universidad distrital francisco jose de...
TRANSCRIPT
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Y PIRETROIDES PRESENTES EN MUESTRAS DE MIEL PROVENIENTES DE
APIARIOS DISTRIBUIDOS EN 14 VEREDAS DE CUNDINAMARCA
YURI ASTRID ESPINOSA PARRA
Código: 20101150018
DIANA GABRIELA ALZATE PÉREZ
Código: 20112150107
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
2
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Y PIRETROIDES PRESENTES EN MUESTRAS DE MIEL PROVENIENTES DE
APIARIOS DISTRIBUIDOS EN 14 VEREDAS DE CUNDINAMARCA
YURI ASTRID ESPINOSA PARRA
DIANA GABRIELA ALZATE PÉREZ
Tesis de grado presentada como requisito para optar al título de:
Licenciada en química
DIRECTORA
MARISOL RAMOS RINCÓN.
Licenciada en Química. Especialista en Ecología Medio Ambiente y Desarrollo. Magister
en Química.
CO-DIRECTOR
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ
Licenciado en Química. Especialista en Análisis Químico Instrumental. Magister en
Ciencias Biológicas con énfasis en Fitoquímica.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
3
TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................. 7
RESUMEN ............................................................................................................................................ 8
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 10
1 JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................... 12
2 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 13
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 13
3 MARCO REFERENCIAL................................................................................................................ 14
3.1 ANTECEDENTES ................................................................................................................. 14
3.2 MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 17
3.2.1 APICULTURA EN COLOMBIA ...................................................................................... 18
3.2.2 CARACTERISTICAS Y PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LA MIEL DE ABEJAS .......... 21
3.2.3 EFECTO DE AGROQUÍMICOS EN HUMANOS ............................................................. 23
3.2.4 ORGANOFOSFORADOS .............................................................................................. 26
3.2.5 PIRETROIDES .............................................................................................................. 29
3.2.6 MIEL COMO BIOMARCADOR ..................................................................................... 32
3.2.7 DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE PLAGUICIDAS......................................................... 36
4 DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA ......................................................................................... 38
4.1 METODOLOGÍA PARA LA RECOLECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS MUESTRAS DE MIEL
39
4.1.1 Reactivos y materiales ............................................................................................... 39
4.1.2 Caracterización de la zona y recolección de muestras: ............................................ 40
4.1.3 Caracterización de las mieles: ................................................................................... 40
4.1.4 Análisis estadístico de la caracterización fisicoquímica de miel de abejas ............... 44
4.2 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS ............................ 45
4.2.1 MÉTODO MULTIRESIDUO PARA PLAGUICIDAS ......................................................... 45
4.2.2 OPTIMIZACIÓN METODOLOGÍA ANALÍTICA ............................................................ 49
4.2.3 DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS EN 14 MUESTRAS DE MIEL DE ABEJAS ........... 56
5 RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................ 57
5.1 CARACTERIZACIÓN DE LA MIEL DE ABEJAS ....................................................................... 57
5.1.1 Zonas de muestreo .................................................................................................... 57
5.1.2 Caracterización de las muestras de miel ................................................................... 63
4
5.2 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS ............................ 70
5.2.1 DESARROLLO MÉTODO CROMATOGRÁFICO ............................................................. 70
5.2.2 SELECTIVIDAD ............................................................................................................ 72
5.2.3 LIMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN .............................................. 75
5.2.4 LINEALIDAD DE LA METODOLOGÍA ........................................................................... 77
5.2.5 EXACTITUD – VERACIDAD .......................................................................................... 82
5.2.6 PRECISIÓN ................................................................................................................. 86
5.2.7 DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS DE MUESTRAS DE 14 VEREDAS DE
CUNDINAMARCA ...................................................................................................................... 88
6 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 93
7 RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 95
8 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 96
ANEXOS ........................................................................................................................................... 104
5
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Metodologías analíticas para la determinación de plaguicidas en productos de la
colmena. Fuente: propia. ................................................................................................. 15 Tabla 2. Plaguicidas organofosforados y piretroides. Fuente: Propia ............................... 35 Tabla 3. Valores de índice de refracción y % de humedad. Fuente: (Serna & Lopez, 2010)
........................................................................................................................................ 42 Tabla 4. Hipótesis estadísticas para el análisis de varianza simple (ANOVA). ................. 44 Tabla 5. Niveles de concentración en mg/ L por plaguicida. Fuente: Elaboración propia . 53 Tabla 6 Hipótesis estadísticas para la técnica de regresión lineal simple. Fuente:
Elaboración propia ........................................................................................................... 54 Tabla 7. Hipótesis estadísticas para el Cochran's test. Fuente: elaboración propia ......... 55 Tabla 8. Ubicación de las muestras de miel. Fuente: propia. ........................................... 59 Tabla 9. Resultados cuantitativos de la caracterización de las 14 muestras de miel.
Fuente: Propia ................................................................................................................. 63 Tabla 10. Resultado estadísticos de análisis ANOVA. Fuente: Elaboración propia .......... 68 Tabla 11. Información referente al patrón de fragmentación, tiempos de retención y
ventanas adquisición en el método SIM. Fuente: Elaboración propia .............................. 72 Tabla 12. Límites de detección y cuantificación por el método de la IUPAC. ................... 75 Tabla 13. Valores mínimos de detección para los ocho plaguicidas. Fuente: Elaboración
propia .............................................................................................................................. 76 Tabla 14. Límites de detección del método y límites de cuantificación del método. ......... 77 Tabla 15. ANOVA de regresión lineal realizado a las curvas de calibración. Fuente:
Propia. ............................................................................................................................. 78 Tabla 16. Curvas de calibración y gráfico de los residuales para cada analito analizado. 80 Tabla 17. Resultados de prueba t- Student realizada al modelo lineal con un α= 0.05.
Fuente: propia.................................................................................................................. 82 Tabla 18. Resultados de % de recuperación de cada nivel y varianza Cochran’s test
teniendo como hipótesis nula Ho: Se presenta homogeneidad entre las varianzas en
los porcentajes de recuperación (α= 0.05) ....................................................................... 83
Tabla 19. Error absoluto determinado para los porcentajes de recuperación ................... 84 Tabla 20. Resultados para la prueba t- Student correspondiente a la evaluación del error
absoluto. .......................................................................................................................... 85 Tabla 21. Coeficiente de variación (%CV) obtenidos en la evaluación de repetibilidad .... 86 Tabla 22. Resultados obtenidos en la evaluación de precisión intermedia (n=10) ........... 87 Tabla 23. Resultados de determinación de plaguicidas encontrados en las 14 de muestras
tratadas provenientes de 14 veredas de Cundinamarca .................................................. 89 Tabla 24. Estudio comparativo de las 14 de muestras tratadas provenientes de 14 veredas
de Cundinamarca ............................................................................................................ 92
6
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Productos derivados de la apicultura. Fuente: (STN CPAA, 2015) .................... 19 Figura 2. Aspectos de la producción nacional de miel y polen en Colombia. Fuente: (STN
CPAA, 2015) .................................................................................................................... 20 Figura 3. Modos de exposición del hombre y ambientes por plaguicidas. Tomado de
Maysaloun et al., 2008. .................................................................................................. 24 Figura 4. Estructura principal de compuestos organofosforados. (Guerrer.E & Restrepo,
2000) ............................................................................................................................... 27 Figura 5. Mecanismo de reacción que se presenta en el cuerpo para la asimilación del
plaguicida organofosforado Malatión. Obtenido de (Tejedor, 2010) ................................. 28 Figura 6. Per oxidación lipídica celular. (I. S. & J., 2001) ................................................. 29 Figura 7. Estructura de los componentes del piretro con actividad insecticida (a),
estructura de varios piretroides derivados de la piretrolona (b,c), cinerolona (d,e) y
jasmololona (f,g) . Tomado de (Lagunes, 2000) ............................................................... 30 Figura 8. Transporte del plaguicida a la miel de abejas. Fuente: Adaptado de Cabrera et
al., 2016. El polen de abeja como un bioindicador de contaminación ambiental de
plaguicidas. ...................................................................................................................... 33 Figura 9. Diagrama de flujo del proceso de pretratamiento de la muestra de miel .......... 47 Figura 10 . Diagrama de flujo del proceso de extracción selectiva de plaguicidas en
muestras de miel ............................................................................................................. 48 Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de limpieza de la muestra de miel ................... 49 Figura 12. Mapa de Cundinamarca con los diferentes puntos de recolección de las 14
muestras. Fuente: propia. ................................................................................................ 58 Figura 13.Tipo de terreno. Fuente: propia. ....................................................................... 60 Figura 14. Tipos de cultivos alrededor del apiario. Fuente: Propia. .................................. 61 Figura 15. Contaminación de la fuente de agua de las abejas. ........................................ 61 Figura 16. Fumigaciones cercanas a los apiarios ............................................................ 62 Figura 17. Gráfico de barras de la determinación de Sacarosa en g/100g de cada muestra.
........................................................................................................................................ 69 Figura 18. Cromatograma del estándar Profenofos tomado en el cromatógrafo con
detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C. .................................. 70 Figura 19. Espectro de masas del estándar Profenofos tomado en el cromatógrafo con
detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C. .................................. 71 Figura 20. Cromatograma (SIM) de extracto de matriz en el tiempo de retención del
plaguicida Profenofos. ..................................................................................................... 73 Figura 21. Cromatograma (SIM) de extracto de matriz en el tiempo de retención del
plaguicida fenitrotión. ....................................................................................................... 73 Figura 22. Cromatograma (SIM) del plaguicida profenofos a una concentración de 50 µg-
L ...................................................................................................................................... 74 Figura 23. Cromatograma (SIM) de la muestra 8, clorpirifos en su tiempo de
retención ........................................................................................................................ 91
7
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos de manera cálida y especial a la Profesora Marisol Ramos, nuestra
directora de tesis, por su constante esfuerzo, por ser nuestra guía en el camino de
la investigación y por compartir su pasión de ser cada día mejor.
Queremos agradecer a nuestro profesor Boris Ávila, quien depositó su confianza
en nosotras y nos ofreció de manera incalculable su apoyo y tiempo de asesoría, sin
la que no hubiera sido posible llevar a cabo nuestro trabajo de grado.
Al Colectivo Abejas Vivas de Cundinamarca por su interés en nuestro proyecto y
su disposición para participar.
A María Cecilia Parra Y Adriana Marcela Espinosa por su compañía y apoyo en
cada decisión, y en cada paso del camino.
A la memoria de Arcesio Alzate por ser mi inspiración, a Gabriela Pérez por cada
abrazo, risa y llanto que me enseñó que siempre habrá luz en medio de la
tormenta, a Juan Camilo Borrero por su compañía y cariño constante.
Gracias al profesor Javier Matulevich, a la Universidad Distrital y a todas las
personas que hicieron parte de nuestra formación profesional y humana.
“La gloria no consiste en no caer nunca, sino más bien en levantarse las veces que sea necesario”.
Mario Benedetti.
8
RESUMEN
La evaluación de residuos de plaguicidas en miel proporciona información sobre el
entorno ambiental y la calidad del producto. En este estudio se realizó la caracterización
fisicoquímica de algunos parámetros de la Norma Técnica Colombiana (1273/2007), para
determinar la calidad de 14 muestras de miel provenientes de veredas de Cundinamarca,
se estableció que las muestras difieren en sus propiedades debido a su origen y cumplen
los estándares de calidad. También se valoró la presencia de residuos de plaguicidas en
las muestras de miel y se validó el método analítico por cromatografía de gases acoplada
a espectrometría de masas, para la determinación de residuos en los siguientes
plaguicidas; diclorvos, monocrotofos, fenitrotión, malatión, clorpirifos, profenofos, lambda-
cialotrina y cipermetrina. Los resultados obtenidos en los ensayos exhibieron que la
metodología fue selectiva, especifica, exacta y precisa. Se extrajeron, purificaron y
analizaron, 13 de 14 muestras de miel de abejas suministradas por los apicultores de la
región, de las cuales el 46.1% de las muestras presentaron residuos del plaguicida
clorpirifos y solo el 7.7% mostró una concentración superior al límite máximo de residuos
(LMR) para el compuesto clorpirifos, establecido en la regulación de la Unión Europea No.
2016/60. De acuerdo a los resultados de las encuestas, la presencia de residuos del
plaguicida clorpirifos se adjudicó a la existencia de cultivos de papa (Solanum tuberosum)
cercanos a los apiarios.
Palabras claves: miel, biomarcador, residuos de plaguicidas, método multiresiduo.
9
ABSTRACT
The evaluation of pesticide residues in honey provides information on the environment and
product quality. In this study, the physicochemical characterization was made with some
parameters of the Colombian Technical Standard (1273/2007), with which determine the
quality of 14 samples of honey from villages of Cundinamarca, the conclusion was that the
samples differ in their properties due to their origin and meet the quality standards. The
pesticide residues presence in honey was evaluated also, the analytical method of gas
chromatography coupled to mass spectrometry was validated for the determination of
residues of the following pesticides; dichlorvos, monocrotophos, fenitrothion, malathion,
chlorpyrifos, profenofos, lambda-cyhalothrin and cypermethrin. The results obtained in the
trials showed that the methodology was selective, specific, accurate and precise. They
were extracted, purified and analyzed, 13 of 14 trials of honey from bees supplied by
beekeepers in the area, the 46.1% of the samples showed residues of the chlorpyrifos
pesticide and only 7.7% showed a concentration higher than the maximum residue limit
(MRL) for the compound chlorpyrifos, established in European Union regulation No. 7.7%.
2016/60. According to the results of the surveys, the presence of residues of the pesticide
chlorpyrifos was attributed to the existence of potato (Solanum tuberosum) crops close to
the apiaries.
Keywords: honey, biomarker, pesticide residues, multiresidue method.
10
INTRODUCCIÓN
Las abejas son considerados los más importantes polinizadores, y por tal razón parte
fundamental en la seguridad alimentaria, infortunadamente en las últimas décadas se
reporta a nivel mundial la disminución de la población de estos polinizadores (Verde M. ,
2014). Las causas de este declive son muchas, dentro de éstas, está el uso de
plaguicidas especialmente organofosforados, piretroides y neonicotinoides (Pinho et al.,
2010). Se ha encontrado que estos plaguicidas pueden contaminar el agua que beben y
flores donde las abejas recogen el néctar para la producción de miel, por lo tanto la miel
puede ser utilizada como indicador de la contaminación ambiental (Cabrera et al., 2016),
pero además los beneficios de la miel pueden ser disminuidos por la presencia de estos
contaminantes que tienen efectos bastantes negativos como afectación del sistema
nervioso, por la inhibición de la acetilcolinesterasa, (Tejedor, 2010)
Es por tanto de gran importancia cuantificar la presencia de plaguicidas en productos de
la apicultura, específicamente en la miel, se han reportado múltiples artículos que
describen la metodología de los procesos de extracción y cuantificación de residuos de
plaguicidas en miel, (Rodríguez et al., 2011) (Juan-Borras et al., 2016) (Zamudio, 2017).
En Colombia la problemática no es ajena, se han reportado desde el 2011 la desaparición
de colmenas en Cundinamarca, Sucre, Antioquia, Boyacá y Risaralda (Rodríguez et al.,
2011) (Gallego & Arenas, 2015) (Zamudio, 2017) (Monsalve, 2017) (Arciniegas, 2016).
Es por lo tanto relevante estimar la presencia de residuos de plaguicidas en miel de
abejas, utilizando la metodología pertinente, para contribuir con este tipo de estudios en
nuestro país específicamente en el Departamento de Cundinamarca en las veredas de
Canavita, San Rafael, Mochuelo, Chamicera, Lunealito, Corales, Santa Ana, Santuario,
Cascavita, Mondoñedo, 11 de Noviembre, El rodeo y el Guamal, donde la actividad
apícola representa el sostenimiento de la economía de muchas familias.
En este proyecto se validó y aplicó la metodología de análisis y evaluación de 8
plaguicidas organofosforados y piretroides en muestras de miel de abejas, provenientes
de 14 veredas del departamento de Cundinamarca por el método de Cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masas. Este producto natural cuenta con amplio
11
reconocimiento como alimento puro y de alta calidad, es por esto que fue de gran
importancia valorar la miel desde el análisis de residuos de plaguicidas, donde los
resultados fueron comparados con los límites máximos de residuos en miel para seres
humanos, además, realizar una caracterización fisicoquímica en la que se estimaron las
condiciones de la miel, por medio de parámetros de pH, acidez, humedad, concentración
de sacarosa, cenizas e hidroximetilfurfural. La calidad es el principal factor para la
determinación de su comercialización.
Este trabajo se estructura en tres capítulos, el primero consiste en el marco referencial
que abarca la importancia de la apicultura en Colombia, propiedades fisicoquímicas de la
miel y características de los plaguicidas, seguido se encuentra la metodología con la que
se sustenta los resultados que se encuentran en el último capítulo. Los resultados de este
estudio contribuyen a la evaluación del entorno ambiental de los apiarios y el impacto de
las prácticas agrícolas sobre la miel de abejas.
12
1 JUSTIFICACIÓN
Las abejas son un importante polinizador, responsables del 80% de esta acción. Un tercio
de los alimentos que consumimos está disponible gracias a la polinización cruzada o por
efecto de la visita de estos insectos a las flores, (A.G.G., 1985) (Basualdo, 2000). Las
abejas ayudan a conservar la seguridad alimentaria del ser humano, sin embargo, desde
el último siglo, la agricultura se ha expandido e intensificado a nivel mundial, lo que ha
ocasionado un incremento en el uso generalizado de plaguicidas, trayendo consecuencias
negativas para la flora, fauna y especialmente para los polinizadores, (Tosi et al., 2018).
En las últimas décadas, investigaciones en todo el mundo han reportado un decrecimiento
poblacional en las abejas. A esta anomalía, se le atribuyó el nombre de colapso de
colmenas de abeja (CCD). Los productos de la colmena como la miel, la cera y el polen
son reservorios de información valiosa sobre la calidad del ambiente en el que se
encuentra la colmena, estos productos han sido centro de investigación para la
determinación de residuos de xenobióticos, (Amaral et al., 2016). En Colombia varias
investigaciones se han llevado a cabo para evaluar la presencia de residuos de
plaguicidas en productos de la colmena, por medio de técnicas cromatográficas han
registrado trazas de plaguicidas a concentraciones cercanas al Límite Máximo de Residuo
establecido por la Unión Europea (Rodríguez et al., 2011) (Juan-Borras et al., 2016)
(Zamudio, 2017) (SANTE/11813/2018).
Esta investigación surgió del interés de dar explicación a la disminución poblacional de los
principales polinizadores, específicamente en 14 de veredas del departamento de
Cundinamarca, disminución reportada por los apicultores quienes basan su economía
familiar en productos de colmena, por lo tanto se decidió establecer las relaciones
causales entre agroquímicos y productos derivados de la apicultura, específicamente la
miel de abejas, por lo que se propuso determinar la presencia de plaguicidas
organofosforados y piretroides, utilizando la técnica de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, (Gallego & Arenas, 2015) (Rodríguez et al., 2011).
13
2 OBJETIVO GENERAL
Determinar la concentración de residuos de plaguicidas organofosforados y piretroides en
muestras de miel provenientes de apiarios distribuidos en el departamento de
Cundinamarca mediante la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas (CG-EM).
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
✓ Evaluar las características fisicoquímicos más relevantes de las muestras de miel
según los parámetros de la norma técnica colombiana NTC 1273 del 2007.
✓ Establecer los criterios para los parámetros analíticos de selectividad, límite de
detección y cuantificación, linealidad, exactitud – veracidad y precisión para la
determinación de residuos de plaguicidas organofosforados y piretroides en matriz
de miel por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
✓ Evaluar la presencia de residuos de plaguicidas organofosforados y piretroides en
14 muestras de miel de abeja por la técnica de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas provenientes de algunas veredas del departamento de
Cundinamarca.
14
3 MARCO REFERENCIAL
3.1 ANTECEDENTES
Las abejas cubren grandes áreas en sus recorridos en búsqueda de fuentes de néctar y/o
polen, por esta razón; están expuestas a la contaminación aeróbica y tóxicos presentes
en plantas rociadas con plaguicidas, (Cabrera et al., 2016). Las colmenas que estén
ubicadas cerca de cultivos sufrirán mayor exposición de los plaguicidas que cada vez son
más usados en la agricultura para prevenir, destruir, repeler o mitigar bacterias, hongos,
insectos y cualquier otro tipo de plaga que amenace contra la seguridad alimentaria,
(Arias et al., 2008). Los residuos de plaguicidas son nocivos para animales, insectos y
especialmente polinizadores, pueden permanecer en el ambiente por largos periodos de
tiempo y estar depositados en productos de consumo humano, (Amaral et al., 2016).
Los productos de la colmena pueden ser utilizados como referentes analíticos para indicar
cualitativa y cuantitativamente la interacción del sistema biológico y el agente
contaminante, (Repetto & Repetto, 2009). Entre estos, el de mayor importancia por su
nivel de consumo y propiedades es la miel, ha sido objeto de estudio en investigaciones
como biomarcador para la determinación de residuos de plaguicidas, (Cabrera et al.,
2016).
Con el fin de adquirir conocimientos sobre la intervención de los plaguicidas en la salud
humana y de las abejas, diversos estudios han sido orientadas a la detección de estos
agroquímicos a través de métodos selectivos y sensibles, a continuación se observa la
tabla 1 donde los estudios descritos hacen una revisión a través del año 2011 y 2017 para
los estudios nacionales y 2004 hasta el 2017 para los estudios internacionales, se revelan
las investigaciones más significativas con el método instrumental de cromatografía de
gases o cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas, observando la
sensibilidad del detector de masas para diferentes familias de plaguicidas, entre esas,
organofosforados y piretroides. Además, se puede observar una correlación entre los
estudios más actuales y otros productos de la colmena, los cuales son cada vez más
utilizados como biomarcadores potenciales, (Cabrera et al., 2016).
15
Tabla 1. Metodologías analíticas para la determinación de plaguicidas en productos de la colmena. Fuente: propia.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
DESARROLLADAS EN COLOMBIA
Matriz
Método de
Extracción
Análisis Instrumental
Familia estudiada
Analito
encontrado
Rango LC
(mg/Kg)
Rango LD
(mg/Kg)
Ref.
MIEL
Extracción
Líquido-
líquido
Cromatografía de
gases con
detectores de
nitrógeno fósforo y
microcaptura
electrónica.
Organoclorado
Organofosforado
Piretroide
Acetamidas
Triazol
Benzimidazol
4,4-DDT
Y-HCH
HCB
Clorpirifos
Fenitrotión
Profenofos
Detector μECD:
0.0002 – 0.792
Detector
NPD:
0,004 - 0.370
Detector μECD:
0.0003 – 2.467
Detector
NPD:
0.001 - 0.286
Rodríguez
et al.
