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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS APLICADAS
NATÁLIA DE ALMEIDA RODRIGUES
IMPACTO DE DIFERENTES RELAÇÕES DE INTENSIDADE E VOLUME DE
TREINAMENTO MONÓTONO E PERIODIZADO LINEAR SOBRE
MARCADORES DE BIOGÊNESE MITOCONDRIAL EM RATOS
NADADORES
IMPACT OF DIFFERENT RELATIONS OF INTENSITY AND VOLUME OF MONOTONE
TRAINING AND LINEAR PERIODIZATION ON MITOCHONDRIAL BIOGENESE
MARKERS IN SWIMMING RATS
LIMEIRA
2018
NATÁLIA DE ALMEIDA RODRIGUES
IMPACTO DE DIFERENTES RELAÇÕES DE INTENSIDADE E VOLUME DE
TREINAMENTO MONÓTONO E PERIODIZADO LINEAR SOBRE MARCADORES DE
BIOGÊNESE MITOCONDRIAL EM RATOS NADADORES
IMPACT OF DIFFERENT RELATIONS OF INTENSITY AND VOLUME OF MONOTONE
TRAINING AND LINEAR PERIODIZATION ON MITOCHONDRIAL BIOGENESE MARKERS IN
SWIMMING RATS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas do
Campus de Limeira da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título
de Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e
Metabolismo, na área de Biodinâmica do Movimento
Humano e Esporte.
Thesis presented to the School of Applied Science of the
University of Campinas in partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor in Nutrition Science
and Sport and Metabolism, in the area of Biodynamics of
Human Movement and Sport.
Orientadora: PROFA. DRA. FÚLVIA DE BARROS MANCHADO-GOBATTO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONTE À VERSÃO
FINAL TESE DEFENDIDA PELA ALUNA NATÁLIA
DE ALMEIDA RODRIGUES E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. FÚLVIA DE BARROS MANCHADO-
GOBATTO
LIMEIRA
2018
FICHA CATALOGRÁFICA
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Fúlvia de Barros Manchado-Gobatto
PRESIDENTE DA BANCA
Prof. Dr. Wladimir Rafael Beck
Profa. Dra. Fernanda Klein Marcondes
Profa. Dra. Marciane Milanski Ferreira
Profa. Dra. Adriana Pertille
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo
de vida acadêmico do aluno
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus por todas as oportunidades e desafios
vivenciados durante o período de doutorado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESP) pelo suporte financeiro que possibilitou a
realização desse trabalho.
A coordenadora do Laboratório de Fisiologia Aplicada ao Esporte (LAFAE), Profa. Dra.
Fúlvia de Barros Manchado-Gobatto, pela generosidade em compartilhar o conhecimento, me
orientando e sendo exemplo de profissional durante todo o processo. Agradeço também pela
amizade e por confiar a mim esse projeto de pesquisa tão importante na minha formação.
Ao coordenador do LAFAE, Prof. Dr. Claudio Alexandre Gobatto, pela amizade e pelas
oportunidades de crescimento profissional.
Agradeço aos amigos do LAFAE por todas as experiências vividas, que contribuíram direta
ou indiretamente para a conclusão dessa etapa. Em especial, ao meu amigo e parceiro de trabalho
Lucas Dantas Maia Forte por compartilhar comigo todos os momentos de construção desse projeto.
A minha família, que estiveram ao meu lado me apoiando e sonhando comigo esse
momento.
E, por último, ao meu querido Filipe Antônio de Barros Sousa por me incentivar e me
ensinar a valorizar essa caminhada.
RESUMO
O exercício físico é um potente promotor de adaptações mitocondriais. Essas adaptações estão
relacionadas aos parâmetros de quantidade, dinâmica e tamanho dessas organelas, tanto em
modelos animais quanto em humanos, e tem sido amplamente relacionada com benefícios para a
saúde e performance. Entretanto, ainda são restritos os conhecimentos sobre qual seria uma ótima
prescrição de treinamento, considerando-se o método e as variáveis como intensidade e volume,
capaz de potencializar os efeitos da biogênese mitocondrial. Dessa maneira, o objetivo dessa tese
investigar as respostas de conteúdo proteico de marcadores de biogênese mitocondrial em tecido
muscular esquelético, cardíaco e hepático após esforço agudo isocarga, bem como as adaptações
aeróbias após treinamento em modelo monótono isocarga e periodizado linear de ratos nadadores.
Para isso dois experimentos foram propostos, sendo um agudo e um crônico, nos quais foram
determinados individualmente, pelo teste de lactato mínimo, as intensidades de capacidade aeróbia.
No experimento agudo os grupos foram divididos em controle (GC), dois grupos que se
exercitaram abaixo do limiar anaeróbio - LAn (GE80, GE90), um grupo que se exercitou na
intensidade de LAn (GE100) e dois, acima do LAn (GE 110 e G120). Todos os animais que se
exercitaram foram submetidos a volume (min) que lhes conferiu a mesma relação de carga (i.e.,
esforços isocarga). No experimento crônico os ratos foram divididos em Baseline, controle (GC),
um grupo que treinou monotonamente abaixo do limiar anaeróbio (GT80), um grupo que treinou
monotonamente na intensidade de LAn (GT100), um grupo treinado acima do LAn (GT120) e um
submetido ao modelo periodizado linear (GPE). Todos os animais que treinaram monotonamente
possuíram um volume que lhes conferiu a mesma relação de carga. Análise de quantidade proteica
de COXIV (citocromo c oxidase) e TFAM foram feitas pelo método de Western bloting e atividade
de citrato sintase pelo método enzimático. Os principais resultados mostraram que os estímulos
agudos propostos não foram capazes de alterar o conteúdo das proteínas COXIV e TFAM para os
tecidos musculares, cardíaco e hepático, enquanto que atividade de citrato sintase foi sensível
apenas para o gastrocnêmio e fígado em decorrência das alterações de intensidade, destacando a
redução da atividade de citrato sintase no GE120 para ambos os tecidos. No experimento crônico
foi possível também observar uma tecido-dependência com relação as adaptações, sendo que o
conteúdo de proteína TFAM apenas aumentou para o grupo GT100 no gastrocnêmio, enquanto
COXIV aumentou em GT80, GT100 e GT120 no sóleo. No entanto, a atividade de citrato sintase
aparece aumentada apenas para o grupo GT120 no tecido gastrocnêmio, o que coincide com a
menor redução da capacidade aeróbia ao longo do período. Em suma, alterações no conteúdo de
proteínas responsáveis pelo funcionamento da fosforilação oxidativa parecem ser favoráveis para
minimizar os declínios da capacidade aeróbia dos animais submetidos a 12 semanas de treinamento
de natação. Os treinamentos monótonos se mostraram mais eficazes se comparados ao periodizado,
com destaque para o grupo GT120 com melhora da capacidade aeróbia e GT80 com melhora
anaeróbia e sendo mais eficiente na manutenção do exercício.
Palavras-chave: Treinamento físico, Mitocôndria, Exercício físico
ABSTRACT
Physical exercise is a potent promoter of mitochondrial adaptations. These adaptations are related
to the parameters of quantity, dynamics and size of these organelles, both in animal models and in
humans, and have been widely related to health and performance benefits. However, the knowledge
about what would be a great training prescription, considering the method and the variables as
intensity and volume, is still limited, capable of potentiating the effects of mitochondrial
biogenesis. Thus, the objective of this thesis was to investigate the protein content responses of
markers of mitochondrial biogenesis in skeletal, cardiac and hepatic muscle tissue after acute
isoload effort, as well as the aerobic adaptations after training in a monotonous isoload and linear
periodized model of swimming rats. For this, two experiments were proposed, one being acute and
one chronic, in which the aerobic capacity intensities were determined individually by the
minimum lactate test. In the acute experiment the groups were divided in control (GC), two groups
that exercised below the anaerobic threshold - LAn (GE80, GE90), one group that exercised in the
intensity of LAn (GE100) and two, above the LAn (GE 110 and GT120). All animals that were
exercised were subjected to volume (min) which gave them the same loading ratio (i.e., isotonic
efforts). In the chronic experiment the rats were divided into baseline, control (GC), a group that
trained monotonously below the anaerobic threshold (GT80), a group that monotonously trained
in the intensity of LAn (GT100), a group trained above the LAn (GT120) and one submitted to the
periodized linear model (GPE). All animals that trained monotonously had a volume that gave them
the same load ratio. Protein amount analysis of COXIV (cytochrome c oxidase) and TFAM were
done by Western blotting method and citrate synthase activity by the enzymatic method. The main
results showed that the proposed acute stimuli were not capable of altering the content of the
COXIV and TFAM proteins to the muscular, cardiac and hepatic tissues, whereas citrate synthase
activity was sensitive only to the gastrocnemius and liver due to changes in intensity, highlighting
the reduction of citrate synthase activity in GE120 for both tissues. In the chronic experiment it
was also possible to observe a tissue-dependence regarding the adaptations, and the TFAM protein
content only increased for the GT100 group in the gastrocnemius, while COXIV increased in
GT80, GT100 and GT120 in the soleus. However, citrate synthase activity appears to be increased
only for the GT120 group in gastrocnemius tissue, which coincides with the lower reduction of
aerobic capacity over the period. In summary, changes in the content of proteins responsible for
the functioning of oxidative phosphorylation seem to be favorable to minimize declines in aerobic
capacity of animals submitted to 12 weeks of swimming training. The monotonous training proved
to be more effective compared to the periodized one, with emphasis on the GT120 group with
improved aerobic capacity and GT80 with anaerobic improvement and being more efficient in
maintaining the exercise.
Key words: Physical Training, Mitochondria , Physical exercise
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação da determinação da intensidade de lactato mínimo (iLM) pelo método intensidade
vs. tempo. a) Curva da concentração de lactato sanguíneo ao longo da fase 3 do teste de lactato mínimo
(teste incremental) para determinação do ponto mínimo, b) Reta de regressão intensidade vs. tempo.
Figura 2. A) Rato nadando durante procedimento experimental. Filtro de luz vermelha no ambiente de
coleta. B) Cargas construidas com peças de chumbo e latex.
Figura 3. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento agudo. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do tempo
limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados nos
grupos exercícios e 4h após a sessão aguda foram eutanasiados. Todos os procedimentos foram realizados
no período noturno.
