxidativas provenientes do
cupim C. gestroi. Objetivando compreender a ação e a sinergia destas enzimas,
além de descobrir novas aplicações biotecnológicas para proteínas.
1.2. Objetivos Específicos e plano de trabalho
1. Clonar e expressar em sistema heterólogo genes alvos de C. gestroi;
2. Produzir, purificar e caracterizar as enzimas recombinantes;
3. Entender a sinergia de enzimas PADs e AAs atuando em conjunto com
glicosil hidrolases para a desconstrução da parede celular vegetal;
4. Investigar a aplicação biotecnológica das enzimas destacadas.
CAPÍTULO 3 – CLONAGEM, OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE ENZIMAS DE COPTOTERMES GESTROI
1.3. Introdução
Até o presente momento, foram clonadas e caracterizadas mais de 100
38
enzimas provenientes da digestômica de mais de 13 espécies cupins. Dentre as
espécies mais estudadas, os cupins: Reticulitermes speratus (24%), Coptotermes
formosanus (17%), R. flavipes (15%) e Nasutitermes costalis (11%) foram
analisados [72]. Sendo então, 60% de enzimas recombinantes de origem
bacteriana, 29% são provenientes do cupim e 11% de Protistas [72].
Portanto, a digestômica, principalmente do hospedeiro C. gestroi, é uma fonte
de enzimas pouco explorada, visto que esta espécie é a maior praga urbana
encontrada no Brasil [73]. Sabe-se hoje que C. gestroi faz uso de enzimas como
GH1 (BG1Cg), GH3, GH5, GH7, GH9 (EG1Cg) e GH16 na conversão celulose; GH
2, 10, 11, 26, 27, 38 e 43 para a hidrólise de hemicelulose; E as GH 28, 29 e 42
atuam na degradação de pectinas [74].
A triagem funcional da biblioteca metagenômica construída a partir de dados
de genômica, transcriptômica e proteômica do cupim C. gestroi resultou na
identificação de novas enzimas que poderiam auxiliar o cupim na degradação da
lignocelulose. Em sequencia, as ORFs selecionadas para este trabalho foram
amplificadas a partir do cDNA de C. gestroi, e então clonadas e expressas em
sistema procariótico.
Portanto, este capítulo traz uma nova perspectiva na área, pois, atualmente
fenoloxidases, esterases, demais AAs e PADs, são menos de 5% do total das
enzimas investigados em todas as espécies de cupins [72]. O papel destas enzimas
é desconhecido na biologia do inseto, bem como, poucos são os estudos
empregando tais proteínas em aplicações biotecnológicas. Deste modo, após a
identificação, a expressão heteróloga em sistema procariótico e a purificação das
enzimas PAD, AAs e GHs de C. gestroi, foi possível realizar estudos de
caracterização funcional de algumas destas enzimas com os componentes da
lignocelulose e demais aplicações em química verde. Em súmula, este capítulo traz
alguns indícios de que enzimas REDOX têm um papel muito importante na biologia
dos cupins inferiores, além de apresentarem grande potencial em aplicações em
processos biotecnológicos.
39
1.4. Materiais e métodos
1.4.1. O cupim
Espécimes de cupins da espécie C. gestroi foram obtidos no Laboratório de
cupins do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brasil (22º
23'S, 47° 31'W). Os cupins da casta operária foram mantidos a 25 ± 2°C e
alimentados com papel cartão com 10% de humidade até a extração de seu material
genético para clonagem e expressão das enzimas.
1.4.2. Identificação de genes alvos através de análise da expressão diferencial
gênica e proteica do experimento de “feeding” em bagaço de cana in-
natura (BIN) x bagaço de cana pré-tratado com ácido fosfórico (PASB)
*Os dados pertencem ao Doutorando João Paulo Franco Cairo e a Análise de bioinformática referente ao RNAseq foi realizada pela pós-doc. Luciana Mofatto, do laboratório de Genômica e
40
Expressão - LGE do IB/Unicamp, sobre a supervisão do Dr. Marcelo Carazzole e Prof. Gonçalo Pereira e se fazem presente apenas para esclarecer a origem dos genes deste trabalho.
O genoma de C. gestroi encontra-se sequenciado e anotado estando
presente em banco de dados do laboratório de genômica e expressão da UNICAMP
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cupim/). O sequenciamento, anotação, mapeamento,
e o agrupamento dos reads dos genes de C. gestroi possibilitaram os cálculos de
expressão diferencial de genes PADs, AAs e GHs. Dois experimentos foram
realizados: (1) A expressão gênica diferencial entre as dietas com bagaço de cana
in-natura e bagaço de cana pré-tratado com ácido fosfórico (BIN X PASB) aos que
os operários de C. gestroi foram submetidos; (2) A expressão gênica diferencial
entre a casta dos operários e dos soldados submetidos à mesma dieta com papel
cartão [5].
A montagem do transcriptoma foi baseada no agrupamento de reads curtos,
na tentativa de obter uma sequência maior para cada transcrito (contig). Para
finalizar a montagem ab-initio do transcriptoma, foi realizada a etapa de anotação
funcional através da comparação contra diversos bancos de dados biológicos como
o NCBI (banco de dados com todas as proteínas conhecidas), CDD (banco de dados
de domínios proteicos conservados), CAZy (banco de dados de enzimas ativas em
carboidratos) [27] e Pfam (banco de famílias gênicas) específicos para enzimas
classificadas como pró-oxidantes, antioxidantes e detoxificantes - PAD.
A expressão gênica diferencial foi realizada através do cálculo da razão dos
valores de Fragmentos por Kilobase de éxon por milhão de fragmentos mapeados
(FPKM) entre as diferentes amostras e essa métrica representou o número de
transcritos expressos de um gene. Para tal análise foi necessário sequenciar o
metatranscriptoma dos cupins em triplicatas biológicas [5].
1.4.3. Seleção dos genes
Os genes alvos foram selecionados a partir da expressão diferencial conforme
o item 3.3.2. Foi levada em consideração a escolha dos genes mais expressos na
casta operária do cupim. Também foi levado em consideração os genes mais
41
expressos quando a casta operária do cupim recebeu uma deita de lignocelulose
pré-tratada (PASB) em relação à lignocelulose in-natura.
1.4.4. Desenho de oligonucleotídeos para amplificação de sequências alvos
A região codificante de cada gene escolhido para expressão foi primeiramente
submetido à análise de enzimas de restrição na plataforma NEBCUTTER (disponível
em: http://tools.neb.com/NEBcutter2/). Nesta análise foi avaliada a ocorrência de
sítios de restrição nessa região para as seguintes endonucleases: NheI e BamHI
para clonagem em vetor pET28a. Caso houvesse sítios de restrição para uma das
enzimas listadas, as endonuclease foram modificadas e listadas ao lado de cada
sequência de primers. Segue abaixo a lista dos primers para cada gene alvo
selecionado para ser caracterizado funcionalmente.
Tabela 1 – Primers utilizados para amplificação de genes a partir do cDNA de C. gestroi
1.4.5. Amplificação dos genes
A extração de RNA do cupim e a construção de cDNA foi realizada de acordo
com Franco-Cairo (2013) [73]. Em seguida, a amplificação dos genes foi executada
através da reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) touchdown, onde a
temperatura de anelamento é gradualmente diminuída. A reação de amplificação
Gene Nome , vetor e enzimas de restrição Primer Forward Primer reverse
ExoglucanaseCgGH7-1_PET281 – NHEI e BAMH1 - Amplicon – 1080 pb
5’ATATAGCTAGCACTAACCAA
GCAGAGAGCC 3’
5’TATATGGATCCTTAGTAGGTT
GAATCAATTGGTC 3’
Aldoketo redutaseCgAKR-1_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon 1005 pb
5’TAAAATG/CTAGCATGCCTAA
ACAACTGAGCAGT 3’ ’
5’TATG/GATCCCTAATAAGGCT
CATCATACGGGT 3’
Superóxido dismutaseCgSOD-1_PET28a – NHEI e BAMH1 - Amplicon - 465 pb
5’TATAG/CTAGCATGCCGATAA
AAGCTGTATGTGTTC 3’
5’TATAG/GATCCTTAGATCTTA
GCAATTCCCAC 3’
Glicose oxidaseCgGDH_pET28a - NHEI e XBAI - Amplicon 1808 pb
5’ATATATAG/CTAGCATGGAGA
GCTGCACGACA 3’
5’TATG/GACTCTTATCCAGATAT
CCAATACCATAT 3’
LPMO AA10CgAA10-2_PET281 – NHEI e BAMH1 - Amplicon - 1083 pb
5’TATAG/CTAG/CATGTTGAAGC
CCATGGACGTC 3’
5’TATTAGGATCCTTAAATATCT
GGATTGATG 3’
LacaseCgLAC-12Cg_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon 1005 pb
5’ATATAG/CTGCCGCGACATCA
GTGCTGCTGAATTC 3’
5’ATATAG/GATCCTTACTGTTTT
CCTTAGGGGC 3’
Aldeído oxidaseCgALOX-1_ pET28a - NHEI e SALI - Amplicon 3700 pb
5’TAAAATG/CTAGCCATGAGG
GGGGCTGTATAG 3’
5’ATTCCG/TCGACCTACAAGGT
AAACAAGTCGATG 3’
Álcool desidrogenaseCgADH-1_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon - 1014 pb
5’TAAAATG/CTAGCATGGTGAA
AACAAAGAAATTTATTCT 3’
5’TATGGATC/CTTAGGCCTTCAC
AACGGCTTT 3’
42
envolveu uma mistura dos seguintes reagentes: 2µL do cDNA de C. gestroi
sintetizado conforme as instruções do fabricante (INVITROGEN), 1µL da solução de
desoxinucleotídeos (dNPTs) 10mM, 1µL de primer forward 10pmol, 1µL de primer
reverse 10pmol, 10µL da solução de tampão 10x já contendo MgCl2, 0,3µL da
enzima Phusion® High-Fidelity DNA Polymerasee (New England) e água estéril
completando para volume final da reação de 50µL. A reação de PCR foi realizada
em termociclador, no qual se programou uma etapa inicial a 98°C durante 3 minutos,
seguido de uma etapa de 10 ciclos: 98°C por 1 minuto, anelamento iniciando em
60,5°C com diminuição de 1°C /ciclo, por 40 segundos, e 72°C por 2 minutos. Após
os 10 ciclos, realizou-se uma etapa de 98°C durante 40 segundos e 30 ciclos a 98
°C por 1 minuto, 55°C por 40 segundos e 72°C por 2 minutos. Por fim, realizou-se
uma etapa a 72°C por 15 minutos. A reação de amplificação foi comprovada por
eletroforese em gel de agarose 1,0%.
1.4.6. Purificação e digestão dos genes amplificados
A banda contendo o produto amplificado foi purificada através do kit illustraTM
GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) de acordo com as
recomendações do fabricante. Obteve-se 30µL de DNA purificado, que foi digerido
com 0,5µL de cada uma das enzimas (NheI e BamHI/ SALI/XBAI - Fermentas),
0,5µL de BSA (1µg/µl),5µL de buffer D, e água estéril, completando-se o volume final
para 50 µL. A reação foi incubada a 37°C durante 1 hora, e posteriormente a 70°C
por 15 minutos, de forma a inativar as enzimas.
1.4.7. Quantificação de DNA
Os ácidos nucleicos foram quantificados através do método
espectrofotométrico por medidas de absorbância a 260nm realizadas no
espectrofotômetro NanoDrop modelo 2000c (Thermo Scientific).
43
1.4.8. Preparação do vetor pET28a e ligação do gene
O vetor pET28a utilizado contém uma região que codifica para uma sequência
de resíduos de histidina, que se adiciona na porção amino-terminal, permitindo a
purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade por íons
metálicos imobilizados (Figura 4). Esse vetor foi digerido com as mesmas enzimas,
NheI e BamHI ou SALI ou XBAI, utilizadas na digestão do DNA amplificado. Para a
reação foram utilizados 1µg do vetor, 0,5µL de cada uma das enzimas (5U), 0,5µL
de BSA, 5µL de buffer D, e água estéril, completando o volume final para 50µL. A
reação foi incubada a 37°C durante 1 hora, e posteriormente a 70°C por 15 minutos,
de forma a inativar as enzimas.
Para a ligação dos genes de interesse no vetor de expressão pET28a,
utilizou-se 10µL do fragmento de DNA amplificado, purificado e digerido com as
respectivas enzimas de restrição, 2,5µL do vetor digerido, 1,5µL de tampão de
ligase, 1µL da T4 DNA ligase (Invitrogen) e completou-se o volume com água estéril
para 20µL de reação. A reação de ligação ocorreu à temperatura de 4ºC durante 16
horas. A proporção de vetor para fragmento foi de 3:1, seguindo-se especificações
do fabricante do vetor (Novagen) e da literatura de Sambrook et al. (2001)[75].
Figura 4 - Mapa do vetor Pet28a
44
1.4.9. Clonagem em Escherichia coli
Uma alíquota de 75L de células competentes foi descongelada e mantida em
gelo onde recebeu a adição de 50 a 100ng de DNA transformante. Esta mistura foi
mantida em gelo por 30 minutos e posteriormente aquecida a 42C por 45 segundos.
As células foram imediatamente incubadas em gelo por 2 minutos e foram
adicionados 800µL de meio LB (extrato de levedura 5g/L; peptona bacteriana 10g/L;
NaCl 10g/L) às células transformadas, que foram incubadas por 1 hora a 37C.
Alíquotas da transformação foram inoculadas em placas de Petri contendo meio
ágar LB adicionado de 50g/mL de kanamicina, por 18 horas a 37C.
1.4.10. Seleção das colônias transformantes por CS-PCR (Colony
Screening by PCR)
Tendo-se como finalidade a escolha das colônias que possuíam o vetor
clonado com os genes de interesse, foi realizada uma PCR de colônia. Para isso,
foram selecionadas aleatoriamente 5 colônias, que foram individualmente diluídas
em 10µL de água esterilizada e filtrada. A reação de PCR consistiu de 1µL da
colônia diluída em água, 1µL da solução de desoxinucleotídeos (dNPTs) 10mM, 1µL
de primer F T7, 1µL de primer R T7, 5µL da solução de tampão 10x já contendo
MgCl2, 0,5µL da enzima Taq polimerase (Fermentas) e água estéril, completando o
volume final da reação para 50µL. A reação foi submetida a uma etapa inicial de
95°C por 5 minutos, para a lise da bactéria e liberação do DNA de seu interior.
Posteriormente, realizou-se um ciclo de 30 vezes (95°C por 45 segundos, 50°C por
45 segundos e 72°C por 2 minutos). Ao final, a mistura foi mantida a 72°C durante 5
minutos, para extensão final. A reação de amplificação foi comprovada com
eletroforese em gel de agarose 1,0%. Os clones positivos tiveram alíquotas
estocadas a -80ºC, bem como, o DNA plasmidial extraído.
1.4.11. Extração do DNA plasmidial
A extração do DNA plasmidial da colônia selecionada foi feita utilizando o kit
45
Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systems (Promega), conforme
procedimento indicado pelo fabricante. O DNA foi diluído em 60µL de tampão TE
(Tris-EDTA). A etapa de sequenciamento dos insertos para confirmação da
clonagem foi realizada através de uma facility disponível no CTBE, com a adição dos
pares de primers do Pet28A T7. Os fragmentos de DNA amplificados pelos pares de
primers T7 foram analisados no sequenciador automático DNA ABI PRISM 3500xl
Genetic Analyser (Applied Biosystems). Os dados obtidos foram analisados pelo
programa Geneious (Biomatters) a fim de gerar sequências no formato FASTA, que
foram comparadas com as sequencias das ORFs anotadas do banco de dados do
genoma de C. gestroi.
1.4.12. Cultivo dos transformantes e expressão das proteínas
As cepas transformadas com os genes de interesse em vetor de expressão
pET28a foram pré-inóculadas em 10mL de meio LB contendo kanamicina
(50µg/mL), e crescidas por 18 horas a 37°C a 250rpm. Posteriormente o pré inóculo
foi adicionado a uma concentração final de 1% do meio de indução. Após os cultivos
atingirem absorbância em 600nm de 0,6, a expressão procedeu-se pela adição de
IPTG a concentração final 0,5mM. As cepas Rosetta-gami 2(DE3), BL21 (DE3) e
Origami B contendo os vetores de expressão foram mantidas nas mesmas
condições de temperatura e agitação por 4 ou 20 horas. A abordagem descrita
acima foi repetida para a cepa ArticExpress, no qual foi realizado na seguinte
abordagem: após a adição do IPTG a 1,0mM, a temperatura foi reduzida para 12ºC
e a rotação mantida a 120rpm. A expressão foi conduzida por mais 24 horas. Além
disso, os cultivos para as cepas contendo os genes de expressão para; CgAA10-2;
CgLAC-1; foram adicionados de cloreto de cobre a uma concentração de 1mM no
momento da adição de IPTG, para CgSOD-1 foi adicionado Cloreto de cobre e zinco
a 1mM. Esta suplementação tem por finalidade proporcionar o correto enovelamento
das metaloproteinas estudadas que necessitam de cobre para exercer sua função.
46
1.4.13. Lise celular para obtenção das proteínas recombinantes
Ao final do cultivo das cepas recombinantes e indução da expressão das
proteínas heterólogas, o meio foi centrifugado a 8000g por 30 minutos a 4ºC,
obtendo-se então um pellet; este pellet foi ressuspendido em 15mL de tampão A
(20mM de fosfato de sódio, 100mM de NaCl e 5mM de imidazol, pH 7,4). Foi
adicionado 1mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) e 0,5mg/mL de lisozima e
incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos sob leve agitação. Em
seguida a amostra foi sonicada à amplitude de 40%, com 10 pulsos de 10 segundos
com intervalos de 50 segundos por dez minutos em banho de gelo. Por fim,
centrifugou-se a amostra a 8000g por 30 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi
separado do pellet formado. A expressão proteica foi analisada por SDS-PAGE 12%
(eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio), a partir do pellet
e o sobrenadante obtido após a lise da célula. Para as proteínas que foram
encontradas insolúveis em corpos de inclusão no pellet celular, um protocolo de
solubilização, desnaturação e enovelamento das proteínas foi realizados conforme
Damásio et al (2013) [76].
1.4.14. Purificação das enzimas em colunas cromatográficas
1.4.14.1. Purificação por cromatografia de afinidade (IMAC)
O sobrenadante obtido da lise celular foi submetido à purificação por
cromatografia de afinidade, em que a sequência poli-histidina (His-tag), adicionada à
região N-terminal das proteínas recombinantes, possibilita sua ligação a uma coluna
de íons Ni+2, bem como as colunas contendo Co+2 (Talon®). A purificação foi
realizada utilizando-se o sistema ÄKTA™FPLC™ (GE Healthcare) e a coluna
HisTrapTM de 5mL (GE Healthcare) a 0,3 Mpa e fluxo de 1,0mL/min. A coluna foi
previamente equilibrada com tampão A. Em seguida, foi adicionado o sobrenadante
contendo a proteína recombinante solúvel. A parte do sobrenadante que não se
ligou à coluna (flow-through) foi recolhida para posterior análise. A eluição foi
realizada com tampão A e tampão B (20mM de fosfato de sódio, 100mM de NaCl e
47
500mM de imidazol, pH 7,4), em que a concentração de imidazol aumentava-se
gradativamente, de 5 a 500mM, mantendo-a constante na presença dos picos de
absorbância. Foram coletadas frações de 1,5mL, correspondentes aos picos de
absorbância a 280nm, e estas foram analisadas juntamente com o flow-through em
SDS-PAGE 12%.