(2011).
POLEN QuEChERS
modificado
Cromatografía
líquida acoplada a
espectrometría de
masas
Organofosforado,
Organonitrogenado
, azoles, triazinas,
carbamatos,
benzimidazoles.
Neonicotinoides
Se pudo
analizar 55
plaguicidas de
58 plaguicidas
que fueron
estudiados
0.003-
0.017
0,0002-
0.0413
Ahumada
et al.
(2014).
MIEL
Extracción
Líquido-
líquido
CG/EM
Cromatografía de
gases acoplado a
Espectrometría de
masas
Organofosforados y
Organoclorados
Forato,
Terbufos,
Diazinón y
Malatión
0.042 -
0.393
0.015 –
0.140
Gallego et
al. (2015).
MIEL QuEChERS
UFLC/MS
Cromatografia
líquida ultrarrápida
acoplada a
Espectrometría de
masas
Organofosforado,
Organonitrogenado
, azoles, triazinas,
carbamatos,
benzimidazoles.
Metalaxil,
Pirimicarb,
Carbofuran
Dimetomorf
Tebuconazol
0.0059 –
0.198
0.0012 –
0.0612
Zamudio,
(2017).
16
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
DESARROLLADAS A NIVEL INTERNACIONAL
MIEL
Extracción
en fase
sólida
Cromatografía de
gases acoplada a
espectrometría de
masas
Insecticida
Acaricida
Fungicida
Herbicida
Diclofluanid
Trillate
Etalfluralin
0.0003 –
0.0201
0.0001 –
0.006
Albero, et
al. (2004)
MIEL
Extracción
líquido -
líquido
Cromatografía de
gases acoplada a
espectrometría de
masas
Organohalógeno,
Organofosforado
Organonitrógeno
Piretroide
Endosulfan
Tetradifón
Atrazina
Simazina
Tebuconazol
Clorpirifos
Malatión
Cipermetrina
< 0.02 < 0.01 Rissato et
al. (2006)
MIEL
COMERCIAL QuEChERS
Cromatografía
líquida acoplada a
espectrometría de
masas
Neonicotinoide
Organofosforado
Azole
Triazina
Formamidina
Piretroide
Amitraz
Coumafos
Taufluvalinato
Acetamiprid
Clorfenvinfos
0.003
0.001
Juan-
Borras et
al. (2016)
CERA DE
ABEJAS QuEChERS
Cromatografía de
gases acoplada a
espectrometría de
masas
Se evaluaron 160
plaguicidas de tipo
acaricida,
insecticida,
fungicida y
herbicida.
Se detectaron
un total de 32
residuos de
plaguicidas (14
insecticidas-
acaricidas, 10
insecticidas, 6
fungicidas y 2
herbicidas) en
las muestras
0.0003 – 0.0201
0.0001 –
0.006
Garcia et
al. (2017)
17
3.2 MARCO TEÓRICO
La abeja desempeña una función importante por su actividad polinizadora
insustituible frente a una agricultura cada vez más moderna y extensa, las abejas se
encargan de polinizar un sinfín de cultivos que forman parte de la cadena trófica del ser
humano, siendo el insecto con mayor participación (aproximadamente un 80%) en
polinización, (Verde, 2014).
El rendimiento de los cultivos más importantes para la alimentación mundial se
incrementa con los servicios ambientales de polinización tanto de abejas domésticas
como nativas, (Klein et al., 2007). Se pudo cuantificar con precisión que la polinización por
insectos es responsable del 9.5% del valor de la producción agrícola mundial, lo que
representa un valor de 153 billones de euros, (Gallai et al., 2009) Estos agentes
polinizadores cumplen un papel esencial para el ecosistema que contribuye al
mantenimiento de la biodiversidad y permite la supervivencia de muchas especies de
plantas que dan seguridad alimentaria al hombre, (FAO, 2003).
De acuerdo a lo mencionado, la polinización de flores silvestres y diversos cultivos
agrícolas realizada por las abejas es primordial tanto para la diversidad biológica como
para producción de alimentos; sin embargo en los últimos años la población de
polinizadores ha disminuido considerablemente a nivel mundial. Según recientes
investigaciones de vigilancia a las colmenas, las tasas de pérdida de colmenas muestran
índices preocupantes en especial en Europa y América, aunque esta disminución se le
atribuye a diversos factores físicos, químicos y biológicos como parásitos patógenos, la
introducción de especies foráneas, fragmentación del hábitat y empleo de plaguicidas
(Amaral et al., 2016). La acumulación de estos últimos aún a bajas concentraciones
constituyen un peligro para el ecosistema y los organismos biológicos que los componen,
puesto que los plaguicidas empleados son precursores del cáncer y disfunciones del
sistema nervioso (Amaral et al., 2016).
A continuación se presentan temáticas que sustentan el desarrollo de la investigación
como son: importancia de la apicultura en Colombia, características y propiedades
fisicoquímicas de la miel y características de plaguicidas.
18
3.2.1 APICULTURA EN COLOMBIA
La unidad funcional en la apicultura es la colmena, está conformada por un conjunto de
individuos (las abejas) y de estructuras orgánicas e inorgánicas que interactúan de forma
dinámica con elementos vegetales, animales y componentes abióticos, (Verde, 2010). En
la apicultura colombiana la especie más habitual de trabajo es Apis mellifera del género
Apis familia Apidae, que son aquellas abejas consideradas domésticas o de condiciones
de explotación racional, sin embargo, existen más de 500 especies en Colombia,
comprendidas por familias como la Colletidae, Oxaeldae, Andrenidae, Halictidae,
Megachilidae y Apidae, (Nates & González, 2000). No obstante, un estudio de la
Universidad Nacional de Colombia determinó que la especie Apis mellifera es
africanizada, debido a los cruces naturales ocurridos entre ellas, establecieron que el 99%
de los apiarios colombianos muestreados eran simultáneos con el linaje de abejas
africanas, esto le confiere a los productos de la colmena características diferentes y
únicas, (AGENCIA DE NOTICIAS UN, 2016).
Entre los productos más utilizados de una colmena de abejas, se encuentra; la miel, el
polen, el propóleo, la cera y la apitoxina (ver figura 1), (Laverde & Egea, 2010). La miel es
un producto viscoso, dulce y aromático, se compone principalmente de aminoácidos,
carbohidratos y minerales que se utilizan para cumplir con la dieta de las abejas, y es
derivada de la transformación química del néctar floral, (Avni et al., 2014) (Ulloa et al.,
2010).
19
Figura 1. Productos derivados de la apicultura. Fuente: (STN CPAA, 2015)
En Colombia el producto apícola de mayor relevancia es la miel, según la legislación
colombiana en la NTC 1273, (ICONTEC, 2007). Actualmente, existen aproximadamente
50.000 colmenas y 2.400 apicultores generando 4.800 empleos directos y otros cuatro mil
ochocientos en el momento de la cosecha. Según el concejo nacional de CPAA la
producción en toneladas desde el 2010 fue de 2.630 y en el 2014 de 2.888, un incremento
notable en el número de colmenas y su producción a través de esos 4 años, (STN CPAA,
2015).
La producción de miel se da especialmente en zonas como la costa caribe, por debajo de
los 1.000 msnm; mientras que la producción de polen se encuentra principalmente en el
altiplano cundiboyacense por encima de los 2.000 hasta los 3.200 msnm como se observa
en la figura 2. Las características como composición, actividad biológica y caracteres
sensoriales de los productos de recolección y transformación de las abejas van muy
ligados con la ubicación geográfica de los apiarios, (Vit, 2004).
Ap
icu
ltu
ra
Material biológico
Nucleos
Colonias
Reinas
Productos de secreción
Jalea real
Cera
Apitoxina
Productos de recolección y transformación
Miel
Polen
Propóleos
20
Figura 2. Aspectos de la producción nacional de miel y polen en Colombia. Fuente:
(STN CPAA, 2015)
La producción de miel se destina para consumo interno, ya que las cifras de
exportaciones no son significativas, tampoco son muy significativas el consumo interno,
teniendo en cuenta que Colombia tiene alrededor de 48 millones de habitantes, el
consumo per cápita es alrededor de 60 g/año, mientras que en países líderes en consumo
como Suiza son de 1.400 g/año. A esto se le suma que el valor del producto es alto a
razón de que se presentan problemas en la producción y comercialización. Estos son;
problemas sanitarios (control y tratamiento de enfermedades por plagas); uso
indiscriminado de agroquímicos que afectan cualquier población de abejas, donde el
apicultor pierde sus colmenas por la aplicación y no hay control sobre esto, además de
que tampoco hay control en la adulteración y falsificación de productos, (STN CPAA,
2015).
21
3.2.2 CARACTERISTICAS Y PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LA MIEL DE
ABEJAS
La miel es un producto alimenticio producido por las abejas melíferas a partir del néctar de
las flores o de las secreciones procedentes de partes vivas de las plantas o de
excreciones de insectos succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de las
plantas, que las abejas recogen, transforman, combinan con consustancias específicas
propias, almacenan y dejan madurar, añejar en los panales de la colmena. (FAO, 2001).
Las propiedades fisicoquímicas de la miel como color, humedad, aroma, densidad, puede
variar dependiendo del contenido de minerales, carbohidratos, agua, ácidos orgánico,
proteínas; de igual forma pueden variar según el néctar, cambios climáticos, formas de
extracción, origen botánico y geográfico (Ulloa, 2010), estos factores son de gran
importancia, para la comercialización y consumo de los productos.
Diversos estudios han determinado, que los componentes de la miel deben cumplir con
ciertas características, para cumplir con la pureza y calidad (Vásquez, 2010), la
variabilidad del color, aroma, sabor, humedad, hidroximetilfurfural, enzimas, cenizas,
acidez, porcentaje de sacarosa, entre otras, dependen del material vegetal del cual las
abejas hayan extraído el néctar para fabricar su miel, por consecuencia también depende
de la ubicación geográfica. Así por ejemplo el pH, el cual está influenciado por el origen
botánico, valores entre 3.3 y 4.6 permiten deducir que son mieles de origen floral,
mientras que valores mayores a 4.6 hasta 5.5 se encuentran en mieles mieladas. El pH
determina el sabor y protege la miel de la proliferación de microorganismos, (Urrego,
2017).
En la miel la acidez puede ser medida como acidez libre, lactónica y total, la acidez libre
representa a todos los ácidos en estado libre, este parámetro se relaciona con la
fermentación de azucares en alcoholes y ácidos. La acidez lactónica es la reserva en
lactonas, las lactonas son glucolactonas que están en equilibrio con el ácido glucónico, las
lactonas originan ácidos cuando la miel se alcaliniza. La acidez libre y la acidez lactónica
aumentan durante el almacenamiento, pero el mayor incremento es de lactonas. La suma
de la acidez libre y la acidez lactónica se conoce como acidez total, (Correa, 2015). El
22
parámetro de acidez contribuye al proteger la miel contra ataques microbianos y le otorga
aroma y sabor, además de adjudicarle propiedades antioxidantes, (Correa, 2015).
El HFM hidroximetilfurfural, se trata de un aldehído y un furano, formado por la
degradación de los productos azucarados, especialmente por la deshidratación de la
fructosa, (Villar et al., 2015). Esta sustancia aparece de manera espontánea y natural en
la miel, se puede ocasionar por el incremento de la acidez, presencia de agua o por altas
concentraciones de monosacáridos (fructosa y glucosa) en el producto. Este parámetro
también indica el grado de envejecimiento de la miel, un valor alto de éste indican que la
miel ha sido almacenada inadecuadamente o que ha estado sometida a altas
temperaturas, (Vásquez, 2010).
Los azucares en la miel son los responsables de las características fisicoquímicas, ya que
estos conforman el 80% de la masa de miel. Los azucares más relevantes son glucosa,
fructosa y sacarosa, este último carbohidrato, es común para la determinación de mieles
falsificadas, no debe superar el 5% de concentración según la Norma Técnica Colombia
(1273/2007).
En relación con la humedad, ésta se relaciona con el contenido del agua, altos valores
indican la tendencia de la miel a fermentarse, debido a que favorece al crecimiento de
levaduras y mohos (Zamora, 2008). La humedad se puede ver afectada por diferentes
razones, entre esas, es recoger la miel antes de que alcanzara la humedad adecuada,
también, puede deberse a la exposición a ambientes húmedos después de extraídas, o al
almacenamiento inadecuado, (Correa, 2015).
Adicionalmente el contenido de agua en la miel influye en su viscosidad, peso específico y
color, condicionando así la conservación y cualidades organolépticas de este producto,
(Bogdanov, et al, 2004). Las enzimas son proporcionadas por las abejas, y algunas por
las plantas. Estas enzimas ayudan a lograr el proceso de maduración del néctar a miel y
éstas son en gran parte las responsables de la complejidad composicional de la miel la
función de dicha enzima es conversión de los tres azúcares básicos del néctar a por lo
menos 25 azúcares adicionales de gran complejidad. La enzima más importante de la
miel es la α-glucosidasa, otras enzimas presentes en la miel son la glucosa oxidasa,
responsable en gran parte de la propiedad antibacteriana de la miel; la catalasa,
23
responsable de convertir el peróxido de hidrógeno a oxígeno y agua; la fosfatasa ácida,
que degrada el almidón; la diastasa que se usa indicador de aplicación de calor a la miel.
El rango de conductividad eléctrica en la miel es de 0.60 y 2.17 mS/cm
(milisiemens/centímetro), el color se relaciona con este parámetro ya que a mayores
minerales, más oscura es la miel. Además, el color también depende del contenido de
polen y compuesto fenólicos. Las mieles oscuras tienen un alto contenido de fenoles y
consecuentemente una alta capacidad antioxidante, (Suescún, 2008).
La cantidad de cenizas es el contenido de minerales, el cual puede tener un valor máximo
de 0.60% para mieles florales, sin embargo, para mieles mieladas y mezclas de estas,
pueden alcanzar valores de 1%, (Zandamela, 2008). El porcentaje de cenizas está
directamente relacionado con las condiciones edáfico-climáticas y las técnicas de
extracción, el elemento dominante en la miel es el potasio seguido del cloro, azufre sodio,
calcio, fosforo, magnesio, silicio, hierro y cobre, en promedio, estos elementos conforman
el 0.17% de las cenizas, (Zamora & Dominguez, 2008).
3.2.3 EFECTO DE AGROQUÍMICOS EN HUMANOS
El uso de productos agroquímicos para el control de plagas no solo representan un riesgo
toxicológico para la biodiversidad ambiental sino también para el ser humano, ya que
pueden llegar al organismo a través de todas las vías de contacto: respiratoria, dérmica y
digestiva, presentándose intoxicaciones de tipo agudo y crónico, lo cual no suele
especificarse ya que depende del tipo de población tal como se observa en la figura 3
(Maysaloun et al., 2008)
24
Figura 3. Modos de exposición del hombre y ambientes por plaguicidas. Tomado de
Maysaloun et al., 2008.
Dentro de los principales riesgos que se pueden presentar en la salud humana por la
exposición sistemática y no sistemática a productos químicos empleados en la agricultura
es posible identificar tres principales: peligros cancerígenos, neurotóxicos y teratógenos
(OMS, 2017); sin embargo hay que tener en cuenta que del total de los casos que se
presentan en intoxicación por agroquímicos es posible realizar seguimiento e
investigación a menos del 10 % en países industrializados y 1 % en países en vía de
desarrollo, lo cual dificulta realizar un estimado concluyente del porcentaje real de
humanos afectados por el consumo de alimentos con trazas de agroquímicos (OMS,
2017), dado que entidades reguladoras como el Institución Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA) en el caso de Colombia no cuentan actualmente con
ningún plan de control que se relacione directamente con el contenido de trazas de
plaguicidas en alimentos de consumo humano. (Maysaloun et al., 2008) (INVIMA, 2017)
Conforme a lo anterior dentro de los efectos adversos que se han podido identificar en la
salud, recientemente se han realizado diversos estudios que relacionan la exposición a
plaguicidas y varias enfermedades de interés humano como los son el cáncer en la
sangre, cáncer de mama, de próstata entre otros. A continuación se evidencian algunos
Suministro
Habitad
Cultura
Jardineria
Crianza
HOMBRE
Cadena Alimentaria
FAUNA Y FLORA
Agricultura
crianza
PLAGUICIDA
Inter-departamento
s
SUELOS , AGUA Y
AIRE
Medio Ambiente
25
de las investigaciones realizadas en torno a la exposición constante de plaguicidas y la
salud humana.
3.2.3.1 Efectos Cancerígenos Por Plaguicidas.
Los efectos cancerígenos por plaguicidas son unos de los efectos más relevantes bajo
estudio, ya que el cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo; en el
2012 hubo 14 millones de casos nuevos de cáncer y ocho millones de muertes
relacionadas con la enfermedad. Las cifras no son nada alentadoras y los pronósticos son
aún más preocupantes, ya que se proyecta un aumento del 50 % en nuevos casos y un
aumento del 60 % en muertes mundiales por cáncer (NIH, 2017). Es por esto que
diferentes estudios han logrado relacionar la probabilidad de sufrir de cáncer (cáncer de
labios, de próstata, cerebral, del sistema hematopoyético, del sistema nervioso central,
estomago, riñones, leucemia, mielomas múltiples, etc.) a la exposición a plaguicidas (Blair
et at., 2001) (Buzio et at., 2002) (Hardell & and Nordstrom, 2002) (Mills, 1998) (Alavanja et
al., 2004).
3.2.3.2 Efectos sobre el sistema endocrino y la reproducción
Plaguicidas como metoxicloro, DDT, dieldrin, dicofol, nitrofen, mancozeb de acuerdo a
diversas investigaciones (Cravedi et al., 2007) se encuentran catalogados con
compuestos disruptores endocrinos, así mismo diversos estudios muestran que la
exposición a plaguicidas organofosforados, piretroides o etileno-bis-diticarbamato pueden
actuar a nivel de la espermatogénesis mediante alteraciones de las hormonas o efectos
genotóxicos, produciendo deficiencias reproductivas y alteración del crecimiento sexual en
la etapa de la pubertad (Anderson et at , 1999) (Cordier, 2008) además se ha
considerado la transmisión epigenética de estas patologías, (Anway et al., 2005).
3.2.3.3 Neurotoxicidad Relacionada Con Plaguicidas
Dentro de los efectos que se pueden presentar bajo condiciones de exposición aguda a
pesticidas constituidos por piretroides, carbamatos y organofosforados se encuentran:
producir parestesia y convulsiones asociadas a enfermedades neurológicas como
polineuropatía y en los casos más agudos de intoxicación se presenta la inhibición de la
26
enzima acetilcoliesterasa y su incidencia sobre las alteraciones neuro-comportamentales,
cognitivas, fisiológicas e incluso afectivas (Moser, 2007) (Kamel & Hoppin, 2004). Por otro
lado resultados evidenciados por estudios realizados entorno a los efectos por exposición
crónica han logrado relacionar, aunque parcialmente la exposición a plaguicidas con el
desarrollo de trastornos neuronales degenerativos como el Parkinson y el Alzheimer
(Baldi et at., 2001) (Priyadarshi, et al., 2000) (Ritz & Yu, 2000).
3.2.3.4 Efectos sobre el sistema inmunológico
Dentro de los efectos inmunológicos que se han estudiado tras la exposición a productos
agroquímicos se encuentran aquellos relacionados con patologías respiratorias como el
asma y la bronquitis (Salameh et al., 2006), así como un aumento de inmunoglobulinas
lgE y linfocitos T, desarrollo de otitis; estas patologías suelen presentarse con mayor
frecuencia en niños que en adultos. También existen casos particulares en infantes y
prenatos como el de la atrazina, el cual inhibe la capacidad de células NK (linfocito del
sistema inmunitario) humanas para secretar proteínas líticas sin afectar las conexiones
con las células diana (Rowe et al., 2007) (Karmaus et al., 2001) y alteran la actividad de
macrófagos y cantidad de linfocitos en el bazo y el timo fetales.
3.2.4 ORGANOFOSFORADOS
Los compuestos organofosforados corresponden a esteres, amidas o tioderivados de
ácido fosfórico, fosfonico, fosforotioico y fosfonotioico, cuya estructura principal se
observa en la figura 4.Dentro de sus propiedades más representativas se encuentra su
baja tensión de vapor, su facilidad para hidrolizarse en medios alcalinos y además son
altamente liposolubles e insolubles en agua (Fernandez et al., 2010). Así mismo estos
compuestos se clasifican en dos grandes grupos: compuestos organofosforados
sistemáticos y organofosforados no sistemáticos; correspondiendo los sistemáticos a
compuestos que suelen ser transformados dentro del organismo y los no sistemáticos
aquellos que actúan por contacto.
27
Figura 4. Estructura principal de compuestos organofosforados. (Guerrer.E & Restrepo, 2000)
Existen más de 200 substancias catalogadas como organofosforadas y se emplean como
aditivos del petróleo, disolventes, barnices, cueros artificiales, aislantes eléctricos,
ablandadores plásticos, impermeabilizantes y principalmente como compuestos para el
control de plagas, actúan por contacto , tanto contra los adultos como contra los estadios
inmaduros de moscas, garrapatas, ácaros, piojos y otros ectoparásitos , así como contra
las larvas de los dípteros que producen los varios tipos de miasis o gusaneras.
La residualidad de los compuestos organofosforados depende del entorno y la aplicación
para la cual se destinó, por ejemplo hay organofosforados que se aplican en ovinos y su
residuos permanecen por semanas, incluso meses de forma activa, hay otro por el
contrario como el Diclorvos que son altamente volátiles y su poder residual dura apenas
unos días. De acuerdo a lo reportado en la literatura actualmente esta familia de
plaguicidas es utilizada en el 40 % de los cultivos de Colombia, donde a su vez se
reportó 4234 de intoxicación causados por plaguicidas (Cycoń et al, 2013), asi mismo el
uso de estos plaguicidas ha traido gran deterioro de los suelos cultivables y ha puesto en
riesgo importantes ecosistemas y su biodiversidad ((FAO), 2013).
28
3.2.4.1 Mecanismo de toxicidad
Dentro de los principales mecanismos de toxicidad que se han estudiado por medio de
experimentos in vitro de estos tipos de plaguicidas, se encuentra el mecanismo
correspondiente a la inhibición de la acetilcolinesterasa en el sistema nervioso periférico o
central, donde el centro de fosforo deficiente en electrones del compuesto obtenido por
medio del citocromo P450 (figura 5), el cual compite con la acetilcolina por el centro
estérico de la enzima acetilcolinesterasa habida de electrones; causando con esto
hiperexcitabilidad de las células neuronales y la disminución de la neurotransmisión
(Moser, 2007) (Lyons, 2000) .Así mismo los plaguicidas organofosforados inhiben la
actividad de NK (linfocito del sistema inmunitario), la cual es responsable de la muerte de
células tumorales; esta inhibición puede darse por apoptosis o por la inhibición directa de
la vía Fas/FasL. (Li & Kawada, 2006) (Carter et al., 2007).