Figura 4. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento crônico. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o primeiro teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação
do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados
nos grupos e foram submetidos a um período de 12 semanas de treinamento com frequência de 6
dias/semana. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Figura 5. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo. Comparação
entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) no gastrocnêmio e sóleo. (GC= grupo controle;
GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado
a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
Figura 6. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo. Comparação
entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos hepático e cardíaco. (GC=
grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM,
GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo
exercitado a 120% da iLM)
Figura 7. Média ± ep da atividade de citrato sintase para o exercício agudo. Comparação entre os grupos
(GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos musculares (gastrocnêmio e sóleo), hepático
e cardíaco. b diferente de GE80; c diferente de GE90; d diferente de GE100; e diferente de GE110; f diferente
de GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da
iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo
exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM).
Figura 8. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para o gastrocnêmio, glúteo e fígado para o experimento
agudo. b diferente de GE80; c diferente de GE90; d diferente de GE100; e diferente de GE110; f diferente de
GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM;
GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado
a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM).
Figura 9. (a) Média ± ep da iLM (%mc) para os grupos GC, GT80, GT100, GT120 e GPE; (b) Média ± ep
da iLM normalizada pelas iLM do momento pré para os grupos; (c) Média ± ep da Tlim 13%mc (s) para os
grupos; (d) Média ± ep da Tlim 13%mc normalizada pelas Tlim 13%mc do momento pré para os grupos a
diferente de GC; c diferente de GT100; d diferente de GT120, e diferente de GPE, * diferença entre pré e pós.
P < 0.05. (GC= grupo controle; GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo
treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento
periodizado linear.)
Figura 10. Média ± ep da relação entre Tlim normalizado e iLM normalizado para os grupos GT80, GT100,
GT120 e GPE pós período de treinamento. a diferente de GT80. P < 0.05. (GT80=grupo treinamento a 80%
da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM,
GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 11. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o gastrocnêmio e sóleo no
experimento crônico. a diferente de GC; b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de GPE.
Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento
a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 12. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para os tecidos hepático e cardíaco do
experimento crônico. b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as análises foi
usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM,
GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 13. Média ± ep da atividade de citrato sintase dos tecidos musculares (gastrocnêmio e sóleo),
hepático e cardíaco para o experimento crônico. a diferente de GC; b diferente de baseline; c diferente de
GT80; d diferente de GT100; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as análises foi usado um
P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM,
GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 14. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para os tecidos gastrocnêmio, glúteo e fígado para o
experimento crônico. b diferente de baseline; c diferente de GT80; d diferente de GT100; e diferente de
GT120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo
treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento
periodizado linear).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Descrição das intensidades (%mc), volume (min) e carga dos grupos exercício referentes
ao experimento agudo.
Tabela 2. Descrição das intensidades (%mc), volume (min), carga de treinamento, frequência e o
momento em que os animais foram eutanasiados referentes ao experimento crônico.
Tabela 3. Organização do treinamento do grupo periodizado linear (GPE) utilizando as intensidades
(END1, END2, END3 e ANA) ao longo das 12 semanas como proposto por de Araújo et al., 2012.
Tabela 4. Média ± ep dos valores de tempo limite - Tlim (s) e intensidade de lactato mínimo - iLM
(%mc) obtidos no teste de lactato mínimo (TLM).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPK - Proteína quinase ativada por AMP
ATP – Adenosina trifosfato
CAMKII – Calmodulina dependente de cálcio
COXIV – Citocromo c oxidase
DNA – Ácido desoxirribonucleico
HIIT – High Intensity Interval Training
mRNA –Ácido ribonucleico mensageiro
mtDNA – DNA mitocondrial
nDNA – DNA nuclear
NRF1/2 – Fator respiratório nuclear 1/2
PGC-1α - Coativador de transcrição proliferador de peroxissomo ativado receptor-γ coativador-1α
PPARβ - Receptor de ativado por proliferador de peroxisoma β
p38 MPK – Proteína quinase ativada por mitógeno p38
rRNAs - Ácido ribonucleico ribossômico
Sirt1 – Sirtuin 1
SIT – Sprint Interval Training
TFAM – Fator A de transcrição mitocondrial
tRNAs - Ácido ribonucleico transportador
TFB1M – Fator de transcrição mitocondrial B1
TFB2M - Fator de transcrição mitocondrial B2
VO2max –Consumo máximo de oxigênio
VO2pico – Consumo de oxigênio pico
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 15
2. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 17
2.1. Domínios de intensidade de exercício ................................................................... 17
2.2. Aspectos gerais da biogênese mitocondrial ........................................................... 18
2.3. Vias de regulação da biogênese mitocondrial induzida pelo exercício ................. 19
2.4. Influência da intensidade e volume sobre a biogênese mitocondrial ..................... 21
3. OBJETIVO ...................................................................................................................... 25
4. HIPÓTESES .................................................................................................................... 26
5. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 26
5.1. Animais .................................................................................................................. 26
5.2. Procedimentos experimentais gerais ...................................................................... 27
5.2.1. Adaptação ao meio líquido – ............................................................................ 27
5.2.2. Teste do Lactato Mínimo: ................................................................................. 27
5.3. Desenho experimental ..................................................................................................... 28
5.3.1. Experimento agudo ........................................................................................... 30
5.3.2. Experimento Crônico ........................................................................................ 31
5.3.3. Amostras sanguíneas: ....................................................................................... 34
5.4. Obtenção do material biológico ............................................................................. 35
5.4.1. Quantificação de proteína por Western blotting .............................................. 35
5.4.2. Atividade enzimática de citrato sintase (CS) .................................................... 35
5.4.3. Estoque de glicogênio ....................................................................................... 36
5.5. Análise Estatística .................................................................................................. 36
6. RESULTADOS ............................................................................................................... 36
6.1. Experimento Agudo ............................................................................................... 36
6.2. Experimento Crônico ............................................................................................. 41
7. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 47
8. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 51
9. REFERÊNCIA ................................................................................................................ 51
15
1. INTRODUÇÃO
O exercício físico é capaz de promover adaptações que favorecem o desempenho esportivo,
a qualidade de vida e a longevidade. Recentemente ganharam notoriedade as adaptações
relacionadas aos parâmetros de quantidade, dinâmica e tamanho de organelas mitocondriais
tanto em modelos animais quanto em humanos, devido a gama de benefícios associados a saúde,
pertinentes à redução de sintomas de doenças crônicas como obesidade (Heo et al., 2017) e
diabetes (Besseiche et al. 2015; Herst et al. 2017), aumento da produção de compostos
antioxidantes (Ji et al. 2016), redução dos efeitos deletérios da idade (Cartee et al. 2016) e
melhora de performance por meio de uma maior eficiência de ressíntese de ATP por via
oxidativa (Drake et al. 2016).
No entanto, ainda há pouco conhecimento sobre qual seria a ótima relação entre intensidade
e volume (carga) para a prescrição de exercício, considerando-se o método e as variáveis de
treinamento, capaz de potencializar os efeitos adaptativos mitocondriais. Em recente revisão de
literatura, Bishop et al. (2014) questionam como a função e o conteúdo mitocondrial se
modelam frente às variáveis de volume e intensidade de exercício. Os autores apresentaram
dados que relacionam a função mitocondrial (via consumo isolado de oxigênio ou consumo de
oxigênio de fibras permeabilizadas) com o aumento da intensidade do exercício e o conteúdo
mitocondrial, (atividade de citrato sintase) com o aumento do volume. Embora os autores
apresentem uma tendência dessas relações, há ainda a necessidade de investigar o efeito dessas
variáveis de treinamento sobre as adaptações mitocondriais e como isso pode refletir no
desempenho aeróbio.
Em 1967, Holloszy propôs um dos primeiros estudos em que se atribuiu ao treinamento
de endurance (alto volume e moderada intensidade) o aumento de marcadores de biogênese
mitocondrial em tecido músculo esquelético em roedores. Mais recentemente, Mille-Hamard et
al. (2015) prescreveram individualmente três intensidades de exercício tendo como parâmetros
a velocidade crítica (relativo a capacidade aeróbia), a velocidade de VO2max e 150% da
velocidade crítica determinada em corrida para camundongos. Nesse caso, os três exercícios
caracterizados como esforços intenso e severos respectivamente, refletiram em diferentes
expressões de genes relacionados a biogênese mitocondrial (PGC-1α, PPARβ, Sirt1, TFAM),
mostrando que o aumento da intensidade pode promover uma moderada expressão desses
marcadores. Não obstante, Terada et al. (2005) ao proporem um treinamento intervalado de alta
16
intensidade e um contínuo em baixa intensidade para roedores encontraram que o primeiro
aumenta o conteúdo proteico de PGC-1α , uma vez que, segundo os autores, o aumento da
atividade de enzimas oxidativas mitocondriais é provocado pela alta intensidade de exercício.
Os estudos que envolvem modelos humanos e treinamento tendem a mostrar a efetividade
dessas adaptações mitocondriais associadas à elevação de parâmetros aeróbios (Bishop et al.,
2014), porém devem ser considerados o nível inicial de condicionamento físico dos
participantes e a aderência ao programa de treinamento, bem como a pequena representação da
porção músculo esquelética executada por meio de biópsia, o que também impossibilita a
avaliação de outros tecidos. Por outro lado, embora os estudos com modelos animais, mais
propriamente os roedores, fiquem aquém dos gestos motores e especificidades esportivas, esses
conseguem representar respostas fisiológicas e metabólicas semelhantes ao modelo humano
com a vantagem de um maior controle ambiental, de treinamento e de linhagem (Booth et al.,
2010).
A proposta de investigar as adaptações de proteínas mitocondriais relacionadas a
biogênese e diferentes modelos e variações de volume e intensidade de treinamento foi
impulsionada por estudos anteriores que identificaram modificações na capacidade aeróbia de
roedores frente ao treinamento (de Araujo et al., 2013; de Araujo et al., 2012). Em 2012, de
Araujo et al. (2012) propuseram um modelo periodizado para ratos com cargas de treinamento
lineares em natação. Esse modelo foi composto por cargas que se modulavam ao longo do
período, iniciando com a predominância do volume na fase de base e finalizando com a
predominância da intensidade na fase de polimento. Ao longo das doze semanas de treinamento,
foi observado que a capacidade aeróbia dos animais treinados reduziu em 18% enquanto para
os animais controle, a redução foi de 35% em comparação aos animais baseline.