1.4.14.2. Cromatografia de Gel Filtração de exclusão por peso molecular (GF)
Após a cromatografia de afinidade, as frações contendo as enzimas
recombinantes foram finamente purificadas por GF. As amostras foram reduzidas a
um volume de 0,8mL e aplicadas na coluna. A purificação foi realizada utilizando-se
o sistema ÄKTA™FPLC™ (GE Healthcare) e a coluna HiLoad Superdex 16/60 200
(GE Healthcare) a 0,3 Mpa e fluxo de 1,0mL/min. A coluna foi previamente
equilibrada com tampão fosfato 20mM pH 7,4. Foram coletadas frações de 1,5mL,
correspondentes aos picos de absorbância a 280nm.
1.4.15. Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
(SDS-PAGE)
A expressão heteróloga das proteínas foram analisadas em gel de
poliacrilamida sob condições desnaturantes, SDS-PAGE, segundo Läemmli (1970)
[77], utilizando PageRuler™ Unstained Low Range Protein Ladder como marcador
de massa molecular.
1.4.16. Dosagem de proteínas
A dosagem de proteínas totais foi realizada segundo o método de Bradford
(1976) [79] utilizando-se BSA como padrão.
1.4.17. Biomassas vegetais hidrolisadas
As biomassas vegetais utilizadas no processo de sacarificação foram
48
nomeadas como: BIN - Bagaço de cana in-natura; BEX - bagaço de cana explodido
a vapor; BH - Bagaço de cana hidrotérmico; BED - bagaço de cana explodido a
vapor e deslignificado; PASB - Bagaço de cana tratado com ácido fosfórico.
Substratos puros como o polissacarídeo β-glucano (BG) também foram avaliados
(Tabela 2).
Tabela 2 - Composição dos bagaços de cana-de-açúcar, em porcentagem na biomassa, submetidos a quatro diferentes pré-tratamentos.
Pré-tratamento Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%)
BIN[80] 43,8 25,8 22,1
BEX[80] 37,0 21,1 28,7
PASB[81] 59,0 1,8 29,5
BH [82] 61,4 6,9 28,8
BED[13] 86,8 5,0 6,1
1.4.18. Estudo de suplementação de coquetéis celulósicos comerciais e
extratos fúngicos
Os bagaços de cana pré-tratados foram submetidos à sacarificação enzimática.
A preparação enzimática comercialmente disponível utilizada foi ®Celluclast 1.5L,
sendo testada a 10, 5, 1 ou 0,5 FPU de coquetel/g de bagaço. A hidrólise enzimática
foi realizada com 2% (m/v) de bagaços pré-tratados em 100mM de tampão de
fosfato, com valores de pH 5,7 e 5,5 e valores de temperatura de 30 e 50ºC com
tempo de hidrólise de até 24 horas.
O extrato fúngico de Penicillium echinulatum S01M29, produzido por Costa
(2016) [82] também foi testado conforme padronizado pelo grupo de Jose Geraldo
da Cruz Pradella - CTBE; onde sua concentração para os testes foi de 0,4 FPU/g de
BH. A hidrólise enzimática foi realizada com 5% (m/v) de BH em 100mM de tampão
fosfato pH 4,8 a 50ºC por 24 horas.
49
As enzimas testadas para a suplementação foram adicionadas a diferentes
quantidades por g de bagaço (0,05-7,50 mg/g). O volume de reação foi de 1,5mL
em tubos Eppendorf de 2mL e incubados em um Thermomixer (Eppendorf,
Alemanha) com agitação de 1000rpm. Ensaios contendo apenas as celulases,
cellases mais anzima desnaturada ou BSA foram realizados em como controle
negativo.
Ao final das hidrólises, as amostras foram centrifugadas a 10.000g durante 15
min (Centrífuga 5418, Eppendorf), filtradas em membrana (Sepak C18, Waters) e
aquecidas a 80ºC por 10 minutos para inativação das enzimas. Os testes foram
feitos em triplicatas e os resultados expressos em g/L. O grau de sinergismo (GS) foi
determinado pela razão da hidrólise do coquetel e enzima juntos, e soma da
hidrólise do coquetel e hidrólise da enzima, separados. Essa razão pode ser descrita
pela equação “a.b/ (a+b)”, onde a é a hidrólise do coquetel e b é a hidrólise da
enzima, conforme descrito por Wang et al. (2011) [83]. O teste t de student para
avaliar se havia diferença estatística entre as hidrólises apenas com o coquetel e o
coquetel suplementado foi realizado no software Excel® 2010.
1.4.19. Determinação de açúcares
A quantificação dos açúcares redutores totais (ART) dos produtos de hidrólise
de bagaço de cana de açúcar foi realizada com alíquotas de 100µl das amostras
adicionadas de 100µl de DNS (3,5-ácido dinitrosalicílico) em placas de PCR de 96
poços. As reações foram incubadas a 95ºC por 5min e as absorbâncias foram
medidas a 540nm, conforme descrito por Miller (1959) [84]. Para análises
específicas dos açúcares (glicose, xilose, celobiose) as amostras de 1,5ml foram
acondicionadas e analisadas por HPLC [81]. Todas as quantificações foram
realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos em gramas por litro.
50
1.4.20. Avaliação da oxidação de carboidratos pelas enzimas
A técnica de cromatografia de troca aniônica acoplada com detecção
eletroquímica por amperometria pulsada (HPAEC-PAD) foi utilizada para a detecção
de oligossacarídeos nativos e oxidados liberados por estas enzimas. O
procedimento, bem como as análises, foram realizadas pelo pesquisador João Paulo
Franco Cairo, e foram gentilmente cedidas para o maior entendimento do
mecanismo de CgAA10-2.
A reação foi realizada pela incubação de 20µg de CgAA10-2 com 100µL de
PASC 0,5% (m/v) em tampão pH tris-glicina pH 8,0; na ausência ou presença de
ácido ascórbico (10mM) e na ausência ou presença de H2O2 (30mM). O volume final
da reação foi de 200µL. O ensaio foi feito a 30ºC durante 120 minutos, em tubos de
2mL, sem agitação. Em seguida, os ensaios foram centrifugados durante 10 minutos
em 14.000rpm e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos de 2 mL,
para posterior análise em HPAEC. Reações de controle foram realizadas, conforme
descrito acima, porém utilizando a enzima desnaturada. Todas as reações foram
realizadas em triplicata.
As análises de HPAEC-PAD foram realizadas utilizando um sistema de
ICS5000 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) equipado com um eletrodo de ouro PAD.
Amostras de 2µL foram injetadas em um sistema de coluna composto por uma
coluna analítica CarboPac PA1 2 × 250mm (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) e uma
guarda coluna CarboPac PAC1 2 × 50mm, a 30°C, conforme descrito por [85]. Os
tempos de retenção dos picos referentes aos açúcares foram descritos por
Rodríguez-Zúñiga (2015) e Wu (2013) e garantiram a exatidão e precisão da técnica.
[85,86].
1.4.21. Análises filogenéticas
Com a finalidade de se compreender melhor a função, localização e possíveis
aplicações, as proteínas selecionadas foram submetidas a análises filogenéticas.
Todas as sequências analisadas foram alinhadas com o método de Multiple
Sequence Comparison by Log-Expectation (MUSCLE) [87]. Em seguida, as análises
51
filogenéticas foram implementadas com o software MEGA 6.0, através do método
neighbor-joining com análise de correção de Poisson e valores de 1000 bootstrap,
onde os valores de bootstrap são mostrados nos nós da árvore gerada [88–90].
Parâmetros e as análises mais específicas das árvores filogenéticas para cada
família de proteínas foram extraídas de trabalhos reportados em literatura. Para as
análises de CgGOX-1, as sequências e a metodologia de análise foram extraídas de
Cavener et al (2007). [66]. Para CgAA10-2, todas as sequências reportadas como
AA10s foram extraídas de banco de dados do CAZY e as análises foram
comparadas ao trabalho de Book (2014) [91]. Para CgALOX-1 todas as sequências
e a metodologia de análise foram extraídas de Marelja et al (2014) [92].
1.4.22. Caracterização de CgGOX-1
1.4.22.1. Atividade de glicose oxidase de CgGOX-1
O lisado celular contendo a enzima CgGOX-1 teve sua atividade de glicose
oxidase verificada com o kit comercial para dosagem de glicose - GLICOSE–
Liquiform (Labtest). A enzima foi incubada com a glicose a 1g/L e NADP+ 0,5mM em
tampão fosfato 100mM pH 7,0 em um volume final de 100µL. O controle foi feito na
mesma condição descrita anteriormente, porém com adição de outro lisado celular
sem a presença de CgGOX-1. Após 30 minutos de incubação, 100µL do reagente 1
GLICOSE–Liquiform (Labtest) foram adicionados e o procedimento de dosagem de
glicose procedeu-se como indicado pelo fabricante. A atividade de CgGOX-1 foi
medida através do consumo da glicose em relação ao controle após a incubação.
1.4.22.2. Confecção de uma biopilha de CgGOX-1 e glicose de bagaço de cana
Uma solução de aproximadamente 5% de glicose (m/v) foi preparada a partir
de BEX. A sacarificação do material foi realizada com 20 FPU de ®Celluclast 1,5L/g
BEX em tampão acetato pH 5,0 50mM por 72 horas a 50ºC e 250rpm de agitação,
sendo depois filtrada para remoção do material sólido.
52
A solução foi utilizada na confecção da biopilha realizada pela aluna de
curso técnico em química Gabrieli do Amaral Diniz e colaboradores (ETECAP), onde
50mL de solução de glicose foi adicionada a 50mL de solução de cloreto de sódio
0,9% em um erlenmeyer de 250ml, sendo essa solução utilizada tanto no ânodo
(dentro do erlenmeyer) como no cátodo da pilha (dentro de um suporte para coluna
de purificação GE). Uma membrana de quitosana foi utilizada como o separador
entre as soluções. Dois eletrodos de grafite (1cm de diâmetro) foram colocados no
sistema, um no anodo e outro no catodo. Estes eletrodos foram conectados a fios de
cobres, que foram plugados ao Multímetro Digital (Foxlux Fx Md.). A tensão elétrica
(volt) e corrente elétrica (mA) foram medidas até o fim da reação. No início do
experimento, a solução enzimática contendo CgGOX-1(5mL) foi adicionada no
ânodo.
Figura 5 - Representação da biopilha de glicose e CgGOX-1.
1.4.23. Caracterização de AA10-2
1.4.23.1. Atividade de LPMO
A determinação de atividade de LPMO bem como a determinação do pH e
temperatura ótima de CgAA10-2 foi feita conforme descrito por Kittl (2013) [93] com
53
adaptações, o qual foi utilizado à detecção de peróxido de hidrogênio gerado por
CgAA10-2 na presença de ácido ascórbico.
Foi realizado um ensaio fluorimétrico com o kit comercial Amplex Red -
horseradish peroxidase™. Para a caracterização da temperatura ótima, 5μg da
enzima e 50μmol/L de ácido ascórbico foram incubados por 30 minutos em tampão
tris-glicina pH 8,0 50mM em diferentes temperaturas (20-90°C). Para a
caracterização do pH ótimo da enzima, a reação foi realizada com 5μg de CgAA10-2
e 50μM de ácido ascórbico incubados em tampão 25mM em uma faixa de pH de 4,0-
7,5 (fosfato) 8,0-11,0 (Tris-glicina) a 30°C por 30 minutos.
Ao final das incubações, alíquotas de 50µl das reações foram incubadas com
50μmol/L de Amplex Red (Sigma-Aldrich) e 7.1U/mL de horseradish peroxidase ™
em um volume final de 100µl por 2 minutos a 30°C nas condições ideias do teste. A
breve incubação é realizada para a peroxidase do kit reagir com todo o H2O2 gerado
na incubação anterior. A concentração de H2O2 gerada por CgAA10-2 em 30
minutos foi então mensurada através da absorbância detectada utilizando-se um
comprimento de onda de emissão de 595nm, em um leitor de placas M200 infinita
Tecan (Tecan Männedorf, Suíça). A atividade foi calculada a partir da concentração
de H2O2 gerada pela enzima, comparada com uma curva de calibração de diferentes
concentrações de H2O2. Controles foram realizados sem a adição da enzima, e os
valores de absorbância foram subtraídos das respectivas reações. Os ensaios foram
realizados em triplicata.
1.4.23.2. Predição de estrutura tridimensional
A predição de estrutura tridimensional foi realizada na ferramenta I-TASSER
(disponível em: http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/), no modo default.
Nesta predição foram feitas as seguintes análises: análise de predição estrutural,
análise de similaridade com proteínas com estrutura resolvida e análise dos sitos
ligantes, desta forma alguns parâmetros de confiabilidade foram gerados. Entre eles
54
estão o C-Score, o qual confere um índice de qualidade da predição estrutural de
acordo com resultados de alinhamentos de proteínas homólogas com a sua
proteína. O C-Score é geralmente em torno de -5,2 sendo valores mais altos que
estes considerados boas predições [94]. O segundo parâmetro é o TM-Score, que é
uma escala proposta para medir a similaridade entre duas estruturas de proteínas,
sendo que ele participa no cálculo de geração do C-Score quando já existe uma
modelo de predição possui topologia correta e < 0, possuem regiões de topologia
randômica, ou seja, não confiável [94].
1.4.24. Atividade de CgLAC-1
A atividade de lacase de CgLAC-1 foi testada pelo método da oxidação do
pirogalol [95,96]. A reação era composta de 240µl de solução tampão fosfato pH 7,0
100mM contendo ou não 20mM de H2O2; 10µl de CgLAC-1 (0,240mg/mL) ou lacase
comercial (novozyn 0,04mg/mL). A reação foi iniciada adicionando-se 1µmol/L de
pirogalol e a o aumento da absorbância em 420nm causado por atividade em
enzimática foi medido durante 10 minutos à temperatura ambiente. As absorbâncias
das reações foram subtraídas de brancos contendo ou não H2O2. Todos os ensaios
foram realizados em triplicata. O calculo enzimático foi calculado através da lei de
Lambert-beer com o coeficiente de extinção molar de 39,4M cm-1 para o pirogalol.
1.4.25. Atividade de CgCAT-1
A detecção da atividade de catalase foi realizada através do ensaio com o
reagente Amplex Red. Todas as reações inicialmente continham 20µmol/L de H2O2
como substrato em tampão fosfato pH 7,0 a 100mM. 25µL de CgCAT-1 (reação) ou
Catalase do kit comercial (Padrão - 0,25U/mL) foram adicionadas as reações e
incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente. Ao final das reações, 50µmol/L
de Amplex Red e 0,2U/mL de HRP reação foram adicionados e as amostras foram
incubadas novamente por 30 minutos. Ao final, a fluorescência foi medida em um
leitor de microplacas (Tecan) a 590nm. A atividade de CgCAT-1 foi calculada
55
comparando-se a atividade com a catalase fornecida pelo kit (0,25U/ml) em relação
ao branco da reação contendo somente H2O2. Todos os ensaios foram feitos em
triplicata.
1.5. Resultados e Discussão
1.5.1. Investigação e seleção de enzimas de C. gestroi com potencial
biotecnológico
Resultados do trabalho de doutorado de Franco-Cairo e colaboradores
levantam indícios sobre os mecanismos oxido redutivos, similares à degradação da
química de Fenton, ocorrendo no digestoma do cupim C. gestroi. Estas análises
constituem-se de dados que foram cedidos por Franco-Cairo et al. (2016) [5] e se
fez presente para o maior entendimento do motivo de investigar as enzimas deste
estudo.
A alimentação dos cupins a base de lignocelulose é uma das mais
interessantes diferenças entre a casta operária e as demais. Esta divergência entre
dois indivíduos da mesma espécie torna possível o estudo da expressão diferencial
de proteínas que pode estar relacionadas com a dieta lignocelulósica [48].
Interessantemente, além do enfoque em proteínas mais expressas na casta
operária, também foi analisado o efeito de diferentes dietas dadas a estes tipos de
cupim. Onde, o bagaço de cana in-natura (BIN) e pré-tratado com ácido fosfórico
(PASB) como deita, foram investigados (Tabela 3B). É possível observar que o pré-
tratamento no bagaço de cana de açúcar acarreta diferenças significativas na
expressão de diversas enzimas pelo cupim (Tabela 3B).
Tabela 3 Comparativo entre as enzimas identificadas no metatranscriptôma de C. gestroi. (A) Diferenças de expressão entre a casta operária e soldado. (B) Influência da dieta com diferentes biomassas (BIN e PASB) no metatranscriptôma da casta dos operários. A expressão foi calculada através dos Valores de FPKM de classes de enzimas GHs, AAs e PADs em C. gestroi. Os dados foram cedidos por Franco Cairo et al. [5].
56
As ORFs selecionadas foram alvo de clonagem, expressão, caracterização funcional
e aplicação biotecnológica. A Tabela 4 exibe uma visão geral do estudo, e os
resultados alcançados.
FPKM FPKM
FPKM FPKM
A B
57
Tabela 4 - Panorama dos resultados obtidos com as enzimas GHs, PADs e AAs de C. gestroi.
58
1.5.2. Clonagem, obtenção e caracterização de enzimas de C. gestroi
1.5.3. Glicosil hidrolases: CgGH1-1; CgGH9-1 e CgsymGH7-1
O estudo e caracterização das GHs do cupim foi fundamental para se
desenvolver os estudos sinérgicos com as demais enzimas oxidativas. A β-
glucosidase, pertencente à família GH1 (CgGH1-1) e a endoglucanase,
pertencente à família GH9 (CgGH9-1), foram parcialmente caracterizadas por
Franco-Cairo (2013)[73], membro de nosso grupo de pesquisa. As enzimas
encontram-se clonadas em vetor PET28a tendo como hospedeiro de
expressão a cepa E. coli ArcticExpress DE3. Os níveis de expressão de
CgGH9-1 são em torno de 1mg de proteína purificada por litro de cultivo;
CgGH1-1 possuiu sua expressão em torno de 3mg por litro de cultivo, e
CgsymGH7-1 não foi expressa (Dados não mostrados) [97].
1.5.3.1. Imunolocalização de CgGH9-1
CgGH9-1 é uma endoglucanase endógena do cupim da família GH9,
reportada com fraca atividade de exoglucanase [73]. A enzima foi detectada no
intestino de C. gestroi através da técnica de Imunolocalização descrita no
capítulo quatro (Figura 6) gerando marcações de alta qualidade. Até o presente
momento, este é o primeiro ensaio por imunolocalização com sondas
fluorescentes desta classe de proteínas encontrada em C. gestroi.
Na Figura 6 é possível observar o aumento de fluorescência na porção
anterior do intestino do cupim, além de presença de fluorescência em porções
do intestino onde a biomassa lignocelulósica estava concentrada. Estes
resultados estão de acordo com estudos de transcriptômica e ensaios
enzimáticos do tubo digestivo de cupins inferiores, onde a maior presença
desta enzima foi encontrada na porção anterior do intestino do inseto, baixa
atividade no intestino médio e atividade intermediária no intestino posterior
[51,98,99].
59
Figura 6 - Imunolocalização de CgGH9-1 no tecido intestinal de C. gestroi. As amostras foram incubadas com anticorpos primários anti-CgGH9-1 e depois com anticorpos secundários fluorescentes (AlexaFluoor 568 fluorophores). As amostras foram analisadas em uma lupa em microscópio de fluorescência Leica DMI 6000. A) Microscopia com luz branca mostrando a estrutura intestinal do cupim. B) Microscopia de fluorescência, onde a cor vermelha representa a imunolocalização de CgGH9-1 no intestino do cupim. C) Sobreposição de A e B. Experimentos similares utilizando apenas anticorpo primário ou secundário foram realizados independentemente para controle de autofluorescência e ligação não específica do anticorpo secundário. Não foram encontrados sinais de falso positivo.