Figura 5. Mecanismo de reacción que se presenta en el cuerpo para la asimilación del plaguicida organofosforado Malatión. Obtenido de (Tejedor, 2010)
Al observar casos más precisos el Clorpirifos por ejemplo induce estrés oxidativo, por
medio de un ataque electrofílico sobre algunos constituyentes celulares, donde se
generan aniones como O2-, OH-,y H2O2 generando per oxidación lipídica (Figura 6) , la
cual perjudica en mayor medida a los eritrocitos (ricos en ácidos grasos poliinsaturados)
que se encuentran involucrados en el transporte de los plaguicidas a su lugar de
29
metabolización (hígado) (Lopez, 2005) conllevando a la alteración de la estructura de
membrana, seguida de disfunción celular y muerte celular. De igual manera se ha
vinculado la liberación de especies reactivas de oxígeno presentes en este plaguicida con
los efectos cancerígenos e inmunotóxicos (Ledirac et al., 2005) (Lee et al., 2008)
(Saulsbury et al., 2008) (Li & Kawada, 2006) (Antherieu et at., 2007). El monocrotofos es
otro agroquímico empleado para el control de plagas que se ha encontrado relacionado
con cambios cromosómicos en linfocitos y bases oxidadas de tipo 8-OH-dG (Calviello et
al., 2006) (Das et al., 2007)
Figura 6. Per oxidación lipídica celular. (I. S. & J., 2001)
3.2.5 PIRETROIDES
Los plaguicidas denominados piretroides corresponden a compuestos sintetizados a partir
de las piretrinas naturales, obtenidas a partir de las flores secas del crisantemo
(Chrysanthemum cinerariaefolium y Chrysanthemum roseum), estas flores poseen
aspecto blanco similar al de un margarita blanca (Nadon, 2015); sin embargo su
rendimiento al extraer la piretrina de interés es del 50 % (Ramírez & Lacasaña, 2001)
Los compuestos Piretroides se encuentran constituidos por seis componentes principales:
esteres derivados de ácido crisantemico y de ácido piretrico con tres alcoholes, llamadas
piretrolona, cinerolona y jasmolona (figura 7). En condiciones naturales los piretroides
30
suelen ser inestables, es por esto que desde que inicio el interés por su síntesis se han
realizado cambios en su estructura con fin de mejorar su estabilidad y efectividad
insecticida. De esta manera las primeras investigaciones realizadas por Staudinger y
Ruzicka en torno a la estructura de la piretrina mostraron ciertos alcoholes bencílicos
sustituidos y alcoholes insaturados producían compuestos más activos, esta variación
seguida de sustituciones de metilos de la cadena vinílica del ácido por cloros, la
combinación del ácido permetrinico, introducción del grupo α-ciano, de atomos de flúor a
posición 4 del m-tenoxibencil alcohol o la sustitución de un cloro por un grupo CF3 han
dado lugar a estructuras cada vez menos parecidas a la Piretrina de origen natural
(Ramírez & Lacasaña, 2001).
Figura 7. Estructura de los componentes del piretro con actividad insecticida (a), estructura de varios piretroides derivados de la piretrolona (b,c), cinerolona (d,e) y
jasmololona (f,g) . Tomado de (Lagunes, 2000)
31
Dentro de sus propiedades principales se encuentra su fácil degradación frente a la luz y
al aire (descomposición por isomerización, dehalogenación, descarboxilación y ruptura de
enlace Ester), lo que hace que tengan un tiempo de vida relativamente corto en
comparación con otros plaguicidas sintéticos. (Gonzales, 2000). De igual manera los
Piretroides deben su actividad a las características estructurales, como se ha mencionado
anteriormente. Esta actividad se encuentra altamente ligada a la mitad ácido
ciclopropanocarboxilico con un C asimétrico en posición 1 y la presencia de un grupo
dimetil en posición C2, no es un requisito absoluto los sustituyentes en posición C3 del
anillo de ciclo propano, y en condición Cis y trans; solo las cadenas insaturadas que
confieren la actividad insecticida. (Nadon, 2015)
Por otro lado además de su efectividad para el control de plagas, los Piretroides,
corresponden a insecticidas neurotóxicos que actúan sobre los canales de sodio tanto en
mamíferos como en insectos, una sola dosis puede producir en mamíferos signos de
intoxicación como temblores, salivación, hiperexitabilidad, parálisis y efectos
trascendentales en el sistema nervioso central.
3.2.5.1 Mecanismo de acción
El mecanismo de acción de los Piretroides actúa principalmente sobre las células
nerviosas con canales iónicos abiertos; sin embargo son capaces de despolarizar la
membrana neuronal y retrasar el cierre de los canales de sodio de la membrana del axón,
originando así una lenta entrada de sodio en los momentos finales de la despolarización
lo que se evidencia como hiperexcitación del sistema nervioso. La alta
estereoespecificidad que se presenta en la unión de los piretroides con los canales de
sodio permite que de acuerdo a los distintos isómeros se den diferentes actividades
tóxicas. De esta manera los isómeros cis son diez veces más tóxicos que los isómeros
trans (gray), ya que son estos son metabolizados más rápidamente. De igual manera
aquellos piretroides compuestos por grupos ciano tienden a ser más tóxicos, puesto que
el grupo ciano retrasa la hidrólisis y la oxidación metabólica. (Repetto M. , Toxicologia
Avanzada)
Por otro lado también se han propuestos mecanismos secundarios de acción, dentro de
los que se encuentran: modulación de la transmisión colinérgica nicotínica, aumento de la
32
liberación de noradrenalina, disminución de flujo de calcio. Los efectos presentes dentro
de estos mecanismos anteriormente mencionados incluyen: irritación dérmica, alergias,
parestesia y efectos bronquiales para los piretroides con menor índice de toxicidad y
temblor fino de todo el cuerpo, sacudidas incoordinadas en los músculos dorsales,
incrementos de contractibilidad cardiaca y un síndrome colinérgico que no se debe a la
inhibición de la colinesterasa, trastornos neurológicos y convulsivos para aquellos con
índice de toxicidad más alto. (Repetto M. , Toxicologia Avanzada)
3.2.6 MIEL COMO BIOMARCADOR
La disminución del número de insectos polinizadores, generalmente es a causa de
pesticidas, y es de gran preocupación a nivel mundial, (Cox-Foster et al., 2007).
Dependiendo del tipo de la familia del plaguicida, puede ser sometido a diferentes
procesos, como degradación por el fenómeno de hidrólisis acuosa, retención en el suelo
(adsorción) o volatilización, (Maysaloun et al., 2008) En consecuencia las plantas que son
pecoreadas por las abejas, sufrieron absorción o deposición de residuos de plaguicidas
por suelo, agua o aire. Permitiendo así, que la abeja en su actividad de forrajeo tenga
mayor probabilidad de contaminarse por inhalación, contacto o de manera digestiva al
tomar el néctar de la flor con ayuda de la lengua, donde absorben y almacenan en un
estómago extra que se conoce como cosecha o buche. Este néctar se mezcla con
enzimas como la invertasa que transforman su composición química y el pH, lo que
permite un almacenamiento a largo plazo. Cuando la abeja regresa a la colmena, esta
pasa el néctar a otra abeja regurgitando el líquido en la boca de la otra abeja, (Palarmo,
2013) (Herrero, 2004). Este proceso se repite hasta que la regurgitación del néctar
parcialmente digerido se deposita en el panal, luego de otros procesos de evaporación de
agua de esta mezcla y un largo almacenamiento para facilitar su maduración, se obtiene
la miel, producto que posteriormente (en la apicultura) es comercializado para consumo
humano (figura 8) (Amaral et al., 2016).
33
Figura 8. Transporte del plaguicida a la miel de abejas. Fuente: Adaptado de Cabrera et al., 2016. El polen de abeja como un bioindicador de contaminación
ambiental de plaguicidas.
En el proceso de polinización participan entre 10.000 y 25.000 abejas obreras de una
colmena, donde hacen un promedio de 10 viajes por día para explorar un área
aproximada de 6 Km en los alrededores, y recolectar néctar, polen y agua de las flores,
(Vásquez & Rodrigo, 2006) En este proceso las abejas están expuestas a partículas en el
aire, microorganismos y sustancias químicas, que expeditamente se retienen en la
superficie de su cuerpo, son inhaladas o consumidas. Las abejas melíferas y sus
productos, como la miel, la cera y el polen, se consideran indicadores potenciales que
reflejan la contaminación de su entorno, el biomonitoreo es una valiosa herramienta de
evaluación, en este sentido se puede definir como el uso de organismos o materiales para
obtener información cuantitativa, (Worterbeek, 2002).
34
3.2.6.1 INOCUIDAD DE LA MIEL
La preservación de las abejas es particularmente importante para proporcionar servicios
esenciales al ecosistema, estas se han visto afectadas por factores ambientales,
patógenos, uso incorrecto de productos fitosanitarios, fragmentación del hábitat y
especies invasoras, (Winterlin et al., 1973). Los productos utilizados en la agricultura son
toxicos empleados para mitigar y prevenir hongos, insectos, bacterias entre otros seres
vivos que sean considerados plagas. Muchos de estos xenobioticos, poseen la capacidad
de conservar indemnes sus propiedades fisicoquímicas en largos periodos de tiempo, lo
que permite que se propaguen por diferentes medios y se aglomeren en compartimientos
ambientales, (Shahawi al et., 2010). Los principales contaminantes ambientales son los
plaguicidas, bacterias, materiales radiactivos y metales pesados tóxicos. Entre los
plaguicidas existen diferentes tipos que son clasificados por su composición química,
grado de toxicidad según organizaciones internacionales o actividad especifica, como los
insecticida, acaricida, fungicida, bactericida, herbicida, fitorregulador, rodenticida y
plaguicidas específicos varios, (Rodrigues et al., 2011)
Estos productos logran interactuar con la abeja y a la vez con su colmena, permitiendo
que la colmena y sus derivados sean utilizados como bioindicadores de residuos de
plaguicidas, (Cabrera et al., 2016). La forma de interactuar puede ser por; contacto directo
en plantas visitadas en el percoreo, contaminación de las fuentes de agua de la zona,
contaminación en el aire y suelo, y biomagnificación de compuestos dificiles de degradar
(Zamudio, 2017).
Una exposición aguda de plaguicidas en la abeja, puede ocasionar una muerte rápida
despúes de la aplicación del xenobiótico, y una exposición crónica a dosis subletales
puede dañar su comportamiento alimenticio, afectando así su salud e impediendo el
desarrollo de la colonia, (Johnston et al. 2010).
La reglamentación de la Unión Europea establece que la miel como producto natural no
debe presentar compuestos químicos, sin embargo, se han establecido los límites
máximos de residuos de plaguicidas en miel que oscilan entre 0,01 y 0,1 mg/Kg, a razón
de el uso indiscriminado de plaguicidas y otros factores ambientales, (ver tabla 2) (Reg.
279/2015). Hasta la fecha, los límites máximos de residuos (LMR) de plaguicidas en miel
no están incluidos en el Codex Alimentarius.
35
Tabla 2. Plaguicidas organofosforados y piretroides. Fuente: Propia
Nombre
Común
Acción Biocida Familia del
plaguicida
Nivel de
Toxicidad
LMR
(mg/kg)
Reglamento
para el LMR
Diclorvos Insecticida, acaricida Organofosforado (IB)
0.01*
Anexo II del
Reglamento (CE) no
396/2005.
Profenofos Insecticida, acaricida Organofosforado (II)
0.05
Reg. (EU) No
1096/2014
Monocrotofos Insecticida, acaricida Organofosforado (IB)
0.01*
Anexo II del
Reglamento (CE) no
396/2005.
Fenitrotión Insecticida Organofosforado (II) 0.01 Reg. (EC) No
459/2010
Malatión Insecticida, acaricida Organofosforado (III)
0.05
Regulación (EU)
2015/399
Clorpirifos Insecticida Organofosforado (II)
0.05 Reg. (EU) 2016/60
Cipermetrina Insecticida, acaricida Piretroide (II)
0.05
Reg. (EC) No
459/2010
Lambda-
Cialotrina Insecticida Piretroide (II) 0.05
Reg. (EU) No
834/2013
Nivel de toxicidad: (IB)= Altamente peligroso, (II) Moderadamente peligroso, (III) ligeramente peligroso. (OMS, 2010).
*El plaguicida no posee LMR especifico establecido para miel por ninguna agencia regulatoria, por esto, se toma un LMR
por defecto de 0.01 mg/Kg como indica el reglamento de la UE.
En el pasado de Colombia se utiilizaron plaguicidas de amplio espectro con efecto
fulminante contra plagas desmesuradamente. Los organoclorados, uno de estos
plaguicidas, tiene un efecto contraproducente en el medio ambiente, ya que este tiende a
acumularse en suelos y son productos con larga vida, (Malhat et al., 2015). Mayoria de
productos de esta familia en Colombia se encuentra discontinuada, haciendo dificil su
busqueda para análisis actuales. Otros de los insecticidas más comunes son los
organofosforados y piretroides, los cuales tienen gran uso en cultivos como la papa y
otras hortalizas, que son alimentos de abundante producción en el departamento de
Cundinamarca. Este estudio se ha centrado en estas dos familias cruciales en la
categoría de insecticidas, con un amplio espectro en cultivos y de gran venta y uso a nivel
nacional, (MAVDT, 2007).
36
3.2.7 DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE PLAGUICIDAS
Desde el 2003 con el fenómeno catalogado como “Colony Collapse Desorder” (CCD) se
han generado avances para comprender cómo los productos fitosanitarios utilizados para
la protección de cultivos afectan la disminución de las poblaciones de abejas melíferas.
Los estudios analíticos se han mejorado en términos de confianza y sensibilidad para la
detección y cuantificación de plaguicidas, existen diferentes métodos, por ejemplo el
método de multiresiduo, donde es posible analizar hasta 160 pesticidas al mismo tiempo
por medio de cromatografía de gases y sistemas de acople como el detector de captura
de electrones. Sin embargo el principal inconveniente de estas metodologías se limitan al
intentar identificar pesticidas recientes, para lo cual se han llevado a cabo otras
metodologías, como el uso de cromatografía liquida o cromatografía de gases acoplada
con detección de espectrometría de masas en tándem, que permite mostrar un espectro
más amplio de hasta 500 pesticidas, (Tomas et al. 2016) (García et al. 2017).
El método multiresiduo consta de cuatro etapas; extracción, purificación, detección y
cuantificación, la primera etapa corresponde a la preparación de las muestras, se busca
obtener un aumento de los analitos y disminución de las impurezas, suele emplearse el
método de extracción liquido-liquido (ELL). Sin embargo, en los últimos años en Colombia
se ha transformado el método convencional (Blasco et al., 2004) con el objetivo de
obtener mayores rendimientos de plaguicidas con menor cantidad de miel y un solvente
orgánico que generen menor contaminación, no obstante, es de mencionar que se utiliza
grandes cantidades de este solvente (Rodríguez et al., 2011). También, existen otros
métodos de extracción comúnmente utilizados como lo es la extracción en fase sólida
(Albero et al., (2004), extracción con fluidos supercríticos, (Rissato et al., 2006),
QuEChERS el cual se basa en el uso de sulfato de magnesio y cloruro de sodio para la
extracción y es común encontrar modificaciones dependiendo del analito objetivo
(Anastassiades et al., 2003), y la extracción liquido-líquido con purificación a baja
temperatura, (Paulino de Pinho et al,. 2010).
La fase que corresponde a la purificación o limpieza es implementada mediante
cromatografía de permeación en gel (Dalpero et al., 2001), cromatografía de adsorción
(Fernández et al., 2002) y extracción en fase sólida (Blasco et al., 2003) necesaria para
evitar enmascaramiento de los compuestos, falsos positivos y una cuantificación inexacta
de los analitos. En la etapa de detección, depende principalmente de las características
37
de los plaguicidas de interés, los compuestos volátiles, semivolátiles y térmicamente
estables (Organofosforado, piretroide, organoclorado, entre otros) pueden determinarse
por cromatografía de gases, mientras que los no volátiles y/o térmicamente inestables
deben determinarse por cromatografía líquida como es el caso de los neonicotenoides,
(Kujawski et al. 2014). La cromatografia de gases acoplada a espectrometría de masas
(CG-EM) cuadrupolar es una de las técnicas con más auge en la determinación
cuantitativa de bajas concentraciones de plaguicidas en matrices compleja como la miel,
sin embargo, como se puede observar en la tabla 1, existen más detectores, como el
detector fotométrico de llama FPD, el detector de nitrogeno fosforo NPD y el detector de
emisión atómica o AED (Amaral et al. 2016). La espectrometria de masas permite la
identificación y detección de iones específicos y sus transiciones de tiempo, este sistema
de monitoreo selectivo de iones es conocido como SIM, en este modelo se seleccionan
los tres iones más intensos del compuesto, donde uno se utilizará para cuantificar y los
otros dos como confirmación. La sensibilidad de este metodo depende de la cantidad de
iones seleccionados. La elección de la columna para CG varia dependiendo de las
necesidades de los analitos, la más utilizada es la columna no polar 5% fenil-95%
dimetilpolisiloxano, también es utilizada columnas de polaridad media y de polaridad alta
como el 50% Cianopropilfenil-50% Dimetilpolisiloxano (Mukherjee, 2009).
38
4 DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA
La metodología de esta investigación se direccionó de acuerdo con los objetivos
planteados hacia cinco puntos principales:
Muestreo de la miel de abejas en catorce veredas del departamento de
Cundinamarca (particularmente en las provincias de Sabana occidental, Sabana
Centro, Soacha y Usme localidad de Bogotá). Así como determinar las
propiedades físicas del terreno en las zonas donde se realizó el respectivo
muestreo.
Llevar a cabo una caracterización fisicoquímica de cada muestra bajo la norma
técnica Colombiana NTC 1273 del 2007 establecida para determinar propiedades
y alteraciones en la miel de abejas, donde se determinó parámetros de pH, Acidez,
Humedad, Cenizas, Hidroximetilfurfural y % de sacarosa.
Extracción selectiva de plaguicidas organofosforados y piretroides por medio de
método líquido-líquida, posterior limpieza empleando una columna de
cromatografía clásica y finalmente el análisis instrumental efectuado con un
cromatógrafo de gases acoplada a espectrometría de masas.
Evaluar el método de cuantificación de residuos de plaguicidas por medio de los
parámetros de selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad,
exactitud-veracidad y precisión bajo los criterios de regulación de la Unión
Europea SANTE/11813/2017.
Analizar el contenido de trazas de plaguicidas organofosforados (Diclorvos,
Malatión, Fenitrotión, Monocrotofos, Clorpirifos y Profenofos) y piretroides
(Cipermetrina y Lambdacialotrina,) en las muestras de miel recolectadas en
catorce veredas de Cundinamarca por medio de cromatografía de gases acoplada
a espectrometría de masas.
39
4.1 METODOLOGÍA PARA LA RECOLECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS
MUESTRAS DE MIEL
La metodología consistió en dos partes, primero, realizar una investigación cualitativa por
medio de una encuesta elaborada a apicultores de catorce veredas del departamento de
Cundinamarca, en las provincias de Sabana Occidental, Sabana Centro, Soacha y Usme
localidad de Bogotá. Posteriormente se llevó a cabo la caracterización fisicoquímica de la
miel de abejas de la especie Apis mellifera para la determinación y detección de
propiedades que permiten establecer alteraciones en este producto alimenticio.
4.1.1 Reactivos y materiales
4.1.1.1 Reactivos
Los reactivos empleados en este estudio fueron:
Fenolftaleína al 1% en etanol
NaOH 97% de pureza
Crema de alúmina
Solución de HCl al 5.34 N
Solución de Fehling (Solución acuosa de sulfato de cobre (II) al 3% + solución
acuosa de tartrato de sodio y potasio en hidróxido de sodio a una concentración de
15%)
Solución de Carrez I (15g de K4Fe(CN)6.3H2O en 100 ml de agua)
Solución de Carrez II (30g de Zn(AcO)2.2H2O en 100 ml de agua).
Sulfito ácido de sodio al 0.2%
4.1.1.2 Equipos
Potenciómetro Hanna portátil calibrado a pH de 4 y 7.
Horno Thermolyne 47900 Furnace
Refractómetro ABBE calibrado
Espectrofotómetro GENESYS 20
40
4.1.2 Caracterización de la zona y recolección de muestras:
En primera instancia se realizó un mapeo básico con la ubicación del apiario
(departamento, municipio, vereda y altitud), tipos de cultivos en un radio de 5km, fuentes
de alimentación de las abejas y tipo de abeja. Posteriormente se recolectaron 14
muestras de miel directamente del panal de diferentes zonas del departamento de
Cundinamarca. Cada muestra correspondió a 60 mL de miel en un recipiente de vidrio,
almacenado bajo refrigeración (- 20 °C) para su posterior análisis.
4.1.3 Caracterización de las mieles:
Se evaluó de forma cuantitativa seis parámetros; pH, Acidez libre, Humedad, Cenizas,
Sacarosa y HMF, bastante representativos para la determinación de mieles florales,
mieladas o adulteradas, cada prueba se realizó 3 veces para evaluar la exactitud y
precisión del método. Esto en base a la Norma Técnica Colombiana NTC 1273, que
establece los valores de los parámetros fisicoquímicos de la especie de abejas Apis
mellifera, (ICONTEC, 2007). A continuación, se describirán los métodos utilizados y un
breve resumen por cada parámetro evaluado:
4.1.3.1 Determinación de valor de pH
El pH corresponde a la concentración de hidrogeniones (H+) en una solución al 10 % de
la muestra de interés. Para la medición del pH se pesaron 4 gramos de la muestra de miel
y se diluyeron en 20 mL de agua destilada, Posteriormente se midió el pH con ayuda de
un potenciómetro HANNA portátil calibrado a pH de 4, de 7 y a una temperatura entre 20
y 22 o C. Esta medición a su vez se replicó tres veces para cada muestra.
4.1.3.2 Determinación de acidez libre
Esta metodología basada en una neutralización del ácido libre presente en la muestra
bajo análisis se desarrolla pesando 4 gramos de muestra de miel y se diluyen en 30 mL
de agua destilada, se toma el pH inicial por medio de un potenciómetro HANNA portátil.