Os autores observaram uma similar resposta adaptativa da capacidade aeróbia em outro
estudo (de Araujo et al., 2013) em que também treinaram roedores, durante doze semanas, em
um modelo monótono de treinamento de natação. Nesse caso, a relação da carga de treinamento
não se alterava ao longo do tempo, sendo testadas duas intensidades de esforço sub limiar
anaeróbio (LAn) (80% e 90% do LAn), desempenhadas sob mesmo volume (aproximadamente
50min diários). Ambos os grupos submetidos ao treinamento apresentaram uma redução
atenuada da capacidade aeróbia em aproximadamente 15%, enquanto essa mesma capacidade
para o grupo controle sofreu redução de 19% se comparada ao grupo baseline.
Tais resultados despertaram o interesse e o questionamento sobre os motivos que
levaram a atenuação da redução da capacidade aeróbia nos animais treinados e quais modelos
ou relações das variáveis de treinamento são mais efetivos para desenvolver (ou ao menos
17
atenuar o declínio) dessa capacidade. Em resposta a esses questionamentos, um modelo de
treinamento monótono isocarga (cargas de treinamento equivalentes) foi proposto para que a
comparação entre os modelos permita inferir qual variável (intensidade ou volume) é mais
influente nas respostas adaptativas para a capacidade aeróbia.
Dessa maneira essa tese foi dividida em dois experimentos, que foram desenvolvidos
sequencialmente, com modelo animal de roedores e natação. A proposta do experimento 1 foi
uma análise das respostas ao esforço agudo considerando cinco exercícios em isocarga, sendo
dois com intensidades sub limiar anaeróbio (80% e 90%), uma na intensidade de limiar
anaeróbio (100%) e dois com intensidades supra limiar anaeróbio (110% e 120%). Para o
experimento 2 foi analisado as adaptações ao treinamento seguindo o modelo monótono com
intensidades selecionadas do experimento 1 (80%, 100% e 120% relativos ao limiar anaeróbio)
e o modelo de treinamento periodizado linear.
Ambos seguem a proposta de analisar a quantificação de proteínas em diferentes tecidos
(muscular, hepático e cardíaco) que estão ligadas a adaptações relativas de biogênese
mitocondrial. Dentre as proteínas, foram selecionadas duas que acionam funções específicas no
DNA mitocondrial (TFAM e COXIV) e uma enzima do ciclo de ácido tricarboxílico (citrato
sintase), sendo que todas possuem relação com o exercício físico (Hood et al., 2016; Leek et
al., 2001; Theilen et al., 2017).
Desta maneira, investigar o efeito do exercício agudo e do treinamento sobre marcadores
de biogênese mitocondrial em modelos isocarga possibilita aprofundar o estudo sobre como
potencializar os ganhos aeróbios. Adicionado a isso, averiguar o conteúdo proteico desses
marcadores em diferentes tecidos pode indicar um caminho, tanto na área da performance
quanto na da saúde.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Domínios de intensidade de exercício
Os domínios de intensidade de exercício são delimitações fisiológicas correspondentes
às demandas energéticas. Uma adequada prescrição de exercícios agudos e crônicos depende
do conhecimento dessas intensidades individuais, pois cada domínio possui características
particulares. De acordo com Gaesser e Poole (1996), os domínios de intensidade são
caracterizados como moderado, intenso e severo, sendo eles distintos quando consideradas as
respostas fisiológicas geradas bem como suas adaptações advindas do treinamento.
18
No domínio moderado são encontradas respostas fisiológicas estáveis (frequência
cardíaca, consumo de oxigênio e lactato sanguíneo), proporcionado pelo pequeno aumento da
contribuição cardiorrespiratória e metabólica. No domínio intenso encontra-se a zona de
transição aeróbia-anaeróbia (Faude et al., 2009) compreendido entre o primeiro limiar, também
conhecido como limiar aeróbio e o segundo limiar conhecido como limiar anaeróbio (Kiderman
et al., 1979), que na presente tese será tratado também como capacidade aeróbia. Nesse domínio
de intensidade as respostas fisiológicas são mais elevadas se comparadas ao exercício
moderado, mas ainda, de modo tardio, conseguem encontrar a estabilização em esforços
contínuos. A mais alta intensidade em que ocorre esse equilíbrio, sendo também o ponto onde
a produção de lactato se iguala a remoção, é nomeado de máxima fase estável de lactato (Faude
et al., 2009).
No domínio severo, intensidades acima do limiar anaeróbio, as respostas fisiológicas
tendem aos seus valores máximos, uma vez que esforços nesse domínio, diferentemente do
anterior, não geram condições estáveis ao organismo. Em complemento, Hill et al. (2005)
sugerem ainda um quarto domínio de intensidade, intitulado como extremo, ocorrendo em
intensidades de exercício supra máximas, onde ocorre a fadiga sem o consumo de oxigênio
atingir valores pico.
A identificação individualizada dos limites entre os domínios, principalmente do ponto
de transição metabólica, permite potencializar os efeitos do exercício e uma correta prescrição
dos métodos de treinamento. Diferentes adaptações são encontradas quando explorado
intensidades dentro de cada domínio, sendo observado uma intensidade dependência nas
respostas celulares (Egan et al., 2010). Assim, diferentes intensidades, contidas em distintos
domínios, serão explorados visando as principais adaptações com relação a biogênese
mitocondrial.
2.2. Aspectos gerais da biogênese mitocondrial
A mitocôndria apresenta características importantes para a sobrevivência da célula
eucariótica, sendo responsável por 90% da energia produzida (Mootha et al., 2003). Em sua
estrutura é possível encontrar uma membrana externa, uma interna na qual ocorre a cadeia de
transporte de elétrons e onde está localizada o complexo ATP sintetase, as cristas da membrana
interna e a matriz mitocondrial, onde há uma alta concentração de enzimas responsáveis pela
oxidação de piruvato e ácidos graxos no ciclo de ácido tricarboxílico. Apresenta também um
DNA circular, no qual são codificados uma pequena quantidade de genes específicos, sendo 13
19
proteínas estruturais da cadeia de transporte de elétrons, 22 tRNAs e 2 rRNAs. O restante de
seus genes é codificado no núcleo da célula (Dominy & Puigserver, 2013).
As mitocôndrias estão envolvidas em diversos processos celulares tais como as vias de
biossíntese, produção de corpos cetônicos, síntese hormonal, manutenção da homeostase e na
morte celular (Dominy and Puigserver, 2013; Ploumi et al., 2017). Devido à importância dessas
funções dentro da célula, as mitocôndrias estabelecem uma complexa rede com o núcleo, se
adaptando em relação ao seu número e função, em situações de alteração metabólica e
modificações do seu estado homeostático (Ploumi et al., 2017).
A biogênese mitocondrial ocorre por meio de atividades coordenadas entre o DNA
nuclear (nDNA) e DNA mitocondrial (mtDNA), com o propósito de formar novas proteínas
que são adicionadas ao retículo da mitocôndria para posterior incorporação e remodelação
dentro dos processos de fusão e fissão (Kim et al., 2017). Esse processo é dinâmico e permite,
além do compartilhamento de componentes do mtDNA, a remoção e degradação de
componentes danificados (Russell et al., 2014). Por conseguinte, o conteúdo mitocondrial
dentro de uma célula estabelece uma relação de equilíbrio entre a sua biogênese e os processos
de degradação (Hood et al., 2015; Russell et al., 2014).
As adaptações de conteúdo mitocondrial podem ser encontradas tanto em modelo
animal quanto em humano por meio da análise das atividades enzimáticas (citrato sintase,
succinato desidrogenase e COX) e quantificação de genes e proteínas específicas (COX,
NRF1/2, TFAM, PGC-1α, SIRT1) (Herst et al., 2017). Embora as mitocôndrias estejam
presentes em quase todas as células eucarióticas, seu proteoma é complexo e exibe
heterogeneidade de tecido para satisfazer as necessidades metabólicas e energéticas específicas
de cada tipo de célula (Valero, 2014). Ainda, as diferenças entre espécies e a quantidade
ofertada de estímulo pode gerar resultados conflitantes (Islam et al., 2017; Safdar et al., 2011).
Nesse contexto, sendo o exercício físico um potente indutor de biogênese mitocondrial
(Bishop et al., 2014; MacInnis et al., 2017), nessa revisão serão discutidas as principais vias da
biogênese mitocondrial induzida pelo exercício e a relação com as variáveis de treinamento
(volume e intensidade).
2.3. Vias de regulação da biogênese mitocondrial induzida pelo exercício
Tem-se o conhecimento que o exercício físico atua como um agente estressor celular,
promovendo alterações na homeostase tais como a diminuição dos níveis de ATP mitocondrial
que causam a privação de energia (aumento da taxa de AMP/ATP) induzindo o aumento da
20
sinalização de proteínas quinase (AMPK), elevação de Ca+2 citosólico proporcionado pelo
aumento da contração muscular, elevação da taxa NADH/NAD+ que afeta a membrana e o
potencial redox, fosforilação da proteína p38 AMPK e aumento das espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Herst et al., 2017; Hood et al., 2016; Hood et al., 2015). Todas essas alterações
são capazes de estimular fatores transcrionais que aumentam a regulação de genes
mitocondriais.
Segundo Hood et al. (2016) a síntese de novas organelas é resultado de um acúmulo de
estímulos agudos resultante do processo de treinamento. Ainda, cada sessão de exercício
aumentaria a expressão de mRNAs específicos promovendo uma nova cascata de sinalizações
podendo resultar na tradução de novas proteínas. De acordo com Erlich et al. (2016) o conteúdo
mitocondrial do músculo esquelético pode aumentar entre 50 e 100%, dependendo do programa
de exercício, fornecendo a esse tecido uma capacidade aprimorada de fornecimento de energia
oxidativa. Em contrapartida, a inatividade física pode provocar a redução de 50 a 75%, o que
pode comprometer o funcionamento celular.
Um dos pioneiros na associação entre exercício físico e biogênese mitocondrial no
tecido esquelético foi Hollosky (1967) que propôs um treinamento de doze semanas com
exercício de longa duração (120min) para modelo de roedores em esteira rolante.
Posteriormente, Puigserver et al. (1998) mostrou que o coativador 1-alfa do receptor gama
ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α) age coordenando a interação entre nDNA e
mtDNA promovendo a síntese de proteínas relacionadas a biogênese mitocondrial e
termogênese em tecido de gordura marrom. Dessa maneira a PGC-1α tem sido reconhecida
como um dos principais coativadores transcricionais da via da biogênese, sendo um marcador
sensível das alterações homeostáticas causadas pelo exercício.