1.5.3.2. Suplementação enzimática com CgGH1-1
CgGH1-1 é uma beta glucosidase reportada por apresentar uma alta
eficiência catalítica e potencial na suplementação de coquetéis
lignocelulolíticos [73].
A suplementação do extrato enzimático de P. echinulatum [82] com
CgGH1-1 foi capaz de aumentar os níveis de hidrólise enzimática de BH em
até 36% como esperado para a suplementação deste extrato com beta
glucosidases (Figura 7). Além disso, houve um limite na suplementação do
extrato, a partir da adição de 0,5mg de CgGH1-1/g de bagaço (Figura 7).
Embora o extrato enzimático de P. echinulatum seja considerado eficiente
para hidrólise de lignocelulose, ele apresenta baixos níveis enzimáticos de β-
glucosidase [82]. Além disso, as análises de espectrometria de massas
realizadas no secretoma deste fungo não encontraram nenhuma enzima da
família GH1 em quantidades significativas nestas condições em que o fungo foi
cultivado [82]. Portanto, como esperado, a adição de CgGH1-1 suplementa
60
uma carência fundamental neste extrato enzimático para aplicações em
biorefinaria, já que as β-glucosidases são enzimas chave para a produção de
etanol 2G [3].
Uchima (2012) [100], clonou uma β-glucosidase endógena do cupim
Nasutitermes takasagoensis e fez estudos de suplementação de Celluclast 1,5
L com esta proteína. Foi verificado que, a enzima aumentou a hidrólise em
cerca de 20%, devido ao fato desta enzima possuir estabilidade térmica e
diminuir a inibição da atividade de endoglucanase do coquetel pela celobiose
[100].
C o n c e n tra ç ã o d e d e C g G H 1 -1 a d ic io n a d a (m g /g B H )
AR
T
(g/L
)
0 .0 0 0 .0 2 0 .1 0 0 .2 0 0 .5 0 1 .0 0 2 .0 0 3 .0 0
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
G S
1 ,0 5
G S
1 ,0 6
G S
1 ,1 7
G S
1 ,2 2
G S
1 ,3 4
G S
1 ,3 4
G S
1 ,3 6
Figura 7 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum (0,4FPU/g BH) com diferentes concentrações da proteína CgGH1-1. As reações foram realizadas em pH 4,8 durante 24 horas de hidrólise, a uma temperatura de 50°C e agitação de 1000rpm. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART) onde GS é o grau de sinergismo. Os testes foram feitos em triplicata e todos os resultados apresentam significância estatística com p<0,05 em relação ao coquetel não suplementado segundo o teste t de student. Não foi detectado ART sem a adição do extrato fúngico.
61
1.5.3.3. Exoglucanase (CgsymGH7-1)
A ORF encontrada e identificada como CgsymGH7-1 foi amplificada do
cDNA do cupim, e posteriormente clonada em vetor PET28a, sendo confirmado
por reação de PCR das colônias transformadas (Figura 8). O gene foi
transformado em todas as cepas de expressão utilizados neste trabalho. Não
houve banda de expressão em análises de SDS-PAGE dos cultivos das cepas
(dados não mostrados). Enzimas da família GH7 são reportadas por serem de
difícil expressão heteróloga, além disso, nenhuma exoglucanase simbiôntica de
cupins foi expressa em sistema procariótico até o momento. Portanto, o
sistema de expressão de células de insetos ou fúngico seria uma alternativa
promissora para obtenção desta proteína [51,101].
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose 1 % do produto de PCR de colônia de ArcticExpress (DE3) para as construções do gene CgsymGH7-1 em pET28a. M = marcador de peso molecular em kpb (pares de base. 10 3). Colunas 1-3 = bandas de confirmação da clonagem de CgsymGH7-1 (1,2Kb).
CgsymGH7-1 possui 94% de similaridade de pares de bases
nucleotídicas com uma sequencia de GH7 de Pseudotrichonynpha grassei [51]
encontrada através do banco de dados NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
A exoglucanase bioquimicamente caracterizada mais próxima é descrita
1,5 kpb
1,0 kpb
1 2 3
62
por Sethi e colaboradores (2013) [102] como GHF7-3, com similaridade de
bases nucleotídicas de 76%. GHF7-3 foi encontrada em simbiontes do intestino
posterior do cupim Reticulitermes flavipes e possuía atividade ótima em pH 7,0.
Contudo, foi reportado que a enzima não possuía termoestabilidade, e foi
ineficiente na suplementação de coquetéis celulásicos comerciais [102].
Figura 9 - Domínio conservado identificado na sequencia de aminoácidos correspondente à ORF(CgsymGH7-1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
1.5.4. CgSOD-1 – Superóxido Dismutase
O gene CgSOD-1 (acesso GenBank: KP642166) de C. gestroi codifica
uma superóxido dismutase. Esta proteína será detalhadamente descrita na
tese de doutorado de João Paulo Franco Cairo no formato de artigo no qual o
autor desta dissertação é colaborador do trabalho. Portanto, apenas alguns
parâmetros adicionais serão reportados neste trabalho.
A enzima foi expressa com obtenção de 8mg de proteína/L de cultivo, o
peso molecular encontrado estava de acordo com o peso molecular da enzima
mais a adição da cauda de histidina (15,8 + 2,5 kDa) (dados não mostrados).
1.5.4.1. Imunolocalização de CgSOD-1
A presença e localização de CgSOD-1 foi investigada através de sua
imunolocalização no intestino de C. gestroi (Figura 10). A porção anterior do
intestino de C. gestroi foi a que apresentou maior intensidade de fluorescência.
Além disso, as imagens A, B, C e D foram ampliadas e analisadas por meio de
microscopia de camada de profundidade com marcação de material genético
63
(Prolong - azul) permitindo uma análise de alta resolução das estruturas do
intestino do inseto. Pode-se notar nas imagens a presença da enzima no lúmen
intestinal do cupim (vermelho - Figura 10B). Estas foram às primeiras análises
de imunolocalização descritas para esta classe de enzima, realizadas no tubo
digestivo de cupins até o presente momento.
Figura 10 - Imunolocalização de CgSOD-1 no tecido intestinal de C. gestroi. As amostras foram incubadas com anticorpos primários anti-CgSOD-1 e depois com anticorpos secundários fluorescentes (AlexaFluoor 568 fluorophores). As amostras foram analisadas em microscópio de fluorescência Leica DMI 6000. As marcações em azul representam o material genético das células corados utilizando ProLong™ Antifade Reagents for Fixed Cells. Experimentos similares utilizando apenas anticorpo primário ou secundário foram realizados de forma independe para controle de autofluorescência e ligação não específica do anticorpo secundário. Não foram encontrados sinais de falso positivo.
1.5.4.2. Suplementação de coquetéis enzimáticos com CgSOD-1
A Figura 11 exibe os resultados da suplementação enzimática de
®Celluclast 1,5L com CgSOD-1 para a hidrólise de BEX a 50 ºC. O efeito
positivo de CgSOD-1 sobre ®Celluclast 1,5L foi demonstrado pelo G.S de 1,15
(3h) e 1,19 (6h de reação) Figura 11. A característica inédita do uso de uma
SOD aplicada na produção de etanol de segunda geração foi depositada em
forma de patente com o número de registro: BR10201501725 (Anexo 2).
64
T e m p o (h o ra s )
AR
T (
g/L
)
3 6
0 .6
0 .8
1 .0
1 .2
1 .4
1 .6
C e llu c la s t® (1 F P U )
C e llu c la s t® (1 F P U )
+ C g S O D -1
G S
1 ,1 5
G S
1 ,1 9
C g S O D -1
Figura 11 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 1FPU por grama de BEX com a proteína CgSOD-1 (1,3mg/g BEX). As reações foram realizadas em pH 5,0 durante 3 e 6 horas de hidrólise a uma temperatura de 50°C e agitação de 1000rpm. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART) onde GS é o grau de sinergismo. Os testes foram feitos em triplicata e os resultados apresentam significância estatística com p<0,05 seguindo o teste t de student.
Além disso, a suplementação do extrato enzimático de P. echinulatum
com CgSOD-1 aumentou os níveis de hidrólise enzimática de BH (Figura 12).
Todos as concentrações de CgSOD-1 adicionadas aumentaram a hidrólise. O
melhor resultado foi encontrado com a suplementação com 3,0mg/g de bagaço,
com um aumento de 123% da hidrólise do material lignocelulósico.
Como reportado por Costa et al (2016) [82], LPMOs e outras enzimas
auxiliares não foram encontradas em análises de espectrometria de massas do
secretoma de P. echinulatum. Os próprios autores sugerem que a adição AAs
poderia contribuir para a otimização deste coquetel enzimático [82]. Portanto,
os dados apresentados na Figura 12 confirmam esta hipótese, visto que a
contribuição de CgSOD-1 se dá por vias oxidativas, e que auxiliam na
diminuição da recalcitrância da celulose do bagaço de cana de açúcar,
facilitando o acesso de celulases clássicas da família GH5, GH6, GH7 e GH9
[82].
65
C o n c e n tra ç ã o d e d e C g S O D -1 a d ic io n a d a (m g /g B E X )
AR
T
(g/L
)
0 .0 0 0 .0 2 0 .1 0 0 .2 0 0 .5 0 1 .0 0 2 .0 0 3 .0 0
0
1
2
3
4
5
G S
1 ,1 5
G S
1 ,1 5
G S
1 ,2 4
G S
1 ,3 6
G S
1 ,5 2
G S
2 ,0 3
G S
2 ,2 3
Figura 12 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum (0,4FPU/g BH) com diferentes concentrações da proteína CgSOD-1. As reações foram realizadas em pH 4,8 durante 24 horas de hidrólise a uma temperatura de 50°C e agitação de 1000rpm. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART) onde GS é o grau de sinergismo. Os testes foram feitos em triplicata e os resultados apresentam significância estatística com p<0,05 segundo o teste t de student. Não foi detectado ART sem a adição do extrato fúngico.
Portanto, devido à capacidade natural de oxido redução de SODs
sugerimos que a degradação dos polissacarídeos realizadas por CgSOD-1 é
relacionada com a presença de EROs ou por mecanismo de oxidação direta
dos carbonos 1, 4 e 6 das unidades de glicose na molécula de celulose, assim
como o mecanismo de AA9s. Contudo futuras análises serão feitas para
esclarecer esta capacidade de CgSOD-1.
Estas enzimas possuem excelentes propriedades bioquímicas,
principalmente por possuírem alta resistência frente a temperaturas e
condições diversas de desnaturação [103]. Além disso, estas enzimas podem
apresentar vantagens em relação as AA9, como por exemplo, seu pequeno
peso molecular, alta atividade catalítica, e fácil expressão em sistema
procarioto.
Deste modo o uso de CgSOD-1 na formulação de coquetéis celulásicos
66
é uma aplicação real e estudos detalhados entre CgSOD-1 e lignocelulose,
bem como o estudo da suplementação de outros coquetéis celulásicos se
fazem necessários.
1.5.5. CgAKR-1 - Aldoketo Redutase
A enzima foi clonada e expressa em sistema de expressão
ArcticExpress (DE3), contendo altos níveis de expressão (25mg de proteína/ L
de cultivo). O SDS-PAGE referente à expressão de CgAKR-1 bem como a
caracterização completa desta enzima serão mostrados no capítulo quatro.
1.5.5.1. A expressão de CgAKR-1 em E. coli BL21 (DE3) promove maior
tolerância ao furfural
CgAKR-1 é descrita em forma de trabalho cientifico no capítulo quatro,
porém dados complementares serão apresentados, pois novas propriedades
desta enzima foram encontradas e não puderam fazer parte do artigo
submetido.
Como CgAKR-1 se trata de uma enzima do tipo PAD, estas enzimas
auxiliam todos os tipos de organismos a tolerar CIs durante a degradação da
lignocelulose [11]. Desta forma, a clonagem de PADs em microrganismos
fermentadores pode melhorar a eficiência fermentativa destes em biomassas
ricas em CIs [11].
Como indicativo que CgAKR-1 poderia contribuir com organismos
fermentadores, CgAKR-1 foi superexpressa em E. coli para confirmar a sua
capacidade detoxificante in-vivo, avaliando o seu efeito sobre o crescimento
bacteriano na presença de furfural em meio rico (Figura 13).
As taxas de crescimento entre as células expressando CgAKR-1 e o
controle negativo eram muito similares na ausência de furfural (dados não
mostrados). Além disso, durante as três primeiras horas, o crescimento
bacteriano não foi prejudicado pela presença de furfural em ambos os testes
(Dados não mostrados). Provavelmente pela alta concentração de inóculo e o
67
baixo crescimento de ambas as cepas.
Como previsto, a superexpressão de CgAKR-1 em E. coli BL21 (DE3)
promoveu substancial melhora no crescimento celular após 24 horas de cultivo
(Figura 13). Provavelmente pela degradação de furfural em álcool furfurílico,
que é conhecido por ser menos tóxico [11].
Nas condições de cultivo onde as cepas foram crescidas na presença de
10mM de furfural, a cepa controle cresceu apenas 10% em relação ao meio
sem adição de furfural, e a cepa recombinante contendo CgAKR-1 atingiu 91%
de crescimento relativo ao seu crescimento na ausência do furfural (Figura 13).
Cepas de E. coli, superexpressando aldoketo redutases NADPH
dependentes, são reportadas em literatura, porem apenas de origem
microbiana [11,45,104,105]. Em vias gerais, houve o aumento do crescimento
destas cepas modificadas quando cultivadas em hidrolisado lignocelulósicos
ricos em CIs, em comparação com cepas que não continham as AKRs
recombinantes [104,105]. Além disso, os objetivos destes trabalhos eram
focados na produção de etanol 2G ou apenas para a decomposição destes
hidrolisados [11,45,104,105].
Estes dados serviram como indicativo para futuras manipulações
genéticas para atribuir resistência aos CIs em bactéria e leveduras
fermentadoras, bem como a criação de microrganismos para a bioremediação
destes compostos. Desta maneira, estes foram os primeiros trabalhos
envolvendo AKRs de eucariotos superiores para detoxificação de biomassa
vegetal.
68
F u rfu ra l (m M )
Cre
sc
ime
nto
- D
O 6
00
nm
(%
)
0 .0 2 .5 5 .0 1 0 .0 2 0 .0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
C o n tro le
C g A K R -1
Figura 13 - Inibição pelo furfural do crescimento de E. coli BL21 (DE3) (PeT28A) com o gene de CgAKR-1 ou o vetor vazio. As células foram crescidas por 24 horas em meio LB + glicose 1% + kanamicina (50µg/ml) + IPTG 0.5 mM. Concentrações de 0; 2,5; 5,0; 10,0 e 10 mM de furfural foram testadas. O crescimento celular foi avaliado medindo-se os valores de absorbância em espectrofotômetro em 600nm. Os testes foram realizados em três réplicas biológicas.
69
1.5.6. CgAA10-2 - (LPMO - AA10)
Uma ORF contendo o domínio CBM33 foi identificada como CgAA10-2,
amplificada do cDNA de C. gestroi e clonada em vetor de expressão PET28a.
CgAA10-2 apresentou expressão heteróloga em forma de corpos de inclusão
em todos os sistemas de expressão utilizados, porém com níveis mais
elevados em cepas Rosetta-gami 2(DE3) (Dados não mostrados). Protocolos
de solubilização, desnaturação e enovelamento (refolding) foram necessários
para a obtenção e analise de CgAA10-2 (Figura 14). A concentração de 0,5mg
de proteína/ L de cultivo foi obtida ao final das etapas de purificação. Não foi
possível analisar o gel da fração purificada por GF, contudo o cromatograma
desta demonstrou a alta pureza da proteinas (dados não mostrados).
Figura 14 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão em Rosetta-gami 2 (DE3) e purificação de CgAA10-2. A Enzima foi expressa a 37ºC, 120rpm por 4 horas e purificada através protocolos de refolding e IMAC. M = Padrão de peso molecular EM kDa (ThermoScience). Coluna 1 = pellet; coluna 2 = pellet após protocolo de refolding; coluna 3 = fração resultante do protocolo de refolding após IMAC com eluição com imidazol 200mM. A seta indica a enzima parcialmente purificada.
70
1.5.6.1. Análises bioinformáticas de CgAA10-2
Os estudos genômicos do cupim revelaram à presença de uma ORF
contendo um domínio de ligação à quitina (Pfam 03067), e recentemente
classificada como domínio LPMO da família 10 (Figura 15). Esse domínio
protéico é capaz de oxidar a celulose, auxiliando na descontrução deste
polímero. Além diss, até o presente momento, estas proteínas foram descritas
apenas em bactérias e fungos [65]. Portando, não existe nenhuma AA10
descrita no reino animal, contudo, ao se realizar uma busca no banco de dados
NCBI com a ORF CgAA10-2, várias sequencias são encontradas nos genomas
de vários insetos como hipotéticas (cerca de 300 ortólogos identificados
segundo NCBI). Uma destas sequências é encontrada no genoma do cupim
inferior, Z. nevadensis (KDR22451.1), possuindo similaridade de 83% com a
ORF encontrada.
Figura 15 - Domínio conservado identificado na sequência de aminoácidos correspondente à ORF(CgAA10-2), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTx.
Após tentativas de análises filogenéticas com proteinas descritas como
AA10 do banco de dados CAZy, foi verificado que nenhuma família de AA10
caracterizada se alinhou deretamente com CgAA10-2.
71
Figura 16 - Figura - Análise filogenética de CgAA10-2. A filogenia foi gerada através do método neighbor-joining com análise de correção de Poisson e valores de bootstrap de 1000. Os valores de bootstrap são mostrados nos nós. Todas estas sequências foram extraídas de banco de dados do CAZY e após as análises os resultados foram comparadas ao trabalho de Book (2014) [91].
As análises com predições de estruturas tridimensional de CgAA10-2
foram efetuadas na plataforma do I-TASSER. A estrutura obteve um C-score =
-1,88 e o TM-Score de 0.49±0.15 tendo uma resolução 11.0±4.6Å. É possível
observar que a estrutura é formada principalmente por estrutura secundária do
tipo folha-ß (Figura 17A). Em seu sítio catalítico há a presença do ligante Cu2+
fazendo contato com os aminoácidos, HIs1, Ala110, His112 e Phe212 que são
aminoácidos conservados entre a superfamília de proteinas do tipo AA10
(Figura 17B). Outra predição realizada foi a de similaridade com estruturas
resolvidas no PDB (Figura 17C). A proteína com maior similaridade foi uma
proteína de fusão de vírus entomopatogênico (fusolina) pertencente ao grupo
entomopóxovirus ou chitinovírus (UniProt 4ow5A) no qual o TM-Score foi de
0.771. A fusolina é reportadas por ter atividade de AA10 relacionada como um
fator de patogenicidade durante a infecção viral em células de insetos [106].
A similaridade estrutural de CgAA10-2 e a fusolina nos permite sugerir
que CgAA10-2 pode ter surgido a partir de transferências gênicas entre o vírus
CgAA10.2
gi|646720868|gb|KDR22451.1| hypothetical protein L798 01446 Zootermopsis nevadensis
gi|242023172|ref|XP 002432010.1| conserved hypothetical protein Pediculus humanus corporis
CBMs Bacilos Gram-negativos
Basídeo micetos
Streptomyces sp
CBMs de Proteobatérias
CBMs de proteobactérias
Actinomicetos
CBMs Vírais
glucose oxidase precursor (EC 1.1.3.4) Aspergillus niger
100
100
100
100
100
100
61
78
70
83
50
78
9973
92
Z. novadensis
Pediculus humanus
100
72
e seu hospedeiro, ancestral de C. gestroi, contudo, outras análises evolutivas
precisam ser feitas para se confirmar esta hipótese.