Se toman alícuotas de 10 mL adicionando dos gotas del indicador fenolftaleína y se titulan
utilizando una bureta de 25 mL provista de una llave de flujo, cargada con NaOH al 0.1 N.
El punto final de la titulación corresponde a la aparición de una coloración rosa, el cual
41
debe perdurar durante mínimo 10 segundos. Posteriormente fue tomado el dato del
volumen empleado en la titulación y calcular la acidez libre por medio de la ecuación
1. (Zandamela, 2008) (MAFF, 1992).
Acidez= 10 x V Ecuación 1 .
Donde V: Número de mL de NaOH al 0.1 N
4.1.3.3 Determinación de Humedad
Este factor se encuentra relacionado con la calidad durante el almacenaje de la miel, ya
que un porcentaje alto de humedad causa cristalización de la miel y fermentación de sus
componentes. Para su determinación fue empleado un refractómetro de ABBE calibrado.
Sobre los prismas se dejó caer suavemente unas gotas de miel y se determinó el índice
de refracción. La lectura se realizó a 20°C. Posteriormente el porcentaje de humedad se
calculó con la tabla de índice de refracción contra humedad a 20°C (tabla 3) .Esta tabla se
construyó a partir de una gráfica del logaritmo del índice de refracción menos el contenido
de agua determinado por secado al vacío, método citado en Harmonised methods of the
European Honey Commission, (AOAC, 1992).
42
Tabla 3. Valores de índice de refracción y % de humedad. Fuente: (Serna & Lopez, 2010)
Índice De Refracción
20 o C
% De
Humedad
Índice De Refracción
20 o C
% De
Humedad
1.5041 13 1.494 17
1.5035 13,2 1.4935 17,2
1.503 13,4 1.493 17,4
1.5025 13,6 1.4925 17,6
1.502 13,8 1.492 17,8
1.5015 14 1.4915 18
1.501 14,2 1.491 18,2
1.5005 14,4 1.4905 18,4
1.5 14,6 1.49 18,6
1.4995 14,8 1.4895 18,8
1.499 15 1.489 19
1.4985 15,2 1.4885 19,2
1.498 15,4 1.488 19,4
1.4975 15,6 1.4876 19,6
1.497 15,8 1.4871 19,8
1.4965 16 1.4866 20
1.496 16,2 1.4862 20,2
1.4955 16,4 1.4858 20,4
1.495 16,6 1.4853 20,6
1.495 16,8 1.4849 20,8
43
4.1.3.4 Determinación de cenizas
La determinación de cenizas corresponde al material inorgánico presente en la muestra
después de calcinar. De esta manera para su determinación se tomó un crisol
previamente tarado y se pesaron 2 gramos de la muestra de interés, posteriormente se
calcinó a una temperatura de 550 o C durante tres horas y se dejó enfriar en un
desecador. Una vez frio se pesó el crisol de nuevo y por diferencia de peso el % P/P de
cenizas presentes en la miel fue calculado (MAFF, 1992).
4.1.3.5 Determinación de azúcar: Sacarosa
El contenido aparente de sacarosa se evaluó mediante un antiguo método de inversión de
Walker, aunque la exactitud del método es aceptable, no es recomendable para la
determinación de sacarosa, sino para medición de azúcares reductores totales. A pesar
de lo mencionado anteriormente, esta técnica es viable cuando no se cuenta con equipos
de cromatografía como establece la norma colombiana que se debe hacer. El método
consistió en pesar 25 g de muestra de miel y diluir con agua destilada en un matraz de
100 mL, añadir 5 mL de crema de alúmina, aforar y filtrar. Se tomó una alícuota de 10 mL
de la solución anterior y se diluyó con agua destilada en un balón de 250 mL hasta aforo.
Luego se tomó una alícuota de 50 mL y se depositó en un balón de aforo de 100 mL, se
agregó 25 mL de agua destilada y se calentó el balón hasta una temperatura de 65 °C en
baño María. Luego de retirarlo del baño María se añadieron 10 mL de ácido clorhídrico al
5,34 N. Se dejó enfriar la solución y se neutralizó con Hidróxido de Sodio al 5 N,
empleando papel tornasol como indicador. Posterior a esto se completó el volumen del
balón hasta aforo y se realizó la titulación con una solución de Fehling, (NTE, 1989).
4.1.3.6 Determinación de Hidroximetilfurfural
Para la realización de la determinación del contenido de hidroximetilfurfural se trata la
muestra de miel con dos reactivos Carrez y se realiza la medición de absorbancia en un
rango de longitudes de onda entre 284-336 nm, empleando un espectrofotómetro análogo
UV- VIS. De esta manera se pesaron de 5 a 10 gramos de miel y se disolvieron en 25 mL
de agua. Posteriormente se añadieron 0.5 mL de la solución Carrez I (15 g de ferrocianuro
de potasio trihidratado en 100 mL de agua destilada) y 0.5 mL de la solución Carrez II (30
g de acetato de zinc dihidratado en 100 mL de agua destilada). Una vez realizado esto se
44
pasó la solución a un matraz aforado de 50 mL, se filtró, los primeros 10 mL se
desecharon y se dispuso el volumen restante para el análisis espectrofotométrico en el
espectrómetro de la Universidad Distrital en laboratorios de química, (AOAC, 980.23,
1992) (Méndez & López, 2011).
Para la realización de la muestra blanco se tomaron 10 mL del filtrado en dos tubos, en el
primero se añadieron 5 mL de agua y en segundo 5 mL de una solución de sulfito ácido
de sodio al 0.2 % y se realizó el mismo análisis espectrofotométrico anteriormente
descrito.
4.1.4 Análisis estadístico de la caracterización fisicoquímica de miel de abejas
El análisis descriptivo se realizó calculando la desviación estándar del promedio de las
muestras para cada parámetro, además, se calculó la precisión del método a través de las
replicaciones de una misma muestra bajo condiciones similares, este parámetro se evaluó
por medio de un coeficiente de variación menor al 10%.
Para este estudio se usó un análisis de varianza (ANOVA) con un modelo lineal mediante
el programa de Excel, para este análisis se plantearon dos hipótesis que se pueden
observar en la tabla 4, la aprobación de la hipótesis se realizó por medio del valor F de la
distribución de Fisher, el cual corresponde a 4.67 para un nivel de confianza del 95% en
1 grado de libertad del numerador y 13 grados de libertad para el denominador. El criterio
de selección fue que si el valor de distribución era mayor al valor F se aprobaba la
hipótesis nula y un valor de distribución menor al valor F aprobaba la hipótesis alternativa
(ver tabla 4).
Tabla 4. Hipótesis estadísticas para el análisis de varianza simple (ANOVA).
ANOVA Hipótesis nula 1 (Ho) La varianza de las muestras de miel no presentan diferencias significativas
Hipótesis Alternativa 1
(H1) La varianza de las muestras de miel son significativamente diferentes
45
4.2 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS
4.2.1 MÉTODO MULTIRESIDUO PARA PLAGUICIDAS
La miel es una de las matrices más compleja de los productos apícolas debido a las
interferencias que presenta. Es por esto, que es necesario realizar un proceso de
extracción y limpieza que permita la detección y cuantificación adecuada de los analitos.
En este estudio se aplicó el método de extracción líquido-líquido con acetato de etilo,
limpieza por cromatografía de columna clásica con silica gel y cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas para 8 plaguicidas de la familia organofosforado y
piretroide propuesto por Rodríguez et al. 2011.
4.2.1.1 Materiales y reactivos
4.2.1.1.1 Estándares de plaguicidas
Los estándares de plaguicidas que se utilizaron provenientes de la casa comercial Dr.
Ehrenstorfer fueron: Diclorvos con pureza 99,0%, Monocrotofos con pureza 98,5%,
Fenitrotión con pureza 98,0%, Malation con pureza 99,0%, Clorpirifos con pureza 99,9%,
Profenofos con pureza 98,5%, Lambda-cialotrina con pureza 98,5% y Cipermetrina con
pureza 96.5%.
4.2.1.1.2 Reactivos
Los reactivos empleados para esta investigación fueron:
Acetato De Etilo grado cromatográfico Hexano grado cromatográfico Silica gel grado residuos (60 – 100 mesh) previamente activada con calentamiento
a 150 oC por 4 horas Metanol Sulfato De Sodio anhidro (12 – 60 mesh) previamente secado con calentamiento a
150 oC por 4 horas Ácido cítrico a una concentración de 0.15 g/L Acetato de sodio a una concentración de 0.15 g/L
46
4.2.1.1.3 Equipos
Balanza digital Denver instrument
Centrifuga Universal modelo PLC – 012E
Rotavapor Buchi R-300
Cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890A/5975C
con software Chemstation
4.2.1.2 Método de extracción multiresiduo de plaguicidas
El análisis de una muestra de miel consistió en cuatro etapas. Una en la que se aplica un
pretratamiento de la muestra, seguido de una extracción, limpieza y análisis instrumental;
la metodología de análisis se encuentra bien documentada por Rodríguez et, al. 2011, por
lo cual la optimización del método en la presente investigación se realizó teniendo en
cuenta las recomendaciones sugeridas por el autor.
4.2.1.2.1 Pre-tratamiento
En esta etapa se pesó 1 g de miel en un tubo eppendorf de 15 mL con ayuda de una
balanza digital de tres cifras significativas, posterior a esto, se agregó 1.5 mL de Metanol
analítico con el objetivo de disminuir la viscosidad de la miel, además, se adicionó 1 mL
de Buffer de citratos a un pH de 5.5, el cual se preparó a partir de una solución de ácido
cítrico (0.15 g/L) y acetato de sodio (0.15 g/L) en proporción 1:6. Finalmente, se realizó
agitación vigorosamente durante 5 minutos de manera manual (figura 9)
47
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso de pretratamiento de la muestra de miel
4.2.1.2.2 Extracción
En esta segunda etapa correspondiente a la extracción selectiva de plaguicidas se realizó
una primera extracción a la respectiva muestra pre-tratada como se indica en el numeral
anterior adicionando 10 mL de Acetato de etilo analítico con una pipeta graduada de 10
mL, se agitó vigorosamente de manera manual la mezcla en el tubo durante 15 minutos.
Después se centrifugó a 4000 rpm durante de 5 minutos, se tomó la fase orgánica y se
transfirió a un Erlenmeyer. A continuación, se realizó una segunda extracción con la fase
precipitada del tubo adicionando 1.5 mL de Metanol analítico y 5 mL de Acetato de etilo
analítico y nuevamente se agitó por 15 minutos. Seguido, se centrifugó esta segunda
mezcla a 4000 rpm en un tiempo de 5 minutos, se tomó la fase orgánica y se adicionó
este segundo extracto al Erlenmeyer donde estaba el primer extracto. Posterior a esto, se
concentró la muestra hasta alcanzar sequedad con un rotavaporador Buchi a una presión
de 240 mmHg, una temperatura de 48 °C y 60 rpm. Finalmente, se le adicionó 1 mL de
Acetato de etilo al balón del rotavaporador y se almacenó la muestra para utilizarla en la
siguiente etapa (figura 10).
PRE- TRATAMIENTO
Disolver
Agitar
Continuar con etapa de
extracción
1,5 mL de metanol
1 gramo de muestra
La muestra
Pesar
1 mL de solución Buffer de ácido cítrico
(0,15 g/mL) y Acetato de sodio (0.15 g/mL)
Tubo eppendorf
Pipeta graduada Agregar
Por 5 minutos
48
Figura 10 . Diagrama de flujo del proceso de extracción selectiva de plaguicidas en muestras de miel
4.2.1.2.3 Limpieza
La limpieza se realizó de la siguiente manera; se tomó una columna de vidrio de 20 cm x
2 cm de diámetro para cromatografía clásica, se preparó agregando un tapón de algodón
en la parte inferior de esta. Se agregó 20 mL de Hexano analítico y 2 g de Sulfato de
sodio Anhídrido (activado a 140 °C por 4 horas en un horno), posteriormente, se añadió 8
g de Silica gel activada (140 °C por 4 horas en un horno) y por último 3 g de sulfato de
Sulfato de sodio Anhídrido, evitando que quedaran burbujas. Se eliminó el exceso de
hexano (evitando que la columna se secara) y se agregó el extracto orgánico en la parte
superior de la columna de vidrio. Seguido, se adicionó la fase móvil constituida por
Acetato de etilo y Hexano en relación 1:1. Se desecharon los primeros 5 mL y se
conservaron los siguientes 20 mL en un Erlenmeyer, luego se rota vaporaron los 20 mL
hasta sequedad y se llevó a 1 mL con acetato de etilo, finalmente se transfirió a un vial y
se conservó a una temperatura de -20 °C (figura 11).
49
Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de limpieza de la muestra de miel
4.2.2 OPTIMIZACIÓN METODOLOGÍA ANALÍTICA
4.2.2.1 DESARROLLO MÉTODO CROMATOGRÁFICO
Para la determinación de plaguicidas en las muestras de interés se empleó un
cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890A/5975C. La
separación se realizó en una columna capilar DB-5MS de 30 metros de longitud x 0,25
mm x 0,25 µm con una inyección en modo Splittles pulsado con presión de pulso de 152
kPa durante 0.8 min, volumen de inyección de 2 μL, el gas de arrastre utilizado fue helio
(grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La programación de la temperatura del
horno se realizó de acuerdo a lo propuesto por Rodríguez et, al. 2011. Así pues la
temperatura del horno inicio a 52 oC (0 min) con un aumento de temperatura de 4 oC/min
hasta alcanzar 100 oC, seguido a esto se aumentó la temperatura hasta 110 oC
a 2 oC/min, posteriormente a una velocidad de 20 oC/min se llevó hasta una
temperatura de 130 oC , luego hasta 145 oC a 4 oC/min y finalmente se llegó a
280 oC aumentando 5 oC por minuto, el tiempo de la corrida fue de 50 minutos.
50
Se realizaron ensayos preliminares correspondientes a la inyección de los ocho
estándares de plaguicidas a una concentración de 1 mg/ L en modalidad SCAN en un
rango de 0 a 500 m/z con el objetivo de evaluar el perfil de fragmentación y el tiempo de
retención de cada plaguicida. Posteriormente se realizaron ensayos preliminares por
modalidad SIM, el cual corresponde a un monitoreo selectivo de iones en los analitos de
interés; esta última metodología de análisis es muy selectiva, sensible y permite
cuantificar trazas de compuestos presentes en las muestras de interés.
4.2.2.2 VALIDACIÓN MÉTODO ANALÍTICO
El método se validó de acuerdo a la guía de SANTE/11813/2017, donde se determinó
selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, veracidad – exactitud
y precisión.
4.2.2.2.1 SELECTIVIDAD
La selectividad es el grado de probabilidad de que el analito se diferencie de otros
componentes de la matriz, en este estudio se evaluó con el espectrómetro de masas en la
modalidad SIM, (Comisión de CODEX Alimentarius, 2010).
La valoración de la selectividad de la metodología se realizó mediante la inyección de dos
tipos de muestras; la primera muestra fue el blanco proveniente del departamento de
Cundinamarca donde la alimentación de las abejas derivaba del bosque nativo, lo que
implicaba ser una muestra sin trazas de plaguicidas. Se tomó un gramo de esta muestra
de miel y se sometió a la extracción multiresiduo para plaguicidas mencionado en el
numeral 4.2.1.2, esta prueba se replicó 6 veces. La segunda muestra se preparó a partir
de extractos de miel fortificados con una mezcla de estándares de los plaguicidas del
estudio. La fortificación se realizó agregando una alícuota de 10 µL de la mezcla de
trabajo la cual se encuentra detallada en la tabla 5, luego se esperó 20 minutos para que
los plaguicidas se adsorbieran en la miel y representar una muestra real, posteriormente,
se efectuó la extracción multiresiduo de plaguicidas de la misma forma que se desarrolló
con el blanco. Las muestras 1 y 2 fueron comparadas entre sí para determinar
interferencias de la matriz en los tiempos de retención de cada plaguicida por medio de la
especificidad.
51
Las inyecciones de ambas muestras se hicieron en modalidad SIM, para todos los
plaguicidas se seleccionaron al menos tres iones, el primer ion seleccionado por cada
analito correspondió al ion de cuantificación conocido como Ion Target, los demás iones
seleccionados fueron de confirmación o cualificadores. Los criterios de selección de los
iones se basaron en la alta intensidad de fragmentación con m/z > 100 y la falta de
interferencias de la matriz en los tiempos de retención de los plaguicidas.
4.2.2.2.2 LIMITE DE DETECCIÓN Y LIMITE DE CUANTIFICACIÓN
El límite de detección (LD) es la concentración mínima que puede ser detectada por un
método analítico, pero no necesariamente cuantificada. En el proceso metodológico del
LD se inyectó 6 veces el blanco de miel sin plaguicidas al cual se le aplicó la metodología
del numeral 4.2.1.2, lo que permitió establecer el ruido del blanco en la ventana de tiempo
de cada plaguicida, a partir del ruido se calculó la desviación estándar. La desviación
estándar del ruido y la pendiente de la curva de calibración posibilitó estimar los límites de
detección para cada plaguicida, según el método de la IUPAC (Corley, 2003).
A continuación se observa la ecuación para determinar el LD de cada plaguicida
𝐋í𝐦𝐢𝐭𝐞 𝐝𝐞 𝐝𝐞𝐭𝐞𝐜𝐜𝐢ó𝐧 =𝟑 𝒙 𝑫𝑺
𝒎 Ecuación 2
DS= Desviación Estándar
m= Pendiente de la curva de calibración
El límite de cuantificación (LC) es la concentración mínima de la sustancia de interés que
puede ser cuantificada de manera exacta y precisa. El LC se estimó de igual manera que
el LD con el método de la IUPAC, (Corley, 2003). La ecuación para determinar el LC se
encuentra a continuación.
𝐋í𝐦𝐢𝐭𝐞 𝐝𝐞 𝐜𝐮𝐚𝐧𝐭𝐢𝐟𝐢𝐜𝐚𝐜𝐢ó𝐧 =𝟏𝟎 𝒙 𝑫𝑺
𝒎 Ecuación 3
Posteriormente, se aplicó un método de confirmación del límite de cuantificación, para
este se realizó una curva de calibración con concentraciones inferiores y superiores al
límite de detección del método de la IUPAC, se estableció el valor mínimo cuantificable
para cada plaguicida y se evaluó su precisión mediante el coeficiente de variación. A partir
52
de los resultados que fueron obtenidos experimentalmente, se aplicó el método propuesto
por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) para la determinación del Límite de
Detección del Método (MDL) y el Límite de Cuantificación del Método (MCL). El MDL
corresponde a la concentración mínima que puede ser medida y reportada con un 99% de
confianza, fue estimado a partir del análisis de una muestra de matriz que contenía el
analito por un método específico. El desarrollo metodológico consistió en fortificar un
blanco de matriz a una concentración de 10 µg/L aproximadamente para cada plaguicida,
se extrajeron los analitos mediante la metodología descrita en el numeral 4.2.1.2. Este
ensayo se replicó 12 veces para evaluar su exactitud y precisión. Los criterios de
aceptación de la exactitud fueron determinados por el rango del porcentaje de
recuperación de los analitos, por otro lado, la precisión se evalúo con un coeficiente de
variación (CV) menor al 20%. Se determinó la concentración de los analitos en cada
fortificada y se calculó la desviación estándar para 12 muestras. La ecuación para evaluar
el MDL se encuentra a continuación y consta de dos variables que son la desviación
estándar y la t de Student.
MLD = 2 t (1-α; ν) x SD Ecuación 4.
t = t-Student
1-α= probabilidad b
v= Grados de libertad
SD = Desviación estándar de las lecturas del testigo.
Sí: t (0.01, 11) → 2.7181
El límite de Cuantificación del Método (MCL) expresa la concentración mínima que puede
ser cuantificada de manera confiable con un cierto grado de fiabilidad en una matriz por
un método específico. El desarrollo metodológico del MCL fue evaluado bajo los mismos
parámetros del MDL, la ecuación para evaluar el MCL se encuentra a continuación:
MCL = 3 x MDL Ecuación 5.
53
4.2.2.2.3 LINEALIDAD
La linealidad contempla evaluar la capacidad del método para dar una respuesta
instrumental proporcional a la cantidad de analito que contiene determinada muestra,
dentro de un intervalo dado (Duffau, y otros, 2010) . De esta manera en el presente
análisis se realizó la construcción de una curva de seis puntos compuesta por los ocho
plaguicidas a diferentes concentraciones cada uno, abarcando valores cercanos al cero y
valores superiores al valor de interés (LMP); a su vez esta curva fue preparada a partir de
una mezcla de trabajo elaborada previamente (tabla 5) empleando alícuotas específicas
para cada nivel y acetato de etilo como solvente. Así mismo se efectuaron 12
replicaciones de las curvas, de las cuales dos analistas prepararon 6 curvas cada una,
luego fueron inyectadas y analizadas por cromatografía de gases acoplada a masas.
Posteriormente se evaluó la regresión lineal aplicada por medio de un análisis de
varianza, donde se estableció la significancia del modelo y = mx + b, la cercanía
estadística de los parámetros m (pendiente de la curva) y b (punto de intercepción) a cero,
así como la correlación de la respuesta cromatográfica (Y) y la concentración (X);
finalmente se realizó una prueba t-Student como un indicador del modelo lineal, donde se
calculó el valor de t con n-1 grados de libertad y se comparó con el valor tabulado de t
para el nivel de confianza (α = 0.05). Así mismo para el desarrollo estadístico mencionado
anteriormente se formularon dos hipótesis nulas y dos hipótesis alternativas, las cuales se
muestran en la tabla 6.
Tabla 5. Niveles de concentración en mg/ L por plaguicida. Fuente: Elaboración propia
Diclorvos (mg/L)
Fenitrotión (mg/L)
Malation (mg/L)
Clorpirifos (mg/L)
Profenofos (mg/L)
Lambda-Cialotrina
(mg/L)
Cipermetrina (mg/L)
Alícuota µL
Nivel 1 0.025 0.25 0.01 0.005 0.01 0.01 0.2 10
Nivel 2 0.05 0.05 0.02 0.01 0.02 0.02 0.4 20
Nivel 3 0.125 0.125 0.05 0.025 0.05 0.05 1 50
Nivel 4 0.25 0.25 0.1 0.05 0.1 0.1 2 100
Nivel 5 0.5 0.5 0.2 0.1 0.2 0.2 4 200
Nivel 6 1.25 1.25 0.5 0.25 0.5 0.5 10 500
Mezcla de trabajo 2.5 2.5 1 0.5 1 1 20
54
Tabla 6 Hipótesis estadísticas para la técnica de regresión lineal simple. Fuente: Elaboración propia
Regresión lineal simple Hipótesis nula 1 (Ho) El modelo no presenta linealidad
Hipótesis Alternativa 1 (H1) El modelo presenta linealidad
Hipótesis nula 2 (Ho) la pendiente no es significativamente diferente de cero
Hipótesis Alternativa 2 (H1) la pendiente es significativamente diferente de cero
4.2.2.2.4 VERACIDAD – EXACTITUD
La exactitud en un método de análisis que contempla el grado de concordancia entre el
valor de referencia y el resultado de un ensayo, es decir, la exactitud determina el grado
de coincidencia entre un valor de referencia y el valor medio obtenido de una serie de
resultados (Duffau et al., 2010). De esta manera en este estudio la exactitud fue evaluada
como porcentaje de recuperación de muestras fortificadas con una concentración
conocida de los plaguicidas de interés y la comparación con los resultados analíticos de
un nivel o patrón de concentración igual. Para esto se tomaron los niveles de referencia
de la curva de calibración y se realizaron los respectivos recuperados a la misma
concentración de cada nivel, agregando el volumen correspondiente de la mezcla de
plaguicidas y dejando concentrar por un lapso de veinte minutos aproximadamente.