Em recente revisão, Islam et al. (2017) discute a possibilidade de duas vias nas quais a
PGC-1α poderia mediar o processo de biogênese mitocondrial induzida pelo exercício no tecido
músculo esquelético. A primeira está pautada no paradigma apresentado, no qual a PGC-1α,
quando fosforilada, seria capaz de coativar fatores transcricionais nucleares que induzem o
aumento de genes mitocondriais. Assim, a PGC-1α se translocaria do citosol para o núcleo da
célula promovendo o aumento de fatores respiratórios nucleares (NRF1/2) que se ligariam aos
promotores dos genes alvo induzindo a expressão do fator transcricional A mitocondrial
(TFAM) e fatores transcricionais B1 e B2 mitocondrial (TFB1M e TFB2M). Destaca-se que a
TFAM apresenta a função de iniciar a transcrição, replicação e manutenção do mtDNA (Theilen
et al., 2017).
21
A segunda via discutida por Islam et al. (2017) estaria relacionada a interação direta da
PGC-1α com a TFAM dentro da mitocôndria, não necessitando da ação coordenada com o
núcleo celular. Outros autores como Safdar et al. (2011) e Smith et al. (2013) mostraram que o
exercício agudo em ratos, camundongos e humanos seria capaz de translocar a PGC-1α para
dentro do subsarcolema mitocondrial, no qual aumentaria a função regulatória da TFAM na
região D-loop (displacement loop) do mtDNA.
Embora essas vias sejam as mais comuns para explicar a biogênese de mitocôndrias
induzida pelo exercício, outros mecanismos necessitam de elucidação, uma vez que esse
processo é dinâmico e complexo. Nesse sentido, estudos que utilizam modelos de roedores com
seleção de linhagem para baixa e alta capacidade de treinamento (Marton et al., 2015) e
modelos knockout para genes como PGC-1α (Erlich et al., 2016) tem demonstrado a
importância do exercício para a manutenção do conteúdo dessa organela, mesmo nos animais
que não expressam geneticamente essa característica.
Pode-se citar alguns marcadores de biogênese mitocondrial como a PGC-1α, TFAM,
COX e citrato sintase, sendo esses modulados pelo exercício físico (Russell et al., 2014). Além
do exemplificado para PGC-1α e TFAM, o citocromo-c oxidase (COX) representa a subunidade
4 da cadeia de transporte de elétrons, responsável pela doação de elétrons ao oxigênio, estando
relacionada a fosforilação oxidativa e produção de ATP. Essa subunidade é codificada no
núcleo celular dependendo também da ação coordenada entre nDNA e mtDNA (Bengtsson et
al., 2001). Ainda a citrato sintase, é uma enzima transferase que controla a etapa inicial do ciclo
do ácido tricarboxílico. Embora seja codificada no núcleo mitocondrial, se localiza na matriz
dessa organela (Bengtsson et al., 2001).
Assim, diversas proteínas e vias estão relacionadas ao processo de biogênese
mitocondrial, devido a sua importância dentro do funcionamento celular. Dessa maneira, no
próximo item utilizaremos dessas proteínas e fatores transcricionais para caracterizar como as
variáveis de treinamento podem influenciar na biogênese mitocondrial.
2.4. Influência da intensidade e volume sobre a biogênese mitocondrial
As variáveis de intensidade e volume de treinamento são capazes de promover
diferentes adaptações mitocondriais, sendo que alguns estudos sinalizam uma relação da
intensidade com a melhora da função e o volume, com o aumento da biogênese mitocondrial
(Bishop et al., 2014). O treinamento de endurance, no qual ocorre a prevalência do volume e
uma moderada intensidade, é reconhecido por beneficiar o condicionamento aeróbio e aumentar
22
o conteúdo de mitocôndrias (Greggio et al., 2017). Por outro lado, estudos têm indicado que
exercícios em alta intensidade possam ser mais eficientes nesse processo (MacInnis e Gibala,
2017; Scalzo et al., 2014).
Com a proposta de investigar uma possível “intensidade-dependência” na regulação da
expressão de PGC-1α no músculo esquelético humano, Egan et al. (2010) propuseram um
experimento agudo em cicloergômtro, em que duas intensidades foram avaliadas, sendo uma
equivalente 40% (baixa intensidade) e, a segunda, em 80% (alta intensidade) do VO2pico. A
maior contração do músculo esquelético em intensidade alta de exercício promoveu uma maior
ativação da sinalização das proteínas quinases AMPK e CAMKII como resultado do aumento
do influxo de cálcio, aumento da necessidade de energia e estresse celular. Essas proteínas
quinases são algumas das principais reguladoras upstream da PGC-1α, apresentando, nesse
caso, uma maior expressão em intensidades altas. Em animais, essa relação de “intensidade-
dependência” da PGC-1α também foi testada por Brandt et al. (2017) mostrando que em
exercício agudo e treinamento a intensidade estabelece uma relação crescente com as respostas
de expressão. Nesse caso, conteúdo de COXIV não se alterou, bem como, atividade de citrato
sintase reduziu com a intensidade.
Embora PGC-1α regule as atividades transcricionais nucleares e mitocondriais, a análise
isolada da sua expressão pode levar a conclusões errôneas sobre como a intensidade de
exercício geram adaptações no conteúdo mitocondrial. Nesse contexto, Cochran et al. (2014)
propuseram dois experimentos em ciclo ergômetro, sendo que o primeiro examinava se a
cascata de sinalização ligada a biogênese mitocondrial era sensível ao método de exercício.
Assim, um exercício intervalado de alta intensidade com 4 séries de Wingate (30s) com pausas
de 4 min e um exercício em all-out (~4min) foram executados. Ambos apresentaram aumento
na expressão de AMPK, p38 MPK e PGC-1α mRNA em tecido muscular esquelético. O
segundo experimento consistia de verificar se haveria o aumento de atividade de citrato sintase
e conteúdo de COX, após 6 semanas (3 vezes por semana) dos mesmos protocolos de exercício.
Neste caso, apenas o treinamento em alta intensidade apresentou o aumento de COX,
especificamente de subunidade 4, acompanhado de uma melhora de VO2max. A atividade de
citrato sintase não apresentou diferença entre as intervenções.
Em complemento, Granata et al. (2016) propuseram um treinamento de 4 semanas
contemplando três protocolos, um contínuo (25 - 30min) com intensidades abaixo do limiar
anaeróbio; um HIIT ‘high intensity interval training’ com 4min de exercício em intensidades
supra limiares e pausa ativa de 2min e um SIT ‘sprint interval training’ com 30s de exercício
em intensidades acima da potência pico e pausa passiva de 4min. Os autores observaram que o
23
conteúdo de proteína PGC-1α após o treinamento em SIT, entretanto atividade de citrato sintase
e TFAM não se alteraram.
A maior intensidade de exercício parece promover modificações na PGC-1α, entretanto
os outros marcadores de biogênese mitocondrial parecem não acompanhar tais modificações.
Ainda, resultados discrepantes são também encontrados, como o estudo de Mille-Hamard et al.
(2015) no qual propuseram três diferentes intensidades de exercício relativas a velocidade
crítica e velocidade pico para camundongos. A análise de correlação apresentou uma relação
negativa entre a expressão de PGC–1α e a intensidade, o que sugere neste estudo que
intensidades altas promovem um menor aumento da expressão desse coativador, enquanto que
a proteína TFAM apresentou uma redução para todos os grupos. Todos os três exercícios foram
realizados até exaustão representando uma significativa diferença entre os volumes e
consequentemente entre as cargas.
Bishop et al. (2014) apresentaram uma relação entre a atividade de citrato sintase e o
aumento do volume de treinamento, entretanto discrepantes respostas na literatura podem ser
motivadas por questões metodológicas como nível de condicionamento dos participantes,
duração ou método de treinamento (Leek et al., 2001; Vigelso et al., 2014). Discordantes
também são as alterações para TFAM e COX levantadas por Islam et al. (2017), em relação as
com respostas coordenadas com a PGC–1α principalmente para o modelo humano, indicando
uma diferença nas respostas frente aos estímulos em decorrência da espécie e do tecido.
Os tecidos esquelético, cardíaco e hepático demandam diferentes necessidades
energéticas gerando adaptações específicas a cada nível celular. A diferença na resposta da
PGC-1α entre os tecidos esquelético e cardíaco pode ser atribuída as diferenças na
disponibilidade de fatores transcricionais e sinalização celular (Russel et al., 2004). Diferente
dos outros tecidos, a demanda energética do coração é elevada, dependendo assim de uma alta
produção de energia, que é sustentada por uma especializada capacidade do sistema
mitocondrial (Leone, et al., 2011). Evidencia-se também que o tipo e a intensidade do exercício
determinam a natureza e o grau das adaptações nesse tecido com mudanças hemodinâmicas que
fornece estímulo para crescimento e adaptações atriais e ventriculares (Fulghum e Hill, 2018).
A PGC-1α parece ser um ponto comum aos processos de biogênese mitocondrial nesses
tecidos, sendo que no coração é sensível ao aumento de catecolaminas, promovido pelo
exercício, via sinalização de receptores β-adrenérgicos (Fulghum e Hill, 2018). Entretanto, o
papel desse coativador, não se restringe apenas à resposta dos mecanismos contráteis e de
estresse como anteriormente elucidados. Destaca-se também, seu importante papel na
maturação metabólica cardíaca, sendo que durante o período fetal, o coração sofre uma
24
mudança dramática na preferência de substratos energéticos, que inicialmente é dependente de
glicose e lactato, e após o nascimento, apresenta uma elevada preferência pela oxidação de
ácidos graxos na mitocôndria (Lehman et al., 2008).
A mudança do substrato energético cardíaco é resultado de uma superexpressão de
PGC-1α elevando o processo de biogênese mitocondrial na fase neonatal (Lehman et al. 2008;
Lai et al. 2008). Entretanto, Russel et al. 2004 conferiu que, ao induzir essa superexpressão de
PGC-1α em camundongos adultos, ocorre um aumento moderado do número de mitocôndrias,
desarranjos na estrutura mitocondrial e cardiopatias, sugerindo que alguns componentes do
processo de biogênese mitocondrial fiquem inativos em células adultas do miocárdio,
possivelmente sendo mais resistente à essas adaptações.