Figura 17 - Predição de estrutura tridimensional de CgAA10-2 A) Predição do tipo foguete mostrando estruturas folhas beta. B) Predição do tipo foguete mostrando os resíduos aromáticos da proteína, essenciais para o reconhecimento do substrato nas redondezas do sítio de ligação ao cobre (globo azul claro). C) Superposição das estruturas, verde: CgAA10-2; vermelho: AA10: N4OW5 D) Alinhamento das sequencias de aminoácidos de CgAA10-2-2 e da uma AA10 depositada no PDB (N4OW5).*resíduos conservados
D
A B
C
73
1.5.6.2. Caracterização bioquímica de CgAA10-2
A expressão e purificação da enzima, mesmo com o baixo rendimento,
possibilitou a caracterização da proteína. Através dos ensaios com Amplex Red
e ácido ascórbico, verificamos as condições de trabalho da enzima. Onde, de
acordo com outras LPMOs, esta proteína possuía atividade ótima em pH 8,0
[107] (Figura 18A). A enzima foi incubada na presença de ácido ascórbico em
diferentes temperaturas, onde a variação da concentração de H2O2 gerada por
CgAA10-2, indica sua atividade ótima de trabalho na faixa de 60ºC (Figura
18B). As LPMOS AA10s são proteínas robustas, possuindo um metal em seu
sítio catalítico que resulta em uma alta termoestabilidade e compatibilidade
com as temperaturas de hidrólise [65].
p H
Re
lativ
e A
ctiv
ity
(%
)
4 5 6 7 8 9 1 0 1 1
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
T e m p e ra tu ra (ºC )
Ativ
ida
de
re
lativ
a (
%)
2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 18 - (A) Efeito do pH sobre a atividade de CgAA10-2. Tampão fosfato (pH 4,0 – 7,5) e tampão Tris-glicina (pH 8,0 – 11,0) foram usadas à concentração final de 25mM. O ensaio foi realizado com a incubação de CgAA10-2 a 30ºC na presença de ácido ascórbico em diferentes pHs. Após 30 minutos os peróxidos de hidrogênio gerado por CgAA10-2 foram mensurados com o kit Amplex red. Os ensaios foram realizados em triplicata, e são mostrados em atividade relativa. B) Efeito da temperatura sobre a atividade de CgAA10-2. O ensaio foi realizado com a incubação de CgAA10-2 na presença de ácido ascórbico em tampão tris-glicina 50 mM pH 8,0 com diferentes temperaturas de reação. Após 30 minutos o peróxido de hidrogênio gerado por CgAA10-2 foi mensurado com o kit Amplex red. Os ensaios foram realizados em triplicata, e são mostrados em atividade relativa.
74
Análises com técnicas de cromatografia de troca aniônica acoplada com
detecção eletroquímica por amperometria pulsada (HPAEC-PAD) foram
aplicadas conforme descrito em literatura para a detecção de oligossacarídeos
oxidados e nativos após a incubação de CgAA10-2 com carboidratos [32,108].
Os resultados indicaram que a CgAA10-2 libera oligossacarídeos de
celulose tratada com ácido fosfórico (PASC). Os oligossacarídeos foram
eluídos em tempos de retenção equivalentes a oligossacarídeos nativos e
oxidados conforme materiais e métodos (Figura 19). Observou-se pelo
tamanho dos picos uma quantidade alta de açucares liberados de PASC, com
liberação de picos de 1 a 7 mono e oligossacarídeos, onde, mono e
dissacarídeos oxidados no carbono 1, monossacarídeos oxidados no carbono 4
e a celobiose foram a maioria dos açucares detectados (Figura 19). Além disso,
é possível verificar que os controles negativos não liberaram açúcares nativos
ou oxidados (Figura 19).
Figura 19 – Cromatograma de HPAEC dos oligossacarídeos liberados de PASC após a adição de CgAA10-2 e ácido ascórbico 10mM. DP: picos de açucares nativos; DPox: picos de açúcares oxidados, os números indicam o número de monômeros de açucares correspondentes ao pico detectado.
75
1.5.7. CgALOX-1 - Aldeído Oxidase (AA5) - Xantina Oxidase
Esta ORF foi amplificada partir do cDNA de C. gestroi (Figura 20),
contudo devido ao número de de 3200 pares de bases deste gene, a clonagem
em sistema PET28a por enzimas de restrição apresentou-se inviável.
Figura 20 - Análises de eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR TouchDown de CgALOX-1. M = marcador de peso molecular em pb (pares de base). Demais colunas: CgALOX-1 (3200bp) amplificadas com temperaturas de anelamento de 45; 50; 55 e 60ºC respectivamente. A seta indica a possível amplificação de CgALOX-1.
CgALOX-1 é uma ORF referente a uma aldeído oxidase endógena de
C. gestroi. O melhor match encontrado no banco de dados do NCBI para
CgALOX-1 foi uma Xantina desidrogenase do cupim Zootermopsis nevadensis
(GenBank: KDR24385. 1) possuindo 64% de similaridade de bases
nucleotídicas com CgALOX-1. A Figura 21 mostra os domínios conservados
encontrados nesta ORF.
76
Figura 21 - Domínio conservado identificado na sequencia de aminoácidos correspondente à ORF(CgALOX-1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
Análises filogenéticos de CgALOX-1 foram realizadas em conjunto com
proteínas da família de AOX e XDHs de acordo com Marelja et al (2014) [92].
CgALOX-1 não foi agrupada a nenhuma das famílias, porem, as enzimas
filogeneticamente mais próximas de CgALOX-1 foram XDHs de insetos sociais
(Figura 22).
77
Figura 22 - Análise filogenética de AOX e XDHs. A filogenia e posterior análise foram implementadas com o software MEGA 6.0 através do método neighbor-joining com análise de correção de Jukes Cantor e valores de 1000 bootstrap encontrados nos nós da árvore [88]. Todas as sequências bem como a metodologia de análise foram extraídas de Marelja et al (2014) [92].
As superfamília de enzimas aldeído oxidase/desidrogenase catalisam a
oxidação irreversível dependente de NAD(P)+ de uma amplo espectro de
aldeídos endógenos e exógenos aos seus respectivos ácidos carboxílicos
[68]. Estas enzimas contêm três domínios: O domínio ligante de NADP+; O
domínio catalítico e um domínio ligante [68].
As AOX e XDHs são enzimas detoxificantes do tipo não citocromo P450
(CYP450), que desempenham um papel crítico na proteção celular contra os
xenobióticos [68]. Estas enzimas são importantes agentes antioxidantes,
atuando na regeneração de NADPH e eliminando radicais hidroxilas através de
gi|356550325|ref|XP 003543538.1|Glycine max (XDH)
gi|367034910|ref|XP 003666737.1|Myceliophthora thermophila
gi|255544848|ref|XP 002513485.1|Ricinus communis (XDH)
gi|79497103|ref|NP 195216.2 |Arabidopsis thaliana (XDH)
gi|357121299|ref|XP 003562358.1|Brachypodium distachyon (XDH)
gi|168016458|ref|XP 001760766.1|Physcomitrella patens
gi|302765308|ref|XP 002966075.1|Selaginella moellendorffii
gi|367034910|ref|XP 003666737.1|MYCTH 2311689 Myceliophthora thermophila ATCC 42464
gi|339476471|gb|EGP91562.1|Zymoseptoria tritici
gi|119194241|ref|XP 001247724.1|Coccidioides immitis (XDH)
gi|67538886|ref|XP 663217.1|spergillus nidulans (XDH)
gi|119500332|ref|XP 001266923.1| Aspergillus fischeri (XDH)
gi|169771453|ref|XP 001820196.1|Aspergillus oryzae (XDH)
XDH (fungos)
gi|924443175|pdb|4UHW|A Chain A Human |924443176| (AOX)
gi|17540638|ref|NP 502747.1| Caenorhabditis elegans
gi|268535120|ref|XP 002632693.1|Caenorhabditis briggsae
gi|2282473|dbj|BAA21640.1|Bombyx mori (XDH)
gi|383858816|ref|XP 003704895.1| PREDITA:Megachile rotundata (XDH)
gi|13506615|gb|AAG47345.1|Ceratitis capitata (XDH)
gi|17737937|ref|NP 524337.1| rosy Drosophila melanogaster
gi|157131095|ref|XP 001662131.1|edes aegypti
gi|170036545|ref|XP 001846124.1|Culex quinquefasciatus (XDH)
XDH (insetos)
XDH
CgALOX
gi|646707665|gb|KDR14320.1| Zootermopsis nevadensis (XDH)
gi|380018750|ref|XP 003693286.1|PREDITA: indole-3-acetaldehyde oxidase-like Apis florea
gi|815910594|ref|XP 003489421.2|Bombus impatiens (XDH)
XDH (insetos sociais)
gi|158294521|ref|XP 001688700.1|Anopheles gambia
gi|170057106|ref|XP 001864334.1|Culex quinquefasciatus (AOX)
gi|157126049|ref|XP 001654511.1|Aedes aegypti
AOX (mosquitos)
gi|242032729|ref|XP 002463759.1|Sorghum bicolor
gi|350535553|ref|NP 001234456.1| aldehyde oxidase Solanum lycopersicum (AOX)
gi|15225852|ref|NP 180283.1| Arabidopsis thaliana (AOX)
gi|297822365|ref|XP 002879065.1|Arabidopsis lyra (AOX)
gi|356501312|ref|XP 003519469.1|Glycine max (AOX)
gi|225436116|ref|XP 002273629.1| Vitis vinifera (AOX)
gi|255549571|ref|XP 002515837.1|Ricinus communis (AOX)
gi|566188171|ref|XP 002313633.2|Populus trichocarpa
AOX
100
100
100
100
72
99
71
83
100
100
92
100
100
92
100
97
53
100
100
100
100
100
98
100
100
94
100
100
86
100
94
61
100
0.1
78
seus grupamentos cisteína e a metionina [68].
Em relação à AOX e XDHs de insetos, sabe-se que em Drosophila sp.
foram encontradas 4 AOXs que possuíam atividade contra diversos aldeídos
reportados como CIs, sendo todas estas proteínas imunolocalizadas no
intestino médio e nos túbulos de malphighi deste inseto [109]. Desta maneira,
as atividades putativas de AOXs e XDHs podem contribuir em aplicações
envolvendo a detoxificação.
1.5.8. CgGOX.1- Glicose Desidrogenase/Oxidase (AA3)
CgGOX-1 é caracterizada como uma glicose oxidase/desidrogenase
endógena do cupim C. gestroi. A enzima foi amplificada e clonada em vetor
PET28a e transformada em todas as cepas testadas neste trabalho. O sistema
de expressão Rosetta-gami 2(DE3) foi capaz de expressar a enzima, porém
esta proteína foi apenas expressa no pellet dos cultivos em formas de corpos
de inclusão (Figura 23).
Figura 23 - Análise de SDS-PAGE 12% da expressão do gene CgGOX-1em diferentes sistemas de expressão. M em kDa = Ladder ThermoScience. coluna 1 = BL21 (DE3); coluna 2 = Origami; coluna 3 = ArcticExpress (DE3); coluna 4 = Rosetta-gami 2 (DE3).
79
1.5.8.1. Análises bioinformáticas e bioquímicas de CgGOX.1
CgGOX-1 é caracterizada como uma glicose oxidase, membro da família
AA3 do banco de dados CAZy [27] (Figura 24). Estas proteínas contêm o
domínio GMC oxidorredutase (PF00732), e são capazes de catalisar a
oxirredução de glicose/álcoois e piranoses gerando H2O2 como coproduto.
Figura 24 - Domínio conservado identificado na sequencia de aminoácidos correspondente à ORF(CgGOX.1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
CgGOX-1 foi capaz de oxidar açucares. O pellet contendo CgGOX-1
apresentou atividade de glicose oxidase em relação ao controle (dados não
mostrados). Contudo, outras análises serão necessárias para verificar se
outros compostos podem ser oxidados pela enzima, como por exemplo,
piranoses, quinonas e lignina.
As GMC oxidorredutases de insetos são agrupadas em subfamílias [66].
Segundo Cavener et al (2007) as GMC oxidorredutases de insetos são
filogeneticamente muito distintas de outros organismos, onde apenas enzimas
fúngicas possuem alguma similaridades com estas (Figura 25) [66].
Análises filogenéticas de CgGOX-1 demonstraram que esta proteína
pertence à subfamília GMC β, com maior proximidade com a enzima TcGMC
β5, a mais distinta entre a subfamília β (Figura 25). TcGMC β5 é expressa em
Tribolium castaneum na porção média do intestino do inseto, durante todas as
fases de seu desenvolvimento [66].
80
Figura 25 - Análise filogenética de GMC oxidorredutases de insetos. A filogenia foi gerada através do método neighbor-joining com análise de correção de Poisson e valores de bootstrap de 1000. Os valores de bootstrap dão mostrados nos nós. Todas estas sequencias bem como a metodologia de análise foram extraídas de Cavener et al (2007) [66]. A filogenia e posterior análise foram implementadas com o software MEGA 6.0. *Os genes foram classificados em subfamílias, onde, cada letra do alfabeto romano, simboliza sua respectiva letra.
Abreviaturas: Dm (d. melanogaster), Ag (a. gambiae) Am (a. mellifera), Tc (T. castaneum), Ecol (Escherichia coli), Cele
(Caenorhabditis elegans), Anig (Aspergillus niger), Aory (Aspergillus oryzae), Pama (Penicillium amagasakiense), EO
(isoinokosterone oxidase) e CHD (colina desidrogenase). "DmEO_B1" (CG9504) pertence ao GMCβ, mas é indicada
como EO pois sua função é conhecida. O número com 4 ou mais dígitos (por exemplo, CG9503, XM961446) indica o
número de adesão GenBank da sequência.
A expressão de GOX em glândulas salivares de insetos é geralmente
induzida pela concentração de glicose e fenólicos em seu aparelho digestivo
[110,111]. As funções atribuídas para GOX em insetos, esta relacionada com, a
GM
C A
LFA
GM
C E
TA
50 GMC A
94
GMC D
100
GMC G
100
GMC Q
CG6142
CMC I
48
26
34
GM
C L
45
GM
C K
GM
C D
E B
ESO
URO
S
36
23
GLD
/GO
X/G
LXr
DE I
NSETO
S
34
CHDAm
GM
C B
7
Am
GM
C B
8
100
AmG
MC B
9
54
AmGM
C B6
95
AmGMC B10
100CgGOX
TcGMC B582DmGMC B2 CG9509
DmGMC B3 CG9512
89
AgGMC B4 iso4
AgGMC B4 iso3
77
AgGMC B4 iso2
AgGMC B4 iso1
66
100
96
63
82
5044
NINAG
52
Dm
EO B1 CG
9504
Anig G
OX
Pam
a GO
XA
ory G
OX
100
100
0.1
81
diminuição de oxigênio no intestinado inseto, a produção de H2O2, e a
degradação de compostos fenólicos [27,110–112]. Nas glândulas labiais de
Helicoverpa zea, por exemplo, uma glucose-oxidase (GOX) estava presente na
saliva e no lúmen do intestino médio do inseto[110]. Esta GOX teve atividade
contra 20 tipos de carboidratos, com eficiência enzimática superior a GOX
fúngicas [110]. Por outro lado, enzimas contendo estes domínios de GMC
redutase também foram reportadas como enzimas que participam na formação
da cutícula de insetos [113]. Portanto, o papel de CgGOX-1 na biologia do
cupim permanece não elucidado.
1.5.8.2. Desenvolvimento de uma biopilha a partir de CgGOX-1 e glicose
de bagaço de cana de açúcar
O pellet proveniente da lise celular contendo CgGOX-1 foi utilizado
através de uma parceria com pesquisadores do LNBio (CNPEM) onde a
proposta foi auxiliar um trabalho de conclusão de curso de alunos de nível
técnico em química para o desenvolvimento de uma bateria biológica feita a
partir de glicose obtida da hidrólise do bagaço de cana de açúcar, uma solução
isotônica e eletrodos de carbono.
As pilhas são dispositivos que possuem dois eletrodos e um eletrólito
onde ocorrem reações de oxirredução espontâneas, gerando então corrente
elétrica. O eletrodo positivo é chamado de cátodo e é onde ocorre reação de
redução, o eletrodo negativo é o ânodo, onde há reações de oxidação [114]. A
tensão elétrica (volt) é uma diferença entre o potencial elétrico entre dois
pontos, e de forma comparativa, seria a força necessária para movimentar os
elétrons e criar assim uma corrente elétrica. Esta diferença de potencial pode
representar uma fonte de energia (uma força eletromotriz) [114]. A amperagem
é intensidade de uma corrente elétrica em amperes (A), e a potência (watt) é a
capacidade de uma fonte de tensão elétrica realizar um trabalho por unidade
de tempo [114].
As pilhas utilizadas atualmente poluem o meio ambiente devido ao uso
82
de metais pesados em sua formulação, portanto, isto justifica os estudos de
fontes renováveis para a elaboração de biopilhas [67]. Neste contexto, o
desenvolvimento de biopilhas ou células elétricas de biocombustíveis envolve a
aplicação de enzimas ou microrganismos na oxirredução de algum
biocomponente utilizado como combustível e um agente oxidante em contato
com eletrodos, gerando então eletricidade [67]. Esta eletricidade é
principalmente gerada através da oxidação enzimática de moléculas como, por
exemplo, a glicose acoplada à redução de O2 molecular em H2O2 [115].
Neste contexto, a capacidade de CgGOX-1 de oxidar a glicose
proveniente de biomassa lignicelulósica foi investigada. Um sistema de
obtenção de energia elétrica foi desenvolvido sendo caracterizado como uma
biopilha de glicose 2G e uma GOX originária de inseto, classe de proteína
nunca antes investigada para esta finalidade (Figura 26)
Figura 26 - Confecção da biopilha de glicose. A imagem foi cedida pelos colaboradores do projeo.
Na ausência da solução de enzimas (tempo zero) os níveis de tensão e
83
corrente foram medidos. Não foi detectada tensão elétrica, mas detectou-se
corrente elétrica de 0,5mA (Figura 27). Ao adicionar-se a solução de CgGOX-1
ocorreu um aumento significativo da corrente e da tensão elétrica (0,23V e
17,3mA) (Figura 27). A tensão elétrica máxima alcançada foi de 0,4V no tempo
de 30 minutos de reação e a maior corrente elétrica foi observada foi aos cinco
primeiros minutos da reação, com valores de até 17,6mA (Figura 27). Tanto a
tensão como a corrente elétrica não foram perfeitamente estáveis durante o
ensaio, além disso, controles negativos para ausência de glicose ou da solução
enzimática não geraram energia elétrica (dados não mostrados).
Figura 27 - Análise da produção de energia elétrica a partir da biopilha composta com o sistema (CgGOX-1+ glicose de BEX sacarificado + eletrodos de carbono). O tempo total de produção de energia foi de 140 minutos, onde os valores de corrente (mA), potência (mwatt) e tensão elétrica (volt) foram aferidos com multímetro. A tabela na imagem traz a média aritmética das leituras de cada grandeza medida.
A maioria absoluta das células elétricas de biocombustíveis apresentam
baixas tensões, geralmente menores que 1V [115]. Isto é devido ao fato de
termodinâmica das reações catalisadas e limitações na transferência dos
elétrons [115]. Mesmo assim, a necessidade de se desenvolver baterias
sustentáveis e seguras é de suma importância. Os valores gerados pela
biopilha de CgGOX-1 (média aritmética de 0,31V; 9,4mA e 2,9mwatt)
encontram-se similares aos reportados em literatura, onde apenas o tempo de
84
duração é inferior [114–116]. Mesmo sem a alimentação com oxigênio puro ou
a adição de enzimas do tipo lacase no cátodo, como reportado em literatura
[115], o oxigênio ambiente foi capaz de promover a geração de corrente
elétrica.