Posteriormente se trató cada muestra siguiendo la metodología de extracción multiresiduo
de plaguicidas descrita en numeral 4.2.1.2, seguido de un análisis cromatográfico por
método SIM y una comparación de estos resultados con los resultados de las muestras de
referencia. De igual manera se realizaron doce replicaciones de la metodología
anteriormente descrita para cada nivel de recuperación de interés.
Los resultados obtenidos se trataron estadísticamente por medio de un cochran’s test con
el fin de evidenciar la homogeneidad que se presenta entre los recuperados, es decir, se
buscó determinar si la metodología es efectiva en cada nivel o es variable en función de la
concentración. Así mismo este cochran’s test tiene como hipótesis nula e hipótesis
alternativa, las que se muestran en la tabla 7.
55
Tabla 7. Hipótesis estadísticas para el Cochran's test. Fuente: elaboración propia
Cochran's test
Hipótesis nula 1 (Ho) Se presenta homogeneidad entre las varianzas en los porcentajes
de los niveles de recuperación
Hipótesis Alternativa 1 (H1) No se presenta homogeneidad entre las varianzas en los
porcentajes de los niveles de recuperación.
Por otro la exactitud se confirma estimando el grado de coincidencia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado (Duffau, y otros,
2010), por lo cual se determinó el error absoluto, es decir, establecer la diferencia los
resultados esperados en un ensayo (material fortificado) y la medición de un valor real
(Niveles control) y luego se evaluó este error absoluto por medio de una prueba t-Student.
En la ecuación 6 se evidencia la fórmula para calcular el error absoluto.
𝑬𝒓𝒓𝒐 𝒂𝒃𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐 = 𝑿 − 𝑿𝒂 Ecuación 6.
Donde:
X = Valor obtenido o promedio de los valores obtenidos
Xa = Valor de aceptado como real.
4.2.2.2.5 PRECISIÓN
La precisión es el grado de dispersión entre resultados obtenidos de múltiples ensayos de
una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas. La precisión se evaluó a
través de la repetibilidad y precisión intermedia del método.
La repetibilidad del método se efectuó preparando 5 fortificaciones en tres diferentes
niveles de concentración de la curva de calibración. Un gramo de miel se fortificó tomando
alícuotas de 10 µL, 50 µL y 200 µL de la mezcla de trabajo la cual se encuentra descrita
en la tabla 5, luego se esperó 20 minutos para que los plaguicidas se adsorbieran en la
miel y simular una muestra real, seguido, se realizó la extracción multiresiduo para
plaguicidas como se mencionó en el numeral 4.2.1.2. La evaluación de la repetibilidad se
determinó bajo un coeficiente de variación menor del 20%.
56
La precisión intermedia del método se calculó a través de los resultados obtenidos con un
segundo analista que realizó la misma cantidad de ensayos en las mismas condiciones
que se mencionó en el párrafo anterior. La evaluación de este parámetro se hizo mediante
la comparación de los resultados del analista 1 y el analista 2 bajo un coeficiente de
variación menor del 20% como establece la norma SANTE/11813/2017.
4.2.3 DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS EN 14 MUESTRAS DE MIEL DE ABEJAS
Después de validar el método de CG-EM con los parámetros mencionados en el numeral
4.2.2, se realizó la determinación de residuos de plaguicidas para 13 de 14 muestras de
miel de abejas provenientes de 14 veredas del departamento de Cundinamarca. El total
de las muestras de miel fueron suministradas por apicultores de la región. Los resultados
obtenidos en este análisis, fueron comparados con los resultados de las encuestas y
justificados a partir de estudios anteriores en el departamento de Cundinamarca.
57
5 RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 CARACTERIZACIÓN DE LA MIEL DE ABEJAS
5.1.1 Zonas de muestreo
Las zonas de muestreo estuvieron conformadas por 1 barrio ubicado en la capital del
país, 1 vereda de la localidad de Usme, 1 vereda de la localidad de Ciudad Bolívar y 11
veredas de la región de Cundinamarca, siendo en total 14 muestras. La región
seleccionada como estudio, es uno de los núcleos productores en apicultura más
importante para Colombia. Los municipios que participaron fueron; Tocancipá, Sibaté, La
Calera, Sopo, Zipaquirá, Guatavita, Guasca, Mosquera, El Rosal y Subachoque, como se
evidencia en la figura 12. Gracias al mapeo que se realizó, se determinó que la altura
oscila entre 3295 y 2541 m s. n. m, la precipitación anual es de 900 y 2000 mm y su
temperatura ambiente es entre 11-18 °C. Condiciones climatológicas y características que
hacen que la región sea óptima para productos apícolas como el polen y el propóleo, más
que la miel.
En varias áreas donde se ubican los apiarios, se encuentran arbustos y árboles
característicos de una vegetación nativa, también se pueden encontrar pinos y eucaliptos.
Los cultivos más relevantes en esta región son; papa, caña panelera, café, maíz, mango,
frijol, cítricos, plátano, arveja, palma de aceite y otros cultivos, siendo el cultivo de papa el
de mayor producción en la región, (MINAGRICULTURA, 2014).
58
Figura 12. Mapa de Cundinamarca con los diferentes puntos de recolección de las 14 muestras. Fuente: propia.
Con el objetivo de complementar la información obtenida de algunos recorridos, se aplicó
una encuesta a cada uno de los apicultores donadores de las 14 muestras. La encuesta
consistió de ocho preguntas.
59
Pregunta 1. Ubicación del apiario (Municipio y vereda)
Tabla 8. Ubicación de las muestras de miel. Fuente: propia.
Número de la muestra
Departamento Municipio o
Localidad Vereda o Barrio
M1 Cundinamarca Tocancipá Canavita
M2 Cundinamarca Sibaté NR
M3 Cundinamarca La Calera San Rafael
M4 Cundinamarca Ciudad Bolívar Mochuelo
M5 Cundinamarca Sopo Chamicera
M6 Cundinamarca Zipaquirá Lunealito
M7 Cundinamarca Guatavita Corales
M8 Cundinamarca Guasca Santa Ana
M9 Cundinamarca Guasca Santuario
M10 Cundinamarca Usme Cascavita
M11 Cundinamarca Mosquera Mondoñedo
M14 Cundinamarca Barrios Unidos 11 de Noviembre
M15 Cundinamarca El Rosal El Rodeo
M16 Cundinamarca Subachoque Guamal
En la tabla 8 se puede observar que las muestras están distribuidas en 4 provincias del
departamento de Cundinamarca, que son la Sabana Centro, Sabana Occidente, Guavio y
Soacha. Las muestras M1, M5 y M6 pertenecen a la provincia de Sabana Centro, las
muestras M11, M15 y M16 pertenecen a la provincia de Sabana Occidente, las muestras
M3, M7, M8 y M9 pertenecen a la región del Guavio, la muestra M2 pertenece a la
provincia de Soacha y por último las muestras M4, M10 y M14 pertenecen al Distrito
Capital.
Pregunta 2. ¿Qué especie de abeja trabaja?
El 100% de los apicultores manifestaron que trabajan con la especie de abeja Apis
mellifera.
Pregunta 3. ¿Qué tipo de terreno presenta el lugar donde realizó el muestreo?
En la figura 13 se evidencia que el 77% de las personas encuestadas afirmaron que el
terreno en el que se encuentra el apiario es montañoso. Es común dado la diversidad de
las formas de los terrenos en Cundinamarca. Mayoría de los apiarios de este estudio
60
están ubicados en zonas rodeadas de bosque natural, siendo este el principal y más
cercano alimento de las abejas. Sin embargo, a un radio menor de 5 km es posible
visibilizar cultivos de varios tipos, convirtiéndose en otra posible fuente de alimentación de
las abejas. En la siguiente pregunta evaluaremos los tipos de cultivos más cercanos de
los apiarios que participaron en el estudio.
Pregunta 4. Realice una descripción de los cultivos cercanos al apiario donde tomó la
muestra (Aproximadamente en un rango de 1-6 km)
El 21% de los apicultores confirmaron tener bosque nativo al alrededor de su apiario, cabe
resaltar que la frontera de los apiarios estudiados es el bosque nativo pero en un radio
mayor a 1 km pueden existir otros cultivos. Según la encuesta realizada a los apicultores,
el cultivo con el que más frecuencia se encuentra es el de papa, como se mencionó
anteriormente, la papa, la cebolla, la fresa y las hortalizas son de gran relevancia para la
economía de la región, siendo importantes productores a nivel nacional. El resto de
apicultores se refirió a cultivos de arveja, flores, fresa, hortalizas, maíz y zanahoria (ver
figura 14).
Figura 13.Tipo de terreno. Fuente: propia.
61
Figura 14. Tipos de cultivos alrededor del apiario. Fuente: Propia.
Pregunta 5. Usted tiene conocimiento si la fuente de agua de las abejas pasa cerca (1
km) de algún cultivo o fabrica.
En esta pregunta se quiso evaluar la opinión de los apicultores con respecto a los
conocimientos en posibles contaminantes de las fuentes de agua cercanas a los apiarios,
dando como resultado que el 35.71% de los apicultores no tenían conocimiento sobre
algún contaminante, el 64,29% restante dijo que los posibles contaminantes provenían de
cultivos en mayor medida con un 57.14% mientras que un solo apicultor (7.14%) afirmó
que su fuente de agua pudo ser afectada por una fábrica de ladrillos (figura 15).
Figura 15. Contaminación de la fuente de agua de las abejas.
62
Pregunta 6. ¿Ha utilizado algún pesticida apícola? (si su respuesta es sí, describa el tipo
de pesticida y la fecha en la que lo realizó por última vez).
El 100% de los apicultores encuestados afirmaron que nunca utilizaron pesticidas
apícolas.
Pregunta 7. ¿Usted tiene conocimiento de que se haya realizado alguna fumigación
cercana a su apiario de parte de alguna entidad externa? (si su respuesta es sí, por favor
indique la fecha en la que notó la fumigación por última vez)
En la encuesta aplicada a los apicultores se preguntó si ellos tenían conocimiento de la
realización de fumigación recientes cercana a sus apiarios, dando como resultado que el
64.29% dijo que no y el restante 35.71% dijo que si en fechas comprendidas entre
principios de 2016 y 2017 (figura 16).
Figura 16. Fumigaciones cercanas a los apiarios
Pregunta 8. ¿Usted ha sufrido de muerte de abejas por alguna contaminación externa?
El 50% de los apicultores encuestados confirman que sufrieron muertes de abejas por
contaminaciones externas y el otro 50% informa que no.
63
5.1.2 Caracterización de las muestras de miel
Los paramentos que fueron tomados en cuenta para la caracterización de la miel fueron:
acidez libre, conductibilidad eléctrica, cenizas totales, determinación de carbohidratos y
solidos solubles. Según la NTC 1273 del 2007 estos parámetros son de gran relevancia
para evaluar la calidad de la miel junto con otros más, en la tabla 9 se encuentran los
resultados promediados y la incertidumbre de cada experimento realizado a las 14
muestras de miel. Los recuadros de color amarillo representan el valor mínimo y los
recuadros de tono naranja representan el valor máximo para cada parámetro, pocos
valores se excedieron de los valores establecidos por la norma NTC 1273, sin embargo la
justificación de estos valores atípicos se encuentra en los siguientes numerales.
En la tabla 9 se puede observar que la precisión del método es aceptable ya que todas las
muestras presentaron coeficientes de variación menores al 10%. Por otro lado, entre las
replicaciones de cada muestra hay poca dispersión de datos y similitud en las condiciones
del laboratorio.
Tabla 9. Resultados cuantitativos de la caracterización de las 14 muestras de miel. Fuente: Propia
PROMEDIO %CV PROMEDIO %CV PROMEDIO %CV PROMEDIO %CV PROMEDIO %CV PROMEDIO %CV
M1 4.37 ± 0.01 0.2 19.47 ± 0.50 2.6 0.66 ± 0.04 6.6 3.03 ± 0.06 1.9 22.98 ± 0.54 2.4 38.70 0.0
M2 4.29 ± 0.02 0.4 20 ± 0.53 2.6 0.52 ± 0.03 6.5 3.88 ± 0.03 0.7 33.04 ± 0.72 2.2 48.80 0.0
M3 4.03 ± 0.12 2.9 19 ± 0.20 1.1 0.31 ± 0.02 7.0 2.68 ± 0.03 1.1 52.89 ± 0.45 0.8 42.33 ± 1.44 3.4
M4 3.90 ± 0.11 2.7 17.40 ± 0.40 2.3 0.31 ± 0.03 8.5 3.26 ± 0.12 3.5 22.77 ± 0.13 0.5 36.76 ± 0.35 1.0
M5 4.03 ± 0.01 0.2 18.20 ± 0.40 2.2 0.120 0.1 4.75 ± 0.05 1.1 22.06 ± 0.47 2.1 23.83 ± 1.15 4.8
M6 3.77 ± 0.03 0.7 18.20 ± 0.40 2.2 0.098 1.4 4.83 ± 0.06 1.2 66.98 ± 0.99 1.5 23.83 ± 1.15 4.8
M7 4.33 ± 0.02 0.5 19.40 ± 0.53 2.7 0.65 ± 0.02 3.7 4.10 ± 0.17 4.2 16.45 ± 0.68 4.1 38.83 ± 0.29 0.7
M8 4.07 ± 0.01 0.1 17 ± 0.40 2.4 0.56 ± 0.02 4.3 4.53 ± 0.06 1.3 55.61 ± 0.40 0.7 33.80 0.0
M9 4.36 ± 0.01 0.1 19.37 ± 0.15 0.8 0.490 0.5 2.26 ± 0.12 5.1 9.67 ± 0.48 5.0 26.33 ± 0.91 3.4
M10 4.10 ± 0.02 0.4 15.60 ± 0.35 2.2 0.37 ± 0.01 2.7 3.20 ± 0.10 3.1 13.58 ± 0.54 4.0 28.76 ± 0.15 0.5
M11 3.72 ± 0.02 0.4 17.40 ± 0.53 3.0 0.15 ± 0.01 5.8 4.88 ± 0.10 2.1 63.18 ± 0.45 0.7 27.53 ± 0.40 1.5
M14 4.74 ± 0.01 0.1 17.93 ± 0.46 2.6 0.27 ± 0.02 5.5 4.16 ± 0.06 1.4 46.95 ± 0.61 1.3 33.83 ± 0.25 0.7
M15 3.80 ± 0.01 0.3 22.20 ± 0.20 0.9 0.61 ± 0.02 3.3 4.53 ± 0.15 3.4 19.74 ± 0.82 4.1 23.80 ± 0.10 0.4
M16 4.38 ± 0.01 0.1 19.07 ± 0.42 2.2 0.31 ± 0.01 4.3 3.86 ± 0.12 3.0 16.80 ± 0.27 1.6 23.76 ± 0.12 0.5
Valores de
calidad para
la NTC 1273
del 2007
0 - 5 0 - 60 0 - 50
Número de
la muestra
pH
3.15 - 4.9 0 - 20.1 0 - 0.6
% Humedad Cenizas ( g /100 g) Sacarosa ( g/ 100g) HMF (mg/kg) Ácidez (meq / kg)
64
5.1.2.1.1 pH
Teniendo en cuenta los resultados mostrados en la tabla 9 para el pH de las 14 muestras
analizadas, se observa que se encuentran valores en un rango de pH 3,7 y 4,7; estos
valores dependen en gran medida del origen o de la fuente floral de donde las abejas
recolectan el néctar, ya que de acuerdo a lo presentado en diversos estudios, las mieles
de origen floral poseen un pH de entre 3,4 y 4,4 y las mieles con pH superiores
corresponden a las denominas mieles mieladas o de bosque que se encuentran
caracterizadas por tener altos contenidos de sales minerales y proceder principalmente de
secreciones de otras partes vivas de planta (Ramírez et al,; 2013) (Codex Alimentarius,
2001). De esta manera es posible establecer que la muestra M14 de la tabla 9
corresponde a una miel mielada o de bosque y las demás corresponden a muestras de
miel de origen floral. Así mismo al comparar los rangos establecidos por la norma
Colombiana (pH = 3.15-4.9) con el rango de resultados (3,7 -4,7), se evidencia que todas
las muestras de miel analizadas se encuentran dentro de los parámetros de calidad
establecidos para mieles no adulteradas, dado que las mieles adulteradas son aún más
ácidas. De igual forma el pH que se reporta en las 14 muestras de miel analizadas se
presenta como una característica positiva, ya que una miel con pH dentro de este
intervalo contribuye inhibición de la presencia y crecimiento de microorganismos, (INTI,
2006).
5.1.2.1.2 Acidez libre
En los valores obtenidos para la acidez libre de la miel se evidenció valores en un rango
entre 23.8 y 48.8 (tabla 9), por lo que se infiere que las mieles bajo análisis corresponden
a mieles de tipo floral. De igual manera los valores de acidez libres expuestos en la tabla
9 podrían determinar el grado de estabilidad del alimento durante su procesamiento y
almacenamiento contra ataques microbianos (Zandamela E., 2008); sin embargo de
acuerdo a lo reportado por Dardón & Enríquez, 2008, valores altos de acidez no
necesariamente relacionan a mieles con mayor actividad antimicrobiana. (Dardón &
Enríquez, 2008), esto puede darse por diferentes factores que se presentan de acuerdo al
origen floral como la osmolaridad, a la generación enzimática de peróxido de hidrogeno
vía glucosa oxidasa, ácidos aromáticos o compuestos fenólicos (M., M., & R., 2007).
65
Conforme a lo anterior no es posible determinar qué tan apropiada es la actividad
antimicrobiana tomando en cuenta solo el parámetro evaluado.
Por otro lado las 14 muestras de miel analizadas, presentan valores dentro del rango
establecido por la norma NTC 1273 del 2007 (tabla 9) para mieles de buena calidad, con
lo cual se determina que se encuentran dentro de los parámetros adecuados de calidad.
5.1.2.1.3 Humedad
Con respecto a la humedad los resultados muestran valores desde el 17 % hasta 20 %
para 13 de las muestras analizadas y un valor de 22,2 % para la muestra denominada
M15 (Tabla 9). De esta manera se evidencia que 13 de las 14 muestras de miel en
estudio se encuentran en un rango apropiado para evitar el crecimiento microbiano, ya
que las bacterias aprovechan la constante presencia de humedad para su replicación y
colonización (Quinn et al. 2015), también se evidencia un rango de humedad propicio para
evitar una posterior fermentación, así como disminuir la probabilidad de que se presente
cristalización de acuerdo a lo referenciado en la literatura (Vargas, 2016); sin embargo
estos valores se encuentran sobre el límite indicado, posiblemente debido a la propiedad
de higroscopicidad que presenta la miel (Boukraá, 2013). Por otro lado el valor de 22,2 %
que se observa en la muestra M15; podría atribuirse a la temperatura, tiempo de
almacenamiento y envasado de la miel, (Zandamela E. , 2008) (Gamboa, 2014).
5.1.2.1.4 Cenizas
El porcentaje de cenizas permitió evaluar la cantidad de residuo inorgánico
(principalmente K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Cl, P y S) que queda después de oxidar
totalmente la materia orgánica, según la normatividad colombiana, el porcentaje aceptado
para este parámetro químico de la miel es 0,6% en fracción de masa dado que el
porcentaje en minerales en la miel es del 0,02 al 1%. Las muestras de miel recolectadas
de la región de Cundinamarca presentaron porcentajes entre 0,10 % hasta 0,66 %, el
número de muestras que sobrepasaron el valor de la norma fueron M1, M7 y M15 (tabla
9), lo cual indica que las muestras evaluadas son de origen floral (Buera, 2004). Las
muestras M1, M7 y M15 presentaron mayor porcentaje de cenizas, con lo cual se infiere
que presentan mayor contenido de metales (Zandamela, 2008), a pesar de que la
composición final de estos, depende de muchas variables como su absorción, mecanismo
de secreción en las células del néctar, manipulación por parte del apicultor y velocidad del
66
transporte iónico; de acuerdo a lo reportado en la literatura el potasio presenta un tercio
de las cenizas totales, seguido por el calcio, magnesio y sodio, (Vásquez C. , 2010).
5.1.2.1.5 Determinación de Sacarosa
Por otro lado el porcentaje de azúcar corresponde a un indicador de vital importancia para
la caracterización y calidad de la miel de abejas, ya que el contenido de azúcar presente
se encuentra determinado por el origen florar del néctar que las abejas colectan, así como
del clima, su origen geográfico, su proceso de maduración y almacenamiento. De igual
manera el porcentaje de azúcares presentes en la miel define propiedades como la
viscosidad, tendencia a la granulación, higroscopicidad, poder rotatorio, entre otras,
(Bachmann, 2007).
Para cada muestra se realizó la determinación del % de sacarosa y de acuerdo a esto se
obtuvieron resultados en un rango de 2,7 a 4,9 % de sacarosa (tabla 9). Estos valores se
encuentran dentro de los aceptados por la norma técnica colombiana NTC 1273 del 2007,
lo cual indica que la maduración de las mieles bajo análisis fue madurada de manera
adecuada. Así mismo se identifican como mieles de origen polifloral y no se encuentran
adulteradas, (Gamboa, 2014).