Em relação ao fígado, o exercício pode modificar os componentes mitocondriais por
meio de mecanismos fosfosrilativos, capacidade oxidativa de substratos, biogênese
mitocondial, danos oxidativos e formação de antioxidantes (Santos-Alves at al., 2015). Esse
tecido possui como importante função a gliconeogênese, que é a formação de glicose por
compostos como lactato, aminoácidos e glicerol, podendo esse processo aumentar frente ao
exercício. Diferentes intensidades relativas ao limiar anaeróbio podem contribuir para tal
processo, sendo que o lactato acumulado em intensidade de domínio severo poderia provocar
modificações na infraestrutura bioenergética hepática para facilitar o processo de
gliconeogênese em detrimento da fosforilação oxidativa e das adaptações mitocondriais (Lu et
al., 2013).
Como amplamente elucidado anteriormente, a relação de adaptações mitondriais
mediante as variáveis do exercício e ao tecido muscular são mais visados na literatura (Bishop
et al., 2014), entretanto há a necessidade de estudar a relação com outros tecidos buscando-se
entender o complexo mecanismo adaptativo. Ainda em relação à esse tecido, o músculo
esquelético possui uma ampla plasticidade em resposta as demandas energéticas apresentando
fenotipagens diferentes como tipo I, IIa, IId/x e IIb (Yan et al., 2011). Fibras tipo I são fibras
de contração lenta, oxidativas dependentes dofluxode energia mitocondrial e menor produção
de força. As fibras tipo IIa são fibras rápidas, apresentando também um perfil oxidativo, porém
apresentam uma produção de força rápida. Fibras tipo IId/x são fibras de contração rápida com
perfil glicolítico. Dentro desse perfil a utilização de glicogênio, que é pouco utilizado em
exercício de baixa intensidade, se torna um predominante substrato para manter o esforço
(Jensen e Richter, 2012). Por último, as fibras tipo IIb são fibras de contração mais velozes e
com um fenótipo glicolítico mais acentuado que o tipo anterior (Yan et al., 2011). Cada
25
mecanismo de contração e utilização energética desencadeia específicas cascatas de sinalização
podendo gerar adaptações mitocondriais.
Assim, as relações entre as variáveis de treinamento (intensidade e volume) e as
adaptações de biogênese mitocondrial precisam ser melhores investigadas, considerando tanto
os efeitos agudos e crônicos acrescentando a essas modulações uma relação de isocarga
viabilizando a comparação entre as prescrições de exercício.
3. OBJETIVO
3.1. Geral
Investigar as respostas de conteúdo proteico de marcadores de biogênese mitocondrial em
tecido muscular esquelético, cardíaco e hepático após esforço agudo isocarga, bem como as
adaptações aeróbias após treinamento em modelo monótono isocarga e periodizado linear de
ratos nadadores.
3.2. Objetivos específicos:
I) Investigar os efeitos de uma sessão de exercício realizado em cinco diferentes
relações de intensidade e volume sobre o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e
atividade de citrato sintase em tecidos muscular esquelético, cardíaco e hepático.
II) Comparar o conteúdo de glicogênio muscular (gastrocnêmio e glúteo) e hepático
nos animais que realizaram a sessão de exercício nas diferentes relações de
intensidade e volume.
III) Investigar as adaptações promovidas por 12 semanas de diferentes treinamentos
monótono (sub, no e supra limiar anaeróbio) sobre o conteúdo de proteína COXIV,
TFAM e atividade de citrato sintase nos tecidos musculares esqueléticos, cardíaco
e hepático.
IV) Comparar o conteúdo de glicogênio muscular (gastrocnêmio e glúteo) e hepático
nos animais que realizaram os treinamentos monótonos em diferentes relações de
intensidade e volume e periodizado linear.
V) Comparar a capacidade aeróbia e índice anaeróbio entre os períodos pré e pós
intervenções de treinamento.
26
4. HIPÓTESES
De acordo com os objetivos apresentados, as seguintes hipóteses foram levantadas:
I) A proteína COXIV, por estar relacionada a fosforilação oxidativa apresentará seu
conteúdo aumentado nos tecidos musculares e cardíaco de animais submetidos à
sessão de exercício em intensidades acima do limiar anaeróbio, enquanto a proteína
TFAM, responsável pela manutenção e replicação do mtDNA, bem como a
atividade de citrato sintase estarão aumentadas para os animais que realizarem
exercício em intensidades abaixo a na intensidade de limiar. No tecido hepático, o
conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase estarão reduzidos
nos animais que submetidos a sessão de exercício com intensidades acima do limiar
anaeróbio.
II) Após 4h da sessão do exercício, ainda será observada a depleção do glicogênio
muscular nos grupos exercitados em relação ao controle.
III) Em termos de adaptações advindas do treinamento, a proteína COXIV apresentará
seu conteúdo aumentado nos tecidos musculares e cardíaco dos animais que
treinarão de modo monótono com intensidades acima do limiar anaeróbio, enquanto
a proteína TFAM e a atividade de citrato sintase estarão aumentadas nas relações de
treinamento monótono abaixo e na intensidade de limiar e periodizado linear. No
tecido hepático, o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase
estarão reduzidas nos animais que treinarão de modo monótono com intensidades
acima do limiar anaeróbio.
IV) Após 12 semanas de treinamento, os animais apresentarão supercompensação de
glicogênio nos tecidos musculares e hepáticos.
V) Os animais que treinarão no modelo monótono abaixo e na intensidade de limiar
anaeróbio e periodizado linear, apresentarão maiores níveis de capacidade aeróbia,
já ratos que treinarão no modelo monótono acima do limiar anaeróbio apresentarão
maiores índices anaeróbios.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Animais
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Uso de Modelos
Animais – CEUA da Universidade Estadual de Campinas (protocolo 3156-1). Para cada
27
experimento foram usados 60 ratos Wistar, com idade inicial de 46 dias e massa corporal de
242,5 ± 23,7g. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas de polipropileno, com um
número máximo de 5 ratos por caixa e mantidos em ambiente controlado de temperatura (22 ±
1 Cº) e umidade (50 ± 5 %). O ciclo dos animais não foi invertido sendo que todos os
procedimentos iniciaram às 18h (período noturno). Os animais receberam água e ração
balanceada (CR1, NUVILAB, BR) ad libitum.
5.2. Procedimentos experimentais gerais
5.2.1. Adaptação ao meio líquido –
Para ambos os experimentos, a carga atada ao dorso foi expressa como a porcentagem
equivalente de massa corporal (% mc) para cada animal. Essa carga foi construída com chumbo
e elástico de látex como demonstrado na Figura 2. Essas cargas foram feitas individualmente
para cada animal. A adaptação ao meio líquido foi realizada durante 14 dias consecutivos
anteriores ao período de treinamento. O consistiu inicialmente de 3 dias de exposição a água
rasa (5 cm de profundidade) com duração de 15 min, seguido de 5 dias de exercício em água
profunda (100 cm de profundidade) com aumento progressivo da duração ao longo dos dias (2
a 10 min). Entre 9º e 14º dia, o exercício foi realizado em água profunda (100 cm de
profundidade), com um aumento progressivo da intensidade e redução do volume de exercício
que variou entre 3 a 15%mc e 5min a 30s de duração (Lima et al. 2017). Em todos os
procedimentos a água apresentava uma temperatura de 31 ± 1 Cº.
5.2.2. Teste do Lactato Mínimo:
O teste de lactato mínimo foi realizado em ambos os experimentos para a determinação
da capacidade aeróbia dos animais e foi desenvolvido em concordância com o estudo de de
Araujo et al. (2012). O teste de lactato mínimo é composto de três fases, sendo a primeira de
indução a hiperlactacidemia correspondendo a um esforço de 30s com 13% mc, seguidos de
30s de pausa passiva e um exercício em mesma intensidade (13%mc) até a exaustão; a segunda,
um repouso passivo com duração de 9 min; e a terceira, um teste incremental com estágios de
5 min e com intensidades relativas correspondentes a 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6% e 7% mc.
Amostras sanguíneas (25ul) foram extraídas da porção distal da cauda do animal nos momentos
pré-teste, pós 8min e ao final de cada estágio da fase incremental. Para a determinação da
intensidade de lactato mínimo (iLM) foi realizado um ajuste da concentração de lactato
sanguíneo (mmol/l) versus o tempo (min), incluindo também o valor da concentração de lactato
28
pico obtida pela fase de hiperlactacidêmia. Desse modo foi determinado o tempo em que
ocorreu o valor mínimo de lactato, sendo esse identificado na reta de regressão da intensidade
(%mc) versus o tempo (min) (Figura 1). A iLM foi determinada individualmente, sendo um
parâmetro de capacidade aeróbia dos animais onde ocorre o equilíbrio entre produção e
remoção de lactato.
Figura 1. Representação da determinação da intensidade de lactato mínimo (iLM) pelo método
intensidade vs. tempo. a) Curva da concentração de lactato sanguíneo ao longo da fase 3 do teste de
lactato mínimo (teste incremental) para determinação do ponto mínimo, b) Reta de regressão intensidade
vs. tempo.
5.3. Desenho experimental
A sessão de desenho experimental foi dividida em dois tópicos equivalente ao
experimento agudo e crônico, seguindo a sequência cronológica dos eventos realizados. Todos
os procedimentos experimentais foram realizados em tanques com água profunda (100cm x 30
cm) e temperatura controlada de 31±1 Cº durante o período noturno, respeitando o horário de
maior atividade espontânea dos animais (Beck et al. 2014). Devido à alta sensibilidade dos
roedores a luminosidade, um filtro com luz vermelha (ROSCO®, SUPERGEL, > 600nm,
<15lux) foi utilizada nos ambientes de exercício e treinamento (Figura 2). Os animais foram
aleatorizados entre os grupos durante a execução dos exercícios e, após secos em maravalha
limpa e devolvidos para suas respectivas gaiolas.
mm
ol/
L
29
Figura 2. A) Rato nadando durante procedimento experimental. Filtro de luz vermelha no ambiente de
coleta. B) Cargas construidas com peças de chumbo e latex.
A B
30
5.3.1. Experimento agudo
A representação esquemática do desenho experimental do experimento agudo está
apresentada na Figura 3.
Figura 3. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento agudo. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do
tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente
separados nos grupos exercícios e 4h após a sessão aguda foram eutanasiados. Todos os procedimentos
foram realizados no período noturno.
Os animais (n=60, idade 60 dias, mc=293,2 ± 24,8g) foram submetidos ao teste de
lactato mínimo para a determinação da iLM 24h após o término dos 14 dias referentes a
adaptação ao meio líquido. Após a realização desse teste, os animais passaram por um período
de 72h de repouso passivo e foram aleatoriamente divididos em 5 grupos exercício e 1 controle
como descrito na Tabela 1. O produto entre a intensidade e volume se manteve a mesma entre
os grupos, sendo de 3000 u.a.. Após 4h da finalização do exercício os tecidos musculares,
hepático e cardíaco foram extraídos e armazenados para a posterior análise.