O fator limitante da invenção, provavelmente foi a indisponibilidade de
cofator NAD+ para a atividade enzimática de CgGOX-1 durante mais tempo.
Este fator poderia ser contornado adicionando-se um sistema enzimático de
regeneração de NADH, como por exemplo, as xiloses redutases, uma vez que
no hidrolisado de bagaço de cana há também a presença de xilose [117].
É importante ressaltar que a aplicação da enzima para esta finalidade,
tratou-se principalmente de um trabalho de extensão, pois foi o tema de
tralhado de conclusão de curso de alunos da escola Técnica Estadual
Conselheiro Antonio Prado (ETECAP), na área de química, sob a orientação da
Professora Erica G. B. Bortolotti e Ana Carolina de Mattos Zeri.
1.5.9. CgADH-1 - Álcool desidrogenase
Esta enzima foi amplificada partir do cDNA de C. gestroi e encontra-se
clonada em PET28a em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). As
análises em SDS-PAGE 12% revelaram que a enzima foi produzida após a
indução com IPTG no cultivo das células (Figura 28A). 0,5mg de CgADH-1 foi
obtida após sua produção e purificação por IMAC, onde, é possível identificar a
banda de expressão em torno de 37kDa. (Figura 28 B). A enzima foi purificada
através de GF, contudo não foram realizadas análises de SDS-PAGE para esta
fração (dados não mostrados).
85
Figura 28 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgADH-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). A Enzima foi expressa a 12ºC, 120rpm por 24 horas. (A) Coluna M: Padrão de peso molecular (ThermoScience); Coluna 1: Cultivo de E. coli antes da indução com IPTG; coluna 2: Cultivo de E. coli após 24 horas de indução com IPTG. (B) Análise após a lise celular e purificação do sobrenadante através de IMAC. Coluna Mw: Padrão de peso molecular (ThermoScience) 1: lisado; 2: pellet; 3: flowthrough; 4-5: Lavagens da coluna. 6: Eluição com Imidazol 200 mmol. A seta indica a enzima.
O melhor match encontrado no banco de dados do NCBI para CgADH-1
foi um álcool desidrogenase de cadeia média (MDR) do tipo prostaglandina
redutase 1 (Figura 29). As enzimas do tipo álcool desidrogenase de cadeia
média (MDR) são proteinas zinco-dependente que possuem um domínio do
tipo Rossmann ligante de NAD(P), e um domínio catalítico do N-terminal [118].
MDRs são classificadas como membro da família AA3.3 do banco de dados
CAZy [27]. Além disso, MDRs são capazes de catalisar a oxido redução de
grupamentos hidroxila de açucares, esteroides, prostaglandinas e nitroalkeno
gerando H2O2 como co-produto [118].
A
)
B
)
A) B)
86
Figura 29 - Domínio conservado identificado na sequencia de aminoácidos correspondente à ORF(CgADH-1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
Em vias gerais, prostaglandinas redutases participam da resposta
imunológica de eucariotos [119,120]. Por exemplo, a prostaglandina redutase-1
em humanos, é capaz de reduzir nitro-alquenos produzidos durante uma
reposta imune exacerbada, diminuindo assim sua reatividade eletrofílica e
consequentemente a inflamação [119,120].
Nos cupins, a mesma enzima homóloga chamada de nitroalqueno-
redutase, é capaz de detoxificar os nitro-alquenos sintetizados pelo próprio
cupim em suas glândulas frontais [121]. As funções de nitro-alquenos nos
cupins são relacionadas com o sistema de defesa química ou na síntese de
feromônios destes insetos [121].
Em relação à aplicação biotecnológica desta enzima, a Figura 30
demonstra que CgADH-1 foi capaz de suplementar coquetéis enzimáticos para
a sacarificação de bagaço de cana de açúcar com um aumento de 28% de
liberação de açucares redutores em 24 horas. Pode-se considerar que o
princípio deste aumento, esteja relacionado ao sinergismo oxidativo similar ao
encontrado por CgAKR-1 (Capítulo 4).
87
Ac
úc
ar r
ed
uto
r (
g/L
)
C g AD H -1 ® C e llu c la s t ® C e llu c la s t
+
C g AD H -1
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
4 h o ra s
2 4 h o ra s
*G S
1 .2 5
*G S
1 .2 8
Figura 30 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). As reações foram realizadas em pH 5,5 durante 4 e 24 horas de hidrólise a uma temperatura de 30°C e agitação de 1000rpm. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART) onde GS é o grau de sinergismo. Os testes foram feitos em triplicata. O teste t de student foi realizado e os resultados que apresentam (*) possuíram significância estatística.
Em relação a isto, o grupo de Michael E. Scharf através de trabalhos de
transcriptômica e proteômica de cupins, identificaram ADHs anotadas com a
mesma atividade de prostaglandina redutase de CgADH-1 [53,54].. Estas
ADHs tinham relação com a presença de lignina na dieta dos cupins, sugerindo
potencial função assim como as AKRs reportadas [53,54].
88
1.5.10. CgCAT-1 – Catalase
A enzima foi clonada e expressa em sistema ArcticExpress (DE3). As
análises de SDS-PAGE 12% demonstram que a purificação em IMAC e GF
foram eficazes (Figura 31). A banda de expressão de CgCAT-1 foi próxima ao
peso molecular de 57,7kDa predito para a proteína. A enzima foi bem expressa
com aproximadamente 1,0mg de proteína/ L de cultivo.
Figura 31 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgCAT-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). A Enzima foi expressa a 12ºC, 120rpm por 24 horas. (A) Purificação através de IMAC; Linha MW: Padrão de peso molecular (ThermoScience); 1: lisado; 2: pellet; 3: flowthrough; 4-6: Frações de IMAC. (B). As frações de IMAC foram finamente purificadas através de GF; linhas 1-3: CgCAT-1. A seta indica a enzima purificada.
CgCAT-1 foi alocada no clado três da família de catalases do tipo heme;
que são encontradas em procariontes e eucariontes, envolvidas na proteção
das células contra os efeitos tóxicos de peróxidos [122]. Estas catalases
promovem a conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio
molecular, ou utilizando este peróxido de hidrogênio para oxidar vários
substratos, tais como álcoois e fenóis [122]. CgCAT-1 possui um sítio de
ligação ao NADPH (Figura 32), o que é comum em catalases do clado 3 [123].
O sítio de ligação a NADPH em catalases é reportado por conferir estabilidade
e prevenir que esta enzima seja desnaturada pelo substrato H2O2 [123].
O melhor match encontrado no banco de dados do NCBI para CgCAT-1
B
) )
B) A)
89
foi uma catalase encontrada no cupim R. flavipes (GenBank: AFV36369. 1) [39]
possuindo 95% de similaridade de bases nucleotídicas com CgCAT-1.
Figura 32 - Domínio conservado identificado na sequencia de aminoácidos correspondente à ORF(CgCAT-1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
90
1.5.10.1. Caracterização Bioquímica de CgCAT-1
Ensaios enzimáticos com Amplex red, demonstraram que a enzima era
funcional (Figura 33). A enzima possuía atividade específica de 83U/mg nas
condições padrões do teste. Ao realizar um comparativo com catalases de
mamíferos, a atividade de CgCAT-1 é semelhante a catalase de humanos,
tendo esta 93 U/mg [124].
%
H2
O2
C g C A T 1
+
2 0 µ M H 2 O 2
P a d r ã o C a t a la s e ( 0 ,2 5 U /m L )
+
2 0 µ M H 2 O 2
2 0 µ M H 2 O 2
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 33 - Detecção da atividade de catalase através do ensaio com o reagente Amplex Red. Todas as reações inicialmente continham 20µM de H2O2 como substrato em tampão fosfato pH 7,0 a 100mM. 25µL de CgCAT-1 (reação) ou Catalase do kit comercial (Padrão - 0,25 U/mL) foram adicionadas as reações e incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente. Ao final das reações, 50µM de Amplex red e 0,2U/mL de HRP reação foram adicionados e as amostras foram incubadas novamente por 30 minutos. Ao final, a fluorescência foi medida em um leitor de microplacas (Tecan) a 590nm. A atividade de CgCAT-1 foi calculada comparando-se a atividade com a catalase fornecida pelo kit (0,25U/ml) em relação ao branco da reação contendo somente H2O2. Todos os ensaios foram feitos em triplicata.
Tartar (2009) e Sethi (2013) [39,53] em seus estudos de metagenômica
e enzimologia combinatória verificaram que catalases de cupins eram
expressas em resposta a dietas ricas em ligninas, em especial uma e enzima
identificada como CAT ([contig 01463 - JX513905) que aumentou a hidrólise
de madeira de pinho por celulases de R. flavipes. Porem esta mesma enzima
91
apresentou antagonismo com AKRs e lacases durante a suplementação de
celulases [39]. Esta enzima apresentou baixo sinergismo com as celulases do
cupim para a hidrólise de PASB, portanto, mais estudos serão necessários
para comprovação de sua atividade sinergistica (dados não mostrados).
Esta classe de catalases também são superexpressas em fungos
filamentosos, bem com em outros insetos degradadores da madeira durante a
degradação da lignocelulose como uma forma de proteção contra a
degradação oxidativa da lignocelulose [71,125].
1.5.11. CgLAC-1 – Lacase
A enzima foi clonada e expressa em sistema ArcticExpress (DE3). As
análises de SDS-PAGE 12% demonstram a obtenção da enzima purificada
(Figura 34). A banda de expressão de CgLAC-1 foi próxima ao peso molecular
de 71,2kDa predito para a proteína. Contudo, a produção de lacases em
sistema heterólogo geralmente resulta em baixos níveis de expressão [126], o
que foi verificado também para CgLAC-1, com obtenção de aproximadamente
0,5mg de proteína/ L de cultivo.
Figura 34 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgLAC-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). A Enzima foi expressa a 12ºC, 120rpm por 24 horas. (A) Purificação através de IMAC; Linha MW: Padrão de peso molecular (ThermoScience); 1: lisado; 2: pellet; 3: flowthrough; 4-6: Frações de IMAC. (B). As frações de IMAC foram
B) A)
92
finamente purificadas através de GF; linhas 1-3: CgLAC-1. A seta indica a enzima purificada.
CgLAC-1 é referente a uma lacase endógena de C. gestroi e os
domínios identificados pelo NCBI revelaram alta especificidade para lacases
de insetos (Figura 35). A família de oxidases dependentes de cobre incluem as
lacases de insetos, que oxidam uma ampla gama de substratos, como
polifenóis e fenildiaminas [127]. O melhor match encontrado no banco de
dados do NCBI para CgLAC-1 foi a enzima RfLacA de R. flavipes
(ACX54558.1) [95], possuindo 84% de similaridade de aminiácidos com
CgLAC-1.
Algumas oxidases dependentes de cobre de insetos, como a AgMCO3
de mosquitos, podem oxidar moléculas tóxicas da dieta sanguínea destes
insetos, e assim, direcionando-os para excreção [127]. Porém em cupins
inferiores, como o R. flavipes, foram encontrados duas isoformas de lacases
evolutivamente exclusivas [52,95]. Estas lacases que possuem alta
similaridade com CgLAC-1, e possuíram atividade de phenoloxidase [95]. Estas
enzimas foram localizadas nas glândulas salivares e no intestino anterior de R.
flavipes. A caracterização bioquímica destas lacases revelaram que estas
proteínas realizam modificações na lignina, que incluíram a desmetilação,
hidroxilação e despolimerização através de oxidação de cadeia lateral destes
compostos fenólicos [95].
93
Figura 35 - Domínio conservado identificado na sequência de aminoácidos correspondente à ORF(CgALOX-1), após comparação com o banco de dados do NCBI pela ferramenta BLASTp.
1.5.11.1. Caracterização bioquímica de CgLAC-1
CgLAC-1 foi capaz de oxidar o pirrogalol com baixa atividade específica
(0,034 U mg-1), porém na presença de 20mM de H2O2 CgLAC-1 recombinante
foi capaz de oxidar o pirrogalol com 13,1 vezes mais eficiência (0,55 U mg-1)
(Figura 36). O teste foi validado com uma lacase comercial e observou-se para
esta enzima, atividade apenas na presença de peróxido de hidrogênio (0,70 U
mg-1). RfLacA de R. flavipes, é reportada por ter atividade enzimática de 1,48
U mg-1 [95]. Esta diferença pode ser atribuída pela diferente padronização da
reação e enzimática e o uso de células de insetos como sistema de expressão
recombinante, conferindo as corretas modificações pós traducionais para este
enzima.
A enzima não demonstrou atividade enzimática para a oxidação de
ABTS (dados não mostrados). Da mesma forma, Coy (2010) [95] reporta que
RfLacA também não apresentava atividade contra o ABTS devido a presença
de uma causa C-terminal de histidina adicionada a proteína para facilitar sua
purificação, o que também ocorre com CgLAC-1.
94
Ati
vid
ad
e e
sp
ec
ífic
a
(µ
mo
l/m
in.m
g)
C g L A C -1 C g L A C -1 + H 2 O 2 L a c a se
(N o v o z y n )
L a c a se
(N o v o z y n )
+ H 2 O 2
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
Figura 36 - A atividade CgLAC-1. A reação era composta de 240µl de solução tampão fosfato 100mM pH 7,0 contendo ou não 20 mM de H2O2; 10µl de CgLAC-1 (0,240mg/mL) ou lacase comercial (novozyn 0,04mg/mL). A reação foi iniciada adicionando-se 1µM de pirogalol e a o aumento da absorbância em 420nm foi medido durante 10 minutos à temperatura ambiente. As absorbâncias das reações foram subtraídas de brancos contendo ou não H2O2. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. O cálculo enzimático foi calculado através da lei de Lambert-beer com o coeficiente de extinção molar de 39,4 M cm-1 para o pirogalol.
1.5.11.2. Suplementação de ®Celluclast 1,5L com CgLAC-1
A Figura 37 demonstra que CgLAC-1 foi capaz de suplementar
coquetéis enzimáticos para a sacarificação de bagaço de cana de açúcar com
um aumento de 39% de liberação de açucares redutores em 24 horas de
ensaio.
95
Ac
úc
ar r
ed
uto
r (
g/L
)
C g L AC -1 ® C e llu c la s t ® C e llu c la s t
+
C g L AC -1
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
4 h o ra s
2 4 h o ra s
G S
1 .0 7
*G S
1 .3 9
Figura 37 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). As reações foram realizadas em pH 5,5 durante 4 e 24 horas de hidrólise a uma temperatura de 30°C e agitação de 1000rpm. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART) onde GS é o grau de sinergismo. Os testes foram feitos em triplicata. O teste t de student foi realizado e os resultados que apresentam (*) possuíram significância estatística.
Lacases podem ser utilizadas para aumentar o rendimento da
sacarificação de biomassas ricas em lignina, bem como, atuar detoxificando
hidrolisados hemicelulósicos, uma vez que esta enzima é capaz que quebrar
os anéis aromáticos da lignina, otimizando assim os processos hidrolíticos
fermentativos [11,128].
Até o presente momento, a única aplicação de lacases endógenas de
insetos foi reportada por Sethi (2013) [129] onde, RfLacA piorou a hidrólise de
madeira de pinho. Contudo, a abordagem utilizada não era considerada ideal
para lacases, como por exemplo, a não adição de mediadores e a falta de
testes de concentração ótima. Desta maneira, CgLAC-1 pode apresentar
potencial se utiliza de maneira correta para sacarificação e detoxificação de
96
biomassa.
1.6. Discussão Geral
Por quase um século acreditava-se que as enzimas hidrolíticas de
simbiontes do trato digestivo posterior do cupim eram as principais
responsáveis pela digestão da lignocelulose [51]. Contudo, na última década,
mais de 85 publicações sobre transcriptômica, metatranscriptôma e estudos de
enzimologia integrativa nestes insetos, demostraram que estes organismos
possuem um arsenal endógeno de enzimas ativas em carboidratos essenciais
para a sua sobrevivência e de seus simbiontes [74,130].
A fim de criar-se uma hipótese mais atual, a Figura 38 traz um esquema
de como as enzimas descobertas poderiam auxiliar o cupim durante a
degradação da lignocelulose, de modo que, trabalhos sobre C. gestroi e outros
cupins inferiores foram utilizados em conjunto com os dados deste trabalho de
mestrado para elaboração do esquema.
Inicialmente, a digestão da lignocelulose no cupim começa com a
fragmentação desta através de suas mandíbulas [51]. Após a moagem deste
material, enzimas irão agir sobre este material descontruindo por completo a
lignocelulose [51]. Neste sentido, além da ação de GHs, há uma hipótese de
degradação oxidativa da lignocelulose nos cupins, que é reforçada por diversos
fatores: 1) No intestino anterior de cupins, há uma quantia substancial de
metais reativos (ex: Fe2+) [131,132], pH ácido [51], alto potencial oxidativo [51]
e a possível existência de um sistema de exportação/geração de ROS para o
lúmen intestinal em insetos [133] (Figura 38). Além do mais, modificações de
origem oxidativa no material digerido por cupins já foram reportadas [134].
Também há evidencias de uma resposta do cupim contra os xenobióticos da
lignocelulose, tais como moléculas derivadas da lignina e grupamentos acetila
da hemicelulose, através de enzimas redox endógenas, tanto intra como
extracelulares, que em hipótese atuam em conjunto durante a degradação da
lignocelulose [5,53,72–74,95,129,130,135–137].
97
Sabe-se que lacases secretadas pelas glândulas salivares de cupins
inferiores [72,95], esterases [138] e citocromo oxidases [139] expressas no
intestino médio, promovem modificações na lignina e diminuem a recalcitrância
da lignocelulose.
Entretanto, neste trabalho, evidenciamos outras enzimas com potencial
de participar na digestômica de cupis inferiores. Dente elas, uma LPMO da
família AA10 (CgAA10-2) foi encontrada sendo expressa no cupim, portanto, é
especulado que esta enzima faça parte da digestômica do cupim inferior, de
maneira que esta poderia promover a quebra oxidativa da celulose [65] (Figura
38). Além disso, SODs, AKRs, ALOXs, GOXs e CATs podem compor o arsenal
enzimático endógeno destes cupins para a degradação e detoxificação da
lignocelulose de sua dieta [16,39,111,129,140–142] (Figura 38). Mais análises,
como por exemplo imunolocalizações, serão necessárias para confirmar esta
hipótese.
Após este pré-tratamento oxidativo, no intestino anterior e médio, o
cupim faz o uso de hidrolases como endoglucanases (ex:CgEG-1 - GHF-9) e β-
glicosidases (ex:CgBG-1 - GHF-1) para cooperar com a sacarificação da
lignocelulose, além de outras celulases simbiônticas [51,73] (Figura 38).
No intestino posterior do cupim, as celobiohidrolases (ex: CgSymGH7-1)
e várias enzimas hemicelulolíticas para completa degradação dos
polissacarídeos neste inseto são produzidas pelos simbiontes [51,102] (Figura
38). Por final, os monossacarídeos gerados derivados da lignocelulose, são
convertidos em ácidos graxos de cadeia curta, sendo então absorvidos pelo
cupim como molécula base de toda sua nutrição [51].
98
Figura 38 - Exemplificação do digestoma de cupins inferiores. A hipótese tem base em dados reportados em literatura citados no durante a discussão, e a inclusão das enzimas estudadas neste trabalho.
99
Desta forma, as enzimas auxiliares de C. gestroi poderiam ser aplicadas nas
biorefinarias conforme exemplificado na Figura 39.
Figura 39 – Mecanismos propostos de atuação das enzimas auxiliares redox de C. gestroi aplicáveis em biorefinarias.