5.1.2.1.6 Hidroximetilfurfural (HMF)
El hidroximetilfurfural es un derivado de la degradación de la fructosa cuando la muestra
es expuesta a cambios térmicos en un medio ácido. El valor máximo aceptado según la
normatividad NTC 1273 del 2007 corresponde a 60 mg/Kg de miel. Tomando en cuenta lo
anterior y observando los resultados obtenidos para este parámetro, se determinó que 13
de las 14 muestras estuvieron en un rango de valores normales, exceptuando la muestra
M6 con un contenido de 66,98 mg/Kg de HMF (tabla 9), con lo cual es posible establecer
que 13 muestras están en un estado de frescura y deben su contenido de
hidroximetilfurfural a las condiciones climáticas del lugar de origen y temperaturas a las
que fueron expuestas durante el proceso de extracción (Lozano et al., 2006) (SUbovsky,
Sosa, & Castillo, 2003), mientras que la muestra M6 pudo haber presentado temperaturas
mayores a los 40 °C en el envasado y se descartó falencias en el almacenamiento, ya que
se mantuvo todas las muestras bajo refrigeración en frasco ámbar (Villar, 2014). Con
respecto a la acidez de la muestra no se evidencian valores en comparación con las
67
demás muestras que permitan establecer la relación antagónica entre la acidez y el
contenido de HMF (un aumento de HMF implica una disminución de ácido glucónico, es
decir, de la acidez) (Lozano et al., 2006). Así mismo no se observan valores de acidez por
fuera de los límites para ninguna de las muestras de miel evaluadas.
68
5.1.2.2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE
MIEL DE ABEJAS
De acuerdo a los resultados obtenidos en cada prueba de caracterización, se recopiló y
analizó estadísticamente todos los datos por medio de un análisis de varianza (ANOVA),
esto permitió comparar las varianzas que se presentan en cada experimento para las 14
muestras de miel de abejas (tabla 10).
En la tabla 10 se observa que los valores de distribución para cada experimento y
parámetro es menor al valor F de la distribución de Fisher (4.67), lo que nos confirma que
la hipótesis alternativa es válida para nuestro estudio (la varianza de las muestras de miel
son significativamente diferentes), las muestras de miel son excluyentes entre sí para
cada experimento y parámetro, difieren en sus propiedades debido al origen, así como
condiciones ambientales del lugar de origen de la muestra.
Tabla 10. Resultado estadísticos de análisis ANOVA. Fuente: Elaboración propia
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.90 0.86 0.74
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.64 0.86 0.86
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.01 0.01 0.01
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.35 0.24 0.31
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.79 0.77 0.79
Experimento EXP.1
n=14
EXP.2
n=14
EXP.3
n=14
Valor F 0.43 0.48 ND
Humedad
Acidez libre
pH
Sacarosa
HMF
Cenizas
69
A pesar de la varianza entre muestras que se le atribuye al origen y condiciones
ambientales en las que se encuentran los apiarios, el coeficiente de variación entre
experimentos para cada parámetro fue menor al 10%, lo que evidencia una concordancia
entre los 3 experimentos, en la figura 17 se puede observar los 3 experimentos para las
14 muestras de miel de abejas en la determinación de Sacarosa, se evidenció correlación
entre experimentos y variaciones significativas entre los valores mínimos y máximos de
las muestras 9 y 11, con valores de 2.26 g/100g y 4.88 g/100g de diferencia entre
muestras para la sacarosa. Esta correlación entre experimentos y gran variabilidad de
datos entre muestras se evidencia en los 5 parámetros restantes (pH, humedad, cenizas,
HMF y acidez).
Figura 17. Gráfico de barras de la determinación de Sacarosa en g/100g de cada muestra.
70
5.2 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS
5.2.1 DESARROLLO MÉTODO CROMATOGRÁFICO
Se realizó un SCAN de los estándares de cada plaguicida a una concentración de 1 mg /L
con el objetivo de identificarlos. En la figura 18 se muestra el cromatograma obtenido del
estándar Profenofos, donde se evidencia la presencia del analito y una buena separación
del pico, así mismo, se obtuvo una buena identificación de los demás plaguicidas
analizados. (Ver anexos)
Figura 18. Cromatograma del estándar Profenofos tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
En la figura 19 se encuentra el espectro de masas correspondiente a la molécula del
Profenofos con un tiempo de retención de 38,619 min, se evidencia la fragmentación con
sus respectivas señales y la comparación de la biblioteca demuestra que es el analito
buscado. Se seleccionaron cuatro iones para este plaguicida, el primero corresponde a
208 m/z llamado ion Target o ion de cuantificación, los demás iones se escogieron con el
criterio de que presentaran una alta intensidad de fragmentación y que no figurara
interferencias con la matriz. De igual manera, este proceso se realizó con todos los
plaguicidas y se puede observar los espectros de masas en anexos.
71
Figura 19. Espectro de masas del estándar Profenofos tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
5.2.1.1.1 METODO SIM
El método SIM corresponde a un monitoreo selectivo de iones de los analitos de interés,
es una metodología con una alta sensibilidad y selectividad que permite cuantificar
compuestos a una baja concentración. A continuación, en la tabla 11 se encuentra toda la
información con respecto a las condiciones que se establecieron para realizar el
monitoreo selectivo de iones (SIM). Cada plaguicida posee un tiempo de retención y al
menos tres iones que le permitió al equipo identificar de manera más selectiva y precisa al
analito objetivo. Se establecieron ventanas de adquisición para cada plaguicida,
exceptuando, Malation y clorpirifos que se agruparon en una ventana de adquisición ya
que la diferencia entre tiempos de retención era mínima.
72
Tabla 11. Información referente al patrón de fragmentación, tiempos de retención y ventanas adquisición en el método SIM. Fuente: Elaboración propia
PLAGUICIDA TIEMPO DE RETENCIÓN (min)
ION TARGET (m/z)
IONES DE CONFIRMACIÓN
Diclorvos 17,456 185 79, 109, 220
Monocrotofos 28,923 127 97, 192, 223
Fenitrotión 34,302 125 109, 260, 277
Malatión 34,764 173 93, 127
Clorpirifos 34,923 197 258, 314
Profenofos 38,619 339 139, 208, 374
Lambda-Cialotrina 45,552 181 141, 197, 208
Cipermetrina 48,973 181 168, 207, 281
5.2.2 SELECTIVIDAD
El método fue selectivo para los plaguicidas valorados con el espectrómetro de masas en
modalidad SIM. Los criterios de selección para escoger los iones fueron cumplidos, ya
que estos se caracterizaron por tener una alta intensidad de fragmentación (m/z > 100) y
no mostrar interferencias de la matriz significativas en los tiempos de retención de cada
plaguicida, en la figura 20 y 21 se puede observar la ventana de adquisición del plaguicida
profenofos y fenitrotión, donde se evidenció que no presentó interferencias significativas
para sus respectivos tiempos de retención. En la figura 22 se encuentra el cromatograma
y el espectro de masas del compuesto profenofos, donde se demostró la relación
directamente proporcional de la abundancia y la intensidad de fragmentación de los iones
cualificadores. El método cumple con los parámetros de selectividad según la norma de la
Comisión Europea SANTE/11813/2015.
73
Figura 20. Cromatograma (SIM) de extracto de matriz en el tiempo de retención del plaguicida Profenofos.
Figura 21. Cromatograma (SIM) de extracto de matriz en el tiempo de retención del plaguicida fenitrotión.
En esta modalidad (SIM) el espectrómetro garantizó la selectividad del método para los
analitos de interés. Además, se verificó la especificidad de la metodología con la
comparación de la muestra de la matriz y las muestras fortificadas con 50 µL de la mezcla
de trabajo. Se comprobó la ausencia de compuestos potencialmente interferentes en el
tiempo de retención de adquisición del Ion Target de los analitos estudiados, en la figura
22 que corresponde a una muestra de miel fortificada con 50 µL de la mezcla de trabajo,
el profenofos a una concentración de 0.05 mg/L no presentó interferencias con la matriz
en el tiempo de retención del Ion Target (línea superior negra). En la especificidad fue
importante valorar los plaguicidas a concentraciones próximas al límite máximo de
74
residuos (LMR) establecido por la Unión Europea, esto con el fin de obtener un estudio
con mayor rigurosidad. El plaguicida diclorvos no pudo ser optimizado y se excluyó para el
resto de la metodología debido a que no presentó señales en este recuperado,
posiblemente, se debió a que el proceso de extracción del plaguicida genera bajos
rendimientos de recuperabilidad (Rodríguez et, al. 2011). Por el contrario, los demás
plaguicidas presentaron características como alta selectividad y especificidad, ver en
anexos los cromatogramas.
Figura 22. Cromatograma (SIM) del plaguicida profenofos a una concentración de 50 µg-L
75
5.2.3 LIMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
El límite máximo de residuos es el cantidad máxima de residuos de determinado
plaguicida sobre un producto agrícola, para este estudio fue de gran relevancia conocer
los límites máximos de residuos (LMR) en miel para cada uno de los plaguicidas
analizados, las concentraciones oscilaron entre 0.01 mg/kg y 0.05 mg/kg según el
reglamento de la Unión Europea, esto nos permitió comparar los valores de los límites de
detección y cuantificación estimados por el método de la IUPAC (ver tabla 12). Los
plaguicidas presentaron un LD menor que el LC, además, los valores de LC se
encuentran en un rango cercano a los LMR establecidos por la Unión Europea, excepto
para el malation y la cipermetrina.
Tabla 12. Límites de detección y cuantificación por el método de la IUPAC.
Plaguicida LD (mg/kg) LC (mg/kg)
Fenitrotión 0.01679 0.05596
Malatión 0.03441 0.11469
Clorpirifos 0.00539 0.01798
Profenofos 0.03406 0.00303
Lambda-Cialotrina 0.00303 0.01008
Cipermetrina 0.01008 0.60706
La confirmación experimental del límite de cuantificación de cada compuesto se
estableció considerando la concentración más baja probada, se demostró una
identificación inequívoca del analito y en la cual se obtuvo un coeficiente de variación
menor al 20%. Los ensayos se realizaron con mezclas de plaguicidas a concentraciones
superiores e inferiores al límite de detección de la tabla 12, con el objetivo de establecer si
los LC de los plaguicidas fueron sobreestimados o subestimados por el método de la
IUPAC. Cada solución preparada se estableció en una concentración promedio de 0.001
mg/ L y 0.1 mg/ L, los ensayos se prepararon a partir de una mezcla de plaguicidas a una
concentración de 1 mg/L en acetato de etilo.
76
El resultado de esta prueba se puede observar en la tabla 13, donde los valores mínimos
cuantificables del fenitrotión, malatión y la cipermetrina se encontraban sobreestimados
en la información que arrojó el método de la IUPAC, los demás plaguicidas presentaron
una buena estimación con respecto a las pruebas iniciales. El profenofos, fenitrotión,
malation, clorpirifos y lambda-Cialotrina presentan una buena sensibilidad de detección
por el método de CG-EM a razón de que fue posible observarlos y cuantificarlos en
concentraciones inferiores al LMR, estas pruebas fueron valoradas en precisión con el
coeficiente de variación, el cual fue inferior al 20% en todos los analitos lo que implica un
buen grado de concordancia entre las replicaciones. La cipermetrina presentó una baja
sensibilidad en la detección, posiblemente porque este analito es susceptible a la
adsorción y/o descomposición en el puerto de inyección (Rodríguez et al., 2011), esto,
implicó un valor de detección mayor al LMR para este plaguicida.
Por otro lado, el monocrotofos presentó una baja sensibilidad en el método de CG-EM,
esto se pudo deber a que el carácter polar del analito y de los grupos activos del
vaporizador del cromatógrafo (conocido en inglés como liner) interaccionan y evitan la
adsorción en una gran proporción, ocasionando que la transferencia del analito sea
deficiente, (Ahumada & Guerrero, 2010). Es por esto que se decidió descartarlo del resto
de la metodología.
Tabla 13. Valores mínimos de detección para los ocho plaguicidas. Fuente: Elaboración propia
Nombre Límite de cuantificación
(mg/kg)
Coeficiente de
variación %CV
Monocrotofos > 0.2 ND
Fenitrotión 0.025 16.2
Malatión 0.01 15.9
Clorpirifos 0.005 11.45
Profenofos 0.01 7.4
Cipermetrina 0.1 10.7
Lambda-Cialotrina 0.01 11.5
ND: No determinado
Establecido experimentalmente el límite de cuantificación a partir de curvas de calibración,
se decidió evaluar el límite de detección del método (MDL) y el límite de cuantificación del
77
método (MCL). Los valores de MDL (ver tabla 14) para cada plaguicida fueron menores
que los valores de la tabla 13, lo que demostró que son apropiados para el MDL
calculado. EL MDL confirmó que este método puede cumplir el requisito de detección
simultánea de los seis residuos de plaguicidas en miel. Los valores de MCL y los valores
de la tabla 13 no son significativamente diferentes, lo que nos permitió concluir que los
valores que aparecen en la tabla 13 representan un límite de cuantificación con un cierto
grado de confiabilidad. La precisión se confirmó a través del coeficiente de variación del
recuperado el cual fue menor al 20% para todos los casos, también se obtuvo una
recuperación media aceptable dentro de un rango de 70 – 100 %. El método utilizado
representó una buena exactitud y precisión según los parámetros de la norma
SANTE/11813/2017.
Tabla 14. Límites de detección del método y límites de cuantificación del método.
Plaguicida MDL (mg/kg) MCL (mg/kg) %Recuperación Coeficiente de
variación (%CV)
Fenitrotión 0.009 0.028 89.2 15.2
Malatión 0.004 0.012 92.8 15.3
clorpirifos 0.002 0.007 100.7 16.2
Profenofos 0.004 0.012 101.9 14.2
Lambda- Cialotrina 0.003 0.010 101.1 12.1
Cipermetrina 0.060 0.180 99.7 11.1
5.2.4 LINEALIDAD DE LA METODOLOGÍA
En el presente trabajo se evaluó la regresión lineal aplicada que por medio de un análisis
de varianza permitió establecer si el modelo y = mx + b es significativo.
De acuerdo a lo anterior en la tabla 15 se muestran los resultados obtenidos en el análisis
de la recta para cada plaguicida analizado. Así pues se observa que el valor crítico F se
aproxima a cero siendo menor que el valor F, lo que nos demuestra que se presenta
linealidad en el modelo evaluado, esto se determinó bajo un nivel de confianza del 95%.
De igual manera se evidencia que los valores de las pendientes respectivas para cada
plaguicida analizado son significativamente diferentes de cero y por ende se rechaza la
hipótesis nula (la pendiente no es significativamente diferente de cero) (tabla 6), lo que
78
implica que para cada variación de concentración va a haber una respuesta
cromatográfica diferente, por ejemplo, para el caso del plaguicida clorpirifos y el plaguicida
lamda cihalotrina se observa que los valores correspondientes a la pendiente son altos en
comparación con la pendiente correspondiente a los demás estándares, lo que nos dice
que en estos 2 plaguicidas se va a presentar una respuesta cromatografica alta ante una
variación pequeña de la concentración, es decir, la sensibilidad del detector y del método
es apropiado y confiable en especial para estos dos plaguicidas. Así mismo al observar
los valores correspondientes a la intercepción se identifica que estos se
encuentran significativamente lejos de cero, lo que nos indica que para el análisis
cromatográfico de muestras posteriores se hace indispensable el uso de este parámetro
dentro de la ecuación y dentro del modelo de regresión lineal.
Por otro lado el gráfico de la primera columna de la tabla 15 muestra que para cada
plaguicida el modelo Y= mx + b corresponde a un modelo lineal que describe la relación
entre la concentración y la respuesta cromatografía, así mismo esta relación se
representa como una línea recta y permite realizar interpolaciones confiables de la
respuesta cromatografía en función de la concentración. El coeficiente de correlación de
la recta es cercano a 1 en todos los analitos analizados, lo que significa que hay una
correlación positiva muy fuerte, donde ambas variables presentan la misma tendencia lo
que nos lleva a confirmar que la hipótesis alternativa 1 es verídica (el modelo presenta
linealidad) (Castejon, 2011) . A su vez el coeficiente de determinación mostrado en la
tabla 15 nos indica que aproximadamente el 97 % de la respuesta cromatográfica
depende de la concentración del analito, lo cual ratifica nuevamente la hipótesis
alternativa H1 (el modelo presenta linealidad)
Tabla 15. ANOVA de regresión lineal realizado a las curvas de calibración. Fuente: Propia.
Compuesto Intercepción
Pendiente
Coeficiente de
determinación
R2
Coeficiente
de
correlación R
Valor crítico
de F
Fenitrotión -5133.4 74.59 0.9728 0.9863 1.55X10-56
Malatión -1774.1 88.99 0.9771 0.9885 3.52X10-59
Clorpirifos -2067.5 157.04 0.9625 0.9811 1.14X10-51
Profenofos -763.3 36.28 0.9802 0.9900 1.48X10-60
Lambda-Cialotrina -3004.3 178.63 0.9782 0.9890 6.01X10-60
Cipermetrina -49702.8 84.71 0.8965 0.9468 3.33X10-36
79
Finalmente al analizar las gráficas de residuos que se muestran en la tabla 16 para cada
uno de los plaguicidas se evidencian que los puntos correspondientes a los residuos en
la mayoría de los casos cumplen un patrón horizontal a lo largo del eje X, salvo algunos
puntos que se encuentran por debajo del eje y cambian un poco el patrón; estas gráficas
indican que aunque el modelo de regresión lineal muestra una adecuada relación entre
las variables la varianza difiere para algunos valores de X, (Cardona, 2013).
80
Tabla 16. Curvas de calibración y gráfico de los residuales para cada analito analizado.
FENITROTION
MALATION
CLORPIRIFOS
PROFENOFOS
81
LAMBDA-CIALOTRINA
CIPERMETRINA
82
Para confirmar el modelo lineal se realizó una prueba t-Student cuyos resultados se
evidencian en la tabla 17, estos resultados incluyen el valor de la prueba t y el valor P
para cada plaguicida. Teniendo en cuenta el valor de referencia para la región de no
rechazo con 71 grados de libertad y un α=0.05 correspondiente a -1.9939 > t < 1.9939,
se observa que los valores t (tabla 17) se encuentran por fuera de este rango,
determinando así el rechazo de la hipótesis nula y la aceptación de la hipótesis alternativa
(el modelo presenta linealidad), lo que a su vez esto es confirmado por los valores P que
se muestran en la tabla 17.
Tabla 17. Resultados de prueba t- Student realizada al modelo lineal con un α= 0.05. Fuente: propia
Plaguicida Valor prueba t Valor P
Fenitrotión -5,7950 0,00000017
Malatión -6,1871 0,00000003
Clorpirifos -5,8333 0,00000015
Profenofos -6,0722 0,00000006
Lambda-Cialotrina -6,3505 0,00000002
Cipermetrina -5,4748 0,00000062
5.2.5 EXACTITUD – VERACIDAD
De acuerdo a la metodología de validación planteada en el numeral 4.2.2.2.1 para la
evaluación de la exactitud del método, se contempló la comparación de los porcentajes de
recuperación de muestras fortificadas con determinados niveles de la curva de
calibración utilizándolos como referencia; esto se llevó a cabo fortificando cada muestra
blanco con una mezcla de plaguicidas de concentración conocida en diferentes niveles.
Los niveles determinados para esta evaluación fueron: el nivel 1, nivel 3 y nivel 5
agregando 10 µL, 50 µL y 200 µL respectivamente de la mezcla de trabajo.
En la tabla 18 se muestran los resultados correspondientes al promedio de los
porcentajes de recuperación para el número de pruebas realizadas (n=12) en cada nivel,
seguido de las varianzas para cada nivel obtenidas a partir de la realización de un
cochran’s test para la evaluación de homogeneidad de varianzas entre los %
recuperación, sumatoria de varianzas, varianza mayor y el G experimental.
83
De este modo al comparar el valor denominado G experimental y calculado a partir de las
varianzas con el valor teórico G = 0.6025, valor que es específico para el cochran’stest
(ver anexos) con un alfa α=0.05, un k=3 (niveles evaluados) y 10 datos. Se observa que
los valores G experimentales para el malatión, clorpirifos y el profenofos están sobre este
valor referencial, con lo cual se infiere que la recuperación de estos plaguicidas se ven
influenciados por la concentración, (SANTE, 2017). De igual manera con respecto a la
hipótesis nula evaluada (se presenta homogeneidad entre los porcentajes de los niveles de
recuperación), se obtuvieron valores P para el fenitrotrión, lambda –cialotrina y cipermetrina
por encima de 0.05 aceptando así la hipótesis nula para estos plaguicidas, sin embargo
para el malatión, clorpirifos y profenofos estos valores P son inferiores a 0.05 y por
consiguiente se acepta la hipótesis alternativa (no se presenta homogeneidad entre los
porcentajes de los niveles de recuperación), esto nos sugiere que en los ensayos
correspondientes a estos plaguicidas se generan diferentes poblaciones, por lo cual no es
aconsejable promediar los porcentajes de recuperación para los plaguicidas clorpirifos,
profenofos y malatión. A su vez los valores P evidenciados nos confirma la influencia de la
concentración en la recuperación para estos tres casos anteriormente mencionados.
Por otro lado se evidencian que los porcentajes de recuperación son satisfactorios de
acuerdo a los criterios establecidos en la comisión europea (SANTE, 2017), donde se
considera un rango de recuperación aceptable de 70 % a 120 %, por lo cual se establece
que se logró una separación adecuada de los diferentes plaguicidas en los respectivos
recuperados 1, 2 y 3.
Tabla 18. Resultados de % de recuperación de cada nivel y varianza Cochran’s test
teniendo como hipótesis nula Ho: Se presenta homogeneidad entre las varianzas en los
porcentajes de recuperación (α= 0.05)
Compuesto Promedio
Porcentaje De Recuperación VAR N1 VAR N3
VAR N5
Sumatoria VAR
mayor G expe
N1 n=12 N2 n=12 N3 n=12
Fenitrotión 89,2 98,3 94,3 184,2 53,47 239.83 477,52 239,83 0,502
Malation 92,8 94,0 107,9 200,77 39,03 83,50 323,30 200,77 0,621
Clorpirifos 100,7 100,7 107,3 267,38 64,37 98,98 430,74 267,38 0,621
Profenofos 101,9 97,3 109,4 208,57 83,51 29,94 322,02 208,57 0,648
Lambda-Cialotrina 101,1 101,2
100,9 148,87 37,42
77,50
263,79
148,87
0,564
Cipermetrina 99,77 112,2
93,7 122,02 85,71
128,90
336,63
128,90
0,383
84
El parámetro correspondiente a la exactitud de método fue corroborado por medio del
cálculo del error absoluto para el promedio de porcentaje de recuperación y evaluado
posteriormente por medio de la prueba t- Student, cuyos resultados calculados para cada
nivel y cada plaguicida se presentan en las tablas 19 y 20 respectivamente. Teniendo en
cuenta lo anterior al comparar los valores t obtenidos por medio de la prueba t- Student
(tabla 20) con el t crítico (2.262) se establece que no hay una diferencia significativa entre
los valores obtenidos de la experiencia analítica con el valor de referencia, ya que se
cumple que el tcal < tcri en cada uno de los casos, por lo tanto el error absoluto obtenido
para el método empleado es aceptable, así como la exactitud del mismo.