31
Tabela 1. Descrição das intensidades (%mc), volume (min) e carga dos grupos exercício
referentes ao experimento agudo.
Grupos
Exercício Intensidade(%mc) Volume (min)
Carga
(Intensidade*Volume)
GC - -
GE80 80% 37,5 3000
GE90 90% 33,3 3000
GE100 100% 30,0 3000
GE110 110% 27,25 3000
GE120 120% 25,0 3000
GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM,
GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo
exercitado a 120% da iLM
5.3.2. Experimento Crônico
Em concordância com o experimento agudo os procedimentos iniciais foram
semelhantes e a mesma relação de carga foi utilizada para os grupos de treinamento monótono.
Para esse experimento foram mantidas as intensidades de 80, 100 e 120% da iLM na tentativa
de acentuar as adaptações advindas do treinamento. A representação esquemática do desenho
experimental do experimento crônico está apresentada na Figura 4.
32
Figura 4. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento crônico. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o primeiro teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a
determinação do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram
randomicamente separados nos grupos e foram submetidos a um período de 12 semanas de treinamento
com frequência de 6 dias/semana. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Os animais (n=60, idade 60 dias, mc = 277,8 ± 26,2g) foram submetidos ao teste de
lactato mínimo para a determinação da iLM e Tlim. Após a realização desse teste, os animais
passaram por um período de 24h de repouso passivo e foram aleatoriamente divididos em 5
grupos treinamento, sendo 4 monótonos (Tabela 2) e 1 periodizado linear (Tabela 3), e 1 grupo
controle. O modelo monótono propõe a manutenção da relação entre intensidade vs. volume ao
longo do período, enquanto o modelo periodizado propõe que o volume se reduza e a
intensidade se eleve gradativamente.
33
Tabela 2. Descrição das intensidades (%mc), volume (min), carga de treinamento, frequência
e o momento em que os animais foram eutanasiados referentes ao experimento crônico.
Grupos
Treinamento Eutanásia
Intensidade
(%mc)
Volume
(min)
Carga
(Intensidade*Volume)
Frequência
Semanal
Baseline Semana 0 - - - -
GC Semana
12 - - - -
GT80 Semana
12 80% 37,5 3000
6
dias/semana
GT100 Semana
12 100% 30,0 3000
6
dias/semana
GT120 Semana
12 120% 25,0 3000
6
dias/semana
GC= grupo controle; GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da
iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear.
Os animais treinaram com uma frequência de 6 dias na semana durante um período de
12 semanas. Durante esse período os animais foram semanalmente pesados para o ajuste de
suas intensidades e o TLM realizado ao final dos ciclos respeitando a periodização linear. Ao
final do período de treinamento foram submetidos à um TLM e 24hs após eutanasiados,
considerando-se o tempo para observar mudanças no conteúdo de glicogênio. Os tecidos
musculares, hepático e cardíaco foram extraídos e armazenados para a análise.
34
Tabela 3. Organização do treinamento do grupo periodizado linear (GPE) utilizando as
intensidades (END1, END2, END3 e ANA) ao longo das 12 semanas como proposto por de
Araújo et al., 2012.
OFF: Dia sem sessão de treinamento; END1: Intensidade de 60% da iLM com volume de 60min; END2:
Intensidade de 100% da iLM com volume de 30min; END3: Exercício intermitente com 3 séries de
5min na intensidade de 120% da iLM e separadas por 1min de pausa passiva; ANA: Exercício
intermitente com 5 séries até a exaustão na intensidade de 260% da iLM e separadas por 1min de pausa
passiva.
5.3.3. Amostras sanguíneas:
O volume de 25 μL de sangue foi extraído da porção distal da cauda do animal por meio
de tubos capilares heparinizados e calibrados. As amostras foram imediatamente transferidas
para tubos eppendorf de 1,5mL contendo 400 μL de TCA (Ácido tricloroacético - 4%) para
desproteinização do sangue e estocadas em geladeira entre 2º a 8ºC. Posteriormente, foi extraído
100μL de sobrenadante e transferidos para tubos de ensaio contendo 500μL de reativo (estoque
glicina/EDTA e hidrazina-hidrato 1,2ml, 100mg de NAD (Beta-nicotinamide dinicleotide
SIGMA) e 150μL de LDH (L-lactic dehydrogenase bovine heart)) devidamente ajustadas a um
pH de 8,85 e incubado durante 60min. As amostras foram analisadas por espectrofotometria,
com absorbância de 340nm, contra a curva de calibração (Engel e Jones, 1978).
35
5.4. Obtenção do material biológico
Após 4h da intervenção aguda e 24h do período de treinamento, os animais foram
anestesiados com 1mL de Tiopental sódico (25mg.ml-1) e eutanasiados via toracotomia. Foram
extraídas amostras de tecido muscular esquelético do sóleo, gastrocnêmio e glúteo, tecido
hepático e cardíaco (ventrículo esquerdo). Esses tecidos foram imediatamente armazenados em
ultrafreezer -80º C para posteriores análises.
5.4.1. Quantificação de proteína por Western blotting
Para as amostras foram utilizados 25mg de fígado 50mg de coração e tecido esquelético.
Os tecidos foram homogeneizados em tampão de extração para imunoprecipitação contendo
1% de Triton X 100, 100mM de Tris (pH 7,4), 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de
fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10mM de vanadato de sódio, 2mM de PMSF e 0,1 mg/mL
de aprotinina a 4ºC. O homogeneizado foi centrifugado a 11000rpm durante 30min e a partir
do sobrenadante, foi determinada a concentração de proteínas utilizando o método de Bradford
(Bradford, 1976). As amostras foram suspensas na solução conservante de Laemmli, contendo
100mmol/L de DTT (dithiothreitol). Após rápida fervura, as amostras foram pipetas em gel de
poliacrilamida para separação por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em SDS-
PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-
RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada overnight com anticorpo primário especifico
em solução de albumina 5%. A ligação de anticorpo com proteínas não-específicas foi
minimizada pela pré incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5% de
leite em pó desnatado; 10mmol/L de Tris; 150mmol/L de NaCl; 0,02% de Tween 20) por 1,5h.
Os anticorpos para TFAM e COXIV foram ambos da Proteintech™ e suas proporções de
diluição foram de 1:200 e 1:500 respectivamente. As bandas das proteínas foram quantificadas
utilizando-se do software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). A massa molecular da proteína
TFAM foi de 25kDa e COXIV de 17kDa. O controle endógeno para ambas as proteínas foi a
alfa tubulina de massa molecular 55kDa.
5.4.2. Atividade enzimática de citrato sintase (CS)
As amostras foram homogeneizadas em tampão contendo PBS (pH 7.3), centrifugados
por 2 minutos, a 4° C (5000 rpm), sendo o sobrenadante coletado para a análise. Uma mistura
de 1M Tris-HCl (pH 8.1), 25 mM de oxalacetato, 10 mM de DTNB [5.5-ditiobis (ácido 2-
nitrobenzóico)] e 5mM de acetila CoA foi adicionada às amostras com aproximadamente 3µg
de proteína total. A redução de DTNB por citrato sintase foi medida por espectrofotômetro
36
durante 5 minutos (37ºC), com absorbância de 412 nm (coeficiente de extinção = 13,6 mM-1
cm-1). A atividade enzimática de citrato sintase foi expressa como µmol de citrato .min-1. mg
de proteína-1.
5.4.3. Estoque de glicogênio
A concentração de glicogênio no tecido muscular esquelético (gastrocnêmio e glúteo) e
hepático foram analisados de acordo com Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers, and Smith (1951).
Amostras do músculo (250mg) e fígado (500mg) foram preparadas em KOH (30%), depois
misturadas a uma solução de sulfato de sódio e etanol para a precipitação de glicogênio. As
amostras foram homogeneizadas com 20 μlL fenol (80%) e 2,0 ml de ácido sulfúrico. A
absorbância (490 nm) foi obtida após 15min de ebulição e a concentração de glicogênio foi
calculada a partir de uma curva de calibração.
5.5. Análise Estatística
Os dados estão apresentados em média ± ep (erro padrão). A normalidade dos dados foi
verificada pelo teste de Shapiro-Wilk e, assim que atestado, uma estatística paramétrica foi
utiliza. Para identificar as diferenças dentro dos grupos exercício e treinamento dos conteúdos
de proteína COXIV, TFAM, atividade de citrato sintase e concentração de glicogênio (variáveis
dependentes), o teste de Anova one-way foi realizado seguido do post-hoc de Fisher. Para
identificar as diferenças da iLM e Tlim (variáveis dependentes) entre os períodos pré e pós
treinamento foi usado o teste de Anova para medidas repetidas seguido do post-hoc de Fisher.
Para todas as análises foi adotado o p < 0,05.
6. RESULTADOS
6.1. Experimento Agudo
Os valores de média ± ep do Tlim (13% mc) e iLM (%mc) referentes ao teste de lactato
mínimo dos animais que realizaram os esforços agudos podem ser observados na Tabela 4.
37
Tabela 4. Média ± ep dos valores de tempo limite - Tlim (s) e intensidade de lactato mínimo -
iLM (%mc) obtidos no teste de lactato mínimo (TLM).
TLM
Grupos Tlim (13%mc) (s) iLM (%mc)
GC 98,0 ± 9,37 4,6 ± 0,40
GE80 79,0 ± 6,56 5,3 ± 0,24
GE90 96,6 ± 14,02 4,6 ± 0,20
GE100 83,8 ± 10,22 4,8 ± 0,20
GE110 105,0 ± 11,90 5,4 ± 0,30
GE120 91,6 ± 3,40 4,7 ± 0,25
GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM,
GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo
exercitado a 120% da iLM.
Os resultados apresentados nas Figura 5 e Figura 6 são referentes respectivamente a
média ± ep da quantificação das proteínas COXIV e TFAM nos músculos gastrocnêmio, sóleo,
cardíaco e hepático. Após 4h da sessão aguda de exercício, não foi encontrada alteração do
conteúdo proteico das proteínas COXIV e TFAM para os tecidos musculares, cardíaco e
hepático.
38
Figura 5. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo (n=4).
Comparação entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) no gastrocnêmio e sóleo.
(GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM,
GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo
exercitado a 120% da iLM)
39
Figura 6. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo (n=4).
Comparação entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos hepático e
cardíaco. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90%
da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e
GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
Para a atividade enzimática da citrato sintase (Figura 7), diferenças foram observadas
gastrocnêmio para o GE90, que apresentou uma menor atividade enzimática em comparação
aos grupos GE80, GE100 e GE110 (GE90 vs. e GE80, p = 0,02, GE90 vs. GE100, p = 0,007,
GE90 vs. GE110, p = 0,008). Já os grupos GE100 e GE110 apresentaram uma maior atividade
em relação aos grupos GE90 e GE120 (GE100 vs. GE120, p=0,03, GE110 vs. GE120, p=0,03).
Para o tecido hepático tanto o grupo GE110 quanto o grupo GE120 apresentaram menor
atividade enzimática em relação ao GE80 (GE110 vs. GE80, p = 0,02, GE120 vs. GE80, p =
0,006) e GE90 (GE110 vs. GE90, p = 0,03, GE120 vs. GE90, p = 0,01).
40
Figura 7. Média ± ep da atividade de citrato sintase para o exercício agudo (n=10). Comparação entre
os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos musculares (gastrocnêmio e
sóleo), hepático e cardíaco. b diferente de GE80; c diferente de GE90; d diferente de GE100; e diferente
de GE110; f diferente de GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle;
GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo
exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a
120% da iLM).
Para os valores do conteúdo de glicogênio no gastrocnêmio (Figura 8), o grupo GC
apresentou um valor aumentado em relação ao GE80 (p<0,001), GE90 (p=0,002), GE100
(p=0,007), GE110 (p<0,001) e GE120 (p<0,001). Para o tecido glúteo, o grupo GC apresentou
um maior conteúdo de glicogênio em relação ao GE80 (p=0,008), GE90 (p=0,005), GE100
(p=0,004), GE110 (p<0,001) e GE120 (p=0,003) e para o tecido hepático o grupo GC
apresentou um maior valor em relação ao GE80 (p<0,001), GE90 (p<0,001), GE100 (p<0,001),
GE110 (p<0,001) e GE120 (p<0,001).
f
f
f f f
41
Figura 8. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para o gastrocnêmio, glúteo e fígado para o
experimento agudo (n=10). b diferente de GE80; c diferente de GE90; d diferente de GE100; e diferente
de GE110; f diferente de GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle;
GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo
exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a
120% da iLM).
6.2. Experimento Crônico
No geral, após 12 semanas de treinamento, o Tlim (13%mc) reduziu de 132,5 ± 44,57s
para 61,8 ± 21,22s (p < 0,001) (Figura 9c) e a capacidade aeróbia, reduziu de 5,09 ± 0,33 %
mc, do período pré-intervenção, para 4,50 ± 0,50 % mc, no período pós intervenção (p < 0,001)
(Figura 9a). Para os valores normalizados de Tlim (13%mc) (Figura 9d), os animais GT80
apresentaram a menor redução em relação aos grupos GC (p=0,005), GT100 (p=0,03), GT120
(p<0,001) e GPE (p<0,001) no período pós-intervenção. Em relação a capacidade aeróbia
(Figura 9b), o grupo GC apresentou a maior redução de iLM (%mc) em relação aos grupos
GT80 (p =0,01), GT100 (p=0,02) e GT120 (p=0,001) e o grupo GPE apresentou diferença
apenas para o grupo GT120 (p=0,02).
42
Figura 9. (a) Média ± ep da iLM (%mc) para os grupos GC, GT80, GT100, GT120 e GPE; (b) Média
± ep da iLM normalizada pelas iLM do momento pré para os grupos; (c) Média ± ep da Tlim 13%mc
(s) para os grupos; (d) Média ± ep da Tlim 13%mc normalizada pelas Tlim 13%mc do momento pré
para os grupos a diferente de GC; c diferente de GT100; d diferente de GT120, e diferente de GPE, *
diferença entre pré e pós. P < 0.05. (GC= grupo controle; GT80=grupo treinamento a 80% da iLM;
GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM,
GPE=grupo treinamento periodizado linear.)
Os resultados apresentados na Figura 10 mostram a relação entre Tlim alcançado pelos
animais que treinaram ao longo do período e as respectivas iLM, ambas normalizadas, no
momento pós treinamento. Os grupos GT120 e GPE apresentaram menores valores dessa
relação em comparação ao GT80 (GT120 vs. GT180, p =0,002 e GPE vs. GT80, p=0,01).
43
Figura 10. Média ± ep da relação entre Tlim normalizado e iLM normalizado para os grupos GT80,
GT100, GT120 e GPE pós período de treinamento. a diferente de GT80. P < 0.05. (GT80=grupo
treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a
120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Os resultados apresentados na Figura 11 são referentes a média ± ep da quantificação
das proteínas COXIV e TFAM nos músculos gastrocnêmio e sóleo. A comparação entre os
grupos treinamento, controle e baseline para o conteúdo proteico de COXIV e TFAM, referente
ao experimento crônico, mostrou que o fator de transcrição TFAM apresentou um maior
conteúdo no gastrocnêmio para os grupos treinamento GT100 (GT100 vs. Controle, p = 0,04;
GT100 vs. Baseline, p = 0,001 e GT100 vs. GT120, p = 0,03) e GPE (GPE vs. Baseline, p =
0,03). No entanto, a proteína COXIV apresentou apenas um maior conteúdo no sóleo para os
grupos GT80 (GT80 vs. Baseline, p = 0.01; GT80 vs. GPE, p = 0.02), GT100 (GT100 vs.
Baseline, p = 0,04) e GT120 (GT120 vs. Baseline, p = 0,03; GT120 vs. GPE, p = 0.04).
44
Figura 11. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o gastrocnêmio e sóleo no
experimento crônico (n=6). a diferente de GC; b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de
GPE. Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo
treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento
periodizado linear).
45
Figura 12. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para os tecidos hepático e cardíaco do
experimento crônico (n=6). b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as
análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a
100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Os resultados apresentados na Figura 12 são referentes a média ± ep da quantificação
das proteínas COXIV e TFAM nos músculos cardíaco e hepático. Nesse caso, a proteína
COXIV apresentou um maior conteúdo no fígado para os grupos GT80 (GT80 vs. Baseline, p
= 0,04), GT100 (GT100 vs. Baseline, p = 0,03) e GPE (GPE vs. Baseline, p = 0,003; GPE vs.
GT120, p = 0,04). No entanto, não houve alteração de conteúdo para fator de transcrição TFAM
nos tecidos cardíaco e hepático nos grupos treinados.
Os resultados apresentados na Figura 12 são referentes a média ± ep da atividade de
citrato sintase nos músculos esqueléticos, cardíaco e hepático. A comparação entre os grupos
treinamento, controle e baseline mostrou que para o experimento crônico a atividade de CS foi
evidenciada no gastrocnêmio para o grupo treinamento GT120 (GT120 vs. CG, p = 0,002,
GT120 vs. Baseline, p = 0,009, GT120 vs. GT80, p = 0,004, GT120 vs. GT100, p = 0,007,
GT120 vs. GPE, p = 0,009).
No sóleo, a atividade enzimática foi aumentada nos grupos GT80 (GT80 vs. CG,
p=0,01; GT80 vs. Baseline, p = 0,006, GT80 vs. GT120, p = 0,03), GT100 (GT100 vs. CG,
46
p=0,005; GT100 vs. Baseline, p = 0,003, GT100 vs. GT120, p = 0,01) e GPE (GPE vs. CG,
p=0,002; GPE vs. Baseline, p = 0,001, GPE vs. GT120, p = 0,006).
Figura 13. Média ± ep da atividade de citrato sintase dos tecidos musculares (gastrocnêmio e sóleo),
hepático e cardíaco para o experimento crônico (n=10). a diferente de GC; b diferente de baseline; c
diferente de GT80; d diferente de GT100; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as análises foi
usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da
iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Os resultados apresentados na Figura 14 são referentes ao conteúdo de glicogênio. Para
os valores do conteúdo de glicogênio no músculo gastrocnêmio, apresentaram valores
aumentados em relação ao grupo Baseline o grupo GC (p=0,005), GT120 (p=0,003) e GPE
(p=0,02). Para o tecido hepático o grupo GC e GPE apresentaram um maior conteúdo em
relação ao Baseline (p=0,01, p=0,005), GT80 (p=0,001, p<0,001), GT100 (p=0,008, p=0,004)
e GT120 (p=0,007, p=0,004).
47
Figura 14. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para os tecidos gastrocnêmio, glúteo e fígado para o
experimento crônico (n=10). b diferente de baseline; c diferente de GT80; d diferente de GT100; e
diferente de GT120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM;
GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo
treinamento periodizado linear).
7. DISCUSSÃO
O objetivo da presente tese foi investigar as respostas de conteúdo proteico de marcadores
de biogênese mitocondrial em tecido muscular esquelético, cardíaco e hepático após esforço
agudo isocarga, bem como as adaptações aeróbias após treinamento em modelo monótono
isocarga e periodizado linear de ratos nadadores. Os resultados demonstraram que a relação de
intensidade e volume proposto para uma sessão de exercício isocarga não foi capaz de promover
o aumento do conteúdo de proteínas COXIV e TFAM nos tecidos estudados. Apesar disso, os
modelos de exercício em isocarga demonstraram depleção de glicogênio em tecidos musculares
e hepáticos, se caracterizando como suficientes para quebrar a homeostase do organismo e
potencialmente promover adaptações a longo prazo (Burke et al., 2017).
As intensidades acima da capacidade aerobbia apresentaram diminuição da atividade
enzimática de citrato sintase hepática, explicada por um possível aumento do processo de
gliconeogênese a partir do metabolismo do lactato (Lu et al., 2013). Ainda, os resultados da
atividade dessa enzima no gastrocnêmio corrobora com a noção de que ela é bastante sensível
aos estímulos agudos (Leek et al., 2001). A característica de baixa atividade oxidativa do
gastrocnêmio pode ter contribuído para uma modulação difusa da atividade da citrato sintase
nesse tecido.