O trabalho desenvolvido possuiu algumas limitações, como o uso de um
sistema procariótico de baixo rendimento, a falta de termoestabilidade de
algumas das proteinas obtidas e o uso de cofatores de alto custo para
processos de sacarificação. Contudo, técnicas de engenharia de proteinas para
a atribuição de termoestabilidade ou a troca da ligação e dependência de
cofatores como o NAPDH por outras entidades doadoras de elétrons para
geração de EROS, poderia otimizar a ação destas enzimas para a
sacarificação. Além disso, estas enzimas poderiam ser industrialmente obtidas
a partir de sua expressão por fungos filamentosos, visando maior produção e
acarretando sua viabilidade econômica. Mesmo com estas limitações, a
contribuição para o maior entendimento da biologia do cupim e a demonstração
de seu potencial biotecnológico demonstrou o sucesso alcançado através dos
objetivos deste trabalho.
100
CAPÍTULO 4 – ARTIGO EM PREPARAÇÃO
The Coptotermes gestroi aldo-keto reductase: a multipurpose enzyme for biorefinery applications
Robson Tramontinaa,b
; João Paulo Franco Cairoa; Marcelo Liberato
a; Fernanda
Mandellia; Amanda Sousa
a,b; Samantha Santos
a; Sarita Cândida Rabelo
a; Bruna
Camposc; Jaciane Ienczak
a; Roberto Ruller
a; André Damásio
d; Fabio Squina
a*
a Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), Centro
Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), Campinas, SP, Brazil
b Programa de Pós Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos
Bioativos (BTPB) - Instituto de Biologia - CP 6109, Universidade Estadual de
Campinas – UNICAMP - 13083-970, Campinas, SP, Brasil.
c Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), from the Brazilian Center
for Research in Energy and Materials (CNPEM), Campinas, Brazil
d Department of Biochemistry and Tissue Biology, Institute of Biology,
University of Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, Brazil
*Corresponding author: Fabio Marcio Squina, [email protected],
Phone: +55 19 35183111 Fax +55 19 35183164. Rua Giuseppe Máximo Scolfaro, nº
10000, Campinas, SP - 13083-970, Brazil
101
Abstract
Background: In nature, termites can be considered as a model biological system for
biofuel research based on their remarkable efficiency for lignocellulosic biomass
conversion. Redox enzymes are of interest in second-generation ethanol production
because they promote synergic enzymatic activity with classical hydrolases for
lignocellulose saccharification and inactivate fermentation inhibitory compounds
produced after lignocellulose pretreatment steps.
Results: In the present study, the biochemical and structural characteristics of the
Coptotermes gestroi aldo-keto reductase (CgAKR-1) were comprehensively
investigated. CgAKR-1 displayed major structural differences compared with others
AKRs, including the differences in the amino acid composition of the substrate-binding
site, providing basis for classification as a founding member of a new AKR subfamily
(family AKR1 I). Immunolocalization assays confirmed CgAKR-1 expression in
termites and the localization of this enzyme in the salivary gland and foregut. CgAKR-1
supplementation promoted the reduction of phenolic aldehydes, which act as
fermentation inhibitors of hemicellulosic hydrolysates, and improved ethanol
fermentation by the xylose fermenting yeast Scheffersomyces stipisis. Moreover, we
observed synergistic enzymatic interactions between CgAKR-1 and commercial
cellulosic cocktail for sugarcane bagasse saccharification. Our data indicated that
additive enzymatic activity could be mediated by reactive oxygen species because
CgAKR-1 could produce hydrogen peroxide.
Conclusion: In summary, we identified the founding member of an AKRI subfamily
with a potential role in the termite digestome. CgAKR-1 was found to be a multipurpose
enzyme with potential biotechnological and bioproduct applications. The present work
102
provided a basis for the development and application of integrative and multipurpose
enzymes in the bioethanol production chain.
Keywords: Coptotermes gestroi; aldo-keto reductase; bioethanol; detoxification;
saccharification; fermentation; integrative; reactive oxygen species; pro-oxidant,
antioxidant, and detoxification enzymes; immunolocalization
Background
Lignocellulose is a recalcitrant matrix composed of cellulose, hemicellulose, and lignin,
and a complex set of enzymes are required for efficient conversion of these plant cell
wall polymers [1]. Termites can degrade almost 90% of consumed plant biomass and
can provide an excellent biological system for studying the biochemical conversion of
lignocellulosic biomass [2,3]. The gut of Coptotermes gestroi (Rhinotermitidae) and
other termites has specialized evolutionary adaptations to digest lignocellulosic diets
[4]. In the termite gut, carbohydrate-active enzymes (CAZymes), such as cellulases and
hemicellulases, are expressed (i.e., both symbiotic and endogenous enzymes).
Additionally, a set of pro-oxidant, antioxidant, and detoxification enzymes (PADs) is
also present [5-7]. Among the PADs found in termites, superoxide dismutase (SOD),
catalases (CATs), glutathione S-transferase (GST), and aldo-keto reductases (AKRs)
have been studied in detail because the transcription of these enzymes is upregulated in
response to lignocellulose degradation [8].
One of the major bottlenecks for second-generation ethanol production is the
toxic metabolites produced after lignocellulose pretreatment [9]. Different
103
lignocellulose pretreatments, such as hydrothermal, steam explosion, and dilute acids,
are required to minimize biomass recalcitrance, alter the biomass structure, and enhance
the enzymatic degradation of lignocellulose [10]. However, during lignocellulosic
biomass pretreatment, several chemical by-products are generated, which inhibit
fermentative microorganisms and lignocellulolytic enzymes [11]. These chemicals
include aldehydes, aliphatic acids, furan derivatives, and phenolic compounds, such as
hydroxybenzoic acid, furfural, and hydroxymethylfurfural (HMF) [9,12,13]. For
example, the presence of furfural can strongly inhibit the growth of many yeast strains
by cell wall and membrane damage, enzymatic activity inhibition, DNA damage, and
protein and RNA synthesis [13,14].
Physicochemical and biological strategies are being developed to minimize the
effects of these inhibitors on enzymatic and microbial activity for second-generation
ethanol [11]. Recently, Liu et al. [15] highlighted the importance of developing an easy-
to-handle in situ detoxification method combined with a fermentation process in order
to produce second-generation ethanol from low-cost lignocellulosic biomass. However,
except for microbial laccases and peroxidases, in-situ use of enzymatic cocktails for
simultaneously detoxification/saccharification of plant biomass has not been reported
frequently [10]. Therefore, PADs and related enzymes may have many applications in
the detoxification of lignocellulosic hydrolysates [8,11,16,17].
In studies of the oxidoreductive mechanisms that can improve lignocellulose
biomass saccharification, laccases, peroxidases, and auxiliary enzymes (AAs) have been
extensively investigated as bacterial and fungal proteins that utilize extracellular redox
and aromatic mediators for lignocellulosic activity [10, 18-21]. These enzymes enhance
104
biomass hydrolysis by acting on the recalcitrance of woody materials by direct or
indirect oxidation of holocellulose [22-24].
The involvement of redox enzymes in lignocellulose modification and
degradation in the termite digestome has not been fully elucidated [2,7,25-27]. Previous
studies have shown that enzymes related to redox reactions and detoxifying metabolism
could improve the ability of termites to digest a lignocellulosic diet. For example,
hydrogen peroxide is produced in the guts of Coptotermes formosanus and
Zootermopsis nevadensis [26,28]. Additionally, a substantial amount of reactive iron is
present in the guts of lower termites [28], and the pH is acidic in the foregut of lower
termites, with high potential for generation of reactive oxygen species [2]. All of these
factors are favorable for the formation of highly reactive radicals, which could
oxidatively degrade lignocellulose and provide synergistic enzymatic interactions with
endoglucanases and beta-glucosidases to improve plant cell wall degradation [29].
Sethi et al. [30] showed that AKR transcription from the termite Reticulitermes
flavipes was upregulated in response to a lignin-rich diet. Furthermore, AKR has been
shown to act synergistically with glycoside hydrolases (GHs) to enhance pine wood
hydrolysis [30]. The AKR superfamily of proteins is known to catalyze the NAD[P]H-
dependent reduction of various carbonyl-containing compounds to their corresponding
alcohols, and systematic nomenclature for the AKR superfamily has been in place since
1996 (www.med.upenn.edu/akr) [31]. Moreover, AKRs are involved in several
metabolic reactions in different organisms, including carbohydrate degradation,
xenobiotic detoxification, degradation of β-aryl ethers in lignin, and various industrial
and clinical applications [32-34].
105
In this work, we describe the AKR from the termite C. gestroi (CgAKR-1), a
founding member of a new AKR subfamily of potential biotechnological interest, which
may play an important role in termite adaptation to wood feeding. Furthermore, to the
best of our knowledge, this is the first report in the literature to describe the use of AKR
for detoxification of fermentation inhibitors during C5 ethanol fermentation and
provides a basis for understanding the synergistic enzymatic interactions of AKRs with
cellulases that improve lignocellulose saccharification.
Results and Discussion
CgAKR-1 was a founding member of a new AKR1I subfamily
Recently, several research groups have investigated the termite digestome,
hypothesizing that auxiliary redox mechanisms may be involved in lignocellulose
degradation [5,30,35-37]. Among these studies, Sethi et al. [30] reported that an AKR is
upregulated after the termites consume a lignin-rich diet. This enzyme was also reported
to show synergism with GHs for lignocellulose deconstruction [30]. However, few
details of the biochemical and structural properties of termite AKR have been reported
[30]. In addition, unpublished data from our group have revealed that AKR transcripts
are abundantly expressed in C. gestroi worker castes when consuming a diet based on
in-natura sugarcane bagasse (BIN), suggesting that some AKRs from C. gestroi are
highly expressed in response to complex lignocellulosic substrates.
The predicted open reading frame (ORF) of CgAKR-1, based on transcriptomics
data, contained 334 amino acids (GenBank accession number: KU686221). The domain
architecture evaluation performed by comparison of the CgAKR-1 protein sequence
with the PFAM database indicated the presence of a conserved domain from the AKR
106
superfamily. Moreover, a comparison of the predicted protein CgAKR-1 with the NCBI
database indicated higher similarity to a protein from C. formosanus (97% identity,
accession number AGM32584.1 [1AKR]). According to data from the AKR
superfamily homepage, AKRs are found in both prokaryotes and eukaryotes and are
distributed among 16 families [38]. A phylogenetic tree was constructed based on the
amino acid sequence, and CgAKR-1 was clustered in an unaffiliated clade and
classified as a novel AKR family (Figure 1). According to the nomenclature
specifications, CgAKR-1 was a founding member of the new subfamily ―AKR1 I‖ [38].
The most related and well-characterized family members in this database are human
AKR (AKR1A1) and nematode AKR from Caenorhabditis elegans (AKR1G1) [38].
Generally, members of the AKR1 family have broad specificity for aldehydes, are
cytosolic and monomeric proteins, and interact strongly with NADPH as a cofactor
[33,38].
107
Figure 1 - Phylogenetic tree of members of the AKR superfamily. Amino acid
sequences (AKR1 family) were found in the AKR database
(https://www.med.upenn.edu/akr/), and CgAKR-1 and a related termite AKR sequence
(AGM32584.1) were added. The dendrogram was generated as described by Hyndman.
[38] The tree was constructed with the neighbor-joining method implemented in
MEGA6.0 using 1000 bootstraps. The evolutionary distances were computed using the
JTT matrix-based method and are presented as the number of amino acid substitutions
per site. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6
108
The gene encoding CgAKR-1 was successfully cloned in Escherichia coli
ArcticExpress DE3 competent cells, and the soluble enzyme was purified by affinity
and size exclusion chromatography steps with high enzyme yield (25 mg/L of cell
culture; see Additional File 1, Supplementary Figure 1 ).
CgAKR-1 was primarily localized in the termite foregut region
The detection of nonsymbiotic phenoloxidase activities in termites has already
been described, supporting the oxidative degradation of lignin and cellulose in the gut
of termites [3,36]. However, elucidation of the redox mechanisms in the termite
digestome is necessary. Accordingly, we next investigated the immunolocalization of
CgAKR-1 in the C. gestroi gut for the first time (Figure 2).
Figure 2 - Immunolocalization of CgAKR-1 in C. gestroi gut tissues. Gut tissues
were incubated with primary anti-CgAKR-1 antibodies and AlexaFluor 568 secondary
109
antibodies and observed under a Leica DMI 6000 microscope. Red fluorescence
indicates anti-CgAKR-1 antibody binding; grey represents the gut visualization under
white light; and blue fluorescence represents the nucleus in all cells using ProLong
Antifade Reagent for Fixed Cells. Images from the red, blue, and white channels were
recorded independently and digitally overlaid to produce a final image. Whole gut:
salivary glands (SG); foregut (FG); malpighian tubules (MT); midgut (MG); hindgut
(HG); A (foregut), B (midgut), D (malphigian tubules), and E (hindgut) indicate
multiple layer image analysis.
The interaction between anti-CgAKR-1 antibodies and target proteins in the gut
of C. gestroi was investigated by immunolocalization. After incubation with both
primary and secondary antibodies, the gut tissue showed strong fluorescence mainly
located in the salivary gland and foregut (Figure 2a). In contrast, there was nearly a
completely lack of fluorescence in the middle part of the gut, including the hindgut
(Figure 2d). Strong fluorescence was also observed in the midgut (Figure 2b) and the
junction of the foregut and midgut. The foregut lumen of lower termites has high
oxygen potential and harbors most digestive enzymes [2], such as C. gestroi
endoglucanase (see Additional file 1, supplementary figure 4). Thus, CgAKR-1 would
be expected to be expressed in this gut section. In addition, CgAKR-1 was also detected
in the malpighian tubules attached in the midgut (Figure 2c). To the best of our
knowledge, some PAD enzymes, such as cytochrome oxidase [39], a candidate enzyme
involved in enzymatic detoxification and lignin degradation in termites [37,40], are
expressed in the malpighian tubules.
CgAKR-1 was active against yeast fermentation inhibitor compounds
Recombinant CgAKR-1 showed high affinity for the standard substrate 2-
nitrobenzaldehyde (NBZ), with a Vmax of 2.34 U/mg., Km of 0.15 mmol/L, and Kcat of
7.5 s-1
. In addition, the Kd for cofactor NADPH was 0.06 mmol/L. The specific activity
of CgAKR-1 on NBZ was 1.53 U/mg under optimal conditions at pH 5.7 (Figure 3a)
and 30°C (Figure 3b). This activity level was higher than that reported for
110
Saccharomyces cerevisiae AKR (0.34 U/mg) [41] and lower than that reported for
human AKR1A1 under optimal conditions (2.47 U/mg) [42].
Figure 3 - Biochemical properties of CgAKR-1. (a) Effects of pH on CgAKR-1
activity. Phosphate buffer (pH 3.0–8.0) and Tris buffer (pH 8.5–9.0) were used at 100
mM. The results were expressed as relative activity (%). (b) CgAKR-1 thermostability.
The enzyme was incubated for 30 min at different temperatures. After incubation, the
standard enzyme assay was performed, and the results are expressed as relative activity
(%).
The optimal pH of the enzyme was within the same range found in the gut of
lower termites and was similar to the pH reported for rabbit AKR (pH 5.6) [43].
Notably, however, aldehyde reductases from animals and fungi typically have an
optimal pH at or near neutral [31,34,42,44]. Furthermore, CgAKR-1 was stable in the
range of 20–35°C and maintained residual activity (about 30%) at temperatures from 50
to 80°C; no activity was observed at 90°C (Figure 3b).
Table 1 shows the specificity of CgAKR-1 for different substrates, as measured
by the oxidation of NADPH. The high specificity of CgAKR-1 for 2-nitrobenzaldehyde
has also been reported for various AKRs [43]. In general, the enzyme had high activity
for aromatic and aliphatic aldehydes. No redutase activity was detected for vanillin,
111
aldose sugars, and polysaccharides (data not shown). According to our data, CgAKR-1
was active on several chemicals found in hemicellulosic hydrolysates from sugarcane
bagasse (SCB), such as syringaldehyde, hydroxybenzaldehyde, HMF, and furfural,
which inhibit yeast fermentation [11]. The activity of an intestinal AKR on these
aromatic aldehyde molecules could prevent electrophilic injury caused by these
compounds and would be consistent with the fact that a similar AKR was induced by a
lignin-rich diet in Reticulitermes flavipes [7,33].
AKRs are able to generate H2O2 and other reactive oxygen species (ROS) via
Table 1 - CgAKR-1 substrate specificity. 1
Substrate (2 mmol/L) Relative activity
(%) Structure
Furfural 112
5 – Hydroxymethylfurfural 116
2 – Nitronezaldeihyde 100
4 – Hydroxybenzaldehyde 61
Syringaldehyde 72
Glutaraldehyde 98
*Specific activity was determined as µmoles of NADPH oxidized per minute per mg of protein.
Relative activities of CgAKR-1 using different substrates are presented as the percentage of CgAKR-
1 activity on 2-nitrobenzaldehyde.
2
112
NADPH oxidation [45,46]. We performed in vitro assays to quantify H2O2 production
by CgAKR-1 because H2O2 contributes to lignocellulose deconstruction [47-49].
Amplex Red assays revealed that CgAKR-1 generated 0.55 mmol of H2O2 per minute in
the presence of 0.6 mmol NADPH (Figure 4). Moreover, the H2O2 generated from
CgAKR-1 was able to initiate the Fenton reaction in the presence of Fe2+
, generating the
•OH radical, a powerful oxidant that can be utilized in lignocellulose degradation [49]
(detected by a peroxynitrite sensor [HPF]; see Additional file 1 - Supplementary Figure
6).
Figure 4 - H2O2 production per minute by CgAKR-1 and its cofactor NADPH, as
measured with Amplex Red. All reactions were performed in triplicate in 100 mM
phosphate buffer (pH 5.7) at 37°C.
Thus, we concluded that in addition to its ability to reduce aldehydic
compounds, CgAKR-1 had an NADPH oxidase-like function and could generate ROS,
such as H2O2, during in vitro assays. Moreover, in the presence of reducing agents, such
as Fe2+
, the hydroxyl radical could also be produced through the action of CgAKR-1.
Loop B of CgAKR-1 was longer than that of other AKRs
The three-dimensional structure of CgAKR-1 revealed a conserved structure, known as
the (β/α)8 barrel, within the AKR superfamily [50]. This structure consisted of eight β-
strands in the central region surrounded by eight α-helices (see Additional file 1-
113
supplementary figure 5). The NADP binding site is buried in the protein structure and is
highly conserved throughout members of the AKR superfamily, despite the low
similarity of other regions of the protein [51]. The amino acids W24, N47, Y52, H114,
S166, N167, Y214, I217, S219, K276, S277, R282, E285, and N286 surrounded the
cofactor (Figure 5a). In addition, the catalytic residues were identified as D47, Y52,
K81, and H114 and were also conserved. In general, the amino acid composition of the
substrate-binding sites in AKRs is diverse and confers different substrate specificities to
each AKR subfamily [33]. The inner region of the substrate-binding site was found by
the C-terminal region of the β-strands together with the NADP nicotinamide group, and
the binding site entrance was composed by loops connecting β-strands with α-helices
(Figure 5b).
114
Figure 5 - Sequence comparison and structural assignment. (a) Multiple sequence
alignment of CgAKR with members of the AKR1–5 families. Despite the low identity
between CgAKR and other AKR enzymes, the catalytic residues (red) and the residues
that interacted with the cofactor (blue) had a high degree of similarity. The residues that
surrounded the substrate (yellow) were more diverse between each family, reflecting the
specificity for different substrates. The position that interacted with both the substrate
and cofactor is shown in green. One of the main differences between CgAKR and the
other enzymes was the presence of a longer loop, known as loop B (magenta), located in
the substrate-binding site. (b) Positioning of the important amino acids in the CgAKR
crystallographic structure. The colors in (b) are the same as those in (a).