Tabla 19. Error absoluto determinado para los porcentajes de recuperación
Compuesto
Promedio Error Absoluto
Porcentaje De Recuperación Porcentaje De Recuperación
N1 n=10 N2 n=10 N3 n=10 N1 N2 N3
Fenitrotión 89,2 98,3 94,3 10,8 1,7 5,7
Malatión 92,8 94 107,9 7,2 6 7,9
Clorpirifos 100,7 100,7 107,3 0,7 0,7 7,3
Profenofos 101,9 97,3 109,4 1,9 2,7 9,4
Lambda-Cialotrina 101,1 101,2 100,9 1,1 1,2 0,9
Cipermetrina 99,77 112,2 93,7 0,23 12,2 6,3
85
Tabla 20. Resultados para la prueba t- Student correspondiente a la evaluación del error absoluto.
Compuesto
Valor de t
Grados de libertad = 9, α = 0.05 y tcri = 2.262
N1 n=10 N2 n=10 N3 n=10
Fenitrotión 0,251645415 0,073648549 0,116300422
Malatión 0,160703108 0,306053743 -0,274551508
Clorpirifos -0,01353841 -0,027672359 -0,233198525
Profenofos -0,041606473 0,09383406 -0,540509459
Lambda-Cialotrina -0,028512 -0,062214204 -0,032344316
Cipermetrina 0,006584936 -0,414872852 0,174772795
De acuerdo a lo anteriormente mencionado es posible determinar que a pesar de que la
concentración influye en la recuperación de los plaguicidas malatión, clorpirifos y
profenofos, el método es exacto y veras en la separación de los plaguicidas, ya que los
rangos de recuperación están por encima del valor mínimo establecido por la comisión
europea y la evaluación de error absoluto mostró que no hay diferencias significativas
entre los resultados obtenidos en los % de recuperación.
Con respecto al Diclorvos, fue descartado del análisis, ya que no fue posible recuperarlo
en los ensayos de fortificación, presentando este plaguicida un problema de exactitud, el
cual puede atribuirse a la agitación manual, ya que de acuerdo a lo reportado en
diferentes estudios, este compuesto presenta mejores porcentajes de recuperación
empleando agitación mecánica en la etapa de extracción selectiva de plaguicidas.
(Rodríguez et al., 2014)
Para el caso particular del Clorpirifos, se evidencia que a pesar de presentar un % de
recuperación afectado por la concentración en la cual se encuentre este plaguicida en la
muestra bajo análisis (tabla 18); la distribución de los datos entorno al valor de referencia
no presenta valores significativos que concluyan un error sistemático en la separación de
los plaguicidas, es decir, en la exactitud de método. Además de lo anterior se observa
que el error absoluto para las concentraciones más bajas (N1 y N2) de este se encuentra
86
cercano a cero (tabla 19), con lo cual puede establecerse que a menores
concentraciones, el método es más exacto.
5.2.6 PRECISIÓN
La precisión se evaluó a través de la repetibilidad y precisión intermedia del método. Para
la determinación de la repetibilidad, se dispusieron 5 muestras de miel sin contaminantes
a un nivel de concentración correspondiente a un punto de la curva de calibración, se
seleccionaron tres niveles de la curva de calibración (niveles 1,3, y 5), cada nivel fue
procesado e inyectado 5 veces. En la tabla 21 se encuentran los coeficientes de variación
calculados para la repetibilidad del método.
Tabla 21. Coeficiente de variación (%CV) obtenidos en la evaluación de repetibilidad
PLAGUICIDA Coeficiente de variación (%CV)
N1 n = 5
N3 n = 5
N5 n = 5
Fenitrotión 15.7 11.5 19.2
Malatión 14.3 7.0 6.6
Clorpirifos 18.2 10.6 4.4
Profenofos 15.3 12.2 4.3
Lambda-cialotrina 6.5 5.4 9.0
Cipermetrina 9.8 12.2 6.3
Los valores de coeficiente de variación determinados a partir de los porcentajes de
recuperación tienen una aceptación menor al 20% según la norma SANTE/11813/2017,
en la tabla 21 se evidencia que él %CV es menor al 20% para todos los niveles
evaluados, por consiguiente se demuestra que el método desarrollado tiene repetibilidad y
cumplió con los estándares internacionales.
Con respecto a la precisión intermedia de la metodología, esta se determinó teniendo en
cuenta la variación de los resultados de recuperación con un segundo analista. En la tabla
22 se evidencia el promedio del porcentaje de recuperación, la desviación estándar y el
%CV por cada nivel y plaguicida analizado. Los %CV calculados fueron menores a 20%
en todos los casos, por lo cual se demuestra que el método desarrollado cumple con los
criterios de precisión intermedia.
87
Tabla 22. Resultados obtenidos en la evaluación de precisión intermedia (n=10)
Nivel Fenitrotión Malatión Clorpirifos Profenofos Lambda-
cialotrina Cipermetrina
Nivel
1
Prom.
(%Rec.) 92.8 96.2 105.5 101.5 108.3 110.1
SD 13.6 12.4 15.8 16.8 8.1 4.1
%C.V 14.6 12.9 15.0 16.5 7.5 3.8
Nivel
3
Prom.
(%Rec.) 98.3 96.3 103.7 100.3 102.0 117.4
SD 3.6 5.9 1.4 4.0 3.5 0.5
%C.V 3.7 6.1 1.3 4.0 3.5 0.4
Nivel
5
Prom.
(%Rec.) 102.3 112.6 116.0 108.7 95.6 99.1
SD 10.3 9.3 3.9 6.6 3.6 13.7
%C.V 10.1 8.2 3.4 6.0 3.8 13.8
88
5.2.7 DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS DE MUESTRAS DE 14 VEREDAS DE
CUNDINAMARCA
El protocolo validado para la determinación de residuos de plaguicidas organofosforados y
piretroides en miel, fue aplicado para 13 muestras de 14 muestras de miel de abejas,
hubo una prueba a la que no se le aplicó el diagnóstico metodológico (M6), debido a que
la muestra de miel entregada por parte del apicultor no tuvo la cantidad de miel necesaria
para llevar a cabo el estudio. Los resultados arrojaron que 6 muestras de miel contenían
residuos del plaguicida clorpirifos, ver tabla 23. Las concentraciones registradas se
encontraron en un rango de 0.0175 mg/kg y 0.0518 mg/kg, la muestra M10 presentó una
concentración mayor al LMR de 0.05 mg/kg establecido por la Unión Europea. Este
resultado conlleva a un riesgo de salud para el consumidor de miel, por otro lado, las
muestras restantes mostraron que son adecuadas para consumo humano, sin embargo,
el clorpirifos es un inhibidor de la acetilcolinesterasa (Tejedor, 2010) y concentraciones
menores a las del LMR establecido por la Unión Europea, afecta de manera incipiente a
las abejas ya que es altamente tóxico para insectos, (EPA, 1993).
89
Tabla 23. Resultados de determinación de plaguicidas encontrados en las 14 de muestras tratadas provenientes de 14 veredas de Cundinamarca
Numero de
Muestra
Fenitrotión
(mg/kg)
Malatión
(mg/kg)
Clorpirifos
(mg/kg)
Profenofos
(mg/kg)
Lambda
Cialotrina
(mg/kg)
Cipermetrina
(mg/kg)
M1 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M2 <0.009 <0.004 0.03146 <0.004 <0.003 < 0.060
M3 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M4 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M5 <0.009 <0.004 0.01748 <0.004 <0.003 < 0.060
M6 ND ND ND ND ND ND
M7 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M8 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M9 <0.009 <0.004 0.02435 <0.004 <0.003 < 0.060
M10 <0.009 <0.004 0.05183 <0.004 <0.003 < 0.060
M11 <0.009 <0.004 0.02946 <0.004 <0.003 < 0.060
M14 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M15 <0.009 <0.004 <0.002 <0.004 <0.003 < 0.060
M16 <0.009 <0.004 0.02968 <0.004 <0.003 < 0.060
NP= No presenta residuos de algún plaguicida estudiado ND= No se determinó
El clorpirifos es un organofosforado con acción de contacto y estomacal inhibidor de la
acetilcolinesterasa, es un plaguicida de amplio espectro y es uno de los productos de
control de plagas más ampliamente utilizados en el mundo, su uso radica en la industria
agrícola y esto ocasiona que su frecuencia en la miel y otros productos de la colmena sea
común, (Tosi et, al. 2018). Las muestras que presentaron residuos del plaguicida
clorpirifos, coinciden con ser muestras que estuvieron expuestas a contaminación por
cultivos de papa (Solanum tuberosum) y fresa (Fragaria × ananassa), productos que son
de gran demanda en el departamento de Cundinamarca.
Según estudios anteriores realizados en Cundinamarca (Rodríguez et al., 2011) este
departamento tiene mayor incidencia de plaguicidas organofosforados en comparación
90
con departamentos como Santander, Magdalena, Boyacá y Risaraldas (Gallego & Arenas,
2015) (Rodríguez et al., 2011). El clorpirifos es un plaguicida con una alta persistencia en
miel, en estudios como el de Rodríguez et, al. 2011 fue detectado con una incidencia del
36,1% en muestras provenientes de Cundinamarca, esto se puede deber a que el
clorpirifos combate plagas en cultivos destacados en esta zona del país, como polillas
presentes en cultivos de papa (phthorimaeae operculella, tecia solanivora y otras) (DOW,
2018).
El clorpirifos fue evaluado bajo los parámetros de selectividad, límite de detección y
cuantificación, linealidad, exactitud - veracidad y precisión. Para el parámetro de
selectividad el espectrómetro de masas en modalidad SIM aseguró un método sensible y
selectivo, esto se evidenció en los cromatogramas del blanco y de la muestra fortificada
donde no presentaron interferencias significativas con el analito clorpirifos en su
respectivo tiempo de retención. El límite de cuantificación del clorpirifos fue el más bajo en
comparación con los demás plaguicidas, demostrando una buena sensibilidad de
detección por el método de CG-EM, la linealidad del método para el plaguicida clorpirifos
presentó un coeficiente de correlación de 0.981 que es cercano a 1 infiriendo que hay una
correlación positiva entre la concentración y la respuesta cromatográfica, de igual manera,
el método presentó una buena exactitud para el clorpirifos ya que los porcentajes de
recuperación se encuentran por encima del valor mínimo establecido por
SANTE/11183/2017, la evaluación del sesgo mostró que no hay diferencias significativas
entre la concentración y los resultados obtenidos en los porcentajes de recuperación. Por
último, la precisión del método para el compuesto clorpirifos presentó coeficientes de
variación menores al 20% como establece la norma SANTE/11183/2017.
En la figura 23 se observan los cromatogramas de la muestra de miel M10 en la ventana
de adquisición del plaguicida clorpirifos, se aprecia las señales en el tiempo de retención
del plaguicida y la separación de las señales de los iones monitoreadas establecidos en la
validación del método, se confirmó la presencia del plaguicida clorpirifos en 6 muestras de
miel.
91
Figura 23. Cromatograma (SIM) de la muestra 8, clorpirifos en su tiempo de
retención
Los resultados que se muestran en la tabla 24 exponen los casos en los que se
encontraron trazas de plaguicidas en las muestras de miel (M2, M5, M9, M10, M11 y M16
respectivamente), así como aquellas que presentaron baja calidad en algún parámetro, y
los casos de muerte reportados en el lugar de origen de la muestra. De esta manera se
evidencia que de las 6 muestras que contenían trazas de plaguicidas todas excepto una
cumplen con los parámetros de calidad, por lo cual no es posible relacionar el contenido
de plaguicidas con la calidad de la miel. Por otro lado, en los casos reportados con
muertes de abejas (M2 y M9) se observa una relación directa entre estos eventos y el
contenido determinado de plaguicida Clorpirifos, esta relación puede confirmarse al
observar la presencia de cultivos (papa, hortalizas, fresas) cercanos a los apiarios de
donde provienen las muestras que contienen trazas de plaguicidas, ya que de acuerdo a
lo reportado el plaguicida Clorpirifos es el más empleado para el control de plagas en
estos cultivos.
92
Tabla 24. Estudio comparativo de las 14 de muestras tratadas provenientes de 14 veredas de Cundinamarca
Nombre de
Muestra Vereda o Barrio
Calidad NTC 1273/2007
Presencia Clorpirifos
mg/kg
Tipo de cultivo alrededor del
apiario
Muerte de abejas
M1 Canavita No cumple
M2 NR Si cumple 0.03146 Fresa Si
M3 San Rafael Si cumple
M4 Mochuelo Si cumple
M5 Chamicera Si cumple 0.01748 Hortalizas No
M6 Lunealito No cumple ND
M7 Corales No cumple
M8 Santa Ana Si cumple
M9 Santuario Si cumple 0.02435 Papa Si
M10 Cascabita Si cumple 0.05183 Papa No
M11 Mondoñedo No cumple 0.02946 Hortalizas No
M14 11 de Noviembre Si cumple
M15 El rodeo No cumple
M16 Guamal Si cumple 0.02968 Papa No
93
6 CONCLUSIONES
El 78.6 % de las muestras suministradas por los apicultores se encuentran bajo los
estándares de calidad aceptados por la Norma Técnica Colombiana del 2007,
determinado a partir de los parámetros de pH, acidez, humedad, sacarosa, cenizas e
Hidroximetilfurfural para miel de abeja de la especie Apis mellifera. El pH se encontró en
un rango de 3.7 a 4.7, la acidez presentó valores entre 3.5 meq/kg y 4.0 meq/kg, la
humedad tuvo valores entre 17% y 22.2%, el porcentaje de cenizas presentó valores de
0.10% a 0.66%, el contenido de sacarosa se encontró entre 2.7 y 4.9% y la concentración
de HMF registró un valor mínimo de 9.76 mg/kg y un valor máximo de 66.98 mg/kg. Los
valores de este estudio son exactos y precisos, presentaron incertidumbres cercanas a
cero y coeficientes de variación menores al 10% entre replicaciones.
Las 14 muestras de miel de abejas presentan heterogeneidad entre sí, difieren en sus
propiedades debido al origen, así como condiciones ambientales del lugar de origen de la
muestra. Los experimentos realizados para cada muestra en un parámetro poseen baja
variabilidad, demostrando que experimentalmente se replicó bajo los mismos criterios.
Las muestras de miel de abejas evidenciaron ser de origen floral, excepto por la muestra
M14 que posee características de miel de bosque o mielada. Todas las muestras
analizadas presentaron propiedades antimicrobianas y únicamente 3 muestras (M1, M7 y
M15) expresan mayor contenido de metales concedido por su porcentaje de cenizas. Sin
embargo, se deben realizar estudios de conductividad para la confirmación de metales.
Los resultados obtenidos en los ensayos de validación de seis plaguicidas
organofosforados y piretroides por medio de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, exhibieron que la metodología fue selectiva, especifica, exacta
y precisa según las directrices de la Comisión Europea (SANTE/11813/2017). La
evaluación de la linealidad se realizó en un rango de concentraciones de 0.005 mg/L a 10
mg/L, haciendo curvas de calibración en solvente (acetato de etilo), los coeficientes de
correlación estuvieron entre un rango de 0.947 a 0.990. Los porcentajes de recuperación
logrados en la fortificación del blanco de miel a tres diferentes niveles de concentración
(N1, N3 y N5) se encuentran en un rango de 89.2% a 112.2 %, además, el valor del sesgo
para cada plaguicida mostró que no existen diferencias significativas entre la
94
concentración y los porcentajes de recuperación con un coeficiente de variación menor al
20%. El límite de detección del método para los plaguicidas estuvo en un rango de 0.002
mg/kg a 0.060 mg/kg, el límite de cuantificación del método se encontró en un rango de
0.007 mg/kg a 0.180 mg/kg.
En el proceso de validación se descartaron dos plaguicidas de los ocho que se planeaban
analizar. El Monocrotofos presentó una baja sensibilidad en el método de cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas, según reportes de estos plaguicidas, el
carácter polar del analito evita la adsorción en una gran proporción en el vaporizador,
ocasionando que la transferencia del analito sea incompleta. Por otro lado, el plaguicida
diclorvos no fue recuperable con el proceso de extracción y purificación.
Se aplicó el método de extracción, purificación y análisis instrumental estandarizado por
Rodríguez et al., 2011 sobre 13 muestras de miel de abejas recolectadas de 13 veredas
del departamento de Cundinamarca, una de las catorce muestras no pudo ser evaluada
debido a que la muestra no fue suficiente para el análisis. Se observó que el 46.1% de las
13 muestras presentaban residuos del plaguicida clorpirifos, la muestra M10 mostró una
concentración mayor al LMR de 0.05 mg/kg establecido por la Comisión Europea. La
presencia de residuos del plaguicida clorpirifos se puede adjudicar a actividades agrícolas
cercanas a los apiarios.
De acuerdo a la caracterización de las muestras de miel y la determinación de plaguicidas
en las mismas, se establece que la muestra M10 no es apta para el consumo humano, el
83.3% de las mieles que contenían plaguicidas presentaron calidad según la norma NTC
1273/2007, por lo cual se infiere que el contenido de plaguicidas no afecta la calidad de la
miel. El 69.2% son aptas para el consumo humano teniendo en cuenta los criterios de
calidad y concentración de plaguicidas.
Se evidencia que hay una relación directa entre las fumigaciones realizadas, a principios
del 2016 y 2017 y la aparición de muestras contaminadas con residuos del plaguicida
clorpirifos. El 33.3% de apicultores de las muestras que exhibieron resultados positivos
para el plaguicida clorpirifos, afirmaron haber observado fumigaciones cerca de sus
apiarios, principalmente en cultivos de papa (Solanum tuberosum) y fresa (Fragaria ×
ananassa). El 14,2% de encuestados que confirmaron sufrir muerte de abejas, también
presentaron residuos del plaguicida clorpirifos en sus muestras de miel.
95
7 RECOMENDACIONES
• Para futuras investigaciones se recomienda ampliar el número y las familias de
plaguicidas bajo estudio, ya que constantemente se obtienen nuevas
formulaciones de plaguicidas en el mercado agrícola y se encuentra necesario
realizar investigaciones en torno al impacto toxicológico que implica el empleo
de estas.
• Se recomienda realizar determinación de residuos de plaguicidas
organofosforados y piretroides en diferentes matrices de la colmena de los
apiarios estudiados.
• Llevar a cabo un seguimiento a las muestras de miel que presentaron residuos
del plaguicida clorpirifos y evaluar otras posibles fuentes de contaminación en
la zona cercana a los apiarios.
• En relación a la recuperación del Diclorvos, el cual no se recuperó y se
descartó del análisis, se recomienda utilizar diferentes técnicas de extracción
de plaguicidas que permiten mejorar los porcentajes de recuperación como por
ejemplo la micro extracción en fase sólida. De esta manera, disponer de
criterios de diversas técnicas para mejorar la recuperación del analito.
• Promover conversaciones entre apicultores y agricultores que permitan
articular el desarrollo de la agricultura y la protección de medio ambiente, así
como reducir el impacto toxicológico sobre los insectos polinizadores, en
especial de abejas y la contaminación de los productos como la miel
provenientes de la colmena.
96
8 BIBLIOGRAFÍA
(FAO), O. d. (5 de marzo de 2013). Departamento de desarrollo sostenible. Obtenido de
http://www.fao.org/docrep/W2598S/
A.G.G., D. F. (1985). toxicologia de los insecticidas organoclorados. Bal Of Sanit Panam,
98.
AGENCIA DE NOTICIAS UN. (28 de Marzo de 2016). Las abejas colombianas se
africanizaron, según estudio de la Universidad Nacional. El Heraldo.
Ahumada, D., & Guerrero, J. (2010). ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ EN EL ANÁLISIS
DE PLAGUICIDAS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES. VITAE, REVISTA DE LA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA, 17(1): 51-58.
Alavanja, M. C., Hoppin, J. A., & Kamel, F. (2004). Health effects of chronic pesticide
exposure: cancer and neurotoxicity. . Annu Rev Public Health., 155-197.
Albero, B., Sanchez-Brunete, C., & Tadeo, J. (2004). Analysis of Pesticides in Honey by
Solid-Phase Extraction and Gas Chromatographya Mass Spectrometry. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52 (19): 5828-5835.
Amaral, P., Rocha, L., Abreu, M., & Fernandesb, C. (2016). Pesticides in honey: A review
on chromatographic analytical methods. Talanta, 124-141.
Anastassiades, M., & Mastovska, K. (2003). Evaluation of analyte protectants to improve
gas chromatographic analysis of pesticides. Journal of Chromatography, 1015:
163-184.
Anway, M. D., Cupp, A. S., Uzumcu, M., & Skinner, M. K. (2005). Epigenetic
transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility. Science,
308(5727): 1466-1469.
AOAC. (1992). Hydroxymethylfurfural in Honey. 980.23.
Arciniegas, P. (26 de Agosto de 2016). ¿Por qué se están muriendo las abejas de
Guasca? El Tiempo.
Arias, E., & al., e. (2008). The mobility and degradation of pesticides in soils and the
pollution of groundwater resources. Agriculture, Ecosystems & Environment. , 123
(4): 247-260.
Avni, D., Hendriksma, H., & Dag, Z. (2014). Aspectos nutricionales de la miel el polen
recolectado por las abejas y las limitaciones en el desarrollo de colonias en el
Mediterráneo oriental. Journal of Insect Physiology , (69): 65-73.
Bachmann, H. (2007). ESTUDIOS PRELIMINARES DE CARACTERIZACIÓN DE MIEL
DE ABEJA: DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR GC/MS Y ANÁLISIS
ENZIMÁTICOS. Valdivia: Universidad Austral de Chile.
Barganska, Z., Slebioda, M., & Namiesnik, J. (2013). Pesticide residues levels in honey
from apiaries located of Northern Poland. Food control, 31: 196-201.
97
Basualdo, M. (2000). Rol de las abejas en la polinización de cultivos. Apicultura, 18-22.
Obtenido de http://www.biblioteca.org.ar/libros/210152.pdf
Blasco, C., Fernandez, M., Pena, A., & Lino, C. (2003). Assessment of pesticide residues
in honey samples from Portugal and Spain. Journal of Agriculture and Food
Chemistry, 51: 8132-8138.
Bogdanov, S., Ruoff, K., & Persano, L. (2004). Physico-chemical methods for the
characterisation of unifloral honeys: a review. Apidologie, s4-s17.
Boukraá, L. (2013). Honey In Traditional And Modern Medicine . CRC PRESS, 26-27.