48
A ausência de grandes respostas durante uma única sessão de exercício fortalece a noção
de que as adaptações no conteúdo de TFAM, COXIV e atividade de citrato sintase são
decorrentes da somação dos estímulos ao longo de um período de treinamento. A síntese de
novas organelas mitocondriais é resultado de um acúmulo de estímulos agudos como
demonstrado por Hood et al. (2015), onde o aumento da expressão de mRNAs desencadeados
a cada nova sessão de exercício promove a tradução de proteínas fundamentais para o
funcionamento da mitocôndria. Ainda, os resultados demonstram que as adaptações crônicas
advindas dos treinamentos monótonos e periodizado são não apenas dependentes da intensidade
de exercício, como também do tecido estudado.
A intensidade dependência verificada no experimento crônico corrobora com os dados
em seres humanos encontrados para esforços agudos (Egan et al., 2010), sendo que a presente
tese também apresenta esses efeitos em diferentes tecidos com diferentes características
contráteis. Dentre essas adaptações, o maior conteúdo de TFAM no gastrocnêmio em
decorrência do período de treinamento na intensidade de capacidade aeróbia (GT100) sugere
uma sinalização no sentido de diferenciação celular (Collu-Marchese et al., 2015) nesse
músculo de característica branca no momento de 12 semanas. A proteína TFAM é codificada
no núcleo celular e translocada até a mitocôndria, onde se liga a área promotora do mtDNA e
inicia o processo de transcrição, replicação e manutenção desse mtDNA (Theilen et al., 2017).
O gastrocnêmio é representado por fibras com características tipo II, de contração rápida
e que apresentam um baixo nível de concentração mitocondrial (entre 2-3% do tecido) (Hood
et al., 2016). Essas modificações de fibras do tipo glicolítica para oxidativa modifica a via de
ressíntese de ATP e são frequentes quando a característica do exercício é de endurance (Yan et
al., 2011). Esse processo se deve à contração muscular necessária para manter o ritmo do
exercício no qual aumenta o influxo de Ca+2 que se liga a proteína mediadora Calmodulina,
sinalizando o aumento de proteínas quinases (CaMK), o que promove o aumento de PGC-1α,
e desencadeia o processo de biogênese mitocondrial nos tecidos musculares (Yan et al., 2011).
Ainda a AMPK e SIRTs se modificam com demanda energética e também regulam PGC-1α
(Yan et al., 2011; Buler et al., 2014). Dessa maneira, a continuidade desse treinamento por um
período maior do que 12 semanas poderia resultar em um aumento de COXIV no gastrocnêmio
para o grupo GT100 – o que poderia influenciar nos resultados de desempenho – porém futuros
estudos se fazem necessários para comprovar essa teoria.
O maior conteúdo de COXIV no músculo sóleo para todos os grupos em treinamento
monótono demonstra um aumento na biogênese mitocondrial consolidado nesse músculo.
Diferente do gastrocnêmio, o sóleo apresenta uma predominância de fibra tipo I, de
49
característica mais oxidativa, cuja saturação de mitocôndrias já é alta (Yan et al., 2011), o que
pode ter favorecido a ocorrência de biogênese mitocondrial nesse tecido. A proteína COXIV é
a quarta subunidade da cadeia de transporte de elétrons, e um aumento no seu conteúdo indica
aumento na capacidade oxidativa das mitocôndrias em decorrência da contração muscular
(Bengtsson et al., 2001; Li et al., 2006; Ludwig et al., 2001). Ainda, o seu aumento indica um
processo completo do DNA mitocondrial entre transcrição e tradução de proteínas induzindo
concretamente a biogênese mitocondrial (Collu-Marchese et al., 2015).
Após o período de treinamento, a atividade da enzima citrato sintase apresentou um
comportamento homogêneo no músculo gastrocnêmio, sendo aumentada apenas no grupo que
treinou acima da capacidade aeróbia – GT120. No músculo sóleo, a mesma enzima apresentou
atividade aumentada nos grupos GT80, GT100 e GPE. Além de conteúdo mitocondrial, esse
aumento pode ser consequência de uma melhora de função da organela, uma vez que a atividade
da citrato sintase disponibiliza para a cadeia de transporte de elétrons os agentes redutores
(Bowtell et al., 2007). Considerando que o grupo GT120 também apresentou menor redução
capacidade aeróbia após o período de 12 semanas, é possível que a somação entre uma melhor
função mitocondrial no gastrocnêmio e o aumento da biogênese mitocondrial no sóleo
expliquem a melhor capacidade aeróbia desse grupo em relação aos demais – que teriam
apresentado melhora de função e biogênese mitocondrial apenas no músculo sóleo.
O grupo GT120 demonstrou não só um aumento da biogênese mitocondrial em fibras
musculares do tipo I como uma possível melhora de função das mitocôndrias em tecidos
musculares do tipo II, refletindo positivamente na sua capacidade aeróbia em relação aos
demais grupos. De maneira similar ao presente estudo, de Araujo et al. (2016) demonstraram
que o treinamento de alta intensidade e periodização monótona ao longo de 12 semanas parece
ser mais eficaz sobre a capacidade aeróbia do que modelos de treinamento em intensidades
mais baixas ou adotando periodização linear (de Araujo et al., 2013; de Araujo et al., 2012).
Ainda, a indicação de aumento de biogênese mitocondrial advindas de adaptações de treinos de
alta intensidade, acompanhadas de melhora de parâmetros aeróbios, também são encontradas
em estudos com modelo humano (MacInnis and Gibala, 2017; MacInnis et al., 2017).
A quantidade de proteína COXIV no fígado apresentou aumento nos grupos GT80,
GT100 e GPE apenas em relação a condição inicial do baseline (ratos mais jovens) e não ao
grupo não treinado (GC). O GPE, por sua vez, apresentou aumento em relação ao baseline e
um aumento em relação ao GT120. Embora outros estudos não discutam o efeito de diferentes
intensidades sobre a modulação dessa proteína no fígado, há evidências do aumento dela, sendo
em conteúdo ou atividade, em decorrência do exercício (Lu et al., 2013; Sun et al., 2010).
50
A característica de variabilidade da intensidade a qual o GPE foi submetido pode ter
favorecido uma modificação na infraestrutura bioenergética hepática para facilitar o processo
de gliconeogênese em detrimento da fosforilação oxidativa, assim como discutido em Lu et al.
(2013) e sinalizado no nosso estudo a partir de um aumento expressivo do conteúdo de COXIV
no tecido hepático. Presumivelmente, o lactato produzido durante o exercício pode promover
alterações hepáticas aprimorando o Ciclo de Cori (conversão glicose – lactato) aumentando a
capacidade do fígado para manter a homeostase da glicose durante condições de esforços
sustentados. Essa mudança hepática provocada pelo treinamento com característica de
periodização linear é suportada pelos resultados de glicogênio hepático, que se manteve
equivalente em relação ao grupo controle, enquanto os demais grupos treinados sob regime de
periodização monótona tiveram seus valores reduzidos.
Diferente do esperado, o GT80 apresentou menor redução no resultado de desempenho
em alta intensidade (Tlim a 13%mc). De maneira controversa, essa é uma característica de
resistência a acidose muscular provocada pelo exercício, sendo um resultado que seria mais
esperado para os grupos que treinaram em alta intensidade. Contudo, os animais do GT80
apresentaram alterações de marcadores de biogênese mitocondrial COXIV e atividade de citrato
sintase, principalmente, no tecido muscular sóleo, o que poderia nesse caso ter aumentado o
influxo de lactato devido ao aumento dos transportadores monocarboxílicos 1 (MCT1) que se
também se co-localizam na membrana mitocondrial (Brooks, 2009).
É possível que durante o exercício de Tlim (13% mc), a produção de alta concentração
de lactato principalmente pelas fibras glicolíticas tenha sido tamponada por um maior número
de organelas das fibras oxidativas, que removem e utilizam esse substrato para produção de
energia. Adicionalmente, a relação entre o tlim normalizado e iLM normalizado mostrou que o
grupo GT80 parece ser mais eficiente no que se refere ao desempenho, pois esse se sustenta
mais no exercício mesmo com uma menor adaptação aeróbia, principalmente em relação ao
grupo GT120. Corroborando com a noção da importância da biogênese mitocondrial na
manutenção do exercício em alta intensidade, as adaptações similares em COXIV e atividade
de citrato sintase no sóleo para o GT100 o colocam como o segundo grupo na análise da relação
entre o Tlim e iLM.
O tecido cardíaco não apresentou nenhuma alteração de conteúdo de proteínas COXIV,
TFAM e citrato sintase tanto no experimento agudo quanto no crônico. Entretanto, é conhecido
o efeito protetor do exercício sobre o tecido cardíaco regulando o balanço autonômico (He et
al., 2015) e os processos de biogênese mitocondrial (Sun et al.,2013). Embora, esse efeito seja
51
atestado é possível que alguns componentes do processo de biogênese mitocondrial estejam
inativos como observado por Russel et al. 2004 em outros modelos experimentais.
Assim, ambos os experimentos auxiliaram na discussão das adaptações mitocôndrias,
sendo que é possível inferir que as proteínas COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase
possuem diferentes funções e dependem de condições específicas dos tecidos para se
modificarem. Nesse contexto, os treinamentos monótonos parecem ser mais eficazes para
promover adaptações aeróbias, com destaque para o grupo GT120 que apresentou uma maior
capacidade aeróbia.
Ainda, destaca-se o grupo GT80 com o melhor índice anaeróbio e melhor eficiência na
manutenção do exercício de alta intensidade. Em termos práticos, para esse desenho
experimental, considerando as relações de intensidade e volume propostos, as alterações de
marcadores de biogênese mitocondrial em consequência do resultado da adaptação do exercício
sub capacidade aeróbia após 12 semanas são recomendadas para a manutenção do exercício em
intensidade acima da capacidade aeróbia.
8. CONCLUSÃO
Diante dos resultados apresentados dos dois experimentos foi possível concluir que
ocorre uma tecido e intensidade dependência. Em suma, ao contrário do foi hipotetizado a
sessão aguda não promoveu aumento nos marcadores de proteína de COXIV, TFAM e citrato
sintase. Embora não tenha ocorrido aumento proteico, o glicogênio apresentou redução nos
tecidos como efeito de sua utilização como substrato energético.
No entanto, os treinamentos monótonos parecem ser mais eficazes para gerar
adaptações de conteúdo proteico do que o periodizado, com destaque e, ao contrário do que
esperado, para o grupo GT120 que apresentou maior capacidade aeróbia, enquanto o GT80
apresentou uma maior eficiência em manter o exercício. Assim, o controle da intensidade e
volume e a prescrição individualizada de exercício se torna importante também em modelo
animal por promover diferentes efeitos teciduais e adaptativos
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