115
The superposition of CgAKR-1 chain A with AKRs complexed with substrates
indicated that the substrate binding site was delimited by the amino acids W24, M51,
Y52, H114, L115, W128, R229, F314, and M316 (Figure 6a).
Figure 6 - CgAKR-1 structural analysis. (a) Superposition of CgAKR-1 with other
AKRs from different families: 1A1 complexed with 3,5-dichlorosalicylic acid (gray
arrow) in gray (PDBid 3cv7), 1B in blue (PDBid 4hbk), 1C in green (PDBid 1ihi), 1D
in red (PDBid 3buv), 2B in orange (PDBid 1mi3), 4A in yellow (PDBid 1zgd), and 5C
in black (PDBid 1hw6). The loops composed the entrance to the substrate-binding site.
Despite the discernible variations in size and position, CgAKR-1 (magenta) had one
loop (loop B - indicated with a magenta arrow) that was longer than the others. This
loop also contained an arginine (R229) that may interact with the substrate. (b)
Substrate-binding site. The cavity in the CgAKR-1 structure, represented here as a blue
surface, was determined to be the substrate-binding site by comparison with other
substrate-complexed AKRs. Therefore, the pocket was mainly delimited by the cofactor
(NADP) and nine amino acids with different properties, including R229 from loop B
(observed only in CgAKR-1).
116
One major feature of the CgAKR-1 structure was the presence of a longer loop
(known as loop B) between the seventh and eighth β-strands of the barrel (residues
L222 to L242) compared with that of other AKRs (Figure 5b and 6b). This longer loop
also exhibited high mobility based on high B-factor in chain A, which could not be
modeled in chain B owing to the absence of a defined electron density. According to
Barski et al. [33], loop B is part of a ―hot spot‖ for variability between the AKR families
and is responsible for multiplicity of substrate specificity and kinetic properties. In
addition, loop B from AKR1A and AKR1B has an open-and-close movement for
cofactor entrapment [52]. Consequently, the unparalleled long loop B from CgAKR-1
seemed to play an important role, not only in cofactor binding but also in substrate
interaction owing to the arginine (R229) positioned towards the substrate binding site
(Figures 5B, 6A, and 6B).
CgAKR-1 exhibited efficient hemicellulosic hydrolysate detoxification and
improved yeast conversion of xylose to ethanol
CgAKR-1 was added to the hemicellulosic hydrolysate prior to fermentation in order to
validate the detoxification capacity of the enzyme. After the enzymatic detoxification
step, 32% of furfural and 15% of soluble lignin were eliminated (Figure 7a).
Fermentation of the detoxified hemicellulosic hydrolysate by Scheffersomyces stipitis at
over 72 h was also evaluated. There was a 45% increase in ethanol production
compared with that of the control (Figure 7b). Moreover, the growth rate during
fermentation was 9.5 ± 1.3 g/L for the control and 7.8 ± 1.1 g/L for the hydrolysate
treated with CgAKR. Thus, the hemicellulosic hydrolysate detoxification by CgAKR-1
seemed to lead to improved conversion of xylose to ethanol (Figure 7c and Table 2).
117
Figure 7 - Effects of CgAKR-1 on hemicellulosic hydrolysate detoxification
followed by alcoholic fermentation using S. stipitis. The fermentation was carried out
at 30°C and 200 rpm for 72 h. Analysis was carried out by HPLC with three biological
replicates. (a) Amounts of furfural and soluble lignin after detoxification; (b) ethanol
production by S. stipitis; (c) xylose consumption by S. stipitis.
118
According to Wahlbom [53], these inhibitors can cause the depletion of redox
cofactors during fermentation, resulting in slower, decreased ethanol production by
yeast. Moreover, the diversity of inhibitory aldehyde structures reduced by CgAKR-1
indicated that this enzyme was able to enhance alcoholic fermentation of this type of
biomass by the detoxification of furfural and phenolic and aldehyde derivatives from
lignin (Table 1).
The detoxification of hemicellulosic hydrolysates is of biotechnological interest,
and many detoxification methods have been reported in the literature [9,11,14,17,54].
For example, laccases and peroxidases are being applied in the development of
enzymatic cocktails for detoxification of these inhibitors, whereas PAD enzymes have
not being widely used in this area [10,18,19]. These inhibitory effects on fermentation
vary according to their functional groups, while furan aldehydes are less harmful than
lignin-derived aromatic aldehydes, which are found at higher concentrations in
hemicellulosic hydrolysates [11].
CgAKR-1 improved lignocellulose hydrolysis by H2O2 production
Next, we performed essays combining CgAKR-1, CgGH9 (C. gestroi endoglucanase
[55]), and CAT (a commercial catalase that catalyzes the decomposition of H2O2 to
Table 2 – S. stipitis fermentation parameters after hemicellulosic hydrolysate 1
detoxification by CgAKR-1. 2
Control
Experiment
Detoxification
by CgAKR-1
Yp/s (g/g) 0.13 0.19
Y (%) 26.19 37.12
Xylose consumption (%) 85.00 99.28
*Yp/s: xylose conversion factor in ethanol; Y: percentage of ethanol
production 3
119
water and oxygen) in order to evaluate whether the synergism of these enzymes on
barley beta-glucan saccharification could be correlated with ROS generation.
Hydrolysis with CgGH9 released reducing sugars and background H2O2 production
(Figure 8). The addition of CgAKR-1 to CgGH9 improved the hydrolysis of beta-
glucan, with a degree of synergism (DS) of 1.68, generating 17 mmol of H2O2 after a 1-
h reaction. The maximum cooperation between the enzymes was found after 14 h of
hydrolysis (DS: 2.04). However, the addition of a CAT enzyme to this reaction
abolished the synergism and concomitantly led to lower production of H2O2 (Figure 8).
Figure 8 – Effects of H2O2 generation during barley glucan hydrolysis by CgGH9,
CgAKR-1, and a commercial catalase. One hundred nanograms of each enzyme,
NADPH, and 1.0% β-glucan were used in the assays (Mix). The reaction was carried
out at 30°C for 1, 14, or 24 h. The reducing sugars were measured by the DNS method.
H2O2 production was measured with Amplex Red, and the DS was calculated as
follows: (g/L) of reducing sugar of (CgGH9 + enzyme) / (g/l) of reducing sugars of
CgGH9. [80] No hydrolysis was detected by CgAKR-1 in the absence of CgGH9.
120
There were synergistic enzymatic interactions between CgAKR-1 and C. gestroi
endoglucanase. Our data indicated that the additive enzymatic activity could be
mediated by ROS because improvement of glucan polysaccharide hydrolysis was
correlated with H2O2 production (Figure 8). Glucan oxidation occurs via H2O2 through
generation of new carbonyl and carboxyl groups in the polysaccharide, which could
cleave the glucosidic bonds of cellulose [47,48]. Several enzymes have been reported to
improve lignocellulose hydrolysis in the presence of H2O2 and other oxygen species
[20,49,56-58].
Moreover, to further explore the potential biotechnological applications of this
enzyme, we performed Celluclast 1.5 L supplementation with CgAKR-1, which resulted
in significant improvements in saccharification yield (Figure 9). The highest DS values
were found for the hydrolysis of phosphoric acid-pretreated SCB (PASB; 1.48 at 2 h,
2.17 at 6 h, and 1.31 at 24 h; Figure 9). In contrast, CgAKR-1 synergistically enhanced
the hydrolysis of BIN at early time points (DS of 1.46 at 2 h), with reduced effects at
later time points (DS of 1.13 at 24 h). In both cases, H2O2 generation was found to
correlate with improved saccharification (Figure 9).
121
Figure 9 – Hydrolytic synergy of enzymatic cocktails and CgAKR-1. Celluclast was
used for hydrolysis at 10 FPU/g sugarcane bagasse and (0.5 mg of CgAKR-1 plus
NADPH)/g sugarcane bagasse. The reactions were performed at pH 5.7 for 2, 6, or 24 h
at 30°C and 1000 rpm. The degree of synergism (DS) was calculated as follows: g/L
release sugar (Celluclast plus CgAKR-1) / g/L released sugar (Celluclast). [80] The total
reducing sugars were measured by the DNS method. H2O2 was measured during the
hydrolysis. Denatured CgAKR-1 was used as the control for all substrates. No
hydrolysis was detected by CgAKR-1/NAPDH in the absence of Celluclast.
The major difference in composition between BIN and PASB is the content of
hemicelluloses and lignin (PASB composition: 59.0% cellulose, 1.8% hemicellulose,
and 30.0% lignin [59]; BIN composition: 42.8% cellulose, 25.8% hemicellulose, and
22.1% lignin [60]). Lignin is responsible for blocking cellulolytic enzymes acting in
bagasse fibers by nonproductive binding [11]. Hence, improvement of commercial
cocktail performance is related to the generation of H2O2 by CgAKR-1, which could
result in lignin degradation through the cleavage of lignin-carbohydrate linkages, such
as β-1,4 aryl ether linkages, and loss of cellulose crystallinity [61].
122
Collectively, our data suggested that oxidative cleavage mechanisms could
significantly improve yields of plant biomass deconstruction to biomass, demonstrating
potential bioproduct applications [62]. Classical cellulase mixtures (e.g., Celluclast) do
not generate reasonable yields of H2O2 or •OH radical during reaction with biomass (see
Additional file 1 – supplementary figure 7 ). These redox agents, which are active
against lignocellulose, can be generated by PAD enzymes, which are therefore good
candidates for the formulation of next-generation lignocellulosic cocktails (see
Additional file 6).
According to the data presented in this study, CgAKR-1 improved lignocellulose
saccharification and yeast fermentation via two different proposed mechanisms (Figure
10): 1) the reduction of fermentation inhibitory compounds found in lignocellulose, and
2) the promotion of synergistic enzymatic interactions with hydrolases.
Figure 10 – Potential biotechnological applications of CgAKR-1 to improve
fermentation and cellulolytic cocktails. AKR can decrease phenolic aldehyde-
dependent inhibition of fermentation and improve lignocelulose deconstruction by
cellulases through ROS generation.
However, there were some limitations to this study. First, the saccharification
process at 50°C is limited by the low thermal stability of CgAKR-1. Additionally, we
123
used a host that would not be suitable for nonindustrial expression. Thus, improvement
of thermostability through protein engineering and protein production by filamentous
fungi could facilitate the industrial application of this method using endogenous
enzymes from termites as a potential tool for biomass conversion. Therefore, studies
involving CgAKR-1 have greatly improved our understanding of termite biology and
the role of this protein in both saccharification and fermentation steps as a
―multipurpose enzyme‖, functioning to mediate process integration during second-
generation ethanol production and for green chemistry purposes.
Conclusion
This work describes a founding member of AKR superfamily 1I, providing a
basis for the involvement of endogenous enzymes, as components of the C. gestroi
digestome, in redox mechanisms. Biotechnologically, CgAKR-1 was found to be a
versatile enzyme that was capable of detoxifying hemicellulosic hydrolysates for
pentose fermentation and enhancing SCB saccharification via hydrolases. CgAKR-1
provided a basis for the development and application of integrative and multipurpose
enzymes as components in the bioethanol production chain.
Methods
Phylogenetic tree of the AKR superfamily
The amino acid sequence identified as CgAKR-1 was submitted to phylogenetic
analysis. The phylogenetic tree was generated as described previously, including
specifications according to the AKR superfamily homepage [38]. The tree was
constructed with the neighbor-joining method using 1000 bootstraps [63]. The tree was
drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary
distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed
using the JTT matrix-based method [64] and are presented as the number of amino acid
substitutions per site. The analysis involved 53 amino acid sequences, including known
124
AKRs from family 1, which contained CgAKR-1 and related AKRs. All positions with
less than 95% site coverage were eliminated. There were a total of 307 positions in the
final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6 [65].
Cloning and expression of C. gestroi AKR
The sequence encoding full-length CgAKR-1 was amplified from C. gestroi cDNA
using a standard polymerase chain reaction (PCR) method, as previously described,
with two nucleotide primers (forward: 5′-
TAAAATGCTAGCATGCCTAAACAACTGAGCAGT-3′, and reverse: 5′-
TATTATGGATCCCTAATAAGGCTCATCATACGGGT-3′), in which the restriction
enzyme recognition site was underlined [55]. The PCR product was recovered after 1%
agarose electrophoresis and further digested with NheI and BamHI enzymes according
to the manufacturer’s instructions. Finally, the double-digested PCR product was ligated
into the pET-28(a) vector (Novagen) after treatment with the same two enzymes,
allowing for insertion of a 6X-His tag sequence at the N-terminal position [55]. After
cloning and sequencing, gene characterization was performed using Protparam, SignalP,
and SecretomeP platforms. ArcticExpress competent cells were transformed with the
pET28a/CgAKR-1 plasmid and plated in selective solid LB medium containing
kanamycin (50 mg/L). Cells from a single colony were grown in liquid LB containing
50 mg/L) for 16 h at 37°C and 200 rpm. The cultures were then diluted in 600 mL fresh
LB medium containing kanamycin and grown at 30°C and 200 rpm for 4 h. The
temperature and rotation were then reduced to 12°C and 120 rpm, respectively. After 1
h of acclimation, expression of the recombinant protein was induced by the addition of
1 mM/L isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside. After 24 h, the cells were harvested by
125
centrifugation at 8500 x g. The cells were resuspended in lysis buffer (20 mM sodium
phosphate [pH 7.5], 500 mM/L NaCl, 5 mM imidazole, 80 g/L egg lysozyme, and 5
mM polymethylsulfonyl fluoride [PMSF]) and then disrupted in an ice bath using an
ultrasonic processor (seven pulses of 10 s at 500 W; VC750 Ultrasonic Processor,
Sonics Vibracell). After that, the AKR from the supernatant was purified by
chromatography using an AKTA FPLC system (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA)
using a 5-mL HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare) charged with Ni2+
followed
by a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare), as previously described [66].
The concentration of purified AKR was measured using a NanoDrop 2000c instrument
(Thermo Scientific, USA) and calculated using the molar extinction coefficient (370251
cm-1
).
Crystallization, X-ray diffraction, and structure determination
The purified protein was concentrated to 10 mg/mL prior to crystallization assays.
Initial crystallization experiments were set up using the sitting-drop vapor-diffusion
method on a Honey Bee 963 robot at the ROBOLAB facility (LNBio-CNPEM) in a 96-
well plate with drops composed of 0.5 µL protein solution plus 0.5 µL reservoir
solution. Commercial kits from Hampton were used as initial conditions. A second
round of crystallization was performed to refine the hits obtained in first experiment
using the hanging drop vapor diffusion technique with the drops composed of 2 µL of
protein solution and 2 µL of reservoir solution. All crystals were grown at 18°C. The X-
ray diffraction data were collected at 100 K using a beamline MX-2 with a Brazilian
Synchrotron Light Source – LNLS (Campinas, Brazil), equipped with a Pilatus 6M
detector. Once the crystals were dissolved in the presence a cryoprotectant, they were
126
directly transferred from the drops to the goniometer. The spots located in the ice ring
areas were excluded for data indexing and integration. The collected data were indexed
and integrated with XDS [67] and scaled with Aimless [68]. The initial phases were
calculated by molecular replacement with Phaser [69] using the structure of aldose
reductase from Schistosoma mansoni (PDBid 4hbk) as a search model. The structure
adjustment and analysis were made with COOT [70], and refinement was performed
with Phenix [71]. The final structure factors and model were validated with Molprobity
[72] and deposited in the PDB databank with accession code 5KET. For more
crystallization and data processing details, please see the additional files.
CgAKR-1 immunolocalization in C. gestroi gut tissue
The immunolocalization of CgAKR-1 was analyzed in the termite gut according
to methods described by Price et al. [73]. The purified protein CgAKR-1 was used to
produce polyclonal antibodies in rabbits (commissioned with RHEABIOTECH Ltd.),
according to standard protocols (www.rheabiotech.com.br). IgG fractions were purified
from rabbit serum by protein G affinity chromatography (Amersham), according to the
manufacturer’s instructions. Eluted antibodies were concentrated to 10 mg/mL.
For analysis of protein immunolocalization, termites were washed in 70% (v/v)
ethanol, followed by phosphate-buffered saline (PBS), and the complete guts were then
dissected out in PBS with PMSF (0.2 mM), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; 1
mM), and leupeptin (20 μM). After dissection, guts were transferred to a tube
containing 2% (w/v) paraformaldehyde. The gut tissue was then fixed for 2 h at room
temperature. After fixation, gut tissues were washed several times in 1× PBS.
Nonspecific antibody binding was prevented by incubating the gut tissue for 1 h in a
solution containing 4% (v/v) Triton X-100 with 2% (w/v) bovine serum albumin (BSA)
in PBS. After blocking, the tissue was incubated in primary antibody with shaking at
4°C for 24 h. Anti-CgAKR-1 antibodies were used at a concentration of 1:1000 in
127
antiserum buffer (0.4% [v/v] Triton X-100 with 2% [w/v] BSA in PBS). Gut tissues
were then washed in PBS at 4°C for 24 h. AlexaFluor 568 (red) secondary antibodies
were incubated with the tissue specimens at a concentration of 1:200 in antiserum buffer
at 4°C for 18 h. The secondary antibody solution was removed, and the tissues were
washed in PBS at 4°C for 18 h. Immunostained gut samples were mounted on glass
slides. Control experiments were run in parallel and consisted of a primary antibody-
only control and a secondary antibody-only control. Control experiments were set up
following the same procedure, except the appropriate antibody incubation stage was
omitted (see Additional file 1 – supplementary figure 3). Additionally, the
immunolocalization of termite endoglucanase (CgH9) was analyzed as a positive
control (see Additional file 1 - Supplementary Figure 4 ). Additional information
about equipment and settings can be found in Additional file 1.
Enzymatic assay
AKR activity was assayed spectrophotometrically at 30°C by monitoring the
decrease in the absorbance of NADPH at 340 nm in microplates. The standard assay
mixture (0.2 mL) was composed of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 5.0
mmol/L substrate (2-nitrobenzaldehyde, furfural, HMF, etc.), and 2.5 µg CgAKR-1.
Additionally, 0.2 mmol/L NADPH was added to the plate to initiate the reaction, and
the reaction rate was measured against an identical blank with no enzyme added.
Activity was measured for 5 min. One unit of enzyme activity was defined as the
amount of enzyme catalyzing the oxidation of 1 mmol NADPH per minute (U/mg of
protein). The kinetic parameters of the purified enzyme were determined by assaying
activities at different NADPH concentrations using 5 mmol/L 2-nitrobenzaldehyde as
the substrate. Furthermore, activities at different 2-nitrobenzaldehyde concentrations
were measured using 0.2 mmol/L NADPH. Optimal pH was determined using
phosphate buffer (pH 3.0–8.0) and Tris buffer (pH 8.5–9.0) at 100 mM. Thermo
residual stability was measured after enzyme incubation for 30 min at different
temperatures. The results were expressed in relative activity (%).
Detection of ROS
128
H2O2 generation was measured using Amplex Red, as previously described [74], with a
Catalase Assay Kit (cat. no. A22180; Life Technologies) at 571 nm. Fifty microliters of
the sample was used in the assay. A hydroxyphenyl fluorescein (HPF) assay kit was
used for ●OH detection (see Additional file 9 and 10), and samples were incubated with
40 µL of 50 µmol/L HPF [75]. Denatured CgAKR-1 was used as a negative control, and
one reaction with 5 mmol/L FeSO4 was performed to evaluate the Fenton chemistry if H2O2
was being generated by CgAKR-1. The reactions were kinetically monitored over 30 min
at 35°C using a plate reader fluorometer (Molecular Devices). The excitation
wavelength was 488 nm, and the emission wavelength was 515 nm. All reactions were
performed in triplicate.