Buera, M. ,. (2004). Parámetros fisicoquímicos de mieles, relación entre los mismos y su
aplicación potencial para la determinación del origen botánico y/o geográfico de
mieles argentinas. Buenos Aires: Universidad De Belgrano.
Cabrera, R., Nascimento, S., & Pinto da Luzc, C. (2016). Bee pollen as a bioindicator of
environmental pesticide contamination. Chemosphere, 163: 525-534.
Calviello, G. P., Boninsegna, A., Tedesco, B., Maggiano, N., Serini, S., Wolf, F. I., &
Palozza, P. (2006). DNA damage and apoptosis induction by the pesticide
Mancozeb in rat cells: involvement of the oxidative mechanism. . Toxicol Appl
Pharmacol, 211(2): 87-96. .
Carter, W. G., Tarhoni, M., Rathbone, A. J., & and Ray, D. E. (2007). Differential protein
adduction by seven organophosphorus pesticides in both brain and thymus. Hum
Exp Toxicol., 26(4): 347-353. .
Castejon, O. (2011). Diseño y análisis de experimentos . Maracaibo: Fondo Editorial
Biblioteca URU.
Codex Alimentarius. (2001). Codex Alimentarius. Obtenido de http://www.fao.org/fao-who-
codexalimentarius/sh-
proxy/es/?lnk=1&url=https%253A%252F%252Fworkspace.fao.org%252Fsites%25
2Fcodex%252FStandards%252FCODEX%2BSTAN%2B12-
1981%252Fcxs_012s.pdf
Comisión de CODEX Alimentarius. (2010). DIRECTRICES SOBRE BUENAS PRÁCTICAS
DE LABORATORIO EN EL ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS.
CAC/GL 40-1993.
Cordier, S. (2008). Evidence for a role of paternal exposures in developmental toxicity.
Basic Clin Pharmacol Toxicol, 102(2): 176-181.
Corley, J. (2003). Best practices in establishing detection and quantification limits for
pesticide residues in foods. North Brunswick: The state University of New Jersey.
Correa, R. (2015). Evaluación de indicadoress de deterioro de miel de diferentes especies
de abejas. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia.
Cox-Foster, D., Conlan, S., Holmes, E., & Palacios, G. (2007). A Metagenomic Survey of
Microbes in Honey Bee Colony Collapse Disorder. Science, 318: 283-287.
98
Cravedi, J. P., Zalko, D., Savouret, J. F., Menuet, A., & Jegou, B. (2007). The concept of
endocrine disruption and human health. Med Sci , 23(2); 198-204.
Dalpero, A., Rossi, S., Ghini, S., Colombo, A., Sabattini, S., & Girotti, S. (2001).
Multiresidual method for gas chromatography analysis of pesticides in honeybees
cleaned by gel permeation chromatography. Journal of cromatography, 223-232.
Das, P. P., Shaik, A. P., & Jamil, K. (2007). Genotoxicity induced by pesticide mixtures:
invitro studies on human peripheral blood lymphocytes. Toxicol Ind Health, 23(8):
449-458. .
DOW. (10 de 01 de 2018). Lorsban Plus. Obtenido de Hoja de seguridad Lorsban:
http://msdssearch.dow.com/PublishedLiteratureDAS/dh_093b/0901b8038093be07.
pdf?filepath=cl/pdfs/noreg/013-60034...&fromPage=GetDoc
Duffau, B., Rojas, F., Roa, L., Soto, M., Aguilera, M., Sandoval, s., . . . Rodriguez, L.
(2010). Validación de métodos y determinación de incertidumbre de medición.
Santiago: Instituto de salud publica.
EPA. (13 de Mayor de 1993). INSECTICIDE: LORSBAN 50. Obtenido de
https://www3.epa.gov/pesticides/chem_search/cleared_reviews/csr_PC-
059101_13-May-93_354.pdf
FAO. (2002). Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del
Consumidor Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación. Recuperado el 10 de 09 del 2014: Protección a los polinizadores.
FAO. (2003). Agricultura orgánica, ambiente y seguridad alimentaria. Roma: Organización
de las naciones unidas para la agricultura y la alimentación.
FAO/WHO. (2001). Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación y la Organización Mundial de la Salud.
Gallai, N., Salles, J., & Settele, J. (2009). Economic valuation of the vulnerability of world
agriculture confronted with pollinator decline. Ecological Economics.
Gallego, S., & Arenas, C. (2015). EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE
PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN MIEL DE ABEJAS PROVENIENTES
DEL MUNICIPIO DE SANTUARIO, RISARALDA, COLOMBIA. Pereira:
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA.
Gamboa, M. V. (2014). Estudio e identificación de composición y bioactividad propias de
miel de mielato de Apis mellifera. Bogota: Universidad Nacional de colombia .
Garcia, M., Duque, S., Fernandez, A., Sosa, A., & Fernandez, A. (2017). Multiresidue
method for trace pesticide analysis in honeybee wax comb by GC-QqQ-MS.
Talanta, 15 (163): 54-64.
Gonzales, a. P. (2000). Estabilidad térmica y actividad insecticida de compuestos
piretroides y metoprene en formulaciones fumígenas. Buenos Aires: Universidad
De Buenos Aires .
99
Guerrer.E, & Restrepo, M. (2000). Acta Medica Colombiana. Recuperado el 23 de enero
de 2018, de http://www.actamedicacolombiana.com/anexo/articulos/01-1979-
04.htm
Hardell, L. E., & and Nordstrom, M. (2002). Exposure to pesticides as risk factor for non-
Hodgkin's lymphoma and hairy cell leukemia: pooled analysis of two Swedish case-
control studies. . Leuk Lymphoma, 43(5): 1043-1049.
Herrero, F. (2004). Las abejas y la miel. Madrid: Caja España.
I. S., Y., & J., M. (2001). Lipoprotein oxidation and atherosclerosis. Biochemical Society
transactions, 358-362.
ICONTEC. (2007). Norma Técnica Colombiana. NTC 1273 .
INTI. (2006). Análisis de Miel . Buenos Aires: INTI Ensayo Interlaboratorio.
INVIMA. (15 de septiembre de 2017). Instituto Nacional De Vigilancia De Medicamentos Y
Alimentos . Obtenido de https://www.invima.gov.co/
Johnston, M., Price, D., L'Hirondelle, S., & Fleming, R. O. (2010). Tree Species
Vulnerability and Adaptation to Climate Change: Final Technical Report.
Saskatoon: Saskatchewan Research Council.
Juan-Borras, M., Domenech, E., & Escriche, I. (2016). Mixture-risk-assessment of
pesticide residues in retail polyfloral honey. Food Control, 67: 127-134.
Kamel, F., & and Hoppin, J. A. (2004). Association of pesticide exposure with neurologic
dysfunction and disease. Environ Health Perspect, 112(9): 950-958.
Karmaus, W., Kuehr, J., & Kruse, H. (2001). Infections and atopic disorders in childhood
and organochlorine exposure. Arch Environ Health., 56(6): 485-492.
Klein, A., Vaissiere, B., & Cane, J. &. (2007). Importance of pollinators in changign
lanscapes for world crops. . Proceedings of the Royal Society, 274: 303-313.
Kujawski, M., Barganska, A., Marciniak, K., & et, a. (2014). Determining pesticide
contamination in honey by LC-ESI-MS/MS-Comparison of pesticide recoveries of
two liquid-liquid extraction based approaches. LWT-Food Sci. Technol, 56: 517-
523.
Lagunes, T. (15 de noviembre de 2000). Revista folia. Recuperado el 23 de enero de
2018, de http://www.folia.socmexent.org/revista/folia/Num%2063/83-101.pdf
Laverde Rodriguez, J., & Egea Hernández, L. &. (2010). Agenda prospectiva de
investigación y desarrollo tecnológico para la cadena productiva de las abejas y la
apicultura en Colombia con énfasis en miel de abejas. Bogotá: Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural. .
Ledirac, N., Antherieu, S., d'Uby, A. D., Caron, J. C., & Rahmani, R. (2005). Effects of
organochlorine insecticides on MAP kinase pathways in human HaCaT
keratinocytes: key role of reactive oxygen species. Toxicological Sciences, 86(2):
444-452. .
100
Lee, W. J., Son, M., Chun, B. C., Park, E. S., Lee, H. K., Coble, J., & and Dosemeci, M.
(2008). Cancer mortality and farming in South Korea: an ecologic study. Cancer
Causes Control., 19(5): 505-513. .
Li, Q., & Kawada, T. (2006). The mechanism of organophosphorus pesticide-induced
inhibition of cytolytic activity of killer cells. Cellular and Molecular Immunology, 3(3):
171-178. .
Lopez, G. O. (2005). INfluencia De La exposición Crónica A PLaguicidas Sobre Diversos
Marcadores Bioquimicos (Esterasas Y Enzimas Antioxidantes) En TRabajadores
De Invernadero De La Costa Oriental De Andalucia. Granada: Editorial De La
Universidad De Granada.
Lyons, G. (2000). Mixed messages : pesticides that confuse hormones. Pesticides Action
Network UK. .
MAFF. (1992). Acidity in honey. Journal of the Association of Public Analysts, 28:171-175.
MAFF. (1992). METHOD FOR ASH IN HONEY. Journal of the Association of Public
Analysts, 28: 177-181.
Malhat, F., & al., e. (2015). Residues of organochlorine and synthetic pyrethroid pesticides
in honey, an indicator of ambient environment, a pilot study. Chemosphere, 120:
457-461.
MAVDT. (09 de Noviembre de 2007). USO APARENTE DE PLAGUICIDAS EN
COLOMBIA. Obtenido de Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial :
http://cep.unep.org/repcar/informacion-de-paises/colombia-
1/COL%20importacion%20y%20exportacion%202004-2007.pdf
Maysaloun, M. M., Baldi, I., Geahchan, A., Tulliez, J., & Gamet-payrastre, L. (2008). Etude
de l'impact de l'exposition à des mélanges de pesticides à faibles doses :
caractérisation des effets sur des lignées cellulaires humaines et sur le système
hématopoïétique murin. Toulouse: UNIVERSITÉ DE TOULOUSE.
Méndez, K., & López, E. (2011). Estudio comparativo de las propiedades fisicoquímicas
de miel natural y miel sometida a proceso comercial. . Ciencia y técnlogia
alimentaria , 9(1): 14-21.
Mills, P. K. (1998). Correlation analysis of pesticide use data and cancer incidence rates in
California counties. Arch Environ Health., 53(6); 410-413. .
MINAGRICULTURA. (2014). Evaluaciones agropecuarias Municipales. Obtenido de
http://www.agronet.gov.co/Documents/Cundinamarca.pdf
Monsalve, M. (8 de Julio de 2017). Colapso de abejas, tremendo lío. El espectador.
Moser, V. C. (2007). Animal models of chronic pesticide neurotoxicity. Hum Exp Toxicol,
26(4): 321-331.
Mukherjee, I. (2009). Determinación de residuos de plaguicidas en muestras de miel. Env.
Contam. Toxicol, 83: 818-821.
101
Nadon, N. A. (2015). NEUROTOXICIDAD DE INSECTICIDAS
PIRETROIDES.EVALUACIÓN DEL RIESGO. Madrid: Real Academia De Doctores
De España.
Nates, G., & González, V. (2000). LAS ABEJAS SILVESTRES DE COLOMBIA: POR QUÉ
Y CÓMO CONSERVARLAS. Acta Biológica Colombiana, 5: 5-37.
NIH. (20 de septiembre de 2017). Instituto NAcional De Cancer. Obtenido de
https://www.cancer.gov/espanol
NTE. (1989). Determinación de azucares, reductores totales, sacarosa y la relación
fructosa-glucosa. INEM, 2-45.
OMS. (noviembre de 2017). Organización Mundial De La Salud. Obtenido de
http://www.who.int/gho/database/es/
Palarmo, E. (20 de Junio de 2013). LiveScience. Obtenido de What Is Honey?:
http://www.livescience.com/37611-what-is-honey-honeybees.html
Pinho, G., Neves, A., Queiroz, M., & Silverio, F. (2010). Optimization of the liquid–liquid
extraction method and low temperature purification (LLE-LTP) for pesticide residue
analysis in honey samples by gas chromatography. Food control, 21: 1307-1311.
Priyadarshi, A., Khuder, S. A., Schaub, E. A., & Shrivastava, S. (2000). A meta-analysis of
Parkinson's disease and exposure to pesticides. Neurotoxicology, 21(4): 435-440. .
Ramírez, J., & Lacasaña, M. (2001). Plaguicidas: clasificación, uso, toxicología y medición
de la exposición. Archivos de prevención y riesgos laborales, 4(2): 67-75.
Repetto, M. (2000). Toxicologia Avanzada. España: Ediciones Diaz De Santos, S. A.
Repetto, M. (s.f.). Toxicologia Avanzada. España: Ediciones Diaz De Santos, S. A.
Repetto, M., & Repetto, G. (2009). Toxicología ambiental . Sevilla: Diaz de Santos.
Rissato, S., Galhiane, M., & Knoll, F. (2006). Método multiresíduo párrafo monitoramento
de contaminação ambiental de pesticidas na região de Bauru (SP) Usando mel
Como bio-indicador. Quim. Nova, 29: 950-955.
Ritz, B., & Yu, F. (2000). Parkinson's disease mortality and pesticide exposure in California
1984-1994. Int J Epidemiol, 29(2): 323-329.
Rodríguez, D., Díaz, A., Ahumada, D., & Guerrero, J. (2014). Desarrollo y optimizacion de
una metodología multiresiduo por metodo simplex para el análisis de plaguicidas
en miel de abejas. Departamento de quimica de la Universidad Nacional de
Colombia, 1-24.
Rowe, A. M., Brundage, K. M., & and Barnett, J. B. (2007). In vitro atrazine-exposure
inhibits human natural killer cell lytic granule release. . Toxicol Appl Pharmacol.,
221(2): 179-188.
Salameh, P., Waked, M., Baldi, I., Brochard, P., & Saleh, B. A. (2006). Respiratory
diseases and pesticide exposure: a case-control study in Lebanon. J . J Epidemiol
Community Health, 60(3): 256-261.
102
SANTE. (2017). guidance document on analytical quality control and method validation
procedures for pesticide residues and analysis in food and feed.
Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O., Wang, K., & Round, D. (2008). Characterization of
chlorpyrifos-induced apoptosis in placental cells. Toxicology, 244(2-3): 98-110.
Serna, L., & Lopez, S. (2010). ACTUALIZACION DEL MANUAL DEL LABORATORIO DE
ANALISIS DE ALIMENTOS DELPROGRAMA DE TECNOLOGIA QUIMICA DE LA
UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA . Pereira: Universidad Tecnológica
de Pereira.
Shahawi, E., & al., e. (2010). An overview on the accumulation, distribution,
transformations, toxicity and analytical methods for the monitoring of persistent
organic pollutants. Talanta, 80 (5): 1587-1597.
STN CPAA. (Junio de 2015). MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL
CADENA PRODUCTIVA DE LAS ABEJAS Y LA APICULTURA. Obtenido de
https://sioc.minagricultura.gov.co/Apicola/Documentos/002%20-
%20Cifras%20Sectoriales/002%20-
%20Cifras%20Sectoriales%20%E2%80%93%202015%20Junio.pdf
SUbovsky, M., Sosa, L., & Castillo, A. (2003). DETERMINACIÓN DE ALGUNOS
PARÁMETROS FÍSICOQUÍMICOS EN MIEL DE ABEJAS DE LA PROVINCIA DE
CORRIENTES, ARGENTINA Y SU RELACIÓN CON LA COSECHA Y
PROCESAMIENTO. Revista Cientifica Agropecuaria, 7(2): 61-64 .
Suescún, L., & Vit, P. (2008). Control de la calidad de la miel de abejas como propuesta
para un proyecto de servicio comunitario obligatorio. . Fuerza farmaceútica, I:6-15.
Tejedor, M. C. (2010). Mecanismos De Toxicidad De Organofosforados Y Carbamatos. En
M. C. Tejedor, Bioquímica Ambiental. Madrid: Universidad Complutense.
Tomas, K., Alicia, n., Stanislaw, S., Marta, G., Milena, B., & Andrzej, P. (2016). Multi-
residue method for the determination of pesticides and pesticide metabolites in
honeybees by liquid and gas chromatography coupled with tandem mass
spectrometry—Honeybee poisoning incidents. Journal of a cromatography A, 100-
114.
Tosi, S., Costa, C., Versco, U., Quaglia, G., & Guido, G. (2018). A 3-year survey of Italian
honey bee-collected pollen reveals widespread contamination by agricultural
pesticides. Science of The Total Environment, 615: 208-218.
Tosi, s., démares, f., Nicolson, W. S., Medrzycki, P., Pirk, W., & Human, H. (2016). Effects
of a neonicotinoid pesticide on thermoregulation of African honey bees (Apis
mellifera scutellata). Journal of Insect Physiology, 56-63.
Ulloa, A. j., Mondragon, C. p., Rodriguez, R., Resendiz, J. ,., & Petra, r. (2010). La miel de
Abeja y su importancia. Fuente Año 2, 11-18.
Urrego, J. (2017). CARACTERIZACIÓN DE MIELES DE ABEJA Apis mellifera,
COLECTADAS DE DIFERENTES REGIONES DE ANTIOQUIA, DE ACUERDO
103
CON LOS PARÁMETROSESTABLECIDOS POR LA LEGISLACIÓN
COLOMBIANA. Medellín: Universidad Nacional de Colombia.
Vargas, R. B. (2016). Estudio De Las Propiedades Antimicrobianas Y Antifungicas De La
MIel De Abeja (Apis Mellifera) Como Tratamiento De Infecciones Causadas
Clostridium Perfringens, Psudomona aeruginosa Candida Tropicalis Y Aspegillus
Brasiliensis. Quito: Universidad De Las Americas.
Vásquez, C. (2010). Caracterización de mieles de San Pedro de Atacama basada en
análisis fisicoquímicos y melisopalinológicos. Valdivia: Universidad Austral de
Chile.
Vásquez, R., & Rodrigo, E. &. (2006). Polinización dirigida con Apis mellifera en un cultivo
comercial de fresa (Fragaria chiloensis). Ciencia y Técnología Agropecuaria, 7(1),
50-53.
Verde, M. (2010). Curso de actualización de apicultura. . Conferencia técnica. Cuba:
Consejo científico Veterinario. .
Verde, M. (2014). Apicultura y seguridad alimentaria. Revista Cubana de Ciencia Agricola,
48: 25-31.
Villar, M. (2014). Determinación de hidroximetilfurfural en mieles como parámetro
indicador de la calidad de las mismas. Sevilla : Proyecto Jovenes con
Investigadores.
Villar, M., Villar, M., Rodríguez, D., & Cobo, S. (2015). Proyecto Jóvenes con
investigadores. Obtenido de Determinación de Hidroximetilfurfural en mieles como
parámetro indicador de la calidad de las mismas:
https://jovenesconinvestigadores.files.wordpress.com/2015/05/determinacic3b3n-
de-hidroximetilfufural-en-mieles.pdf
Vit, P. (2004). Productos de la colmena secretados por las abejas: Cera de abejas, Jalea
Real y Veneno de abejas. Instituto Nacional de Higiene., 35 (1): 32-39.
Winterlin, W., Walker, G., & Luce, A. (1973). Carbaryl residues in bees, honey, and bee
bread following exposure to carbaryl via the food supply. Environ. Contam. Toxicol,
1: 362-374.
Worterbeek, B. (2002). Biomonitoring of trace element air pollution: principles, possibilities
and perspectives. Environment Pollut, 120: 11-21.
Zamora, O., & Dominguez, R. (2008). Frecuency of European and African-Derived
morphotypes and haplotypes in colonies of honey bees (Apis mellifera) from NW
México. 39(4): 388-396.
Zamudio, A. (2017). Evaluación de residuos de plaguicidas y metales tóxicos en miel de
abejas producida en zonas de cultivos de fresa y cítricos. Bogotá: Universidad
Nacional de Colombia.
Zandamela, E. (2008). Caracterización Fisico - Quimica y evaluación sanitaria de la miel
de mozambique. Barcelona. Barcelona: Universidad Autonoma De Barcelona.
104
ANEXOS
ANEXO 1. Encuesta de muestreo
105
ANEXO 2. Gráficos de barras en la caracterización de miel en g/100 g
1. Gráfico de barras de la determinación de pH en g/100 g de cada muestra
2. Gráfico de barras de la determinación de Acidez Libre en g/100 g de cada muestra
106
3. Gráfico de barras de la determinación de Humedad en g/100 g de cada muestra
4. Gráfico de barras de la determinación de HMF en g/100 g de cada muestra
107
5. Gráfico de barras de la determinación de HMF en g/100 g de cada muestra
ANEXO 3.Valores De F De La Distribución De Fisher
108
ANEXO 4. Cromatogramas tomados en SCAN de estándares de plaguicidas.
1. Cromatograma del estándar Diclorvos tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
2. Cromatograma del estándar Monocrotofos tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
109
3. Cromatograma del estándar Fenitrotión tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
4. Cromatograma del estándar Malatión tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
110
5. Cromatograma del estándar Clorpirifos tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
6. Cromatograma del estándar Lambda- Cialotrina tomado en el cromatógrafo con
detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C
111
1. Cromatograma del estándar Cipermetrina tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C
ANEXO 5. Espectros de masas tomados en SCAN de estándares de plaguicidas
1. Espectro de masas del estándar Diclorvos tomado en el cromatógrafo con detector
selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
112
2. Espectro de masas del estándar Monocrotofos tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
3. Espectro de masas del estándar Fenitotrión tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
113
4. Espectro de masas del estándar Malatión tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
5. Espectro de masas del estándar Clorpirifos tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
114
6. Espectro de masas del estándar Lamda-Cihalotrina tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
7. Espectro de masas del estándar Cipermetrina tomado en el cromatógrafo con detector selectivo de masas Agilent Technology 7890 A / 5975 C.
115
ANEXO 6. Valores Críticos Para Prueba De Homogeneidad De Varianzas de Cochran
bajo un nivel de significancia de α = 0.05
ANEXO 7. Valores Críticos Para Test t - Student Para Dos muestras Emparejadas.
116
ANEXO 8. Cromatogramas (sim) del clorpirifos en su tiempo de retención en las
muestras donde se identificó.
1. Cromatograma (SIM) de la muestra 2 clorpirifos en su tiempo de retención.
2. Cromatograma (SIM) de la muestra 4 clorpirifos en su tiempo de retención.
3. Cromatograma (SIM) de la muestra 7 clorpirifos en su tiempo de retención.
117
4. Cromatograma (SIM) de la muestra 9 clorpirifos en su tiempo de retención.
5. Cromatograma (SIM) de la muestra 12 clorpirifos en su tiempo de retención.