Detoxification of hemicellulosic hydrolysate by CgAKR-1
The hemicellulosic hydrolysate represented the soluble fraction of the hemicellulosic
portion of SCB after thermal pretreatment and was composed of arabinose (21.59 g/L),
glucose (31.90 g/L), xylose (209.21 g/L), cellobiose (5.08 g/L), formic acid (0.66 g/L),
acetic acid (6.45 g/L), HMF (0.12 g/L); furfural (0.85 g/L), and levulinic acid (1.12
g/L). Moreover, hemicellulosic hydrolysate phenolic compounds that inhibited
alcoholic fermentation were previously reported by Santoro et al. [76]. To evaluate
whether CgAKR-1 could be applied to enzymatic in situ detoxification of fermentation
inhibitors in hemicellulosic hydrolysate, samples were sterilized at 111°C for 5 min and
diluted twice with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 5.0, adjusted with 6 mol/L
NaOH, which was added slowly to ensure that the lignin would not precipitate).
Subsequently, 1 mg CgAKR-1 and NADPH (2 µmol/L) were added to the reaction and
incubated at 30°C for 16 h. After incubation, hemicellulosic hydrolysate alcoholic
129
fermentation was performed. The yeast used in this study was the wild-type S. stipitis
NRRL Y7124 strain, a xylose-fermenting microorganism capable to ferment the
hemicellulosic hydrolysate. During this process, 3 g/L yeast extract was added to the
liquor, and S. stipitis yeast was inoculated at a final concentration of 10 g/L in 50 mL.
Thereafter, the experiment was incubated at 30°C with continuous agitation at 200 rpm
for 72 h, as described by Dussán et al. [77], using shake flasks. Glucose, xylose, acetic
acid, glycerol, xylitol, furfural, and ethanol were measured during the fermentation
according to the analytical measurements described above.
Analytical measurements
The DNS method [78] was used for measurement of total reducing sugars. Analysis of
glucose, xylose, cellobiose, acetic acid, glycerol, xylitol, furfural, and ethanol was
performed using high-performance liquid chromatography (HPLC; Agilent Infinity
1260; Agilent, Santa Clara, CA, USA) analysis, as described by Rocha et al. [79]. For
greater accuracy and specificity, the samples were filtered through a Millex 22-µm
PVDF filter, and the filtrate was injected into the HPLC system. Compounds were
separated with an Aminex HPX 87H (300 7.8 mm; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) at
35°C using 5 mM H2SO4 as the mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min. The
measurement of soluble lignin was performed as described by Gouveia et al. [60]. All
reactions were performed in triplicate.
Enzyme synergism and the role of ROS during glucan hydrolysis
To evaluate CgAKR-1 synergism with hydrolases and the relationship with H2O2
generation, 1.0% BG was hydrolyzed in 100 mM phosphate buffer (pH 5.7) in a total
130
volume of 500 µL at 30°C and 1000 rpm for 24 h. Samples were collected at 1, 14, and
24 h, and 100 ng of each enzyme (CgAKR-1 and CgGH9) and 200 nmol/L NADPH
were combined as the ―Mix‖. A commercial catalase (H2O2 decomposer; cat. no.
A22180; 1 U/mL; Life Technologies) was used to evaluate the effects of ROS inhibitors
on the DS. After hydrolysis, the H2O2 generation of each sample was measured with
Amplex using 50 µL of each reaction, and the total sugars were measured with the
remaining sample. The analyses were performed in triplicate. No hydrolysis was
detected by CgAKR-1 or NAPDH in the absence of endoglucanase. The DS for sugar
release was calculated as follows: (g/L) of reducing sugar of (CgGH9 + enzyme) / (g/L)
of reducing sugars of CgGH9, as described by Wang [80].
SCB hydrolysis and composition
The SCBs were subjected to enzymatic saccharification with a commercially available
enzyme preparation (Celluclast 1.5 L; Novozymes) at 10 FPU/g SCB and in
combination with 0.5 mg CgAKR-1 plus 6.25 mmol NAPDH/g SCB. The enzymatic
hydrolysis was performed with 2% (w/v) SCB in 100 mM phosphate buffer (pH 5.7) at
30°C. The reactions were carried out in 2-mL Eppendorf tubes using a Thermomixer
microplate incubator (Eppendorf, Germany). Samples were centrifuged at 10,000 x g for
15 min (5418 Centrifuge; Eppendorf) and filtered (Sepak C18; Waters). The SCBs are
described in detail in previous studies of BIN [60] and PASB [59]. Denatured CgAKR-
1 was used in all reactions lacking the enzyme. No hydrolysis was detected by CgAKR-
1 or NAPDH in the absence of Celluclast. The analyses were performed in triplicate.
The DS for sugar release was calculated as follows: (g/L) of reducing sugar of
131
(Celluclast + CgAKR-1) / (g/L) of reducing sugars of Celluclast, as described by Wang
[80].
List of abbreviations
C. gestroi: Coptotermes gestroi
CgAKR-1: Coptotermes gestroi aldo-keto reductase
S. stipisis: Scheffersomyces stipisis
H2O2: hydrogen peroxide
HMF: hydroxymethylfurfural
PAD: pro-oxidant, antioxidant, and detoxification enzyme
AA: auxiliary enzyme
ROS: reactive oxygen species
HPF: peroxynitrite sensor
NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
•OH: hydroxyl radical
CgGH9: termite endoglucanase CgEGL1
BG: barley beta-glucan
SCB: sugar cane bagasse
PASB: phosphoric acid-pretreated sugarcane bagasse
BIN: in-natura sugarcane bagasse
Mix: CgGH9 + CgAKR-1 + NADPH
Declarations:
Ethical approval and consent to participate: Not applicable
Consent for publication: Not applicable
Availability of data and material: The dataset supporting the conclusions of this
article is included within the article and its additional files
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests
Funding: This work was financially supported by grants from FAPESP (2014/20576-7;
for RT; 2011/2977-3 for JPFC; 2012/20549-4 for ARLD; 08/58037-9 for FMS;
2013/06336-0 for BC; 2014/04105-4 for MVL).
132
Authors’ contributions: Robson Tramontina designed and carried out all the
experiments. João Paulo L. Franco Cairo discovered and cloned the enzyme. Fernanda
Mandelli supported the biochemical characterization. Amanda Sousa, Samantha
Christine Santos, Jaciane L. Ienczak, Sarita Cândida Rabelo, and Roberto Ruller carried
out the detoxifications and fermentations. Marcelo V. Liberato and Bruna M. Campos
worked on the enzyme 3D structure. Robson Tramontina, Marcelo V. Liberato, and
André R. L. Damásio drafted the manuscript. Fabio M. Squina conceived the study,
participated in data interpretation, and reviewed the manuscript. All the authors read and
approved the final manuscript.
Acknowledgements: We gratefully acknowledge the provision of time at the analytical
facilities and the sugarcane bagasse derivate provided by CTBE/ CNPEM located in
Campinas, Brazil. Additionally, we thank Ana Maria Costa Leonardo, Sílvio Roberto
Consonni, and Marcelo Carazzolle for technical support.
Additional file:
File name: Additional file 1
File format: .docx
Title of data: Supplementary Information
Description of data: Supplementary Text including Supplementary figure 1-7, and
Supplementary table 1.
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Supplementary Material
Heterologous production of CgAKR-1
SDS-PAGE was performed according to the method of Laemmli [1] using 12% gels.
Supplementary Figure 1. Analysis of heterologous expression of CgAKR-1 in the
Arctic Cell Expression System. CgAKR-1 was expressed at 12°C with shaking at 120
rpm for 24 h and purified using IMAC and GF. (A) IMAC purification with SDS-
PAGE. Lanes: MW, molecular weight standard; 1, lysate; 2, pellet; 3, flowthrough; 4–7,
IMAC fractions. (B) Gel filtration fraction. MW, molecular weight standard. The
CgAKR-1 purified band is indicated by the arrow.
141
CgAKR immunolocalization
Preparation of gut samples
For gut isolation, specimens of C. gestroi were maintained in the Termite
Laboratory of the Biology Department, UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brazil (22º 23′S,
47º 31′W) after collection them from field colonies with traps of corrugated cardboard.
Termites were kept at 25 ± 2°C and fed on cardboard with 10% humidity until use.
Antibodies
Supplementary Figure 2 shows the results of anti-CgAKR antibody analysis; the
antibody showed affinity for the target, even at a dilution of 1:2000. The assay was
performed by RHEABIOTECH LTDA as described in the Materials and Methods
section and the company’s specifications. The antibodies were analyzed using
standard indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). The blocking step
was carried out in phosphate-buffered saline (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM
Na2HPO4 and 2 mM KH2PO4, pH 7.5) plus 2% BSA, and the detection was carried out
with the following dilutions: 1:500, 1:1,000, 1:2,000, 1:4,000, 1:8,000, 1:16,000,
1:32,000, and 1:64,000. The revelation step was performed with a secondary antibody
conjugated with peroxidase, and H2O2/OPD was used as the chromogen substrate. The
reading was carried out at 492 nm. The purified IgG fractions were tested for specific
binding to their targets by ELISA. The results showed that the anti-CgAKR antibody
could bind specifically with recombinant CgAKR-1 (Supplementary Figure 2).
Supplementary Figure 2. Detection of CgAKR by indirect ELISA using the polyclonal
antibody.
B
lank
Flu
ore
sc
en
ce
142
The supplementary figure 3 shows the positive control which is the primary and
secondary antibody incubations with the sample (1), the primary only and secondary
antibody only negative controls (2 and 3 respectively). There was clear evidence of the
antibody specificity for the protein CgAKR-1 in the sample (1A). Also, nonspecific
fluorescence wasn’t detected in the absence of primary only or secondary only antibody
incubation with the sample.
Supplementary Figure 3 - Immunolocalization of CgAKR-1 in C. gestroi gut tissue.
Gut tissues were incubated with primary anti-CgAKR-1 antibodies and fluorescent
secondary antibodies (conjugated with AlexaFluor 568) and observed under a Leica
DMI 6000 microscope. Red fluorescence represents CgAKR immunolocalization in the
foregut (1). Blue fluorescence represents the nuclei of all tissue cells, as determined
using ProLong Antifade Reagents for Fixed Cells (B). (C) Represents the junction of
images 1 and 2 (midgut). Similar experiments using either primary or secondary
143
antibodies independently provided a control for autofluorescence and nonspecific
binding of the fluorescent secondary antibody (2 and 3). Images from the red and blue
channels were recorded independently and digitally overlaid to produce a final image.
As a positive control, termite endoglucanase was immunolocalized to the termite
gut. The enzyme was secreted mainly in the foregut (Supplementary Figure 4). These
data validated the technique for presence of CgAKR in the termite gut.
144
Supplementary Figure 4 - Immunolocalization of CgGH9 in C. gestroi gut tissue. Gut
tissues were incubated with primary anti-CgAKR antibodies and fluorescent secondary
antibody (conjugated with AlexaFluor 568) and observed under a Leica DMI 6000
microscope. Red fluorescence represents CgGH9 immunolocalization; blue
fluorescence represents the nuclei of all tissue cells, as determined using ProLong
Antifade Reagents for Fixed Cells. Similar experiments using either primary or
secondary antibodies independently provided a control for autofluorescence and
nonspecific binding of the fluorescent secondary antibody. Images from the red and
blue channels were recorded independently and digitally overlaid to produce a final
image.
Equipment and settings
The samples were examined at the Biological Imaging Facility of the Brazilian
Biosciences National Laboratory (LNBio) at the Brazilian Center for Research in
Energy and Materials (CNPEM) using a Leica TCS SP8 confocal microscope on a
Leica DMI 6000 with 10× and 40× objectives. Images were collected using a 578 nm
laser for excitation, with emission detection at 603 nm (AlexaFluor 568). The generated
images were analyzed using Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF)
Version 4.3. The images were built through Microsoft® PowerPoint (2010).
CgAKR Structural features
The first CgAKR protein crystals were obtained under conditions containing 5%
PEG400, 0.05 M magnesium sulfate, 2 M ammonium sulfate, and 0.1 M Tris base (pH
8.5). In order to obtain larger and well-formed crystals, manual screening was carried
out by varying the initial condition. A crystal grown in 10% PEG400, 0.1 M magnesium
sulfate, 2 M ammonium sulfate, and 0.1 M Tris base (pH 8.5) was diffracted, and a
complete data set was collected at 2.85-Å resolution. The statistics are described in
Supplementary Table 1.
Supplementary Table 1 - Statistics from X-ray diffraction data collection and
refinement
145
* Highest resolution shell is shown in parentheses.
The structure of AKR was solved by molecular replacement using an aldose
reductase from Schistosoma japonicum (SjAR). Although CgAKR has only 46.3%
amino acid sequence identity with SjAR, the high structural similarity between them
(RMSD = 0.61 Å) allowed molecular replacement for identification of the initial phases.
The final crystallographic model was composed of two molecules in the asymmetric
unit; however, there was no evidence that the enzyme formed a dimer in solution. Due
CgAKR
Data collection
Wavelength (Å) 1.46
Space group H32
Cell dimensions
a, b, c (Å) 131.14, 131.14, 290.66
α, β, γ(°) 90, 90, 120
Resolution (Å) 44.74–2.85 (3.0–2.85)*
Total reflections 195360
Unique reflections 22740
Rmerge 0.29 (1.65)
Rpim 0.10 (0.64)
I/σI 8.6 (1.5)
Completeness (%) 99.8 (99.9)
Redundancy 8.6 (7.5)
CC ½ (%) 98.7 (53.6)
Refinement
Rwork / Rfree, (%) 23.89/29.01
No. atoms
Protein 4950
Ligand 96
B-factors
Protein 50.6
Ligand 70.6
R.m.s. deviations
Bond lengths (Å) 0.009
Bond angles (°) 0.968
Ramachandran
Favored 95.25
Allowed 4.75
Outliers 0
146
to poor resolution or absence of electron density, the following residues were not built
in the final model: 1–6 from chain A; and 1–2, 129–136, 225–233, and 316–321 from
chain B.
The two molecules in the asymmetric unit were very similar (RMSD = 0.32 Å),
with the differences located in loops exposed to solvent. Both molecules were
complexed with NADP, and, because the cofactor was not added in any step of
expression, purification, or crystallization, the cofactor could have been supplied by the
expression host (Escherichia coli). The presence of the cofactor with the enzyme, even
after the purification steps, suggested a high affinity for the binding site. The high
affinity of NADP for AKR members has been described previously [2].
Supplementary Figure 5 – Overall crystallographic structure model of CgAKR, chain
A. (A) Cartoon representation showing conserved folding of AKR, known as the (β/α)8
barrel. The secondary structures are highlighted in different colors: β-strands in blue, α-
helices in gold, and loops in pink. (B) Surface representation showing the NADP
binding site crossing the protein structure.
147
Hydroxyl radical and peroxynitrite (HPF) assays for Fenton reaction detection
The capability of CgAKR to generate H2O2 to enzymatically start the Fenton
reaction was validated in assays using the •OH radical and peroxynitrite sensor (HPF)
(Supplementary Figure 6). As expected, no •OH radicals were produced by CgAKR-1
alone. However, the •OH radical was produced via Fenton chemistry when Fe2+
was
added to the reaction. As presented: Fe2+
+ H2O
2 → Fe
3+ +
•OH + OH−.
Supplementary Figure 6 - ●OH generation by CgAKR-1, NADPH, and Fe
2+, as
measured using an HPF assay kit (see the Materials and Methods), with fluorescence
(RFU) measured using emission wavelengths of 515 nm for 20 min. All reactions were
performed in triplicate in 100 mM phosphate buffer (pH 5.7) at 37°C.
148
Supplementary Figure 7 -
●OH generation by CgAKR-1, NADPH, Celluclast, PASB,
and Fe2+
, as measured using an HPF assay kit (see the Materials and Methods), with
fluorescence (RFU) using emission wavelengths of 515 nm for 20 min. All reactions
were performed in triplicate in 100 mM phosphate buffer (pH 5.7) at 37°C.
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1 UK Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-5.
2 Penning TM. The aldo-keto reductases (AKRs): Overview. Chem Biol Interact.
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149
CONCLUSÕES GERAIS
O papel das enzimas endógenas do cupim durante a degradação e
detoxificação da lignocelulose tem sido descoberto ser cada vez mais
importante. De maneira que, o cupim e seus simbiontes devem ser tratados
como uma unidade funcional única e integrativa, denominada de holobiôntica.
Diminuindo a recalcitrância e a toxidade das biomassas lignocelulósicas,
resultará em maiores níveis de liberação de açúcares e melhor rendimento
fermentativo destas. Portando, o cupim como um modelo de transformação da
biomassa contribuirá para o desenvolvimento de tecnologias amplamente mais
eficazes. De forma que, as PADs e AAs descobertas através de estudos
ômicos da digestômica de C. gestroi apresentaram potencial para diversas
aplicações tais como:
1) Sacarificação de biomassa lignocelulósica; 2) Tratamento de frações
não cellulósicas, como a lignina e compostos aldeídicos da lignocelulose; 3)
Desenvolvimento de coquetéis ou organismos recombinantes contendo um
sistema antioxidante e detoxificante para fermentação de biomassas
específicas. 4) Geração de bioeletricidade. Contudo, algumas limitações como
a baixa termoestabilidade e produção destas enzimas poderiam ser
solucionados através de engenharia de proteinas e sua produção industrial por
fungos filamentosos.
Por fim, conclui-se que PADs endógenas de cupins podem ser
consideradas muito promissoras e de múltiplos propósitos, com o potencial
para envolverem-se como “enzimas integrativas” em todos os processos nesta
cadeia.
150
ANEXOS
PUBLICAÇÕES
PATENTE
151
ARTIGOS PUBLICADOS
152
153
CAPÍTULO DE LIVRO
154
ARTIGOS SUBMETIDOS:
Submetido para Frontiers in Microbiology:
Discovery of carbohydrate-active enzymes in castes of the lower termite
Coptotermes gestroi
João Paulo Lourenço Franco Cairo; Marcelo Falsarella Carazzolle; Flávia Costa
Leonardo; Luciana Souto Mofatto; Lívia Beatriz Brenelli; Thiago Augusto
Gonçalves; Cristiane Akemi Uchima; Romênia Ramos Domingues, Thabata
Maria Alvarez; Robson Tramontina; Ramon Oliveira Vidal; Fernando Ferreira
Costa; Ana Maria Costa- Leonardo; Adriana Franco Paes Leme; Gonçalo
Amarante Guimarães Pereira & Fabio Marcio Squina*
Submetido para International Journal of Biological Macromolecules
Biochemical and biophysical properties of a metagenome-derived gh5
endoglucanase displaying an unconventional domain architecture
Gabriela C. G. Ematsu; Fabio Marcio Squina; Marcelo V. Liberato; Fernanda
Mandelli; Agnes Cristina Pimentel; João Paulo L. Franco Cairo; Mario de
Oliveira Neto; Douglas A. A. Paixão; César Augusto Gandin; Robson
Tramontina; Thabata Alvarez*
ARTIGOS EM PREPARAÇÃO PARA SUBMISSÃO:
A superoxide dismutase from the lower termite Coptotermes gestroi
displays synergism with carbohydrate-active enzymes for lignocellulose
breakdown
João Paulo L. Franco Cairo; Fernanda Mandelli; Robson Tramontina; David
Cannella; Marcel R. Ferreira; Thiago Augusto Gonçalves; Lívia B Brenelli;
Thabata M. Alvarez; Marcelo F. Carazzole; Adriana F. P Leme; Ana M. Costa-
Leonardo; Claus Felby; Gonçalo A. G. Pereira; Mário Oliveira Neto; Fabio M.
Squina*
155
CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA CBIO
156
DECLARAÇÃO